1. Einleitung
1.7. Einführende Zusammenfassung und Ziel der Arbeit
Die PTPs 1B und Tc- sind strukturell eng miteinander verwandte Enzyme, die einen hohen Grad an Homologie in ihren katalytischen Domänen aufweisen. Ihre biologischen Funktionen und die Regulationsmechanismen ihrer Aktivität und Substratspezifität scheinen aber verschieden zu sein. Beide PTPs sind in unterschiedlichen Signalwegen aktiv und werden durch unterschiedliche Mechanismen kontrolliert. Beide PTPs werden physiologisch durch Prozesse wie Phosphorylie-rung, funktionale Proteolyse, alternatives Splicing, differentielle subzelluläre LokalisiePhosphorylie-rung, Oxi-dation von katalytischen Aminosäuren und molekulare Assoziationen mit (u.a.) Regulationsprote-inen, kontrolliert (Porsche, 2001; Mustelin et al., 2005; Tonks, 2006). Trotzdem gibt es noch keine ins Detail gehenden Kenntnisse bezüglich ihrer Regulierung der Genexpression im Immunsystem (weder auf Transkriptionsebene noch auf Protein-Ebene). Weitergehende Untersuchungen in die-ser Richtung sollten ein vertieftes Verständnis bezüglich der Regulationsmechanismen vermitteln, welche in Zellen des Immunsystems ablaufen.
In der vorliegenden Arbeit wurden auf experimentellem Wege die Genexpression der PTPs Tc- und 1B in Lymphocyten untersucht, die aus der Milz des Hausschweins gewonnen wurden. Es sollte ermittelt werden, ob und wie diese beiden strukturell homologen Enzyme auf mitogene Reize
sion durch biochemische Stimulation oder pharmakologische Behandlung kontrollierbar ist. Die Studien verstehen sich als Beitrag zum Verständnis der Kontroll-Mechanismen der Genexpression von cytoplasmatische (Non-Rezeptor) PTPs in Signal-Vorgängen während der Aktivierung von Lymphocyten.
2. Material und Methoden 2.1. Chemikalien
Bezugsquellen der verwendeten Chemikalien:
• Amersham/Pharmacia Biotech; Ficoll-Paque, Percoll
• Biomol; IL-4
• BioRad; Coomassie Lösung für Protein Quantifizierung (nach der Bradford Methode)
• Boehringer Mannheim/Roche Molecular Biochemicals; Enzyme für die Molekularbiologie, Restrik-tionsenzyme, RTAMV , Taq DNA-Polymerase, Expand High Fidelity Taq DNA-Polymerase, Anti-biotoka.
• Calbiochem; organische Chemikalien
• Difco-Laboratories; Medien und Substrate für Mikrobiologische Methoden
• Gibco; DNA und Protein Standards, Taq Pol., RT.
• MBI-Frementas; RE, Taq DNA-Pol., DNA Standards.
• Merck; Salzen, Puffern, DMSO, DMF, Detergenzien.
• MWG-Biotech; Synthese von Oligonukleotide (für RT, PCR und DNA-Sequenzierungen)
• Oncogene Research Products; Monoklonal Antikörper (Maus AK α – Tc-PTP)
• Qiagen; Kits für DNA bzw. RNA Isolierung
• Riedel-de Haën; Salzen, Puffern, Isoamylalkohol.
• Roth; Phenol/Chloroform, Aqua Roti-Phenol, PAA-Harnstoff für DNA Gel-Elektrophorese, Kits für RNA-Präps.
• Seromed; RPMI 1640.
• Serva; Coomassie Blue G-250, Ponceau Rot, SDS.
• Sigma Chem. Co.; Detergenzien, organische Puffern, Ponceau Rot, Sekundäre Antikörper
• Transduction Laboratories; Monoklonal Antikörper (Maus AK α - PTPs: 1B, 1C, 1D, CD45, R-PTPα).
Alle Salze und die biochemischen Reagenzien im Reinheitsgrad p. a.
Das Wasser für die Versuche wurde mit einer „Milli-Q“ Reinstwasseranlage der Fa. Millipore („Ul-trapure Water Purification Systems” für Biochemische Zwecke; Reinheitsqualität 18,2 MΩ/cm Widerstand, mit UV254 - Bestrahlung) aufbereitet.
