Untersuchungen zu den Extraktionsbedingungen von PTPs aus Splenocyten des Schweins

und Western-Blotting durchgeführt werden konnten, war es erforderlich, das Lösungsverhalten dieser Enzyme in Puffern niedriger Ionenstärke zu kennen und Standardverfahren zur Homogenisierung und/oder für das differentielle Zentrifugieren von subzellulären Fraktionen festzulegen. Die Kenntnis dieser Faktoren ist relevant, um Aussagen zu Konzentrationsänderungen der verschiedenen PTPs im Gewebe und ihre mögliche Assoziierung mit subzellulären Strukturen durch Genexpression und post-traduktionelle Modifizierung machen zu können.

Weiterhin wurden Versuche zur Extrahierbarkeit der PTPs in den mit Percoll aufgetrennten T-Splenocyten durchgeführt. Hierzu wurden zentrifugierte Zellschichten (Nr. 4; Abb. 1, A) verschie-denen Extraktionsprotokollen mit Puffern niedriger Ionenstärke unterzogen und anschließend in un-terschiedlichen Medien re-extrahiert. Die ersten Versuche erfolgten mit Kombinationen von Extrakti-onslösungen des Detergens Tx-100 und der Aminocapronsäure in unterschiedlichen Konzentrationen und Proportionen.

T-Splenocyten wurden, wie oben beschrieben vorbereitet. Nach dem letzten Waschen in PBS 1x wurden die Zellen in sieben Aliquots in Eppendorf-Röhrchen fraktioniert. Die bei 500g erhaltenen Pellets wurden auf Eis mit einem manuellen Glas-Teflon-Homogenisator in Puffer A (niedriger Io-nenstärke) homogenisiert. Die Rohextrakte wurden 15 Minuten auf Eis belassen und dann bei 13.000 rpm (4 °C) in einer Eppendorf- Kühlzentrifuge für 10 Minuten zentrifugiert. Der erhaltenen Über-stand entspricht der „löslichen“ Proteinfraktion (Abb. 17, A–F; Ü-1, Spuren a+p). Die erhaltenen Pellets wurden in verschiedenen Medien/Extraktionslösungen (aus Puffer A + Tx-100 und/oder Ami nocapronsäure) resuspendiert (Konzentrationenen, s. Abb. 17). Dann wurde wie vorher zentrifugiert.

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Puffer A; Ü-1 Puffer A; Ü-10,1 % Tx-100 250 mM ACS 750 mM ACS 1 M ACS

1 % Tx-100 0,1 % Tx-100 + 250 mM ACS 1 % Tx-100 + 750 mM CAS

Abb. 17 (A-F) Löslichkeit von PTPs aus isolierten T-Splenocyten in verschiedenen Lösungsmitteln.

Splenocyten wurden präpariert und 24 h kultiviert. Milz T-Lymphocyten wurden durch Percoll-Zentrifugation getrennt und mit Puffer A homogenisiert (manueller Teflon/Glas Homogenisator). Die „lösliche“ Fraktion wurde auf 10% PAA-SDS-Gele aufgetragen (Ü-1; Spuren a, p). Nach dem ersten Zentrifugieren wurden die Pellets (“P“) mit den gezeigten Puffern re-homogenisiert und extrahiert (Ü-2) (alle Substanzen in Puffer A; Aminocapronsäure: ACS). Nach der zweiten Zentrifugierung wurden die Pellets P2 in Puffer A + 8 M Harnstoff/1 % Tx-100 re-homogenisiert, zentrifugiert und der Überstand (Ü-3) aufgetragen.

Abb. 17 A) Western-Blot Analyse zur Löslichkeit der Tc-PTP. Exposition des Films, 10 min.

