Verwendete Software - Material und Methoden

2. Material und Methoden

2.8. Verwendete Software

Die Grafiken wurden mit SigmaPlot (V. 8) erstellt; die densitometrische Analyse erfolgte mit ScionImage for Windows (Kompilierung von NIH Image durch Scion corp. nach einer Version für Macintosh des National Institute of Health). Für die Sequenzanalysen wurde der CLC-Sequence-Viewer (V. 4.6.2.) von CLC-Bio verwendet.

3. Ergebnisse und Diskussion 3.1. Amplifikation und Klonierung von Protein-Tyrosinphosphatasen des Hausschweins

Das Hausschwein ist für die Gewinnung von Zellen des Immunsystems ein häufig benutzter Organismus, einerseits wegen seiner relativ hohen immunologischen Ähnlichkeit mit dem Menschen, andererseits auch deshalb, weil es in ausreichender Menge zur Verfügung steht und für seine Hand-habung keine besonderen Sicherheitsmaßnahmen erforderlich sind, wie dies z.B. bei Humanmaterial vorgeschrieben ist (Boeker et al., 1999; Rothkötter et al., 2002, 2005; Butler et al., 2006). Das Im-munsystem des Schweins ist auch deshalb für biomedizinische Untersuchungen von großer Bedeu-tung, weil die Spezies als Spenderorganismus für Xeno-Transplantationen verwendet wird (Tucker et al., 2002).

Eines der Ziele der vorliegenden Arbeit war es, für die weiteren Untersuchungen die genomi-schen Nucleotidseqenzen von Tyrosinphosphatasen zu ermitteln. Dazu wurde mRNA mit Hilfe von RT-PCR amplifiziert und die cDNA Transkripte in geeignete Vektoren kloniert. Hierfür wurden PCR-Primer so synthetisiert, daß sie zu den kodierenden N- und C-terminalen Enden der humanen PTPs bekannter Sequenzen komplementär waren. Um die Klonierung der amplifizierten DNA zu erleich-tern, wurden an die 5´-Enden der Primer Nukleotidsequenzen mit Restriktionsschnittstellen angekop-pelt. Dafür wurden die Erkennungssequenzen von Restriktionsenzymen mit hoher Schnitteffizienz gewählt, wie z.B. EcoRI, BamHI, HindIII. Da die Erkennungssequenzen dieser Enzyme wenigstens sechs Basenpaare umfassen, war es möglich, unerwünschte Schnitte innerhalb der codierenden DNA zu vermeiden.

Es wurde folgendermaßen vorgegangen: Zuerst wurde Gesamt-RNA aus der Milz von frisch geschlachteten Schweinen extrahiert. Das Gewebe wurde im Schlachthof aus unmittelbar nach der Entnahme noch vor Ort unter „freeze clamping“ Bedingungen mit Hilfe von zangenartig konstruier-ten, vorgekühlten Aluminiumblöcken in flüssigem Stickstoff eingefroren, um die Degradation von RNA zu minimieren. Gesamt-RNA wurde im Labor nach der Methode von Chomczynski & Sacchi (1987) extrahiert. Die für die reverse Transkription und die Ampflifizierung verwandten Primer sind in Material und Methoden (Kap. 2.5.8) aufgeführt. Hierfür wurden vor allem Primer verwendet, die für die Tc-PTP (Primer gegen den CT der Sequenz; Tc-CT-5’ + Tc-CT-3’) synthetisiert worden waren.

Es wurde eine positive Amplifikation eines einzigen Transkripts der Tc-PTP erzielt (ER-Variante; Ab-bildung nicht gezeigt). Die Größe des Transkripts entsprach mit einer Sequenzlänge von 1,1 kbp den Erwartungen an die entsprechende Human Tc-PTP. Eine Amplifizierung wurde bei 1 und 5 µl cDNA erreicht, die als Template verwendet worden war, nicht jedoch bei Konzentrationen unter 1 µl. Da die genaue cDNA-Konzentration im Anschluß an die Durchführung einer reversen Transkriptasereaktion in der Praxis nicht bestimmt werden kann, wurde die für RT-PCR Amplifizierungen erforderliche cDNA-Menge als Ansatzvolumen festgelegt. Die Standardisierung der RT-PCR erfolgte mittels einer konstanten Konzentration der Gesamt-RNA; zur Kontrolle dieser Konstantmenge an Gesamt-RNA wurden Transkripte der GapDH amplifiziert.

