Isolierung von T-Lymphocyten aus Splenocyten mittels Zentrifugierung in Percoll-Gradienten

Haus-schweins untersucht. Die Splenocyten bestehen vorwiegend aus B-Lymphocyten und Unterpopula-tionen von T-Lymphocyten (Yamasaki et al., 2003; Mebius & Kral, 2005), da die adherenten Zellen (Makrophagen und mononukläre Zellen) während der Isolierung der Splenocyten im verwendeten Vlies-Filter zurückgehalten werden sollten (Volvovitz et al., 1980; Yamasaki et al., 2003). Bei dieser Methode bleibt ein geringer Rest (1-2 %) von Monocyten, Granulocyten und Erythrocyten in den erhaltenen Präparaten zurück. In den Splenocyten-Primärkulturen konnte der Einfluß auf die mRNA-Expression der Tc-PTP und PTP1B von mitogenen Molekülen, Zytokinen und Pharmaka nachgewie-sen werden (Wasserstoffperoxyd oder Antioxydantien: Schreiber, 1999; Karin et al., 2004). Diese sind Substanzen, welche auf die Proliferation der Lymphocyten in unterschiedliche Signaltransduk-tionswege einwirken, und deren Effekte auf verschiedene Zelltypen des Immunsystems untersucht wurden (Majumdar et al., 2002; Aggarwal, 2003; Yamamoto & Gaynor, 2004).

Um die PTP-Expression in T-Lymphocyten auf mRNA und Proteinniveau zu untersuchen, wur-den Splenocyten aus der Milz von Schweinen durch Zentrifugation in linearen Percoll-Gradienten isoliert. Hierzu wurden Lymphocyten aus der Schweinemilz unter Zusatz von 10% FCS 24 h lang bei

37 °C kultiviert. Der sterile Ansatz der Percoll-Gradienten (20 – 80 %; in PBS 1 x) erfolgte in einem Gradientenmischer auf ein Endvolumen von 40 ml. Jeweils 10 ml (1 – 2 x 10⁷ Zellen/ml) wurden auf die Gradienten gegeben und in Batches von 8 – 16 Falcon-Röhrchen 20 Minuten im Winkelrotor bei 3.600 rpm zentrifugiert (Rt: 20 – 22 °C). Auf diese Weise wurden nach Dichte angeordnete Zellpopu-lationen erhalten (Abb. 1, A). Bei den Versuchsreihen trennte sich das Zellmaterial generell in 7 – 8 Schichten auf. Je nach Zusammensetzung der Proben war die Schichten mehr oder weniger scharf getrennt. Jede der weißlichen Zellschichten wies verschiedene Mengen an Zellen auf (Schema in Abb. 1, A). Bei 20 – 30 % Percoll lagen zwei Schichten, und in der Mitte der Gradienten, bei 40 bis 60 % entstanden 4 unterscheidbare Schichten. Bei 70 – 80 % Percoll fielen Erythrocyten aus (Reste der Granulocyten und Erythrocyten, die von der Zubereitung der Splenocyten herrührten). Aufgrund von Literaturangaben (Gutierrez et al., 1979) und der verschiedenen Dichten wurden in den Schich-ten 1 und 2 der Percoll-GradienSchich-ten vorwiegend B-LymphocySchich-ten, in den SchichSchich-ten 3 – 6 vorwiegend Subpopulationen von T-Lymphocyten erwartet.

Die erhaltenen Schichten aus Lymphocyten und Erythrocyten wurden vorsichtig mit einer Mi-kropipette abgesaugt, in PBS 1 x gewaschen, nochmals abzentrifugiert und in Kulturmedium, unter Zusatz von 10 % FCS, bei 37 °C für 24 h, wie in Kap. 3.3 beschrieben, weiter kultiviert. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert und eine Resuspension der Zell-Pellets in Extraktionspuffer A + 8 M Harnstoff/1 % Tx-100, anschließend eine Homogenisierung mit einem 2 ml manuellen Glas-Teflon-Homogenisator vorgenommen, um dann mittels Western-Blot die relativen Mengen der ver-schiedenen PTPs aus jeder Percoll-Schicht zu untersuchen (monoklonaler Antikörper-Nachweis mit kommerziellen Detektions-Kits).