Abb. 17 B) Löslichkeit der PTP1B in verschieden Extraktionspuffern. Exposition, 1 min.

kDa

Der Überstand aus dieser zweiten Extraktion wurde zum Blotten auf SDS-PAA-Gele aufgetragen (Abb. 17, A–F; Ü-2, Spuren c, e, g, i, k, m, o). Die Pellets wurden zum dritten Mal re-homogenisiert, diesmal in Puffer A + 8 M Harnstoff/1 % Tx-100. Wieder wurde zentrifugiert und die Überstände wurden auf PAA-SDS-Gele aufgetragen (Abb. 17, A–F; Ü-3, Spuren b, d, f, h, j, l, n). Die Blots lassen erkennen, daß in der „löslichen“ Fraktion mit diesem Protokoll die PTPs 1D („größere“ Bande), et-was PTP1C und R-PTPα enthalten sind. Außerdem kann man erkennen, daß das Detergens Tx-100 (0,1 und 1%) die PTPs CD45, 1B, R-PTPα extrahiert; in geringerem Umfang aber auch PTP1D und PTP1C; aber praktisch kein Tc-PTP, die möglicherweise komplett proteolysiert wurde. Aminocapron-säure in relativ hohen Konzentrationen extrahierte zu einem gewissen Grad die PTPs 1D, 1B, CD45 und R-PTPα, und in geringerem Umfang den Rest der PTPs. Es scheint aber, daß diese Säure die Tc-PTP vor Proteolyse schützt (dieser beobachtete Vorgang ist bisher nicht näher untersucht; außerdem enthielt jeder Extraktionspuffer einen „Cocktail“ von Proteaseinhibitoren wie in Material und Metho-den beschrieben), Metho-denn nach der Extraktion mit Aminocapronsäure verblieb die Tc-PTP im letzten Pellet intakt (Abb. 17, A; Spuren f, h, j, l). Ein ähnliches Resultat wurde auch bei PTP1C beobachtet, das nach der Extraktion mit Aminocapronsäure in größerer Menge in den Pellets verblieb. Auf der anderen Seite wurde aber bei der PTP1B im Pellet der 3. Extraktionsstufe sehr wohl eine Proteolyse nach der Extraktion mit Aminocapronsäure festgestellt (größere Mengen des 34 kDa-1B-Peptids).

Abb. 17 D) Löslichkeit der PTP1D, mit verschiedenen Extraktionspuffern. Exposition, 10 min.

Abb. 17 E) Löslichkeit der Transmembran-PTP CD45, in verschiedenen Extraktionspuffern.

Exposition 3 min.

Abb. 17 F) Löslichkeit der R-PTPα (Pfeile), mit verschiedenen Extraktionspuffern. Exposition, 15 min.

Der Blot wurde vorher mit Antikörpern gegen PTP1D dekoriert.

205 11698 66 45

Puffer A; Ü-1 Puffer A; Ü-10,1 % Tx-100 250 mM ACS 750 mM ACS 1 M ACS

1 % Tx-100 0,1 % Tx-100 + 250 mM ACS 1 % Tx-100 + 750 mM CAS

Aminocapronsäure scheint aber auch die Proteolyse (im Pellet, auf eine bisher noch nicht bekannte Art) der PTP1B zu begünstigen (Abb. 17, B; f, h, j, l, n). Die Aminocapronsäure destabilisiert apola-re Interaktionen aufgrund ihapola-res „hydrophoben Endes“, in ähnlicher Weise wie ein ionisches Deter-gens. Mischungen des Detergens mit der organischen Säure waren bei der Extraktion der verschiede-nen PTPs aus den Zellen nicht effizienter als die Einzelsubstanzen. Klar beobachtet werden konnte eine verstärkte Proteolyse der verschiedenen PTPs nach Extraktion mit Puffer A + 0,1 % Tx-100/250 mM Aminocapronsäure (im 2. Überstand, Abb. 17, A–F; Spur m). Es fällt die Abwesenheit von Tc-PTP, 1C und 1D auf, außerdem ein proteolytischer Abbau der PTPs 1B, CD45, und der Hauptbande der R-PTPα (Abb. 17, A–F; Spur m).