Eine ähnliche Methode wurde zur Standardisierung der optimalen Template-Konzentrationen für die PCR (Volumen der cDNA-Ansätze) und der Konzentration der Primerpaare mit der höchsten Amplifizierungseffizienz angewendet. Als Beispiel hierfür zeigt Abb. 2 die Amplifizierung der Tc-PTP und Tc-PTP1D. Um die Amplifikationsbedingungen zu standardisieren, wurde das Protokoll mit verschiedenen Template-Konzentrationen der cDNA (aus Schweinemilz) und verschiedenen

Primer-konzentrationen für die PTPs durchgeführt. Es wurden hierzu Tc-PTP-Primer in zwei Konzentrati-onen verwendet (CT des Enzyms; Abb. 2, A; a-b), ebenso für die vollständige Sequenz der PTP1C (Abb. 2, A; Spuren c-d). Gleichfalls wurden Primer gegen den NT der Tc-PTP (Abb. 2, A; Spur e) und gegen die vollständige PTP1D-Sequenz (Abb. 2, A; Spur f) getestet. Sowohl das CT (nt 162 – 1.248 im Leseraster der entsprechende Humansequenz) wie auch das NT (nt 1 – 951) der Tc-PTP wurde amplifiziert; die Primer-Konzentration hatte keinen Einfluß auf die amplifizierten DNA-Menge (Abb.

2, A; Spuren a vs. b). Das Transkript der Schweine-PTP1D wurde ebenfalls amplifiziert (Abb. 2, A;

Spur f). Abb. 2 (B), zeigt die Amplifikation der PTP1D bei drei verschiedenen cDNA-Konzentratio-nen. Aufgrund dieser Ergebnisse (Abb. 2; zgl. nicht aufgeführter Resultate) wurde für die folgenden Versuche eine Template-Konzentration gewählt, die einem Mengenverhältnis des cDNA-Ansatzes von 2 µl je 100 µl PCR-Ansatz von in vitro-Transkriptionsansätzen entspricht, bei einer Primer-Endkonzentration von 20 pmol/ml. Hiermit wurden sowohl sukzessive RT-PCR-Amplifikationen als auch teil-quantitative Experimente zur Analyse der Expression der PTPs Tc- und 1B in Splenocyten des Schweins mittels RT-PCR durchgeführt (Kap. 3.3.2.).

Die PTP1C-Primer (1C-NT1-5’ + 1C-CT1-3’; Beschreibung in Kap. 2.5.8) konnten dieses Enzym aus Schweinemilz mittels PCR nicht amplifizieren – und zwar bei keiner der verwendeten Primerkonzentrationen (Abb. 2, A; Spuren c-d). Deshalb wurde eine Amplifikation der PTP1C aus Splenocyten (Milz-Lymphocyten) versucht. Es galt herauszufinden, ob diese Zellen erstens überhaupt PTP1C ausdrücken und ob zweitens eine Stimulierung der Primärkulturen mit Mitogenen wie z.B.

A B

Abb. 2 RT-PCR Amplifikation von cDNA-Sequenzen, die für PTP codieren, aus der Milz von Schweinen.

Die cDNA wurde mit dT₁₅ synthetisiert.

(A) Standardisierung der Primer Konzentration. 1 µl cDNA wurde benutzt, um PTP Sequenzen zu amplifizieren: a-b, Primer gegen den CT-Bereich der Tc-PTP aus Schwein (Tc-CT-5’ + Tc-CT-3’); c-d, Primer gegen die PTP1C (1C-NT1-5’ + 1C-CT1-3’); e, Primer gegen den NT der PTP (NT-5’ + Tc-NT-3’); f, Primer gegen die PTP1D. Primerkonzentrationen sind gezeigt (pmol/ml). Marker („M“ u. „X“) sind gezeigt (Beschreibung in Material u. Methoden, Kap. 2.5.15). 1 %ges Agarose Gel, gefärbt mit EthBr.

