Northern-Blotting zur PTPs Tc- und 1B in isolierte T-Splenocyten

Durch Zentrifugieren in Percoll-Gradienten wurden Zellen aus dem Immunsystem des Schweins separiert. Aus der vierten Schicht des Gradienten (45 – 50 % Percoll; Abb. 1, A) wurden Zellen ent-nommen, die vorwiegend aus T-Lymphocyten bestanden und an ihnen die Genexpression der PTPs Tc- und 1B mit Northern-Blotting untersucht (Abb. 12 + 13; A). Diese Zellen wurden wie in Kap.

3.4 beschrieben isoliert und in RPMI + 10% FCS kultiviert, wobei verschiedene Substanzen zugefügt wurden, um deren Einfluß auf die Expression beider PTPs (bzw. die Konzentration oder cytoplasma-tische Stabilität der ausgereiften Transkripte der PTPs Tc- und 1B) zu untersuchen. Zur Durchführung des Northern-Blotting wurde nach Reinigung und der pharmakologischen Behandlung der Zellen in Primärkultur die Gesamt-RNA gereinigt und eine Elektrophorese in Agarose-Gelen durchgeführt.

Danach wurden die RNAs auf Nylonmembranen geblottet. Die Transkripte beider PTPs wurden mit RNA-DIG-Sonden unter Bedingungen erhöhter Stringenz durchgeführt, wie in Material und Metho-den beschrieben (68 °C, 0,1 x SSC). Zur Kontrolle der konstanten Menge der Gesamt-RNA, die auf die Spuren in den RNA-Gelen aufgetragen worden waren, wurde im UV-Transiluminator die ribo-somalen RNA-Hauptbanden fotografiert (Membran mit der RNA-Seite nach unten); in Abb. 12 + 13 (B) kann man erkennen, daß beide Blots konstante rRNA-Mengen aufweisen (rRNA 28 S und 18 S, s. Legende).

Die Membranen wurden einzeln mit jeder Sonde gegen die PTPs Tc- und 1B hybridisiert. Man kann erkennen, daß die Menge der PTP1B-Transkripte – zwei Splicing-Varianten der PTP1B, von 1,7 und 4,3 kb – keine Konzentrationsschwankungen aufwiesen; bei allen in Primärkultur zugesetzten Pharmaka blieb die relative Menge der Transkripte konstant (Abb. 13, A). Die Tc-PTP wies jedoch deutliche Schwankungen der intrazellulären Konzentration auf, die in Beziehung zur

pharmakologi-1,9 kb 

Abb. 12 (A) Northern-Blot Analyse der Expression der Tc-PTP, auf mRNA Ebene, nach Stimulierung von T-Splenocyten. T-Splenocyten wurden durch Zentrifugation in Percoll isoliert (Schicht Nr. 4 in Abb. 1, A;

45 – 50 % Percoll) und für 24 h kultiviert (plus 10 % FCS). Gesamt-RNA wurde auf RNA-Agarose Gele aufgetragen, getrennt und durch Northern Blotting transferiert. Die Behandlungen (18 h) waren: a-e, ConA (µg/ml); f-h, Salicylsäure (SS); i-j, NAC (mM); k-l, H₂O₂ (mM); m-o, 5 µg/ml ConA + 0,5 (m), + 1,5 (n), + 5 (o) mM SS; p, Kontrolle (unstimulierte T-Splenocyten, 18 h). Detektion der Tc-PTP mit einer DIG-markierten RNA-Sonde (ca. 1 kb) gegen den N-terminalen Bereich des Enzyms. Exposition des Films, 1,5 h. (B) Nylon Membran unter UV-Bestrahlung, als Kontrolle der ribosomalen-RNAs (18 S und 28 S rRNAs sind gezeigt).