Abb. 18 (A-D) Löslichkeits-Experiment der PTPs von isolierten Milz T-Lymphocyten. Die Zellen wurden in Puffer A homogenisiert, um die „lösliche“ Fraktion zu erhalten (Ü-1); die entstehenden Pellets wurden in den gezeigten Lösungen re-homogenisiert (alle in Puffer A) und extrahiert (Ü-2): 0,1 mg/ml Heparin (k);

0,5 mg/ml Poly-Lysin (m). Das zweite Pellet wurde mit Puffer A + 8 M Harnstoff/1 % Tx-100 extrahiert und dieser letzte Überstand wurde jedesmal aufgetragen (Ü-3).

Abb. 18 A) Extraktion der Tc-PTP aus Milz T-Lymphocyten mit verschiedenen Lösungsmitteln. Exposition des Films 6 min.

Abb. 18 B) Extraktion der PTP1B aus Milz T-Lymphocyten mit verschiedenen Lösungsmitteln. Exposition des Films 1 min.

Abb. 18 C) Extraktion der PTP1C aus T-Splenocyten. Exposition des Films 2 min.

kDa

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Eine zweite Versuchsreihe zu den Extraktionsbedingungen von PTPs aus T-Splenocyten folgte einem ähnlichen Protokoll wie die vorherigen Versuche, jedoch wurden als Extraktionsmedien Puffer A plus Mineralsalze benutzt (KCl, MgCl₂, [NH₄]₂SO₄), und verschiedene organische Moleküle wie Harnstoff, SDS, Heparin und Poly-Lysin (Abb. 18, A–D).

Homogenisierung und Extraktion erfolgten wie bisher beschrieben. Tc-PTP wurde mit Puffer A plus 300 mM Ammoniumsulfat, 0,1 % SDS und 0,1 mg/ml Heparin extrahiert. Hierbei verblieb in den Pellets praktisch keine Tc-PTP, was mit hoher Wahrscheinlichkeit auf eine Proteolyse schließen läßt (Abb. 18, A; d, h, n; teilweise in Spur b). PTP1B verhält sich mit den verschiedenen Extrakti-onsmedien unterschiedlich (s. Bildbeschreibung); ein Teil der durch die Salze erzielten Extraktion könnte auch auf proteolytische Prozesse der PTP1B während der Durchführung dieser Protokolle zurückzuführen sein. Mit keiner der verwendeten Mischungen konnte die PTP1B vollständig und effektiv extrahiert werden; immer blieb im letzten Pellet das Enzym nachweisbar (Extraktion mit Puffer A + 8 M Harnstoff/1 % Tx-100: Abb. 18, B; d, f, j, l, n). Mit KCl und Ammoniumsulfat wurde PTP1C aus den Milz-T-Lymphocyten extrahiert; eine sehr schwache Extraktion erfolgte mit Harn-stoff, Poly-Lysin und SDS, eine etwas stärkere Extraktion wurde mit Heparin erreicht. Es könnte auch eine Proteolyse vorgelegen haben, denn in den letzten Pellets wurde im Vergleich zu Abb. 18, C (Spur b) nur sehr wenig PTP1C freigesetzt (Abb. 18, C; d, h, j, l, n). PTP1D konnte mit Salzen (KCl und Ammoniumsulfat) extrahiert werden, Harnstoff und SDS extrahierten schwächer. Die höchsten Extraktionsraten mit Puffer A wurden bei PTP1D erzielt (Abb. 18, D; Ü-1, Spur o). Bei diesem Proto-koll konnte besonders die obere Bande (p73) der PTP1D beobachtet werden, im Gegensatz zu Beob-achtungen beim SDS-PAGE mit Percoll-aufgetrennten Splenocyten (Abb. 11, D; c–f; Zell-Schichten 3–6), wo sowohl p73 als auch p69 vorkommen.