Hierzu wurden die Protein-Überstände auf vier PAA-Mini-Gele zur SDS-PAGE-Analyse auf-getragen, dann per Western-Blotting auf Nitrozellulose-Membranen transferiert und die Blots mit mo-noklonalen Antikörpern auf die folgenden PTPs (membrangebunde und cytoplasmatische) getestet:

Tc-PTP, PTP1B, 1C, 1D, CD45 und R-PTPα (Abb. 11; A – F). Aus den Western-Blots ging hervor, daß die Tc-PTP vor allem in den vier Zellschichten zwischen 40 und 60 % Percoll, besonders aber in der dritten dieser vier Schichten auftrat (Abb. 11, A; e). Die ersten zwei Zellschichten, bei ca. 20 und 25 % Percoll, enthielten sehr wenig Tc-PTP (es wurde eine unspezifische Bindung des Antikörpers an Erythrocyten-Proteine beobachtet, weil in diesem Blot die Verdünung erstmalig angewendet wurde:

Abb. 11, A; g). PTP1B wurde in den sechs weißen Schichten gefunden und zeigte in der Elektropho-rese drei bis vier spezifische Banden zwischen 34 und 50 kDa, mit einer Haupt-Bande bei 50 kDa, und zwei kleineren Banden bei ca. 37 und 34 kDa (Abb. 11, B). Eine nicht identifizierte Proteinbande von ca. 160 kDa erschien vorwiegend in Immunzellen aus den vier oberen Schichten des Gradienten;

zu dieser unspezifischen Bande wurde in der Literatur keine Angabe gefunden. PTP1C (Abb. 11, C) wurde in den Zell-Schichten 2 – 6 (s. Abb. 1, A) gefunden, mit Proteinmaxima in den Schichten 3 – 5, etwa wie für Tc-PTP, jedoch klar abgegrenzt in Bezug auf die relative Proteinkonzentration;

die höchsten Level für PTP1C lagen in Schicht 4 (Abb. 11; C; d). Nur eine Proteinbande war für PTP1C sichtbar. Die PTP1D (Abb. 11, D) kommt vor allem in den Schichten 3 – 6 vor, ähnlich wie Tc-PTP und die PTP1C, aber auch in Zellen der Ebene 2 und in den Erythrocyten (Abb. 11, D; g). Die PTP1D war in zwei Proteinbanden (69 und 73 kDa) aufgetrennt. Nur die obere dieser Banden ist in Erythrocyten vorhanden (Abb. 11, D; g), ein Ergebnis, das einem alternativen splicing dieses Enzyms zugeordnet werden könnte; auch eine Phosphorylierung des Proteins wäre denkbar, wogegen eine Proteolyse als Erklärung für das Vorhandensein dieser Banden weniger wahrscheinlich ist.

Zum Vergleich mit den cytoplasmatischen PTPs wurden zwei weitere Western-Blot-Analysen für membrangebundene PTPs durchgeführt, und zwar für CD45 und R-PTPα. Man kann erkennen, daß CD45 in allen 6 Percoll-Fraktionen (weiße Schichten) ungefähr gleich hohe Levels aufweist. In verschiedenen Lymphocyten-Unterpopulationen lagen Splice-Varianten der CD45 vor, die unterein-ander eine unterschiedliche Mengenverteilung aufwiesen (Abb. 11, E; a–f). R-PTPα, das ähnlich wie CD45 mit der Plasma-Membran assoziiert ist, wurde vorwiegend in Zellen der Gradientenmitte (bei 45 – 55 %; hauptsächlich in den Schichten 4 und 5 (Abb. 1, A) gefunden. R-PTPα konnte weder in den Lymphocyten-Fraktionen 1 und 2 noch in den Erythrocyten nachgewiesen werden (Pfeile: 136, 200, 87 kDa; Abb. 11, F). Die relative Mengenverteilung der R-PTPα in den Lymphoiden-Zellschich-ten ist sehr ähnlich wie die der Tc-PTP.

Die Zentrifugierung in kontinuierlichen Percoll Gradienten konnte schnell und einfach durch-geführt werden und erlaubte die Separierung einer großen Menge von Zellen des Immunsystems in

Abb. 11 (A-F) Identifikation der PTPs durch Western Blotting in Splenocyten-Fraktionen, die durch Zentrifugieren in Percoll-Gradienten isoliert wurden (20 – 80 % Percoll; 7 Zell-Schichten, hervorgehoben in Abb. 1, A). Nach der Percoll Zentrifugierung wurden die Zellschichten isoliert und mit Puffer A + 8 M Harnstoff/1 % Tx-100 homogenisiert und aufgelöst (SDS-PAGE, 10 % PAA; 10 µg Protein/Gel-Tasche).