2.2. Geräte
• Analysenwaagen, Mettler
• Autoklav
• Biofuge Heraeus „pico“ (13.000 rpm)
• Cleanbench
• CO2-Brutschrank, Heraeus
• Elektroporationsgerät, BioRad
• Gewebe-Homogenisator, Polytron
• Hybridisierungsofen, Bachofer
• Kühlzentrifuge Eppendorf 5403, Tischmodell (14.500 rpm)
• Kühlzentrifuge Heraeus, mit Winkelrotor (10.000 rpm)
• Kühlzentrifugen, Sorvall RC-5 und RC2-B (18.500 rpm; Rotoren SS-34, SA-600, GSA)
• Mikrobiologische Brutschränke
• Milli- Q-Wasseranlage, Millipore
• pH-Meter, Knick
• Sonifier, Cell Disruptor B 15, Branson
• Spektrophotometer, Uvikon 810, Kontron
• Thermozykler, Biometra Trio
• Zentrifuge Eppendorf, Tischmodell (13.000 rpm)
Konstantstromquellen, Gelelektrophoresekammern, Transferkammern für Proteine/ Nukleinsäuren, u.a., sind Eigenbau der Uni Konstanz.
2.3. Grundsätzliche Methoden zur Sterilisierung von Materialien und Lösungen - Glasgeräte und Gefäße wurde über Nacht bei 180 °C, sterilisiert.
- Kunststoffe und Lösungen: Autoklav, 121 °C, 40 min (bzw. 20 min, bei empfindlichen Sub-stanzen/Lösungen).
- Temperaturempfindliche Lösungen: Sterilfiltrierung mit Einmalfiltern (Advantec, Schleicher
& Schuell, Millipore), 0,2 µm Porengröße.
Alle Mikrobiologischen und Molekularbiologische Methoden wurden nach den Standard Richt-linien zur Molekularbiologie durchgeführt (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1996).
2.4. Mikrobiologische Verfahren 2.4.1. Medien zur Bakterienkultur
Es wurde flüssiges LB-Kulturmedium wie folgt angesetzt:
Medium LB (Ansatz in Milli-Q Wasser):
- 5 g/l NaCl - 5 g/l Hefeextrakt - 10 g/l Bacto-Trypton Ansatz +/- Ampicillin (Endkonzentration):
- 100 µg/ml
Für die Vorbereitung von Agar-Platten wurden dem flüssigen Kulturmedium 18 g/l Bacto-Agar zugesetzt. Alle mikrobiologischen Medien wurden autoklaviert (40 min, 121 °C). Antibiotika (steril-filtriert) wurde zugesetzt, sobald die Flüssigkeit beim Abkühlen 50 °C unterschritt.
LB-Amp Agar-Platten, die für das weiß-blau-Screening von rekombinanten pBl Plasmiden in E. coli einen Zusatz von X-Gal benötigten, wurden zusätzlich mit der folgenden Lösung behandelt:
- 40 µl X-Gal (Stammlösung 20 mg/ml) - 4 µl IPTG (Stammlösung 1 M) mit Wasser auf 100 µl aufgefüllt
Diese wurde homogen auf der Oberfläche verteilt und die Platte sofort verwendet. Flüssige Kulturmedien und LB-Agar-Platten wurden bei 4 °C bis zu ihrer Verwendung gelagert.
2.4.2. Lagerung von E. coli und Kulturbedingungen
Die Kultur von E. coli erfolgte bei 37 °C, üN, in einem Brutschrank, auf LB-Agar (+/- Amp), oder in flüssigem LB-Medium auf einem Schüttler (120 rpm).
Isolierte Kulturen von E. coli auf LB-Amp wurden für einige Wochen bei 4 °C gelagert. Sollten sie länger aufbewahrt werden, wurden die Bakterien in LB-Medium üN bei 37 °C inkubiert, nach Zusatz von 10 % DMSO (v/v) in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann bei -80 °C gelagert.
