Zukünftige Untersuchungen zur Expression von PTPs

Im Verlauf zukünftiger Untersuchungen wäre es interessant, die hier studierten PTPs, insbe-sondere Tc-PTP und PTP1B, weiter zu erforschen bezüglich ihrer Beteiligung als Modulatoren der Proliferation und Differenzierung von Immunzellen. Die Vernetzung von Signalübertragungswegen in Zellen des Immunsystems erlaubt eine systematische Integration von Möglichkeiten zur Kontrolle der biologischen Aktivität dieser PTPs, sowohl hinsichtlich ihrer Gentranskription, Proteinsynthese und Posttraduktionaler Modifizierungen. Dies würde wesentlich zum Verständnis der biologischen Funktion bei Aktivierung und fate von Subpopulationen von Lymphocyten beitragen.

In den letzten Jahren konnte die Beteiligung verschiedener PTPs an physiopathologischen Pro-zessen experimentell bestätigt werden. Hierzu gehören vor allem Tumorbildung, Stoffwechselerkran-kungen, Anomalien des Immunsystems (z.B., HIV-Infektion), Zellalterung und Apoptose (Ouellet et al., 2003; Meng et al., 2004; Garcia et al., 2005; Lund et al., 2005; Halle et al., 2007; Lou et al., 2008;

Stuible et al., 2008). In einigen dieser Fälle wurde deutlich, daß ein differenzierter Expressionsgrad oder eine Regulierung der Gentranskription von PTPs mit der Ätiologie der vorgenannten Patholo-gien in Beziehung gebracht werden kann. Bereits vorliegende Erkenntnisse zur pharmakologischen Kontrolle von Signaltransduktionswegen weisen auf interessante Perspektiven zur molekulären Be-einflussung (Meng et al., 2002; Mustelin et al., 2005; Tonks, 2003,b; 2006) - sowohl von Trans-kriptionsfaktoren als auch von spezifischen PTPs selbst hin und lassen bedeutende biomedizinische Möglichkeiten in diesem Forschungsbereich erkennen.

Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von sog. Non-Rezeptor Protein-Tyrosin-phosphatasen in Lymphocyten („Splenocyten“) untersucht, welche aus Schweinemilz isoliert wor-den waren und teilweise in primären Kulturen gehalten wurwor-den. Die Analyse der Expression von Transkripten der Protein-Tyrosinphosphatasen der PTP1B/Tc-PTP – Unterfamilie wurde mittels Reverser-Transkriptase-PCR (RT-PCR) und mit Northern-Blotting durchgeführt. Die Änderungen in den Proteinkonzentrationen dieser PTPs in primären Zellkulturen unter unterschiedlichen pharmako-logischen Bedingungen wurden mit Hilfe von Western-Blotting und Immundekoration ermittelt.

Mit Hilfe von RT-PCR – Strategien wurden DNA Sequenzen amplifiziert, die u.a. für verschie-dene PTP des Schweins codierten. Folgende Enzyme wurden hierbei in Vektoren kloniert: Tc-PTP, PTP1B, PTP1C, PTP1D, PKA. Die PTP1C und PTP1D gehören zur Unterfamilie der SH2-PTPs und besitzen SH2-Domänen im NT-Bereich ihrer Sequenz, die Phosphatasen der PTP1B/Tc-PTP–

Unterfamilie weisen einen hydrophoben Bereich im CT auf und sind weitgehend Membrangebunde-ne Enzyme, die an das ER gekoppelt bzw. im Zellkern lokalisiert sind und an die Plasmamembran transloziert werden.

Die Sequenzierung der PTP-Klone ergab eine hohe Identität (~96 % bei PTP1C und ~99 % bei PTP1D) der Aminosäure-Sequenzen der beiden SH2-PTPs des Hausschweins gegenüber den entspre-chenden humanen PTP. Die nichtidentischen AS in den Sequenzen aus Schwein und Mensch sind bei PTP1C und PTP1D gleichmäßig über den gesamten Sequenzbereich verteilt. Die Sequenzen von Tc-PTP von Schwein und Mensch sind zu ca. 92 % identisch, während die Sequenzen der Tc-PTP1B etwas geringere Identitäten von ca. 86 % aufweisen. Dabei sind sich die N-terminal gelegenen katalytische Domänen ähnlicher als die C-terminalen nicht katalytischen Sequenzen. Die Sequenz der PTP1B des Schweins zeigt im Vergleich zur humanen Sequenz eine Deletion von 8 AS in der Prolin-reichen Sequenz des CT, zwischen G₃₇₆ und A₃₈₅ der Human-PTP1B. Weiter, in Richtung CT, liegt bei der PT-P1B vom Schwein eine weitere Pro-reiche Sequenz vor (4 Pro hintereinander, ab P₃₉₂ in der Human-PTP1B), die in der Human-PTP1B nicht vorkommt.