Zunahme der Tc-PTP Transkripte beobachtet werden (in allen Fällen der Northern-Blot-Analysen wurde jeweils nur ein einziges Transkript für Tc-PTP detektiert; ER-Tc-PTP); stärkere Expression der Transkripte bei 25 µg/ml ConA. SS erzeugte bei drei Konzentrationen eine Abnahme der Tc-PTP mRNA (im Vergleich zur Kontrollgruppe, Abb. 12, A; Spur p), ähnlich wie bei der beobachteten Ab-nahme für die zwei NAC-Konzentrationen. Andererseits bewirkte H₂O₂ (in zwei Konzentrationen) bei diesen Zellen, im Gegensatz zu den Splenocyten, nach 18 Stunden Exposition keine Aktivierung der Tc-PTP-Expression. Schließlich konnte SS (in drei Konzentrationen) die durch ConA (5 µg/ml) induzierte mRNA-Zunahme der Expression dieses Enzyms nicht umkehren. PTP1B erfuhr, wie be-reits erwähnt, keine Mengenänderung durch die verwendeten Pharmaka. Abb. 14 (A, B) zeigt die

densitometrische Auswertung der Abbildungen 12+13 (A). Überraschenderweise (und im Gegensatz zu den bei Gesamt-Splenocyten beobachteten Resultaten) zeigte das GAPDH-Enzym (Abb. 15), das als mRNA durch RT-PCR unabhängig von den pharmakologischen Stimuli konstante Expressionen aufwies, in T-Splenocyten eine deutliche, konzentrationsabhängige Interdependenz zwischen phar-makologischer Stimulation und der Menge der vorhandenen mRNA; ähnlich den Resultaten, die bei

28 S 18 S

28 S 18 S a b c d e f g h i j k l m n o p

4,3 kb  1,7 kb  PTP1B

rRNAs B

Abb. 13 (A) Northern-Blot Analyse der Expression der PTP1B nach Stimulierungen von T-Splenocyten, die durch Percoll-Gradienten isoliert worden waren. Pfeile zeigen auf beide Transkripte der PTP1B. Die DIG-Sonde wurde gegen die gesamte Sequenz der PTP1B synthetisiert. Behandlungen wie bei Abb. 12 beschrieben. Entwicklung des Films, 1 min. (B) Nylon Membran unter UV-Bestrahlung, Kontrolle der aufgetragten RNA-Menge (18 S und 28 S rRNAs sind gezeigt).

A

A

B

µ

µ

Abb. 14 (A+B) Densitometrische Analyse zu Abb. 12 (A) u. 13 (A).

Tc-PTP beobachtet wurden: also eine deutliche Erhöhung der mRNA bei steigenden Konzentrationen von ConA, fortschreitende Verminderung bei ansteigenden Konzentrationen von SS; leichte Vermin-derung bei 10 mM NAC (im Vergleich zu 0,1 mM). Die zwei Konzentrationen von H₂O₂ ließen keine Beeinflussung erkennen. Auch SS (5 mM) hatte nur eine leichte inhibierende Wirkung auf die Zunah-me der GAPDH-mRNA der mit ConA induziert wurde - ein qualitativ ähnliches Ergebnis wie bei der Tc-PTP. Demnach waren Änderungen in den Expressionslevels der Transkripte von Tc-PTP und GAPDH beobachtbar, die von den Versuchsbedingungen abhängig waren, während bei PTP1B in T-Splenocyten die pharmakologische Beeinflussung keine Konzentrationsänderung der Transkripte hervorrief.

In ähnlicher Weise wie bei Untersuchungen an Gesamt-Splenocyten, konnte eine klare Än-derung in den Expressionslevels der Tc-PTP unter verschiedenen chemischen Einflüssen beobach-tet werden, was ein Hinweis darauf sein könnte, daß die Genexpression während der Aktivierung von T-Zellen als Antwort (auf physiologische oder pathologische Situationen) aktiv modifiziert wird (wie für PTP1B in anderen Zelltypen beschrieben wurde; Fukada & Tonks, 2003; Zabolotny et al., 2008). Anders als bei Splenocyten, hat PTP1B auf extrazelluläre Stimuli nicht mit einer Änderung der Genexpression in T-Lymphocyten reagiert. Demnach wären es unterschiedliche Signalwege bzw.

Transkriptionskontrollen, mittels derer die Expression beider Gene in Zellen des Immunsystems kon-trolliert wird.

Die durch ConA erhöhte Expression von Tc-PTP in T-Milzzellen bestätigt die bei Splenocyten erhaltenen Ergebnisse. SS modifizierte nicht die durch ConA ausgelöste Aktivierung der Tc-PTP in T-Splenocyten. Dies ist ein Hinweis darauf, daß SS kein downstream-hemmender Regulator die-ses durch ConA ausgelösten (und die Tc-PTP-Expression kontrollierenden) Signalweges sein dürfte.