2.4.3. Herstellung von chemokompetenten Bakterien aus E. coli a) Herstellung chemokompetenter Bakterien
Für die Herstellung von chemokompetenten Bakterien aus E. coli (Stamm TG 1) wurden Zellen verwendet, die in DMSO bei –80°C in Tiefkühlröhrchen aufbewahrt waren. Diese gekühlten Kry-oröhrchen wurden in flüssigen Stickstoff gelegt und ins Labor überstellt; mit einem Spatel wurden die Bakterien auf festes LB-Medium, Antibiotika-frei, übertragen. Dies geschah durch Abschaben gefrorener Bakterien von den Kryoröhrchen, ohne die Zellen anzutauen. Die Röhrchen wurden dann sofort wieder in flüssigen Stickstoff zurückgelegt und zurück in die Tiefkühltruhe gebracht. Die so erhaltenen Bakterien wurden dann auf festem Kulturmedium bei 37 °C üN inkubiert.
Um aus den so vermehrten Bakterien chemokompetente E. coli zu erhalten, wurden die Bak-terien, je nach gewünschter Menge, in Batches von 50 - 100 ml flüssigem LB-Medium während 4-5 Stunden bei 30 °C weiterkultiviert, bis eine Absorption von 0,5 - 0,6 (600 nm) erreicht war. Die Bak-terien wurden 10 min in Eis gekühlt und dann zentrifugiert (3.000 g, 10 min, 4 °C), und 1:100 in steril filtriertem Puffer resuspendiert (20-30 ml):
- 10 mM Pipes (pH 6,7) - 50 mM CaCl2
- 250 mM KCl - 55 mM MnCl2
Die resuspendierten Zellen wurden wiederum für 20 min in Eis gekühlt, dann neuerlich zentri-fugiert und 1:10 im gleichen Puffer resuspendiert (2-3 ml) + 7 % DMSO (Endkonzentration). Sofort nach der Resuspension wurden die Bakterien in Aliquots von 50 µl in Kryoröhrchen verteilt und in flüssigem Stickstoff abgekühlt, um sie dann bei -80 °C aufzubewahren.
b) Herstellung von elektrokompetenten Bakterien
Es wurden 50 - 100 ml flüssiges LB-Kulturmedium zubereitet und mit einer Kolonie eines üN in festem Medium inkubierten E. coli- Stammes TG 1 inokuliert.
Die Kultur wurde während 2-3 Stunden bei 37 °C und in leichter Horizontalbewegung gehalten.
Danach wurden die Bakterien bei 3.000 g / 4 °C während 10 min auszentrifugiert. Die erhaltenen Bakterienpellets wurden 3 mal mit jeweils 60 ml, 30 ml und 3 ml kaltem Milli-Q Wasser (steril) gewaschen. Danach wurden die Bakterien ein letztes Mal zentrifugiert; danach wurde das Pellet mit kompetenten Bakterien in 10%iger wässriger Lösung von Glycerol (steril) resuspendiert. Die Bak-teriensuspension wurde in Portionen zu 50 µl in Kryo-Röhrchen aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann bei -80 °C eingelagert.
2.4.4. Transformation kompetenter Bakterien
Für die Transformation kompetenter E. coli- Stämme wurden zwei experimentelle Methoden angewendet:
a) Transformation mittels Thermoschock b) Transformation mittels Elektroporation
a) Für die Transformation der Bakterien mittels Thermoschock wurde entsprechend dem durch Inoue et al. (1990) beschriebenen Protokoll vorgegangen. 50 µl chemokompetente Bakterien, un-mittelbar nach ihrem Auftauen aus -80 °C in Eis, und variable Mengen von bakteriellen Plasmiden (1 µl als "Mini-Präp" und 2 µl als Ligationsansatz) wurden gemischt. Die erhaltenen Suspensionen wurden 30 min auf Eis inkubiert und dann einem "Hitzeschock" von 42 - 43 °C während 30 Sekunden unterzogen. Sofort darauf wurde das Eppendorf-Röhrchen wieder auf Eis gebracht, 1 ml flüssiges LB-Medium zugegeben und eine Stunde lang bei 37 °C inkubiert (bis eine phänotypische Ampicillin-Resistenz auftritt), um dann in LB-Festmedium auf selektiven Platten kultiviert zu werden.
b) 50 µl chemokompetente E. coli (TG 1), wurden unmittelbar nach dem Auftauen aus -80 °C in Eis, mit 0,5-1 µl Plasmid- Präparation (Ligationsansatz) gemischt und weiter auf Eis zum Elektro-porationsgerät gebracht (BioRad), wo die Mischung in neue, sterile Elektroporationsküvetten über-tragen wurde. Die Elektroporation wurde wie folgt programmiert:
- Kapazitäts Extender 125 µFa - Widerstand 200 Ω
- Kapazität 25 µFa
- Spannung 2,5 kV
Nach dem Einbringen der Küvetten in den Probenraum und Auslösung des Entladungspulses wurde sofort 1 ml flüssiges LB-Medium zugegeben, 1 Stunde bei 37 °C inkubiert, dann auf LB-Amp-Platten ausplattiert und üN bei 37 °C kultiviert.