(B) Standarisierung der cDNA-Konzentration für die PCR-Amplifikation der PTP1D aus Schweine Milz.

1-3 µl cDNA/100 µl PCR-Ansatz wurden benutzt. Primer, je zu 20 pmol/ml; Marker M u. X sowie die Längen einiger Basenpaare der Standards sind gezeigt.

sucht, ob die Expression der PTPs durch eine in vitro-Stimulation erhöht werden kann und so auch eine ursprünglich nur sehr schwache Genexpression einiger PTPs in den Immunzellen in einen durch RT-PCR nachweisbaren Bereich gebracht werden könnte.

3.1.1. Isolierung der PTP-DNA-Sequenzen aus kultivierten Milz-Lymphocyten

Splenocyten aus Schweinemilz wurden isoliert und während 24 Stunden unter Zusatz von 10%

FCS kultiviert (Kulturdichte 2 x 10⁷ Zellen/ml). Hierauf wurden drei 5 ml-Kulturplatten mit LPS (20 µg/ml) und H₂O₂ (1,7 mM) 15 Stunden lang behandelt. Zur Kontrolle wurde eine unbehandelte Kulturplatte in 10% FCS parallel inkubiert. Anschließend wurde Gesamt-RNA aus den Primärkultu-ren extrahiert und die Expression der PTPs Tc-, 1D und 1C mittels RT-PCR untersucht. WähPrimärkultu-rend bei der Kontrollplatte (ohne Stimulierung) keine Amplifizierung der Tc-PTP beobachtet werden konnte (Abb. 3; a, b), wiesen die anderen Platten abweichende Resultate auf:

LPS produzierte eine Zunahme von Transkripten der Tc-PTP (zwei verschiedene Bereiche auf der DNA-Sequenz; s. Legende Abb. 3; c, d). H₂O₂ erzeugte eine sichtlich erhöhte Zunahme der Tc-PTP-Expression (Abb. 3; h, i) in den kultivierten Splenocyten. Gleichzeitig kann in Abb. 3 (j), sowohl die Amplifizierung des CT-Bereichs der Tc-PTP als auch eine Amplifizierung von 367 nt der dem α-Aktin zugehörigen Basenpaare beobachtet werden. Eine Amplifizierung der PTP1C und 1D wurde nicht nachgewiesen.

a b c d e f g h i j

Tc-PTP (NT-CT) + + +

Tc-PTP (NT-Nuc) + + +

Tc-PTP (CT) +

PTP1C +

PTP1D +

α -Aktin +

H2O2

Kontrolle LPS

Splenocyten

3530 2027 1375

Abb. 3 Amplifikation durch RT-PCR von cDNA-Sequenzen aus Milzzellen des Schweins nach Stimulierung von kultivierten Splenocyten. Zellen (1 x 10⁸, in 5 ml Platten) wurden nach der Präparation 24 h kultiviert (in Anwesenheit von 10 % FCS); dann wurden die Zellen weitere 15 h kultiviert (ohne Stimulierung; Kontrolle, lanes a-b) und mit 20 µg/ml LPS stimuliert (lanes c-g) oder mit 1,7 mM H₂O₂ inkubiert (lanes h-i). RT-PCR aus Milz-Gesamt-RNA ist ebenfalls dargestellt (j). Die PCR Amplifikation wurde mit folgenden Primern durchgeführt: a, c, h, Tc-PTP (NT–CT; Tc-NT-5’ + Tc-CT-3’); b, d, i, Tc-PTP (NT–Nuc; Tc-NT-5’ + Tc-Nuc-3’); j, Tc-PTP (CT;

Tc-CT-5’ + Tc-CT-3’); e, PTP1C (1C-NT1-5’ + 1C-CT1-3’); f, PTP1D (NT–CT); g, α-Aktin (370 bp). 2 µl cDNA (mit oligo dT₁₅ hergestellt) wurden für die PCR benutzt.