ConA könnte aber NF-κB-unabhängige Signalwege aktivieren, da ansteigende Konzentrationen von Salicylsäure (ein Inhibitor der Aktivierung dieses Transkriptionsfaktors; Kopp & Ghosh, 1994; Yin et al., 1998) die durch ConA ausgelöste Erhöhung der Tc-PTP-Expression nicht revertieren könnten.

Andererseits zeigte Tc-PTP gegenüber einer Exposition mit NAC eine progressive Abnahme bei zu-nehmenden Konzentrationen dieses Antioxydans. NAC hemmt die Aktivierung des NF-κB (Oka et al., 2000). HO zeigt keinen klaren und eindeutigen Effekt bei der Aktivierung der

Tc-PTP-Expres-28 S 18 S GAPDH 

a b c d e f g h i j k l m o

ConA (µg/ml) SS (mM) NAC

(mM) H₂O₂ (mM)

ConA 5 SS (mM)+

Abb. 15 Northern Blot Analyse der GAPDH in isolierten T-Splenocyten. GAPDH wurde als “Expressions-Kontrolle“ verwendet. Stimulierungen wie in Abb. 12 (A). Dargestellt sind ribosomale RNAs. Filmbelichtung 25 min.

Diese Ergebnisse könnten nahelegen, daß Tc-PTP, neben einem intrazellulären Redox-Status außer-dem noch zusätzliche stimulierende Signale („co-stimulatory signals“) für die Expression benötigt (Frauwirth & Thompson, 2002); unterschiedliche (Redox-abhängige und –unabhängige) Wege akti-vieren außerdem NF-κB in Lymphocyten (Majumdar et al., 2002; de Oliveira-Marques et al., 2007;

Wietek & O’Neill, 2007).

PTP1B zeigte keinerlei Änderungen hinsichtlich der Menge beider Transkripte, unabhängig von den experimentellen Bedingungen, die für die T-Lymphocyten gegeben waren (Abb. 13, A;

scheinbare Expressionsänderungen der PTP1B sind durch einen unregelmäßig ausentwickelten Hin-tergrund im Blot zu erklären). Aus diesem Resultat kann man schließen, daß die Expression dieser PTP in T-Lymphocyten (Unterpopulation von Th) nicht beeinflusst wird; daraus ließe sich der Schluss ableiten, daß PTP1B keine regulierende Funktion bei der Aktivierung von T-Lymphocyten durch Ex-pressionskontrolle des Gens während der Immunantwort besitzt, wie sie z.B. die Proliferation/Diffe-renzierung von T-Lymphocyten nach extrazellulärer Stimulierung mit Cytokinen oder pharmakologi-schen Substanzen darstellt. Dieses Ergebnis stimmt mit den Resultaten aus neueren Untersuchungen über ein, bei denen PTP1B keine aktive Rolle bei der Kontrolle der Aktivierung von T-Lymphocyten in den molekulären Mechanismen der Immunantwort zugeordnet werden konnte (Mustelin et al., 2005). Daher, und weil Tc-PTP einen inhibierenden Effekt auf die Aktivierung von T-Lymphocyten hat (Mustelin et al., 2005; Dolton et al., 2006), mögen es diese Effekte auf die Expression der Tc-PTP in Lymphocyten erlauben, eine regulierende Rolle bezüglich der Proliferation oder Differenzierun-gen dieser Zellen als Kontrollmechanismus der Immunantwort nach mitoDifferenzierun-genen Stimuli anzunehmen, wie dies z.B. ein Apoptose-Mechanismus in Unterpopulationen von T-Lymphocyten auslösen könnte (Chin et al., 1997; Scarzello et al., 2007), ein Feedback-Mechanismus zu Regulierung der Funktion von Tc-PTP als Proliferationskontrolle von Zellen gegenüber mitogenen Stimuli (Lu et al., 2007). Es wurde beobachtet, daß eine STAT2-Mutation in der SH2-Domäne dieses Transkriptionsfaktors die Phosphorylierung in Tyr der STAT1 verlängert (STAT1 wird durch Tc-PTP dephosphoryliert; ten Hoeve et al., 2002), ein Vorgang der die IFN-induzierte Apoptose in hämatopoietischen Zellen fördert (Scarzello et al., 2007). In diesem Zusammenhang wurde festgelegt, daß Tyr-Phosphorylierungen verschiedener Proteingruppen in hämatopoietischen Systemen die intrazellulären Vorgänge zwischen Proliferation, Differenzierung und Apoptose bestimmen (Yousefi et al., 1994; Treigyte et al., 2000;

Navakauskiene et al., 2004).