2.4.5. Bakterienwachstum in selektivem Medium
Für das Wachsen der Bakterien in isolierten Kolonien oder in flüssigem Medium wurden E.
coli manuell in Medium geimpft, in Gegenwart von 100 µg/ml Ampicillin (LB-Amp) im Falle von Flüssigmedium bzw. auf bakteriologischen Agar in sterilen Petrischalen. Die Kultur erfolgte bei 37
°C üN, bei Flüssigkulturen auf dem Horizontalschüttler. Die in festem Medium kultivierten E. coli wurden dann in 1 bzw. 5 ml LB-Amp gegeben um anschließend Plasmid-DNA (pBl) herzustellen, durch “Mini-Präps” (oder “Maxi-Präps).
2.5. Molekularbiologische Methoden
2.5.1. Beschreibung des Plasmids pBluescript
In dieser Arbeit wurde als Klonierungsvektor das Plasmid pBluescript II (pBl-SK(+), Stratage-ne, Heidelberg) benutzt. Dieser Vektor besitzt 2.961 Basenpaare und hat zwei Orientierungen seines
“multi-cloning site” (MCS), SK und KS, innerhalb des Gens lacZ, welches das N-terminale Fragment des β-Galactosidase-Enzyms codiert.
SK repräsentiert die MCS-Orientierung an der die Transkription des lacZ-Gens von SacI in Richtung KpnI erfolgt, während von pBl-KS die Transkription umgekehrt von KpnI in Richtung SacI verläuft.
Die Symbole (+) und (-) in pBl zeigen die Orientierung der intergenen Region f1 des Phagen
(“IG”), der (bei cis) die erforderlichen Sequenzen für Anfang und Ende der Phagen-DNA-Synthese (f1) enthält.
pBl II enthält:
a) f1 (IG)
b) rep (pMB1), “Replikon” - Für die Replikation des Vektors erforderlich.
Die Replikation beginnt bei Position 1.213.
c) bla (ApR), dieses Gen kodiert β-Lactamase, wodurch Ampicillin-Resistenz erzeugt wird.
d) lacZ, äußerstes 5’-terminal des Gens lacZ; kodiert das N-terminale Fragment des Enzyms β-Galactosidase. Dieses Fragment ermöglicht ein Weiß-Blau-Screening von E.
coli Kolonien, die den rekombinanten Vektor tragen.
e) MCS (“Multi-Cloning-Site”), mit einmalig vorkommenden Restriktions-Sequenzen.
f) T3; T7, diese Regionen begrenzen den MCS an beiden Seiten und promovieren die Transkription T3 und T7.
Dieser Vektor diente zum Klonieren und für die Amplifizierung von rekombinanten DNA-Sequenzen, die aus Genen vom Schwein stammten (DNA-Sequenzierung nach der Sanger-Metho-de, unter Verwendung von Didesoxy-NTPs) und für die in vitro-Transkription für die Synthese von RNA-DIG markierten Sonden.
2.5.2. Vorbereitung von Plasmiden (“Mini-Präp.”)
Die Plasmidpräparation aus E. coli wurde in der Regel wie bei Birnboim & Doly (1979) be-schrieben, durchgeführt. Hierbei werden die Bakterien einer alkalischen Lyse unterzogen, danach wird die DNA mit Phenol/Chloroform extrahiert und in Alkohol ausgefällt.
Im Einzelnen wurde folgendermaßen vorgegangen: Für individuelle Übernachtkulturen wurden jeweils ca. 2,5 ml Kulturmedium flüssig von Agar-Kulturen aus beimpft; am nächsten Tag wurden die vermehrten Bakterien in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen bei maximaler Drehzal abzentrifugiert (Heraeus Biofuge, 13.000 rpm, Rt).