Abb. 11 A) SDS-PAA Gel-Elektrophorese, Western Blotting, und Detektion der Tc-PTP mit kommerziellen monoklonalen Maus-Antikörper gegen menschliche recPTPs. Entwicklung des Western-Blots, 90 min (α-Tc-AK-Verdünnung, 1.000 x).

Abb. 11 B) Anwesenheit der PTP1B in verschiedenen Schichten von Milz-Splenocyten, die durch Zentrifugieren in linearen Percoll-Gradienten aufgetrennt wurden. Entwicklung des Blots, 4 min. AK-Verdünnung, 600 x.

Abb. 11 C) Western Blotting zur PTP1C, in Splenocyten, die durch Dichte-Zentrifugieren in Percoll aufgetrennt wurden. Entwicklung, 4 min. AK-Verdünnung, 500 x.

p48 

relativ kurzer Zeit. Andere Verfahren sind methodologisch anspruchsvoller und bisher nicht für die-sen Zelltyp standardisiert (z.B. Das FACS-Verfahren unter Verwendung monoklonaler Human-Anti-körper (α-CD)) oder solcher Verfahren, bei denen AntiHuman-Anti-körper in Säulen durch magnetische Bindung zurückgehalten werden (Dynabeads, Dynal, oder der Fa. Miltenyi). Diese Verfahren isolieren Immun-zellen (kleinere Mengen) aufgrund der Gegenwart von Oberflächenmarkern und nicht aufgrund der spezifischen Dichte dieser Subpopulationen (Uher & Dickler, 1988). Die Gradienten-Zentrifugierung in Percoll wurde auch zur Isolierung anderer tierischer Zellen benutzt (Uher & Dickler, 1988); bei-spielsweise Eosinophilen, Mastzellen aus -Geweben, B-Lymphocyten, Untertypen von T-Lymphocy-ten, NK, unter anderen Immunzellen. In der Literatur ist die Migration von Lymphocyten-Subspecies aus der Milz in Percoll-Gradienten bisher für keine Spezies beschrieben. Bei der vorliegenden Arbeit waren keine kommerziellen anti-CD Antikörper des Hausschweins verfügbar. In der Literatur war der Erkennungsgrad dieser Oberflächenmarker zwischen Zellen vom Menschen und vom Schwein bisher nicht beschrieben. Deshalb wurden als Indikator für die Auflösung der Percoll-Dichteseparation in unterschiedlichen Lymphocytentypen die relativen Mengen jeder PTP in den jeweiligen Schichten bestimmt, was Rückschlüsse auf die Effizienz der Separierung in diskrete Zelltypen zuläßt.

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Abb. 11 D) Detektion der PTP1D durch Western Blotting, nach Zentrifugieren von Splenocyten in Percoll Gradienten. 2,5 h Entwicklung des Blots. AK-Verdünnung, 500 x.

Abb. 11 E) Western Blotting der Transmembran PTP CD45 in Splenocyten nach Percoll-Zentrifugation.

Entwicklung, 4 min. AK-Verdünnung, 500 x. Blot gestrippt; vorher mit Tc-AK dekoriert.

Abb. 11 F) Western-Blot Analyse zur Membran-gebundene PTP, R-PTPα (Pfeile), in Splenocyten Schichten verteilt durch Percoll-Dichte-Gradienten. Entwicklung, 2,5 h. AK-Verdünnung, 5.000 x. Der Blot wurde vorher mit PTP1B Antikörper dekoriert.

kDa

Die Vielzahl der Splenocyten-Subpopulationen könnte auf Subsets von Zellen zurückzufüh-ren sein, die durch die Anwesenheit verschiedener Membranmarker charakterisiert sind. Die Milz des Schweins enthält zwei Typen von B-Lymphocyten: IgM⁺ und IgD⁺ (Rothkötter et al, 2002). T-Lymphocyten der Milz können mehrere diversifizierte Subpopulationen bilden, da sie durch Kom-binationen der Oberflächenmarker CD4, CD8, CD2, TCRαβ und TCRγδ charakterisiert sind. In der Milz des Hausschweins liegen somit T-Zellen TCRαβ⁺/CD4⁺ und TCRαβ⁺/CD8⁺ vor; eine Fraktion dieser Zellen gehört zu CD2⁺, eine andere zu CD2^- (Yang & Parkhouse, 1996; Butler et al., 2006).