Eine dritte Versuchsreihe untersuchte die Extraktion („Löslichkeit“) von PTPs aus T-Splenocy-ten (Schicht 4 in Percoll-GradienT-Splenocy-ten), wobei verschiedenen Konzentrationen von Heparin und Ammo-niumsulfat benutzt wurden. Die differentielle Extraktion wurde mit einigen Modifikationen ähnlich wie bei den vorherigen Versuchen durchgeführt. Splenocyten wurden vorbereitet, die T-Splenocyten isoliert und 15 h in Gegenwart von 10% FCS kultiviert. Die T-Splenocyten wurden dann in einem manuellen Glas/Teflon-Homogenisator in Puffer A (1:30) homogenisiert. Vor dem Zentrifugieren wurde das homogenisierte Rohmaterial in sieben Paare Eppendorf-Röhrchen verteilt. Der Überstand aus dem ersten Zentrifugenlauf wurde auf SDS-PAA-Gelen elektrophoretisch getrennt und geblottet (Abb. 19, A–D; Ü-1, Spur p). Die erhaltenen Pellets P1 (7 Paare) wurden nacheinander resuspendiert und re-homogenisiert. Hierbei wurde jeweils ein Pellet aus jedem Paar nur in Puffer A, das andere mit Puffer A plus ansteigenden Konzentrationen von Heparin und Ammoniumsulfat behandelt.

Nach neuerlichem Zentrifugieren wurden die erhaltenen Überstände auf PAA-SDS-Gele auf-getragen und mit Western-Blotting auf die PTPs Tc-, 1B, 1C und 1D untersucht. Abb. 19 (A–D) zeigt sowohl die Überstände aus der zweiten Homogenisierung in Puffer A („Kontrollen“, Abb. 19, A–D;

Spuren a, c, e, g, i, k, m) als auch die Überstände der Homogenisierung (Extraktion 1:5, w/v) in Puf-fer A plus Heparin (Abb. 19, A–D; Spuren b, d, f, h) und in PufPuf-fer A + Ammoniumsulfat (Spuren j, l, n). Das Pellet (P2) der zweiten Homogenisierung (erhalten aus der Extraktion mit 1 µg/ml Heparin;

erstes Pellet des Paares 1) wurde in Puffer A + 8 M Harnstoff/1 % Tx-100 re-homogenisiert; nach dem Zentrifugieren wurde dieser letzte Überstand auf die Gele gebracht (Abb. 19; Ü-3, Spur o). Bei den SDS-PAGE-Gelen wurde beobachtet, daß Heparin und Ammoniumsulfat konzentrationsabhängig (aus Pellet 2) die PTPs 1C und Tc- extrahierten. PTP1D ließ sich gleichfalls mit allen angewandten

Konzentrationen (und Kombinationen) dieser Versuchsreihe extrahieren, ohne daß hier spezifische Beziehungen zwischen Konzentration und Löslichkeit beobachtet werden konnten. Das Gleiche galt auch für PTP1B, die in ähnlicher Menge mit allen Extraktionspuffern, sowohl mit als auch ohne Heparin und Ammoniumsulfat („Kontrollen“, Abb. 19, B; c, e, g, i, k, m) extrahiert wurde. Dieses Er-gebnis könnte unterschiedlichen proteolytischen Effekten für PTP1B zugeschrieben werden die wäh-rend der Extraktion auftraten, nicht jedoch spezifischen Lösungsvorgängen die von der subzellulären Ebene für dieses Enzym ausgehen, auch deshalb, weil PTP1B sich mit dem hydrophoben Ende seines CT an die ER-Membran bindet und durch Detergentien (Tx-100, SDS, s. Abb. 17+18, B) extrahiert werden kann; folglich dürfte PTP1B nicht durch Heparin oder Ammoniumsulfat extrahierbar sein.

Die Milz-Lymphocyten wurden mit einem manuellen Teflon/Glas-Homogenisator zellschonend in Extraktioslösungen unterschiedlicher Zusammensetzung extrahiert. In Puffer niedriger Ionenstärke wurde in der Hauptsache PTP1D solubilisiert, wenn auch nur sehr wenig seiner homologen PTP (1C),

Puffer A + ... (Ü-2) 

