Standardisierung der Amplifikationsbedingungen für RT-PCR

Für die Versuche zur Analyse der Genexpression mittels RT-PCR wurde die Methode standar-disiert. Die RT-PCR wurde zweistufig gewählt, um aus einem cDNA-Präparat mehrere Sequenzen amplifizieren zu können. Das für die RT-Reaktion verwendete kommerzielle Isoenzym (RT_AMV, Avian myeloblastosis virus) erlaubt (im Gegensatz zur RT_M-MuLV) die Transkription bei erhöhter Temperatur (42-45 °C), was das Risiko der Bildung von Sekundärstrukturen in der Ausgangs-RNA reduziert.

Die Amplifizierung durch PCR wurde so weit wie möglich unter semi-quantitativen Bedingungen durchgeführt, also:

a) Vermeiden der Überschreitung einer exponentiellen Amplifizierung, um die Effizienz des Vorganges nicht zu gefährden (nicht wesentlich über 30 Zyklen amplifizieren);

b) Verwenden nur von hochkompatiblen Primerpaaren (Schmelzpunkt, Primerlänge und der C/G -Gehalt);

c) Abstimmen der Primerpaare auf DNA-Stranglängen möglichst nicht über 1 kbp.

Wie in Kapitel 3.1.1 beschrieben, wurde ein aktivierender Effekt von H₂O₂ auf die Genex-pression (mRNA-Halbwertszeit bzw. Stabilität) von ausgereiften Transkripten spezifischer Gene aus isolierten Zellen beim Immunsystem des Hausschweins (gewonnen aus Vollblut und Milzgewebe)

festgestellt, wenn diese in Primärkultur verschiedenen chemischen Stimuli ausgesetzt waren. Die in der Folge durchgeführten Versuche unterziehen die Tc- und 1B-Expression der PTPs aus isolierten Schweinezellen des Immunsystems (Blut und Milz) einer näheren Betrachtung.

Periphere Lymphocyten und Granulocyten wurden unter Zusatz von 10% FCS zur Reinigung in Ficoll zentrifugiert, 24 h bei 37 °C kultiviert und in einer Dichte von 1 x 10⁸ Zellen/Kultur auf jeweils 5 ml Kulturmedium ausgebracht. Hierbei wurden den Kulturen verschiedene H₂O₂-Dosierungen im millimolaren Bereich zugesetzt. Abb. 6 zeigt, wie sich unterschiedliche H₂O₂-Levels auf den Grad der Genexpression bei den ausgereiften mRNA der Tc-PTP auswirken (Nachweis durch RT-PCR). Dies könnte ein Hinweis auf verschiedene Angriffspunkte innerhalb der Signaltransduktion sein, durch welche die Genexpression in beiden Zelltypen gesteuert wird. In Abb. 6 (c) wird weiterhin deutlich, daß in der Kontrolle (ohne H₂O₂) nach 15 Stunden in den peripheren Lymphocyten mRNA der Tc-PTP nachgewiesen werden kann. Die nachweisbaren Tc-Tc-PTP-mRNA-Mengen nahmen bei Wasser-stoffperoxid-Konzentrationen von 0,3 und 1 mM ab. Bei peripheren Granulocyten in Primärkultur wurde beobachtet, daß 1 mM Wasserstoffperoxid nach 15 h einen stärkeren stimulierenden Effekt auf die Tc-PTP-Expression hat als die Vergleichsmengen 0,3 und 5 mM.

Um eine semiquantitative Analyse von Transkripten durch RT-PCR zu standardisieren, wurde untersucht, ob die Transkripte genauso effizient detektiert werden können, wenn als RT-Primer statt eines oligo dT₁₅ -Primers ein “random Primer” (dN₆) verwendet wird (Abb. 7). Hierzu wurden 5 äquivalente Splenocyten-Primärkulturen zu je 5 ml, in einer Kulturdichte von 1 x 10⁸ Zellen/Platte angeimpft und mit zwei unterschiedlichen H₂O₂-Konzentrationen von 1,9 und 3,8 mM verschieden lang inkubiert (0, 1,5 und 5,5 h). Gesamt-RNA wurde wie in “Material und Methoden” beschrieben bereitet und die RNA aus den im Versuch erhaltenen Zellen wurde in zwei gleich große Batches auf-geteilt. Dann wurde jede Platte mit RT-PCR analysiert, wobei jeweils eine Probe mit Random-Primer dN und die andere mit dT behandelt wurde. Dann wurde die komplette, aus ~1200 bp bestehende

Granulocyten Lymphocyten

Tc-PTP  α-Act 

M a b c d e f g h M

Kontrolle + + +

H2O2 (mM) (15 h) 0,3 1 0,3 1 5 cDNA (µl) 1 1 2 2 2 2 2 2

A

B

Abb. 6 Stimulierung der Expression von Tc-PTP mit H₂O₂ in Lymphocyten und Granulocyten aus Schweineblut. (A) Blut wurde in Ficoll-Paque zentrifugiert; Lymphocyten und Granulocyten wurden 24 h kultiviert (10 % FCS). Danach folgten weitere 15 h Inkubation in Anwesenheit von H₂O₂. Kontrolle - unstimulierte Zellen. Die cDNA-Mengen sind gezeigt. Die Primer waren gegen: α-Aktin (lane a) und Tc-PTP (lanes b-h; Tc-NT-5’ + Tc-CT-3’); a, Marker M.