Der Überstand wurde verworfen und das Bakterienpellet in 200 µl eiskalter Lösung I resus-pendiert. 400 µl der frisch zubereiteten Lösung II wurden zugegeben und durch 2-3-maliges Umdre-hen des RöhrcUmdre-hens gemischt. Nach 5 min Inkubation aus Eis wurde mit 300 µl eiskalter Lösung III neutralisiert, durch vorsichtiges mehrmaliges Umdrehen der Röhrchen homogenisiert und wiederum 5 min auf Eis inkubiert. Dann wurde 5 min lang zentrifugiert. Das sedimentierte Pellet enhielt Zell-reste, chromosomale Bakterien-DNA und Proteine. Der Überstand mit plasmidaler DNA (und RNA) wurde entnommen und in ein neues Eppendorf-Röhrchen gegeben. Nach Zugabe von 10 µl RNAse A wurde zur Hydrolyse der bakteriellen RNA 30 min bei 37 °C inkubiert. Dann wurden 700 µl Phenol/
Chloroform beigefügt und geschüttelt. Diese Mischung wurde 5 min zentrifugiert. Der so gewonnene wässrige Überstand wurde mit 700 µl Chloroform/Isoamylalkohol versetzt und gut geschüttelt. Wie-der wurde 5 min zentrifugiert, Wie-der Überstand abgenommen und 75 µl 10 M Ammoniumacetat (10 x) sowie 800 µl Ethanol (99 %) zugefügt. Die Plasmid-DNA wurde während 30 min bei –20 °C ausge-fällt, danach wurde in der Biofuge bei Höchstdrehzahl zentrifugiert. Das Pellet wurde in 700 µl 80
% Ethanol gewaschen, abzentrifugiert und das Ethanol abgesaugt. Das Pellet mit der konzentrierten Plasmiden DNA wurde kurz im Vakuum getrocknet (Wasserfalle /Exsikkator). Nach der Resuspensi-on in 10-20 µl sterilem Wasser wurde die DNA bei 260 nm im AbsorptiResuspensi-onsspektrophotometer
quanti-tativ bestimmt und sodann sofort für Versuche weiterverwendet oder aber bei -20 °C eingefroren.
Lösung I
- 25 mM Tris-HCl (pH 8,0) - 50 mM Glucose
- 10 mM EDTA Lösung II (Frisch)
- 0,2 ml 6 M NaOH - 0,6 ml 10 % SDS - 5,2 ml H2O Lösung III
- 3 M Kaliumacetat - 11,5 % (v/v) Essigsäure
RNAse A: wurde in Wasser angesetzt (20 mg/ml) und die Lösung im Wasserbad erhitzt (100 °C, 15 min). Danach wurden auf Eis Aliquots von 100 µl fraktioniert und bei –20 °C eingefroren.
Phenol/Chloroform: Die Lösung wurde durch Zugabe von 0,1 % 8-Hydroxychinolin zum Phe-nol, und anschließendes Zusammenmischen von Phenol und Chloroform/Isoamylalkohol, im Ver-hältnis 25:24:1 hergestellt.
2.5.3. Restriktionsverdau
Die in dieser Studie verwendeten Restriktionsenzyme stammten von MBI-Fermentas und Boe-hringer Mannheim/Roche. Diese Enzyme werden mit ihren entsprechenden Puffern Zeit-Temperatur-Protokollen zur Hydrolyse der jeweiligen DNA geliefert. Bei PCR-amplifizierten DNA-Fragmenten die mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten werden sollten, wurden diese Schnitte mit dem jeweils zu verwendendem Enzym nacheinander durchgeführt. Zwischen den Schnitten wur-de mit Phenol/Chloroform extrahiert und in Ethanol ausgefällt.
Typischer Ansatz der Reaktionslösung für Restriktionsschnitte (10 – 20 µl):
- 1 – 2 µl Puffer (10 x)
- 1 – 5 µl DNA (PCR-Produkt bzw. Plasmid) - 0,5 – 2 µl RE
- BSA (Optional: für einige RE der Fa. MBI-Fermentas) - H2O (Endvolumen 10 – 20 µl)
Die meisten dieser Reaktionsmischungen wurden bei 37 °C zwischen 30 und 300 min inku-biert. Nach Ablauf der Zeit wurde die Effektivität der Schnitte mittels Agarose-Ethydiumbromid-Gelen ermittelt. Schließlich wurden die geschnittenen DNA-Segmente zur weiteren Verwendung mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Alkohol ausgefällt, z.B. um eine Ligation mit T4 DNA-Ligase zu erreichen.
