Funktionelle Untersuchungen der Protein-Histidin-Phosphatase und Identifizierung der ß-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins als deren Substrat

und Identifizierung der β-Untereinheit des

G-Proteins als deren Substrat

Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades

der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

dem

Fachbereich Pharmazie

der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Anette Mäurer

aus Ludwigshafen

Danksagung

Zu allererst möchte ich mich bei Frau Professor Dr. Susanne Klumpp für die Überlassung des interessanten Themas und für die ausgezeichnete Betreuung und Unterstützung während aller Phasen meiner Arbeit herzlich bedanken.

Herrn Prof. Dr. Dr. Josef Krieglstein, der jederzeit bereit war die Arbeit mit wertvollen Anregungen und Hinweisen zu unterstützen, möchte ich ebenfalls danken. Genau wie seinem gesamten Arbeitskreis, der mich während meines Aufenthaltes in Marburg freundlich empfangen hat. Danken will ich dabei besonders Frau Daniela Faber, ohne die, die Versuche in Marburg sicher nicht halb so gut geklappt hätten und Herrn PD Dr. Carsten Culmsee, der die Antisense-Versuche mit mir durch gestanden hat.

Bei Herrn Prof. Dr. Thomas Wieland, der mich für einige Wochen in seinem Labor in Mannheim freundlich aufgenommen hat, bei Frau Dr. Susanne Lutz, die mir beim Bau meines Adenovirus jederzeit mit Rat und Tat zur Seite gestanden hat und dem gesamten Mannheimer Arbeitskreis möchte ich mich ebenfalls sehr bedanken.

Dank auch an Herrn Prof. Dr. Thomas Gudermann für die Überlassung seines S2-Labors in Marburg.

Ein ganz herzliches Dankeschön geht selbstverständlich an meine Kolleg(inn)en aus dem Arbeitskreis in Münster für die Unterstützung, mit der man jederzeit rechnen kann, den guten Zusammenhalt und das freundschaftliche Arbeitsklima. Besonders danken möchte ich dabei Frau Dr. Dagmar Aichele und Herrn Dr. Alexander Maaßen, die immer ein offenes Ohr für Fragen hatten.

Bedanken möchte ich mich auch ganz herzlich bei meinen Freunden und meiner Familie, die mich in den vergangenen Jahren immer unterstützt haben, die immer da waren und ohne die diese Arbeit sicherlich niemals entstanden wäre.

Inhaltverzeichnis

Abkürzungen………... 14

1 Einleitung………... 18

1.1 Die reversible Phosphorylierung... 18

1.2 Phosphatasen………... 20

1.3 Signaltransduktion in Prokaryonten... 21

1.4 Histidinphosphorylierung in Eukaryonten……….. 22

1.5 Die Protein-Histidin-Phosphatase (PHP)………... 24

1.6 Die Substrate der PHP……….. 25

1.7 Fragestellung……….. 26

2 Materialien………... 28

2.2.1 Chemikalien und Enzyme……… 29

2.2.2 Medien und Zusätze………. 30

2.2.3 Kits……….. 30

2.2.4 Vektoren………. 30

2.2.5 Zelllinien………. 31

2.3 Geräte und Verbrauchsmittel……….. 31

2.3.1 Geräte………. 31

3 Methoden………... 33

3.0 Allgemeine Bemerkungen……… 33

3.1 Allgemeine proteinbiochemische Methoden……….. 33

3.1.1 Aufarbeitung von Rattengeweben……….. 33

3.1.1.1 Homogenate für G-Protein-Versuche………. 33

3.1.1.2 Zytosolische Proben für PHP-Versuche……… 34

3.1.2 Proteinbestimmung………35

3.1.2.1 Modifizierter Bradford / BioRAD...35

3.1.2.2 Lowry………....35 3.1.2.3 BCA-Methode………..35 3.1.3 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)……… 36 3.1.4 Coomassie-Färbung………. 38 3.1.5 Blotting-Verfahren………. 39 3.1.5.1 Semidry-Blotting………. 39 3.1.5.2 Tank-Blotting……….. 39 3.1.6 Ponceau S-Färbung………. 40