Die Expression der PTP1B und Tc-PTP in kultivierten Splenocyten wurde mit Hilfe von RT-PCR analysiert. LPS erzeugte eine deutliche Erhöhung der mRNA für Tc-PTP nach ca. 6 Stunden, was auf eine erhöhte Gen-Expression und/oder eine erhöhte Stabilität der mRNA zurück zu führen sein könnte. Die Tc-PTP zeigt nach kurzer Zeit (1,5 h) eine Konzentrations-abhängige Erhöhung der mRNA unter H₂O₂-Exposition der Lymphocyten. Verschiedene chemische Behandlungen (Stimulie-rung mit IL-6, IL-4, IFNγ und N-Acetylcystein; NAC) von kultivierten Splenocyten beeinflussten gegenseitig die Expression der Tc-PTP und PTP1B Die Ergebnisse zeigen, daß der Redox-Zustand in Splenocyten eine wichtige Rolle bei der Expressionsregulation der PTP1B und Tc-PTP spielen kön-nen.

Die Genexpression verschiedener PTPs wurde auch in isolierten Lymphocyten aus der Milz untersucht, um eine T-Zell spezifische Antwort nach mitogenen Stimuli zu erhalten. Die Splenocyten wurden durch Zentrifugation in Percoll-Gradienten getrennt in verschiedene Subpopulationen ge-trennt und die Anwesenheit verschiedener PTPs (Tc-, 1B, 1C, 1D, CD45 und R-PTPα) auf Protein-Ebene (Western Blotting) untersucht.

Die Expression der Phosphatasen der PTP1B/Tc-PTP Subfamilie wurde mit Northern-Blots

und konzentrationsabhängige Erhöhung der mRNA nach ConA Behandlung, nicht aber für die PT-P1B. Salicylsäure (SS) und NAC verringerten die Menge der mRNA der Tc-PTP in T-Splenocyten.

Diese Beobachtung weist möglicherweise auf eine Beteiligung des Transkriptionsfaktors NF-κB bei der Signaltransduktion hin, welche die Genexpression der Tc-PTP in T-Zellen kontrolliert. SS konnte jedoch die Zunahme der Expression, die durch ConA induziert worden war, nicht verringern, was wiederum ein Indikator dafür sein könnte, dass ConA in T-Zellen nicht auf Signalwege wirkt, die NF-κB aktivieren. Unter pharmakologischer Beeinflussung der T-Splenocyten zeigte sich für beide Transkripte der PTP1B keine Änderung in der mRNA Menge. Diese Ergebnisse weisen auf eine Vernetzung verschiedener Signalübertragungswege hin, welche die Genexpression der Tc-PTP in T-Zellen Steuern und sie weisen auch darauf hin, dass die beiden Gene für die Phosphatasen der PTP1B/Tc-PTP Unterfamilie getrennt von einander reguliert werden. Die Enzyme dieser Unterfa-milie könnten unterschiedliche Rollen bei der Proliferation der Lymphocyten oder Aktivierung von T-Zellen spielen.

Unterschiedliche Extraktionsbedingungen zur Isolierung verschiedene PTPs aus T -Lymphocy-ten wurden ebenfalls untersucht. Sie soll-Lymphocy-ten Hinweise sowohl über die unterschiedlichen Lokalisie-rungen und Bindungen an subzelluläre Strukturen als auch auf Protein-Protein-Interaktionen liefern.

Mittels nativer Elektrophorese konnte man einen Komplex der PTP1D von 160-170 kDa nachweisen, dessen Zusammensetzung sich nach Exposition mit ConA-stimulierten Lymphocyten änderte.