2.5.4. Ligation von mit Restriktionsenzymen geschnittenen DNAs
Segmente aus dsDNA, die mit Restriktionsenzymen geschnitten worden waren (Vektoren, PCR-Produkte), wurden in die folgende Reaktionsmischung gegeben (Volumen 10 µl):
- 1 µl Ligasepuffer (10 x) - 1 µl PEG-4000 (50 %) - 1 – 2 µl Plasmid
- 2 – 5 µl PCR-Produkt - 1 – 5 µl H2O
- 1 µl T4 DNA-Ligase (1 U)
Die zur Ligation bestimmte DNA wurde in der Reaktionslösung einige Stunden bei Rt inkubiert und anschließend in Aliquots von 0,5 – 3 µl zur Darstellung von kompetenten E. coli aufgeteilt; nicht verwendete DNA wurde bei -20 °C eingefroren für den Fall, daß die Ligation wiederholt werden mußte.
Für Ligationen, nach der „blunt end“ Methode wurde der Vektor dephosphoryliert, um eine Religation zu vermeiden. Die Dephosphorylierung wurde mit CIAP Alkalische Phosphatase im fol-genden Ansatz durchgeführt:
- 25 µl pBl-Verdau - 19 µl H2O - 5 µl CIAP-Puffer - 1 µl CIAP
Der Ansatz wurde 1 h bei 37 °C inkubiert, danach wurde die DNA mit Ammoniumacetat/Etha-nol präzipitiert und in Wasser resuspendiert.
2.5.5. RNA-Extraktion DEPC-Wasser Lösung:
Für die Vorbereitung von H2ODEPC wurde 1 l Milli-Q Wasser plus 0,1 % (v/v) DEPC üN unter dem Abzug gerührt. Danach wurde die Lösung 45 min autoklaviert (121 °C), um das DEPC zu inak-tivieren.
Gesamt-RNA-Präparation:
Die RNA wurde entsprechend dem Protokoll von Chomczynski & Sacchi (1987) präpariert.
Die verwendeten Lösungen für die Extraktion und Reinigung der Gesamt-RNA wurden im Labor hergestellt; ebenfalls wurden kommerzielle Kits zur Isolierung der Gesamt-RNA (Roth, Qiagen) ein-gesetzt. Für die Reinigung der RNA wurden die folgenden biologischen Gewebe bzw. Zellen verwen-det:
- In flüssigem Stickstoff eingefrorenes Gewebe (Schweinemilz)
- Aus der Schweinemilz isolierte Lymphocyten, mit und ohne Vorkultur (Splenocyten) - Periphere Lymphocyten, die durch Zentrifugieren in Ficoll-Paque gewonnen wurden.
Von diesem Ausgangsmaterial wurden zwischen 10 und 100 mg entnommen und in Proben-röhrchen aus Polypropylen (13 ml, Sarstedt, Phenol- und Chloroformresistent); Zellen wurden in Sarstedt-Röhrchen abzentrifugiert, sodann auf Eis in RNA-Extraktionslösung (1-2 ml, je nach Menge des verwendeten Zellmaterials) mit einem Polytron Homogenisator in folgendem Puffer homogeni-siert:
RNA-Extraktionspuffer (pH 7,0):
- 4 M Guanidinium Isothiocyanate - 0,5 % Sarkosyl
- 0,1 M β-ME
- 25 mM Natriumcitrat
Die RNA aus dem so homogenisierten Material wurde in 3 Zyklen zu je 30 Sekunden Homo-genisierung mit 30 Sekunden Pause extrahiert. Die Proben wurden hierbei die ganze Zeit über im Eis belassen. Je 1 ml Extraktionslösung und je 100 mg biologisches Material wurden der Extraktionslö-sung hinzugefügt:
- 0,1 ml NaAc 2 M (pH 4,0)
- 1 ml Wassergesättigtes saures Phenol (Aqua-Roti-Phenol, Roth) - 0,2 ml Chloroform/Isoamylalkohol (49:1)
Es wurde 15 min auf Eis inkubiert und dann bei 20.000 g 20 min bei 4°C zentrifugiert (Rotor SS-34). Der wässrige Überstand wurde vorsichtig abgesaugt, um ihn vom suspendierten Material aus der Grenzschicht zu trennen; dieser Überstand wurde in Eppendorf-Röhrchen von 1,5 ml gebracht.