Abb. 19 (A-D) Löslichkeit cytoplasmatischer PTPs mit Heparin und Ammoniumsulfat. T-Splenocyten wurden mit Hilfe von Percoll Gradienten isoliert und für 15 h kultiviert (plus 10 % FCS). Die Zellen wurden (in einem Batch) in Puffer A (1:30, w/v) manuell homogenisiert (Teflon/Glas Homogenisator) und der Rohextrakt in 7 Paare Eppendorf Röhrchen aufgeteilt; der nach dem Zentrifugieren erhaltene Überstand wurde auf 4 SDS-Gele aufgetragen (A-D, Spur p). Die 7 Pellets wurden einzeln in Puffer A re-homogenisiert (Ü-2, Kontrolle), oder in Puffer A plus („Ü-2 + ...“): Heparin bzw. (NH₄)₂SO₄ extrahiert. Die Überstände sind jeweils gezeigt. Zum Schluß wurde Pellet P2 (des ersten Eppi-Paares) in Puffer A + 8 M Harnstoff/1 % Tx-100 re-extrahiert; der Überstand wurde auf die Gele aufgetragen (Ü-3; Spur o).

Abb. 19 A) Löslichkeit der Tc-PTP aus T-Splenocyten. Exposition des Films 30 min.

Abb. 19 B) Löslichkeit der PTP1B aus T-Splenocyten mit Heparin und Ammoniumsulfat. Exposition des Films 1,5 min.

Abb. 19 C) Löslichkeit der PTP1C aus T-Splenocyten mit Heparin und Ammoniumsulfat. Exposition des Films 1,5 min.

Abb. 19 D) Löslichkeit der PTP1D aus T-Splenocyten mit Heparin und Ammoniumsulfat. Exposition des Films 30 min.

kDa

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was insofern überraschend war, als zwischen beiden SH2-PTPs eine große strukturelle Ähnlichkeit besteht (Poole & Jones, 2005; cf. Wang et al., 2006,b). PTP1C wurde hauptsächlich mittels Puffern hoher Ionenstärke (z.B. ansteigenden Konzentrationen von Ammoniumsulfat und anderen Salzen) so-wie auch Heparin aus den Zellen extrahiert. Diese Ergebnisse lassen molekuläre Wechselwirkungen vermuten, bei denen die PTP1C durch ionische Interaktionen an subzelluläre Strukturen angelagert wird (Barford & Neel, 1998). Strukturelle Wechselwirkungen für PTP1C scheinen in Lymphocyten funktionell relevant zu sein; in der Literatur gibt es Hinweise für die Generierung von molekulären Assoziationen der PTP1C sowohl mit Plasmamembran-gebundenen (in ”lipid rafts” vorhandenen) Proteinen als auch mit unterschiedlichen Adaptorproteinen (Su et al., 2001). In aus periphen Human-Lymphocyten dargestellten “lipid rafts” wurden in Abhängigkeit der Aktivierung von T-Lymphocy-ten veränderliche Mengen der PTP1C gefunden (Su et al., 2001).

Die beiden strukturell ähnlichen PTPs, Tc-PTP und 1B zeigten ein unterschiedliches Extrakti-onsverhalten, obwohl sie einander in ihrer Proteinstruktur (und subzellulären Verteilung) sehr ähnlich sind. In der vorliegenden Arbeit wurden Ergebnisse erzielt, die den Schluss zulassen daß die Bindung an ER seitens beider Proteine durch verschiedene molekulare Mechanismen vermittelt wird. Dies deshalb, weil die PTP1B praktisch vollständig durch Detergentien aus dem Gewebe extrahiert wurde (0,1% Tx-100, u.a.), was zu erwarten war, während Tc-PTP durch Detergentien allein nur in sehr geringem Umfange solubilisiert, jedoch unter ähnlichen Versuchsbedingungen wie PTP1C konzent-rationsabhängig mit Puffern hoher Ionenstärke oder Heparin gut aus dem Gewebe extrahiert werden konnte. Die Resultate weisen auf verschiedene molekulare Mechanismen hin, die bei der Veranke-rung der PTPs Tc- und 1B an subzelluläre Strukturen agieren, wobei andererseits beide auch wieder hydrophobe N-Termini besitzen, mittels derer sie mit den Membranen-Lipiden interagieren sollten.

Beide Proteine wurden (in verschiedenen Graden) während der Extraktionsabläufe proteolysiert, (s.