Änderungen in der Konzentration von Protein Tyrosinphoshatasen wurden in isolierten T-Lymphocyten aus der Milz in Anwesenheit von Ionophoren und Immunsupressoren mit Hilfe von Western-Blotting untersucht. In Milz T-Lymphocyten verursachten Ca²⁺ Ionophore (nach 20 h An-wesenheit von Ionomycin und A23187 im µM-Bereich) eine Abnahme der Tc-PTP und in gerin-gerem Ausmaß der PTP1B und PTP1D, aber ohne klaren Effekt auf die Menge der PTP1C und der Rezeptor-Tyrosinphosphatase CD45. Die Immunsupressoren Cyclosporin A, FK-506 und Rapamy-cin (Konzentrationen im µM-Bereich) induzierten eine Zunahme der Tc-PTP in T-Splenocyten, die durch beide Ionophore gehemmt wurde. Die PTPs CD45 und PTP1C zeigten keine Änderungen der Protein-Konzentration in T-Lymphocyten nach Behandlung mit Immunsupressoren oder Ionophoren.

Die Ergebnisse könnten auf einen “cross-talk” verschiedener Signalübertragungswege hinweisen, weil der aktivierende-Effekt von Immunsupressoren auf die Tc-PTP Expression durch Ionophoren gehemmt wurde. Die aktivierende Wirkung von Immunsupressoren auf die Konzentrationen von Tc-PTP in T-Lymphocyten könnte eine weitere Erklärungsmöglichkeit ihrer Wirkung über die festge-stellte hemmende Wirkung von Tc-PTP auf die Aktivierung von T-Zellen eröffnen.

ANHANG

Vergleichende Analyse zwischen Human- und Schweine- Sequenzen Abbildungen Anhang -1 bis -13

PTP-Sequenzen vom Schwein:

Tc-PTP, PTP1B, PTP1C, PTP1D; zum Vergleich, PKA vom Schwein

Abb. Anhang-1)

DNA des „sense“-Strangs für die in der vorliegenden Arbeit klonierte Tc-PTP_ER des Haus-schweins (NCBI-Accession: EU753191); Vergleichsanalyse mit dem entsprechenden Human-En-zym. Die identischen Nukleotide sind als Punkt gekennzeichnet; zur Hervorhebung der Nukleoti-dunterschiede erfolgte eine farbige Hinterlegung. Die in Großbuchstaben gesetzten Sequenzen im Human-Strang entsprechen den Primer-Basen, welche für die Amplifizierung der cDNA verwendet wurden (s. Kap. 2.5.8). Die „gaps“ in der DNA sind mit einer horizontalen Linie gekennzeichnet. Die Human-Sequenz stammt aus der NCBI-Genbank (Accession-Code: M25393.1).

Abb. Anhang-2)

Gezeigt ist die DNA („sense“-Strangs) für die in der vorliegenden Arbeit gewonnene PTP1B des Hausschweins (NCBI-Accession: EU753192) sowie eine Vergleichsanalyse des entsprechenden Human-Enzyms. Die identischen Nukleotide sind als Punkt gekennzeichnet; zur Hervorhebung der Nukleotidunterschiede erfolgte eine farbige Hinterlegung. Die in Großbuchstaben gesetzten Sequen-zen im Human-Strang entsprechen den Primer-Basen, welche für die Amplifizierung der cDNA ver-wendet wurden (s. Kap. 2.5.8). Die „gaps“ in der DNA sind mit einer horizontalen Linie gekenn-zeichnet. Die Human-PTP1B stammt aus der NCBI-Genbank (Accession-Code: M33689.1).

Abb. Anhang-3)

DNA-Sequenz für die in der vorliegenden Arbeit klonierte PTP1C des Hausschweins (NCBI-Accession: EU753189); Vergleichsanalyse mit Human-PTP1C. Die identischen Nukleotide sind als Punkt gekennzeichnet; die in Großbuchstaben gesetzten Sequenzen im Human-Strang entsprechen den Primer-Basen, welche für die Amplifizierung der cDNA verwendet wurden (s. Kap. 2.5.8). Das Stop-Codon auf der Human-DNA ist ebenfalls in Großbuchstaben dargestellt. Die Human-Sequenz stammt aus der NCBI-Genbank (Accession-Code: M77273.1).

Abb. Anhang-4)

DNA-Sequenz für die in der vorliegenden Arbeit klonierte PTP1D des Hausschweins (NCBI-Accession: EU753190); Vergleichsanalyse mit PTP1D des Menschen. Die identischen Nukleotide sind als Punkt gekennzeichnet; die in Großbuchstaben gesetzten Sequenzen im Human-Strang ent-sprechen den Primer-Basen, welche für die Amplifizierung der cDNA verwendet wurden (s. Kap.