Für je 100 mg erhaltenes Gewebe wurde 1 ml eiskaltes Isopropanol zugegeben und die RNA bei -20 °C während 60-90 min ausgefällt. Die Gesamt-RNA wurde mit einer Eppendorf-Kühlzentrifuge (Tischmodell 5403) bei 13.000 rpm während 25 min bei 4 °C erhalten. Die ausgefällte RNA wurde mit 0,3 ml RNA-Extraktionslösung (für je 100 mg Gewebe) resuspendiert und dann durch Zugabe von 0,3 ml Isopropanol erneut ausgefällt (60-90 min, -20 °C). Dann wurde das Material wiederum zentrifugiert. Das erhaltene RNA-Pellet wurde mit 0,3 ml Ethanol 70 % auf Eis gewaschen und 10 min bei 4 °C, 13.000 rpm, in einer Mikrofuge zentrifugiert. Das erhaltene Gesamt-RNA-Pellet wurde zuletzt resuspendiert in:
- Mit DEPC behandeltes Wasser (zur Amplifikation durch RT-PCR) - Mit DEPC behandeltes Wasser + 0,5 % SDS (für Northern Blot-Analyse)
Die RNA wurde spektrophotometrisch quantifiziert und sofort verwendet (RT-PCR), oder bei -20 °C eingefroren (Northern Blotting).
2.5.6. Präparation der Gesamt-RNA mit einem kommerziellen Kit
Für die Extraktion der Gesamt-RNA, besonders aus Primärkulturen isolierter Milzzellen oder peripherer Lymphocyten, wurde das RNeasy Minikit (Qiagen) verwendet. Die abzentrifugierten und in Extraktionslösung resuspendierten Zellen wurden an QiaShredder-Säulen (Qiagen) auf der Mik-rofuge für 2 min bei 13.000 rpm abzentrifugiert. Das filtrierte Material (mit der RNA) wurde dann in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und 0,33 ml Ethanol (96 %) zugegeben. Dieses Material wurde in eine für RNA-affine Spin-Säule (Qiagen) gegeben, die dann während 15 sec bei 10.000 rpm in der Mikrofuge zentrifugiert. Der Durchfluß wurde verworfen und die Säule wurde dreimal gewaschen, wobei nach jedem Waschen 15 sec bei 10.000 rpm zentrifugiert wurde:
- Waschpuffer RW1 (Qiagen), 0,7 ml: Durchfluß verwerfen - Waschpuffer RPE (Qiagen), 0,5 ml: Durchfluß verwerfen
- Waschpuffer RPE (Qiagen), 0,5 ml; 2 min zentrifugieren; Durchfluß verwerfen
Die an die Säule gebundene Gesamt-RNA wurde dann nach Zugabe von 40 µl RNAse- freiem Wasser (Qiagen), eluiert und eine Minute bei 10.000 rpm zentrifugiert. Um die RNA vollständig aus der Säule zu lösen, wurde dieser Schritt wiederholt. Beide so gewonnenen Filtrate wurden gemischt, die RNA-Konzentration spektrophotometrisch gemessen und das Material unmittelbar danach mittels RT-PCR amplifiziert. Die nicht verwendete gereinigte Gesamt-RNA wurde bei –80 °C in Eppendorf-Röhrchen eingefroren.
2.5.7. RNA/DNA-Quantifizierung RNA-Quantifikation
Die nach verschiedenen Methoden gereinigte Gesamt-RNA wurde in eimem Absorptions -UV- Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm quantifiziert. Die Reinheit (in Bezug auf die Kontamination mit Proteinen), wurde durch Vergleichsmessungen der Absorption bei 260 gegen 280 nm ermittelt, wobei davon ausgegangen wurde, daß das Verhältnis der Absorption zwischen 260 und 280 nm, einen Anhaltspunkt für die Reinheit der RNA darstellt. Die in DEPC-Wasser (bzw. H2ODEPC + 0,5 % SDS) resuspendierten Proben wurden 50 - 1.000- fach in DEPC-Wasser verdünnt und gegen DEPC-Wasser als Referenz in einem Spektrophotometer (Uvikon 810) gemessen (1 ml Quarzküvet-ten). Die RNA- Konzentration wurde wie folgt errechnet:
RNA-Konzentration (µg/ml) = 1000 x 40 x ∆A 260 Vol Aliquote
Von einer hohen Reinheit wurde ausgegangen, wenn:
(A 260 / A 280 ) = 1,7 – 1,8
Ab: (A 260 / A 280 ) < 1,6; wurde die Probe verworfen.