Abb. 16, A, Spuren K, S, für Tc-PTP; Abb. 16, B, Spuren K, M, für PTP1B). Parallel hierzu kann man beobachten, daß die Tc-PTP in vivo nur in ihrer intakten Struktur in Kulturzellen nachweisbar war (48 kDa; Abb. 11, A; 20, A); nur eine protelytische Form der Tc-PTP wurde nach subzellulärer Fraktio-nierung beobachtet (Abb. 16, A, Spuren K und S). Die PTP1B wurde in ihrer vollständigen Struktur (50 kDa) in Lymphocyten nachgewiesen, wobei zudem proteolytische Fragmente (mit oder ohne Proteinphosphorylierung; Frangioni et al., 1993) vorlagen (s. Abb. 11, B; 17, B; 20, B). Dieser Schluß darf als zulässig betrachtet werden, weil die Kulturzellen schnell auf Eis und in 8 M Harnstoff/1%

Tx-100 – Puffer homogenisiert worden waren, was eine Proteolyse während der Extraktion, Zentrifu-gierung und dem Laden der Gele ausschließen würde (dies gilt auch für die anderen hier analysierten PTPs, welche aus intakten Zellen gewonnen worden waren; s. Abb. 11).

Unter den erhaltenen Resultaten war vor allem die Solubilisierung der PTPs Tc- und 1C durch Heparin überraschend, die Konzentrationsabhängig erfolgte (Abb. 19, A; C). Dies könnte ein Hin-weis auf eine bisher nicht beschriebene molekulare Interaktion beider PTPs sein. In der vorliegenden Arbeit wurden auch Experimente mit Ultrazentrifugation in linearen Saccharose-Gradienten, die sowohl mit als auch ohne Heparin angelegt waren, durchgeführt. In Saccharosegradienten die 12 Stunden im Winkelrotor bei 40.000 rpm zentrifugiert worden waren, konnte beim darauf folgen-den Western-Blotting beobachtet werfolgen-den, daß die PTP1C in Gradienten mit Heparin weniger weit migrierte als in Gradienten ohne Heparin (wo sie offenbar in geringerer Dichte vorlag; Daten nicht gezeigt), ein Ergebnis, daß eine strukturelle Interaktion zwischen Heparin und PTP1C nahelegt, die bisher in der Literatur nicht beschrieben ist.

Das amphipathische Agens ε-Aminocapronsäure weist am einen Ende eine positive Ladung auf; am anderen Ende ist das Molekül hydrophob. In hoher Konzentration wird es in nativen Gelen zur Analyse von Membranproteinen bei Elektrophoretischer Trennung eingesetzt (Methode BN-PA-GE: Schägger et al., 1994; von Jagow & Schägger, 1994). Es wurde beobachtet, daß die Extraktion mit erhöhten Konzentrationen von ε-Aminocapronsäure + Tx-100 (jeweils konzentrationsabhängig) eine Proteolyse der PTP1B induzierte (Abb. 17, B, Spur m). Außerdem konnte eine Proteolyse der PTP1B in Gegenwart von 0,1% SDS beobachtet werden, die bei anderen Extraktionsmethoden aus Lymphocyten nicht auftrat. Es scheint sich hier um einen selektiven und spezifischen Proteolyse-Mechanismus zu handeln, weil bei verschiedenen Extraktionsmethoden (die mit Western-Blotting untersucht worden waren) bei einigen PTPs eine Proteolyse induziert wurde (1B, 1D, R-PTPα und CD45), jedoch nicht bei anderen (trotz der in Puffer A vorhandenen Proteasehemmer; Abb. 17, Spur m; Abb. 18, Spur i). Die bei diesen Experimenten gemachten Beobachtungen bestätigen Literaturbe-richte, nach denen gerichtete Proteolyse die subzelluläre Lokalisierung so wie die katalytische Akti-vität von PTPs kontrollieren (Rock et al., 1997; Gil-Henn et al., 2001), wie dies speziell auch für die PTP1B beobachtet wurde (Gulati et al., 2004; Kuchay et al., 2007).

3.7. Western-Blotting-Studien zur Expression von PTPs an isolierten T-Splenocyten