Das Enzym Tc-PTP steht in engem Zusammenhang mit dem Zellzyklus: die Transkription des Gens ist demnach mit dem Fortschritt der Zellteilung assoziiert (Wee et al., 1999; Ibarra-Sanchez et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit wurde beobachtet, daß IL-4 in Lymphocyten der Milz ein Absinken der Tc-PTP mRNA auslöst. In der Literatur werden hämatopoietischen Tumortypen be-schrieben – diffuse large B-cell lymphomas und activated B-cell-Typ Tumoren - in denen IL-4 einen deutlichen Anstieg der Tc-PTP-Expression hervorruft und damit an der Regulierung des Zellzyklus beteiligt ist (Lu et al., 2007); die interdependenten Mechanismen dieses Prozesses sind im Einzelnen noch nicht untersucht: weder jene, die den Anstieg der Tc-PTP-Expression kontrollieren, noch dieje-nigen Mechanismen, bei denen die Tc-PTP an der Proliferation maligner Zellen beteiligt sein könnte (Stuible et al., 2008). Daher geht man vorläufig davon aus, daß in verschiedenen Tumoren - auf bisher nicht geklärte Weise - eine Assoziation zwischen der Zunahme der Tc-PTP-Expression und der Zell-proliferation besteht (Yamamoto et al., 2002; Lu et al., 2007). Im Gegensatz zu dieser Annahme hat man festgestellt, daß die Zunahme im Phosphorylierungsgrad von STAT(1/3)-Transkriptionsfaktoren

(die ein Substrat der Tc-PTP sind und durch dieses Enzym mittels Dephosphorylierung deaktiviert werden) mit der Auslösung der Apoptose asoziiert ist (z.B. die durch IFNγ ausgelöste Apoptose in HeLa-Tumorzellen; ten Hoeve et al., 2002). In Übereinstimmung mit diesen in Experimenten an verschiedenen Zellsystemen erhaltenen Resultaten kann man als Arbeitshypothese die Annahme auf-rechterhalten, daß eine Abnahme der Tc-PTP-Expression entweder mit der Apoptose in Zusammen-hang steht oder diesen Prozeß, auf einem bisher noch nicht dokumentierten Weg, eventuell sogar auslöst.

In der vorliegenden Arbeit konnte beobachtet werden, daß IL-6 die Tc-PTP-Expression erhöht und IFNγ diese vermindert. Die mögliche Beteiligung einer Abnahme der Tc-PTP-Expression an der Apoptose, wenn auch zu diesem Zeitpunkt nur spekulativ, ist um so naheliegender als man die neuesten Untersuchungen hierzu beachtet. Besonders einige PTPs (z.B. R-PTPα) stehen insofern mit der Entwicklung von Apoptose-Prozessen in direkter Beziehung (Halle et al., 2007; Scarzello et al., 2007), als deren Aktivitätskontrolle einen direkten Zusammenhang mit diesen Prozessen erkennen läßt. In der vorliegenden Arbeit wird vorgeschlagen, daß eine Abnahme der Tc-PTP Genexpression (direkt oder indirekt?) in Form eines negativen Kontrollmechanismus zur Proliferation von T-Lym-phocyten die Apoptose von LymT-Lym-phocyten auslöst.

Es sollte erwähnt werden, daß die effizienteste Kontrolle des Expressionslevels für die Nort-hern-Blotting Experimente die RNA-Menge war (fotografiert in UV-Durchlicht bei 320 nm und um-gedrehten Membranen) weil das Gen der GapDH nicht als Marker für die Konstante Genexpression in T-Lymphocyten aus dem Milzgewebe des Hausschweins gegenüber mitogenen Stimuli benutzt werden konnte.