2.5.8). Die Human-Sequenz stammt aus der NCBI-Genbank (Accession-Code: X70766.1).

Abb. Anhang-5)

DNA-Sequenz für die in der vorliegenden Arbeit klonierte PKA (katalytische Untereinheit) des Hausschweins (NCBI-Accession: EU753188); Vergleichsanalyse mit Human-cAMP-Proteinkinase A. Die identischen Nukleotide sind als Punkt gekennzeichnet; die in Großbuchstaben gesetzten Se-quenzen im Human-Strang entsprechen den Primer-Basen, welche für die Amplifizierung der cDNA verwendet wurden (s. Kap. 2.5.8). Die Human-Sequenz stammt aus der NCBI-Genbank (Accession-Code: X07767.1).

Abb. Anhang-6)

Aminosäuresequenz der in dieser Arbeit erhaltenen Tc-PTP (ER-Form, „Pig-1“) des Haus-schweins (NCBI-Accession: ACE79218). Gezeigt ist eine Vergleichsanalyse mit dem Human-Enzym (NCBI-GenBank; s. Abb. Anhang-1). „Pig-2“ entspricht der nukleären splicing-Variante des Enzyms (vgl. Lorenzen et al., 1995), Tc-PTP_Nuc kloniert aus Schwein durch (Jorgensen et al., 2005; Accession:

AY610205.1). Die identischen Reste sind mit einem Punkt gekennzeichnet. Die farbige Darstellung der AS erfolgt entsprechend dem chemischen Charakter:

Schwarz- Apolar Grün - Neutralpolar Rot - Säurepolar Blau - Basischpolar

Die Unterschiede zwischen den Aminosäuren sind farbig hervorgehoben (Gelb). Die AS auf der Humansequenz, die zu Primersequenzen gehören, sind in Kleinbuchstaben gesetzt.

Abb. Anhang-7)

Vergleichende Analyse der AS-Sequenzen von Human-PTP1B und dem Enzym des Haus-schweins. Pig-1 entspricht der PTP1B, die im Verlauf der vorliegenden Arbeit kloniert wurde (NCBI-Accession: ACE79219); Pig-2 entspricht der PTP1B aus Schwein, die von (Sherwood et al., 2004;

NCBI-GenBank Accession: AAQ04720.1) kloniert wurde. Die identischen Reste sind mit einem Punkt gekennzeichnet; die Unterschiede zwischen den Aminosäuren sind farbig hervorgehoben (Gelb). Die den Primern entsprechenden AS-Sequenzen sind bei der Human-Sequenz in Kleinbuch-staben gesetzt.

Abb. Anhang-8)

Vergleichende Analyse der AS-Sequenzen von Human-PTP1C und PTP1C des Hausschweins, die im Verlauf der vorliegenden Arbeit kloniert wurde (NCBI-Accession: ACE79216). Die identi-schen Reste sind mit einem Punkt gekennzeichnet; die Unterschiede zwiidenti-schen den Aminosäuren sind farbig hervorgehoben (Gelb). Die den Primern entsprechenden AS-Sequenzen sind bei der Human-Sequenz in Kleinbuchstaben gesetzt. Man kann erkennen, daß bei etwa der Hälfte der AS-Änderun-gen der chemische Charakter des modifizierten Restes erhalten bleibt (Buchstaben gleicher Farbe).

Abb. Anhang-9)

Vergleichende Analyse der AS-Sequenzen von Human-PTP1D und dem Enzym des Haus-schweins, die im Verlauf der vorliegenden Arbeit kloniert wurde (NCBI-Accession: ACE79217). Die identischen Reste sind mit einem Punkt gekennzeichnet; die Unterschiede zwischen den Aminosäu-ren sind farbig hervorgehoben (Gelb). Die den Primern entsprechenden AS-Sequenzen sind bei der Human-Sequenz in Kleinbuchstaben gesetzt.

Abb. Anhang-10)

Vergleichende Analyse der AS-Sequenzen von Human-PKA (katalytische Untereinheit) und der PKA des Hausschweins, die im Verlauf der vorliegenden Arbeit kloniert wurde (NCBI-Accession:

ACE79215). Die identischen Reste sind mit einem Punkt gekennzeichnet; die Unterschiede zwischen den Aminosäuren sind farbig hervorgehoben (Gelb). Die den Primern entsprechenden AS-Sequenzen sind bei der Human-Sequenz in Kleinbuchstaben gesetzt.