Um die Expression von verschiedenen cytoplasmatischen PTPs in Zellen des Immunsystems aus Schweinemilz zu untersuchen, wurden Splenocyten isoliert und 24 h in einer Primärkultur inku-biert. Danach wurden 2 Platten nochmals unter Zugabe von 10 % FCS 5,5 h weiter kultiviert, und zwar sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit eines ROS (Reactive Oxygen Species) - Stimulus (H₂O₂): eine dieser Platten mit H₂O₂ (1,9 mM) und eine Kontrollplatte (ohne H₂O₂), um den Einfluß dieser Substanz auf die Expression der cytoplasmatischen PTPs zu untersuchen. Gleichzeitig wurde die Expression anderer Gene mit untersucht (β-Aktin und das glykolytische Enzym GAPDH), deren Funktion als house-keeping genes in der Literatur beschrieben wird; zusätzlich ein hochgradig kon-serviertes Protein: die katalytische Untereinheit der cAMP-abhängigen Protein-Kinase, PKA. In Abb.

4 erkennt man die RT-PCR-Amplifikation der cDNAs der Enzyme PTP1B (1,3 kbp), β-Aktin (1,1 kbp), GAPDH (0,45 kbp) und PKA (1,1 kbp). Eine Amplifikation von PTP1B und PKA auf der Kon-trollplatte (ohne H₂O₂) konnte nicht nachgewiesen werden (Abb. 4); 1,9 mM H₂O₂ erzeugte einen markanten Anstieg der Transkripte von β-Aktin (Abb. 4), und eine leichte Stimulierung der PKA- Expression, beeinflußte aber offenbar nicht die Transkription von GAPDH (Abb. 4). Bei diesen

Ver-suchen wurden die PTPs He-, PEST- und PEP-, über deren Beteiligung bei der Aktivationsregulier-ung von Lymphocyten bisher noch nicht viel bekannt ist (Mustelin et al., 2004) nicht amplifiziert, ebenso wenig ist ihr Expressionsgrad in Lymphocyten des Schweins bekannt. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse zeigen entweder, daß diese PTPs nicht in Schweinelymphocyten exprimiert werden, oder daß die Primer, die gegen die kodierenden N- und C-Termini (generell weniger Konser-vierte Zonen in PTPs: Ahmad et al., 1993; van der Sar et al., 1999) gerichtet sind, zur Erkennung von Genen des Schweins nicht geeignet waren. Wenn auch bis heute in dieser Richtung wenige Untersu-chungen vorliegen, so konnte man doch aufzeigen, daß PEST-PTP, PEP-PTP und He-PTP in Human-Lymphocyten exprimiert werden (Gjörloff-Wingren et al., 2000).

Auf der weiteren Suche nach der Amplifikation von PTP1C, wurde eine von zwei weiteren Optionen verworfen: Zellen mit einer sehr niedrigen Expression von Transkripten und/oder ungeeig-nete Primer. Aus frischem Schweineblut (mit EDTA) wurden mittels Zentrifugieren in Ficoll-Paque Plus periphere Lymphocyten und Granulocyten gewonnen. Die Zellen wurden nach

Herstelleran-He 1B PEST PEP β-Act GapDH PKA Kontrolle + + + + + + + H2O2 1,9 mM + + + + + + +

X M

3530 2027 1375 947

Abb. 4 RT-PCR Analyse der Expression von DNA-Sequenzen aus Schwein. Splenocyten wurden isoliert und 24 h kultiviert. Primär Kulturen wurden teilweise mit H₂O₂ inkubiert (1,9 mM, für 5,5 h), oder ohne H₂O₂ Behandlung (für weitere 5,5 h kultiviert; Kontrolle). 2 µl cDNA (mit dT₁₅ hergestellt) wurden für die PCR benutzt. Die Primer waren gegen: He-PTP, PTP1B, PTP-PEST, PTP-PEP, β-Aktin, GAPDH (Gap-5' + Gap-3') und PKA (Primer gegen die Maus-PKA-Sequenz).