Die RNA-Proben wurden parallel in Agarose-Formaldehyd-Gelen, in Gegenwart von Ethidi-umbromid elektrophoretisch getrennt. Dazu wurden Aliquote der Gesamt-RNA verwendet. Die Gele wurden mit konstanten Mengen (zwischen 2 und 5 µg) beschickt und nach dem Durchlauf Intensität und Integrität der ribosomalen RNA-Banden 18 S und 28 S (rRNA) überprüft. Als optimales Ergebnis wurde bewertet, wenn beide Banden gut abgegrenzt (nicht diffus) erschienen und die relative Intensi-tät der rRNA aus 28 S im UV-Licht ungefähr doppelt so stark war wie die der 18 S-rRNA (Abb. 1).
Bestimmung der DNA-Konzentration:
Die nach der Reinigung erhaltenen DNA- Zubereitungen wurden in Wasser 100 x – 1000 x (Milli Q) verdünnt und in einer 1-ml-Quarzküvette die Absorption im UV Bereich, bei 260 nm und 280 nm gemessen.
Die Konzentration der Nukleinsäuren konnte dann nach der folgenden Formel errechnet werden:
A 260 x K x Vf = [µg/µl]
1.000
K = 50 (DNA)
Vf = Verdünnungsfaktor
Generell konnten durchaus A260 / A280 Verhältnisse nach DNA-Präps. (Reinheitsgrad der Nukle-insäuren), von 1,7 - 1,8 erzielt werden.
2.5.8. Reverse Transkriptase - Polymerase Kettenreaktion (RT - PCR)
Zum Klonieren von DNA-Sequenzen, die aus Genen des Hausschweins stammen, wurde die Technik der “Reverse Transkriptase – PCR” angewendet. Es wurde Gesamt-RNA aus Schweinemilz von schlachtwarmen Tieren isoliert (Kap. 2.7.1.). Gleichzeitig wurde Gesamt-RNA sowohl aus pe-ripheren Lymphocyten (Kap. 2.7.2) als auch aus isolierten Lymphocyten der Milz („Splenocyten“), gewonnen (Kap. 2.7.3.), die während 24 Stunden in Gegenwart von 10 % FCS kultiviert wurden.
Nach der Vorbereitung der Gesamt-RNA (Kap. 2.5.5./2.5.6.), wurde sofort 1 µg RNA entnom-men (Konzentrationen von 0,5-10 µg/µl, in mit DEPC behandeltem Wasser gelöst) und die folgende Pufferlösung für die Reverse Transkriptase (Boehringer Mannheim/Roche), entsprechend dem Ver-suchsprotokoll zugesetzt.
Zuerst wurden in 10 µl Lösung (mit H2ODEPC) angesetzt:
- 1-2 µg Gesamt-RNA
- 40 mUA260 oligo dT15 (bzw. dN6)
- Inkubation 10 min bei 65 °C; dann sofort auf Eis abkühlen
Danach wird die Reaktionsmischung für das RT-Enzym wie folgt fertig gestellt:
(Endvolumen 20 µl):
- RT-Puffer, 1x - 0,2 mM dNTPs - 25 U RNAse Inhibitor
- 40 U Reverse Transkriptase zufügen (0,8 µl) (AMV, Boehringer Mannheim/Roche)
Inkubation bei:
40 °C, 20 min 42 °C, 20 min 45 °C, 15 min 50 °C, 10 min 4 °C, Pause
Ein Teil der so gewonnenen cDNA wurde sofort für PCR-Amplifizierung verwendet. Die nicht
Ein Teil der so gewonnenen cDNA wurde sofort für PCR-Amplifizierung verwendet. Die nicht