Abb. Anhang-11)

DNA-Sequenzvergleich von in dieser Arbeit erhaltener Tc-PTP (ER-Form, „Pig-1“) des Haus-schweins (NCBI-Accession: EU753191) mit der nukleären splicing-Variante des Enzyms („Pig-2“), kloniert aus Schwein von (Jorgensen et al., 2005; Accession: AY610205.1). Die identischen Reste sind mit einem Punkt gekennzeichnet. Die Nukleotidunterschiede sind farbig hervorgehoben. Man kan erkennen, daß eine vollständige Übereinstimmung aller Basen vorliegt und nur die Splicing-Stellen Abweichungen zeigen (AS 2 – 4 im NT und ab Arg₃₈₁ am CT auf der Human- Tc-PTP).

Abb. Anhang-12)

Vergleichende Analyse der DNA-Sequenzen von PTP1B des Hausschweins. Pig-1 entspricht der PTP1B, die im Verlauf der vorliegenden Arbeit kloniert wurde (NCBI-Accession: EU753192);

Pig-2 entspricht der PTP1B aus Schwein, die von (Sherwood et al., 2004; NCBI-GenBank Accession:

AF455037.1) kloniert wurde. Die identischen Basen sind mit einem Punkt gekennzeichnet; die Nuk-leotidunterschiede sind farbig hervorgehoben.

Abb. Anhang-13)

Vergleichende Analyse der AS-Sequenzen von den 4 hier klonierten PTPs vom Schwein: Tc-PTP, PTP1B, PTP1C und PTP1D (entsprechende NCBI-Accession: ACE79218; ACE79219; ACE79216;

ACE79217). Die identischen Reste sind mit einem Punkt gekennzeichnet; die Aminosäuren-Unter-schiede sind farbig hervorgehoben (Gelb). Die den Primern entsprechenden AS-Sequenzen sind in Kleinbuchstaben gesetzt. PTP-Signaturmotiv ist die Sequenz [I/V]HCSxGxGR[T/S]G (Reste 213-223 in der Human-PTP1B); die konservierte DYINA-Sequenz ist ebenfalls erkennbar (Andersen et al., 2004).

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Werner Hofer für die Möglichkeit, in seinem Labor zu forschen, für die interessanten Aufgabenstellungen und seine stetige Hilfsbereitschaft – nicht nur in akademischen Fragen.

Ich danke dem Deutschen akademischen Austauschdienst für die Finanzierung des Studienauf-enthaltes, der auch für meine Frau und unsere Tochter eine erlebnisreiche Zeit in Konstanz bedeutete und durch den diese Dissertation erst möglich wurde. Unter all den freundlichen und hilfsbereiten Mitarbeitern möchte ich besonders Frau Maria Hartmann für ihre Betreuung danken.

Meinem Arbeitgeber in Chile, der Universidad de Los Lagos, insbesondere dem Fachbereich Aquakultur, danke ich für die Förderung, sowie die Unterstützung während meiner Reisen nach Deutschland.

Petra Zoll danke ich ganz besonders für ihre Geduld bei meiner nicht immer ganz einfachen Einarbeitung in die Methoden experimentellen Arbeitens, und für ihre immer gute Stimmung.

Der Arbeitsgruppe Hofer danke ich für die freundliche aufnahme im Team, das angenehme und freundschaftliche Arbeitsklima und die unschätzbare Hilfe bei den Experimenten. Ganz besonderen Dank an André Voges, Alexandra Porsche und Raffaella Willmann.

Herrn Jose Luis Medina danke ich für seine wertvolle Hilfe im Bereich der Analythischen Me-thoden in der Molekularbiologie.

Herrn Mathias Rée danke ich für redaktionelle Betreuung und Lektorat sowie die Erledigung der DTP-Arbeiten.

Während ich an dieser Dissertation arbeitete, verstarb unsere langjährige Freundin und hochge-schätzte Kollegin, María Victoria Vial, die auch während der Jahre meines Aufenthaltes in Deutsch-land meine Stelle vertrat.

Schlußendlich - und an erster Stelle- danke ich Jesus Christus, durch den wir das Leben erhal-ten, für seine Gegenwart in jedem Augenblick.

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