Marker X u. M sind gezeigt.

Stimulierung) in einer Primärkultur inkubiert. Danach wurde die Gesamt-RNA gereinigt und eine Analyse der PTP1C-Expression mittels RT-PCR durchgeführt; hierbei wurden verschiedene Primer-Kombinationen verwendet. Diese Primer waren mit untereinander leicht versetzten Sequenzen gegen die komplette Sequenz der Human-PTP1C synthetisiert (NT bis CT). Die Primer (beschrieben in Kap. 2.5.8) wurden in 2 Konzentrationen und mit verschiedenen cDNA-Ansätzen kombiniert (Abb.

5). In der Abbildung ist die positive Amplifizierung der PTP1C deutlich zu erkennen, mit den Primer-paaren 1C-NT1-5’ + 1C-CT2-3’ (nt 1 – 1.830 im Leseraster der Human-PTP1C-cDNA) (Abb. 5; b), und beim Primerpaar 1C-NT2-5’ + 1C-CT2-3’ (Abb. 5; a, d, e) (entsprechend der nt 16 – 1.830 im Human-PTP1C-cDNA). Der Primer 1C-CT1-3’ war ohne Wirkung (Abb. 5; c) auf die Amplifikation der PTP1C beim Schwein. Außerdem wurde beobachtet, daß sich ein höher konzentrierter Primer (30 pmol/ml; Abb. 5, e) negativ auf die PCR-Amplifikation der PTP1C auswirkte, wobei PTP1C nur in peripheren Lymphocyten, nicht jedoch in Granulocyten transkribiert wurde (Abb. 5; f, g). In Granulo-cyten konnte dafür jedoch Tc-PTP nachgewiesen werden, und zwar ein zur Sequenzmitte gehörendes transkribiertes Segment (Abb. 5; Spur h).

3.1.2. Klonierung von DNA Sequenzen des Schweins

Die amplifizierten PCR-Produkte wurden in den Cloning-Site des pBluescript Vektors einge-bracht. In jedem Falle wurden RE benutzt, die nur an den Schnittstellen der Primer selbst schnitten, jedoch die vollständige amplifizierte Sequenz jeder Schweine-PTP intakt ließen. Im Falle des CT der Tc-PTP (DNA geschnitten mit BamHI) wurde das Einfügen in den pBluescript mittels des „T-Überhang“ Protokolls vorgenommen (das Plasmid wurde mit EcoRV geschnitten, um blunt ends zu erhalten). Die so klonierten vollständigen kodierenden PTP- Sequenzen wurden dann sequenziert und mit den ensprechenden Human-Genen (Tc-PTP, 1B, 1C und 1D) verglichen. Gleichermaßen wurden die amplifizierten DNA-Fragmente in pBl geklont, die zu den Genen β-Aktin (1,1 kbp), GAPDH (1,0 kbp; Primer GAPDH-5'/3') und PKA (katalytische Untereinheit; 1,1 kbp) gehören und die von Transkripten aus Immunzellen des Schweins stammten.

X a b c d e f g h X

1C-NT2-5´+1C-CT2-3´ + + + +

1C-NT2-5´+1C-CT2-3´(30) +

1C-NT1-5´+1C-CT2-3´ +

1C-NT2-5´+1C-CT1-3´ +

Tc-CT-5´+Tc-NT-3´ +

cDNA (µl) 3 3 3 5 3 3 6 3

Granulocyten Lymphocyten

1,8 kbp 

1,1 kbp

Abb. 5 RT-PCR Amplifikation der Tc-PTP und PTP1C aus Blut-Lymphocyten und Granulocyten. Blut vom Schwein wurde in Ficoll-Paque zentrifugiert. Lymphocyten und Granulocyten wurden in Anwesenheit von 10 % FCS 24 h kultiviert. Danach wurde RT-PCR durchgeführt. Primer (je zu 10 pmol/ml bzw. 30 pmol/

ml; Spur e) und cDNA-Mengen sind gezeigt.