(B) Densitometrische Analyse zur Abb. 6.

Sequenz der Tc-PTP amplifiziert. In Abb. 7 ist zu erkennen, daß mit dem dN₆ Primer keine spezifische Amplifizierung erfolgte, wogegen beim dT₁₅ als RT-Primer die Amplifizierung der Tc-PTP positiv war (dT₁₅ hybridisiert mit den poly-A⁺ 3’-Enden der ausgereiften Transkripte). Außerdem bestand ein Zusammenhang zwischen der zur Stimulierung der Splenocytenkultur angewendeten H₂O₂ Konzen-tration bzw. Inkubationszeit auf die KonzenKonzen-tration der transkribierten Tc-PTP mRNA. Bereits nach 1,5 h konnte bei der Probe mit 3,8 mM Wasserstoffperoxid (unter Zusatz von 10% FCS) ein Anstieg der Transkripte dieses Enzyms beobachtet werden. In der Kontrolle ohne H₂O₂ war in der Primär-kultur keine Tc-PTP mRNA in Splenocyten nachweisbar. Nach 5,5 h konnte bei den Zellen mit 1,9 mM Wasserstoffperoxid ebenfalls ein deutlicher Anstieg der mRNA aus Tc-PTP in den kultivierten Splenocyten nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse sind ein Hinweis darauf, daß hier Regelmecha-nismen mit potentiell physiologischer Aktivität bei der Regulierung der Enzymexpression vorliegen.

Dies könnte im weiteren Sinne für die Aktivitätskontrolle phosphorylierter Proteine in Tyrosin rele-vant sein.

Für eine genauere Untersuchung über die Regulierung der Genexpression der PTPs Tc- und 1B wurden zuerst die optimalen Bedingungen einer semi-quantitativen Amplifikation mittels RT-PCR untersucht. Da die cDNA- und Primer-Konzentrationen bereits in standardisierter Form vorla-gen (vgl. vorherige Abbildunvorla-gen, in Übereinstimmung mit anderen, hier nicht gezeigten Resultaten), folgte jetzt die Untersuchung darüber, ob verschiedene Primerpaare konsistent und reproduzierbar ein spezielles, definiertes Transkript amplifizieren können. Hierfür wurden 6 Kulturplatten vorbereitet:

Splenocyten auf 5 ml Kulturmedium in einer Dichte von 1,5 x 10⁸ Zellen/Platte, 24 h Inkubation (in Gegenwart von 10 % FCS). Nach der Inkubation wurde drei der Kulturen LPS (20 µg/ml) zugegeben.

Nach weiteren 24 Stunden wurde die Tc-PTP mittels RT-PCR untersucht, wobei drei Primerpaare verwendet wurden, die an verschiedene Bereiche der kompletten Nucleotid-Sequenz des Enzyms angepasst waren. Ein Primerpaar für den N-Terminus (nt 1 – 951 der Human-Tc-PTP), ein weite-res für den CT (nt 162 – 1.248 der Humansequenz-cDNA) und ein drittes Paar für die vollständige Tc-Sequenz (NT – CT; nt 1 – 1.248 in der Leseraster-Sequenz des Human-Transkripts). Die drei Primerpaare wurden mit ähnlichen Hybridisierungstemperaturen gewählt, um mögliche Unterschie-de im Amplifikationsgrad aufgrund Unterschie-der Länge Unterschie-der zu amplifizierenUnterschie-den Transkripte auszuschließen

M a b c d e f g h i j X

dN₆ dT15

8454

1929 1264

A B

Abb. 7 Stimulierung der Expression der Tc-PTP mit H₂O₂ in kultivierten Splenocyten. (A) Die RT-Reaktion wurde mit oligo dN₆ (random Primer, a-e), bzw. oligo dT₁₅ (f-j) durchgeführt. Die Tc-PTP-Primer (jeweils 20 pmol/ml) waren: Tc-NT-5’ + Tc-CT-3’. Kontrolle (unstimulierte Zellen; a, f); 1,9 mM H₂O₂, 1,5 h (b, g);

3,8 mM H₂O₂, 1,5 h (c, h); 1,9 mM, 3,5 h (d, i); 1,9 mM H₂O₂, 5,5 h (e, j). (B) Densitometrische Analyse zur Abb. 7.

bp

(Ausschluß von Artefakten die von der RNA-Zubereitung oder der in vitro-Transkriptionsreaktion herrühren könnten).

Abb. 8 zeigt in den drei Kontrollkulturen nur sehr wenig amplifizierte cDNA der Tc-PTP; (fast nur CT wurde nachgewiesen; Abb. 8; a), wohingegen eine 24-stündige Exposition von 20 µg/ml LPS eine deutliche Zunahme der mRNA-Transkripte erzeugte, wobei außerdem bei den drei verschiede-nen Primern annähernd gleich hohe amplifizierte DNA-Mengen detektiert werden konnten (außerdem noch verschieden lange Segmente, die von der Template cDNA erzeugt wurden). Am NT-Ende wurde eine geringfügig kleinere Menge Tc-PTP festgestellt (Abb. 8; e), was entweder auf einen teilweisen Abbau der mRNA am 5´ -Ende oder auf eine niedrigere in vitro-Transkriptionseffizienz schließen läßt. Mittels RT-PCR können so in semi-quantitativer Form die Schwankungen der Genexpression (bzw. Stabilität und/oder Halbwertszeit reifer Transkripte) der PTPs analysiert werden.