Dies wiederholt sich, wenn auch in kleinerem Maßstab, in T-Zellen TCRγδ⁺/TCRαβ^- (Saalmüller et al., 1990; Butler et al., 2006). Das genaue Mengenverhältnis der NK-Zellen (CD16⁺) in der Schwei-nemilz kennt man bisher nicht, wiewohl man weiß das diese Fraktion beim Menschen 10% unterhalb der von Lymphocyten liegt (Abbas et al., 2000).

Im Falle der PTP1B könnten die verschiedene Proteinbanden, die mit dem Western-Blot erkannt wurden (Abb. 11, B), durch mögliche Splicing-Varianten erklärt werden, obwohl es wahrscheinlicher ist, daß sie auf eine Proteolyse des Enzyms (Frangioni et al., 1993; Gulati et al., 2004) und/oder durch gel-shift zurückzuführen sind (für diejenigen Banden mit geringerem Molekulargewicht), ausgelöst durch die Regulierung mittels einer covalenten Phosphorylierung in Ser/Thr (Flint et al., 1993) oder in Tyr (Tao et al., 2001).

R-PTPα besteht beim Menschen aus einer Polypeptidkette von 130 kDa (Su et al., 1994), da-her sind die obere und untere Bande, welche durch den Antikörper erkannt werden (möglicda-herweise unspezifisch), wobei wahrscheinlicher ist, daß die untere Bande ein proteolytisches Fragment dieser Transmembran-PTP darstellt (Gil-Henn et al., 2001), während die größere Bande dadurch erklärt wer-den könnte, daß eine Splicing-Variante dieses Enzyms aus dem Schwein vorliegt, die beim Menschen nicht vorkommt.

Es ist hoch wahrscheinlich, daß das Fragment p87 (positive Erkennung durch den monoklo-nalen Antikörper im Blot Abb. 11, F) der R-PTPα durch Proteolyse gelöst wird. Bei Versuchen zur Solubilisierung (bei denen eine intensivere Manipulation der subzellulären Fraktionen während des Extraktionsprotokolls erfolgt; s. Abb. 17, F) wurde eine im Verhältnis zu p136 erhöhte p87- Menge ge-messen, während umgekehrt in Splenocyten, die direkt in 8M Harnstoff / 1% Tx-100 extrahiert worden waren, eine höhere relative Menge von p136 im Gegensatz zu p87 gemessen wurde (Abb. 11, F). Nach der Präparation der in (Abb. 16) beschriebenen subzellulären Fraktionen (Spuren K, M, S), konnte R-PTPα in keiner der subzellulären Fraktionen nachgewiesen werden, was den Schluß zuläßt, daß diese Form, im Vergleich zu anderen PTPs und trotz der im Puffer A vorliegenden Protease-Inibitoren, differenziell proteolysierbar ist.

Für CD45 kann man sowohl beim Schwein als auch beim Menschen Muster von Splicingvari-anten der Gentranskripte dieses Enzyms beobachten (Hermiston et al., 2003), wobei sich verschiedene Profile von Isoformen des Proteins in unterschiedlichen Subpopulationen von Zellen des Schweine-Immunsystems manifestieren (Abb. 11, E; Abb. 16, E). Diese Muster von Isoformen könnten aber auch als verschiedene Grade von extrazellulärer Glycosylierung dieser Transmembran-PTP (Huntington &

Tarlinton, 2005) angesehen werden. Die CD45R-Form fand sich in allen Milzlymphocyten (ca. 200 kDa), während die CD45RO (p175) fast ausschließlich in den Schichten 3-6 (Abb. 11, E; c-f) vorlag. Es wurde beschrieben, daß diese Splicing-Variante der PTP CD45 hauptsächlich in T- Lymphocyten gefun-den wird; etwa 50 % der Human-T-Zellen seien vom CD45RO⁺ – Typ (Schwinzer & Wonigeit, 1990).