Die RT-PCR Prozedur ist eine schnelle und effiziente Methode zur Amplifizierung von Nukleo-tidsequenzen ausgereifter Transkripte aus einem spezifischen Gen. Je nach den bei der RT verwendeten Enzymen, aber insbesondere je nach dem Isoenzym der verwendeten kommerziellen Thermostabilen DNA-Polymerase (z.B. Expand high fidelity polymerase-PCR system), erhält man - reproduzierbar - Amplifizierungen von 2 kbp- DNA-Fragmenten. Diese thermostabilen DNA Pol. haben eine sehr niedrige Fehlerquote von nur ca. 1 nt bei 5.000-10.000 amplifizierten nt (bei etwa 30 PCR-Zyklen).

Wenn man Taq (Thermus aquaticus) DNA-Polymerase benutzt, wurden Fehlerquoten von bis zu 2,1 x 10^-4 base substitutions/bp (Tindall & Kunkel, 1988; Keohavang & Thilly, 1989), bzw. bis zu 2,0 x 10^-5 errors/bp (Hengen, 1995) beschrieben.

3.2. DNA-Sequenzierung von PTPs vom Schwein

Die DNA-Sequenzen aus Immunzellen des Schweins, die durch RT-PCR aus reifen Transkrip-ten der PTPs Tc-, 1B, 1C und 1D amplifiziert und in pBl kloniert worden waren, wurden nach zwei Verfahren gewonnen. Das “manuelle Verfahren” wurde im Labor nach der Methode von Sanger et al.

(1977) mit ddNTPs und dATP-³⁵S_α durchgeführt. Hiermit wurden ca. 20 – 25 % der in den 5 Ansätzen (4 PTPs plus PKA) erhaltenen DNAs sequenziert (insgesamt etwa 7.000 nt).

Um die vollständige Sequenz der vier klonierten PTPs zu erhalten, wurde eine automatische Sequenzierung durchgeführt (Sequiserve, Vaterstetten; Methode mit fluoreszierenden Nukleotiden).

Die DNA-Sequenzen der PTPs Tc-, 1B, 1C und 1D und die entsprechende AS-Translation sind als Anhang gezeigt (Abb. Anhang-1 bis -13; S. 107): AS- bzw. DNA-Vergleiche zwischen Human- und Schweinesequenzen, sowie Sequenzvergleich zwischen den 4 klonierten PTPs vom Schwein (Abb.

Anhang-13). Die Aminosäuresequenz des PKA-Enzyms beim Hausschwein ist ebenfalls gezeigt (s.

Anhang: S. 112). Sowohl die automatische als auch die manuelle Sequenzierung führten zu den glei-chen Ergebnissen; die automatische Sequenzierung diente vor allem zur Absicherung der manuell erzielten Nukleotidsequenzen.

In der vorliegenden Arbeit wurden für die RT-PCR Primer verwendet, die gegen die kodieren-den N- und C-terminalen Gensequenzen für Humane Tyrosinphosphatasen (bzw. die PKA der Maus) gerichtet waren. Obwohl zu erwarten war, daß die Homolgien zwischen den Species innerhalb dieser Abschnitte geringer ausfallen als im Bereich der katalytischen Domänen, waren die Amplifikationen mit der Mehrzahl der verwendeten Primer erfolgreich. Die Aminosäuresequenzen der SH2-PTPs des Hausschweins zeigen einen hohen Grad an Identität (95,7 % für PTP1C; Abb. Anhang-8). PTP1D zeigt eine Identität von 98,7 % zwischen Mensch und Schwein und damit den höchsten Konservie-rungsgrad unter den 5 verglichenen Sequenzen (s. Abb. Anhang-9).

Die Unterschiede in den Aminosäuren zwischen Schweine– und Human-PTPs 1C und 1D sind regelmäßig über die gesamte Sequenz verteilt. Die PTPs Tc- (die ER-Variante, p48, wurde kloniert) und 1B aus dem Schwein zeigen eine geringere Identität mit den menschlichen Aminosäuresequen-zen beider Enzyme: 91,8 % (Tc-; Abb. Anhang-6) und 85,7 % (1B; Abb. Anhang-7). Beide PTPs aus dem Schwein haben einen katalytischen Bereich (NT), der näher bei den Humansequenzen liegt, außerdem noch einen nicht-katalytischen Teil (CT) der eine niedrigere Identität mit den Human-Sequenzen zeigt, vorwiegend bei der PTP1B. Für die Tc-PTP (ER-Form) sind die Austausche von AS zwischen Schwein und Mensch gleichmäßig über die ganze Sequenz verteilt. PTP1B zeigt aber im CT-Bereich größere Unterschiede zur Humansequenz (membrangebunden), die für dieses Enzym

eine wichtige funktionelle Bedeutung haben könnten, wie weiter unten noch genauer ausgeführt wer-den wird. Die letzten 35 AS des CT der PTP1B sind erforderlich, um die subzelluläre Lokalisierung des Enzyms im ER zu bestimmen (Frangioni et al., 1992). Eine Proteolyse löst die PTP1B aus dem ER (Frangioni et al., 1993). Die Sequenz der Schweine-PTP1B weist auch eine Deletion von 8 AS im Vergleich mit der menschlichen PTP1B auf, in der Pro-reichen Sequenz im CT (in der Region AS 380 der Human-PTP1B). 15 AS in Richtung CT zeigt die PTP1B aus dem Schwein eine weitere Pro-reiche Sequenz (4 Pro hintereinander), die in der Human-PTP1B nicht vorliegt. Der AS-Unterschied zwischen Schwein und Mensch für die PTP1B im katalytischen Bereiches der Sequenz (AS 15-286 im NT) beträgt 4 AS; die Austausche im CT (AS 287-410) umfassen 43 AS, mit 14 Deletionen in der Sequenz des Enzyms aus dem Schwein. Ein weiterer Unterschied ist das Fehlen von 4 Ser-Resten im CT-Bereich des Enzyms in der Sequenz der PTP1B aus Schwein (zwischen AS 370 und 400 der Human-PTP1B), die als Phosphorylierungsstellen für PKA und/oder PKC gelten (z.B. Ser₃₅₂, Ser₃₇₈ und Ser₃₈₆ auf der Human-PTP1B; Flint et al., 1993), aber auch für die Cyclin-abhängige Kinase B/

Cdc2, eine Prolin-gerichtete Proteinkinase (Shifrin et al., 1997). Die Pro-reichen Sequenzen binden an SH3 Domänen (Liu et al., 1996; Zhou, 2006), weshalb diese Unterschiede zwischen Human- und Schweine PTP1B im CT-Bereich des Enzyms von physiologischer Bedeutung sein könnten.

Zu Vergleichszwecken wurde in dieser Arbeit auch die Sequenz der katalytischen Untereinheit von PKA aus dem Schwein ermittelt. Bei diesem Enzym ist nicht nur die dreidimensionale, sondern auch die Primärstruktur auch zwischen weit voneinander entfernten Spezies in hohem Maße konser-viert (Jung et al., 1995). Die katalytische Untereinheit der PKA des Hausschweins, die hier durch RT-PCR kloniert worden war, wies eine 97,7-prozentige Identität mit der entsprechenden Human-cDNA auf, wobei die Abweichungen zwischen beiden Sequenzen gleichmäßig über die Stranglänge des amplifizierten Gens verteilt waren (ca. 1050 bp, 350 AS). Bei den PTPs war dies nicht der Fall, da hier die katalytische Domäne, im Vergleich zu den nicht katalytischen Sektoren der PTP-Gene des Schweins, einen höheren Erhaltungsgrad aufwiesen; die Homologie zur Human-Sequenz war geringer. Auch der Identitätsgrad der Aminosäuresequenzen bei den vier klonierten PTPs zwischen Mensch und Hausschwein ist im Vergleich zu anderen Proteinen des Immunsystems wesentlich hö-her; z.B. weisen zwei kürzlich klonierte Cytokin-Rezeptoren des Schweins, IL-13Rα1 und IL-4Rα eine deutlich niedrigere Identität (83 % bzw. 66 %; Zarlenga et al., 2004) mit den entsprechenden Rezeptoren beim Menschen auf.

Die Nukleotidsequenzen einiger PTPs vom Schwein (meist teil-Sequenzen) sind in Genbanken publiziert. Unter den Non-Rezeptor-PTPs, PTP1B (s. Abb. Anhang-7) und Tc-PTP (vollständige Se-quenz der Nukleären Variante des Schweins, Abb. Anhang-6); von den Transmembran-PTPs sind nur einige Fragmente von CD45 verfügbar (ca. 580 AS der Sequenz im NT) und ein kurzes Segment der R-PTPγ (PTPRG).

Bei der in dieser Arbeit beschriebenen Tc-PTP konnte keine einzige Abweichung der Nukleo-tide von der durch (Jorgensen et al., 2005; NCBI-Accession: AY610205.1) veröffentlichten Sequenz von Tc-PTP_Nuc aus Schwein beobachtet werden; nur jene Nukleotide zeigen Unterschiede im NT und CT, wobei es sich hier um Splicing-Varianten handelt (ER vs. Nuc; Abb. Anhang-6 und -11). Der Rest der Nukleotide zeigt eine vollständige Übereinstimmung. Auf der anderen Seite zeigt die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen PTP1B größere Abweichungen der Nukleotid-Sequenz (Segment von 289 AS, katalytische Domain des Enzyms, s. Abb. Anhang-7) in Bezug zur PTP1B des Schweins, beschrieben von (Sherwood et al., 2004; NCBI-Accession: AF455037.1; s. Abb. Anhang-12).

Zu den Aminosäuren Ser₂₈₆ bis Ile₃₀₆ der Human-PTP1B weist die von (Sherwood et al., 2004;

Abb. Anhang-7) beschriebene PTP1B vom Schwein eine sehr große Ähnlichkeit auf, aber die hier beschriebene Schweine-PTP1B zeigt in diesem Bereich ihrer Primärstruktur eine im Vergleich zum Human-Enzym völlig andere Sequenz auf, die bei 20 AS nur eine einzige Übereinstimmung zur Human-PTP1B (W₂₉₁; Abb. Anhang-7) zeigt. Dies könnte mit dem Auftreten von Isoformen beim Schwein zusammenhängen, die beim Menschen nicht vorliegen (oder nicht beschrieben wurden).

Außer in diesem Bereich, zeigt die in der Arbeit beschriebene Schweine-PTP1B, 4 verschiedene Nu-kleotide, im Unterschied zum Klon der von (Sherwood et al., 2004; Abb. Anhang-12) beschriebenen Schweine-PTP1B auf.

Für CD45 vom Schwein wurden in der NCBI-Genbank 6 Isoformen (Accession: AY444866.1-AY444871.1) der NT dieses Transmembranenzyms hinterlegt, die weniger als 50% Identität mit der Human-CD45 aufweisen.

3.3. Untersuchungen zur Expression von PTPs in Zellen des Immunsystems des Schweins nach Primärkultur

Verschiedene Mitglieder der PTP-Familie weisen strukturell homologe Proteine auf, bei de-nen sich funktionale Domäde-nen wiederholen. Bisher ist nicht geklärt, wodurch sich strukturhomologe PTPs in ihren biologischen Funktionen voneinander unterscheiden und welche strukturellen Cha-rakteristiken deren unterschiedliche biologische Wirkungen steuern, insbesondere bei Tc-/1B und 1C/1D (Andersen et al., 2004; Wang et al., 2006,b). Ein weiteres Beispiel hierfür sind auch die PTPs R-PTPα/R-PTPε (Tonks, 2006). Genauere Untersuchungen zur Expression dieser homologen Reprä-sentanten der PTPs können daher sehr zum besseren Verständnis der biologischen Funktion in ver-schiedenen Geweben und Zelltypen beitragen (Gjörloff-Wingren et al., 2000; Salmond & Alexander,

Im Dokument Untersuchungen zur Expression von Protein-Tyrosinphosphatasen in Lymphocyten (Seite 61-0)