3.1.7 Nachweis von Proteinen mittels Antikörper..……… 40

3.1.8 Autoradiographie………... 42

3.1.9 Phosphorylierung und Dephosphorylierung von Proteinen……… 42

3.1.9.1 Phosphorylierung von Transducin……….. 42

3.1.9.2 Phosphorylierung von H10-Zellmembranen……….. 42

3.1.9.3 Phosphorylierung von Leberextrakt……….... 43

3.1.9.4 Dephosphorylierung……….. 43

3.1.10 Säure-Lauge-Behandlung………... 44

3.1.11 Temperaturbehandlung………. 45

3.2 Allgemeine molekularbiologische Methoden………. 45

3.2.1 Restriktionsverdau von DNA………...……… 45

3.2.1.1 Durchführung………. 45

3.2.1.2 Reinigung der DNA……… 46

3.2.2 Agarose-Gelelektrophorese...……….. 46

3.2.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen……….. 47

3.2.4 Photometrische Gehaltsbestimmung von DNA und RNA……….. 47

3.2.5 Alkohol-Fällung von DNA……….... 48

3.2.6 Herstellung von LB-Kanamycin-Agarplatten………. 48

3.2.7 Herstellung elektrokompetenter Zellen……….. 48

3.2.8.1 Minipräparation……….. 49

3.2.8.2 Midipräparation……….. 50

3.3 Methoden zur Herstellung eines rekombinanten Adenovirus………... 50

3.3.1 Das adenovirale Expressionssystem………. 50

3.3.2 Ligation………... 53

3.3.2.1 Durchführung……….. 53

3.3.2.2 Reinigung der DNA...………. 53

3.3.3 Elektrotransformation………... 54 3.3.4 Homologe Rekombination………... 54 3.3.5 Zelllinien………. 55 3.3.5.1 HEK 293-Zellen………. 55 3.3.5.2 TSA-Zellen………. 55 3.3.5.3 SH-SY5Y-Zellen……… 56

3.3.6 Kultivierung der Zellen………. 56

3.3.6.1 HEK 293- und TSA-Zellen………... 56

3.3.6.2 SH-SY5Y-Zellen………. 57

3.3.7 Transfektion von HEK 293-Zellen……….. 59

3.3.8 Amplifikation der Adenoviren in HEK 293-Zellen………. 60

3.3.9 Reinigung des Virus mittel Cäsiumchloridgradient………..……… 62

3.3.10 Titerbestimmung des Virus mit Hilfe der Viabilitätsmethode………... 64

3.3.11 Infektion von TSA- und SH-SY5Y-Zellen……… 65

3.3.12 Aufarbeitung der infizierten Zellen………... 66

3.4 Methoden zur Antisensebehandlung……… 67

3.4.1 Anlegen und Kultivierung von Primärkulturen……….. 67

3.4.2 Aufarbeitung hippokampaler und kortikaler Neurone……….. 67

3.4.2.1 Protokoll A……….. 67

3.4.2.2 Protokoll B……….. 68

3.4.3 Oligonukleotidsequenzen für die PHP-Antisenseblockade……….... 68

3.4.4 Test auf Toxizität der Oligonukleotide………... 70

3.4.5 Antisensebehandlung von Primärkulturen……… 70

3.4.5.1 Unmodifizierte und PTO-Antisense-Oligonukleotide……… 70

3.4.5.2 FITC-markierte Antisense-Oligonukleotide……… 70

3.4.6 Staurosporinschädigung der Antisense behandelten Neurone……...……….. 71

3.4.7 Hoechst-Färbung... 72

3.4.9 Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)... 73 3.4.9.1 Reverse Transkription... 73 3.4.9.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)... 74 3.4.9.3 Auswertung der RT-PCR... 75 3.4.10 Statistik... 75

4 Ergebnisse... 76

4.1 Regulierung der PHP-Expression mittels Antisensetechnologie... 76

4.1.1 Expression der PHP im Gehirn... 77

4.1.2 Antisensebehandlung kortikaler Neurone... 78

4.1.3 Staurosporinschädigung Antisense behandelter Neurone... 80

4.1.3.1 Beobachtungen auf zellulärer Ebene... 81

4.1.3.2 Beobachtungen auf Proteinebene... 82

4.1.3.3 Beobachtungen auf Ebene der mRNA... 83

4.1.4 Einsatz von Phosphothionat-Antisense-Oligonukleotiden... 85

4.1.5 Verwendung eines neuen Antisense-Oligonukleotids... 87

4.1.6 Behandlung mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden... 90

4.2 Überexpression der PHP mit Hilfe eines rekombinanten Adenovirus... 92

4.2.1 Einklonierung der PHP-Sequenz in den Shuttle-Vektor pAd-Track-CMV... 94

4.2.2 Transfektion von HEK 293-Zellen mittels pAd-Track-CMV-PHP... 96

4.2.3 Homologe Rekombination... 98

4.2.4 Transfektion von HEK 293-Zellen... 99

4.2.5 Infektion von TSA-Zellen... 100

4.2.6 Infektion von SH-SH5Y-Zellen... 102

4.2.7 Auswirkung der Ad5-PHP-Infektion auf SH-SY5Y-Zellen... 104

4.3 Identifizierung eines neuen Substrats der PHP... 108

4.3.1 Phosphorylierung und Dephosphorylierung des G-Proteins... 109

4.3.2 Charakterisierung der Phosphorylierung von Gβ... 110

4.3.2.1 Temperaturbehandlung... 110

4.3.2.2 Säure-Lauge-Behandlung... 111

4.3.3 Spezifität der Dephosphorylierung... 112

5 Diskussion... 117

5.1 Die Funktion der PHP... 117

5.1.1 Herabregulierung der PHP-Expressionsrate... 117

5.1.2 Erhöhung der PHP-Expressionsrate... 120

5.1.3 PHP und Apoptose... 121

5.2 Das Substrat der PHP... 122

5.2.1 Die Gβ-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins... 122

5.2.2 G-Proteine...124

5.2.3 Die Phosphorylierung der Gβ-Untereinheit... 126

5.3 Ausblick... 127

6 Zusammenfassung... 129

7 Literaturverzeichnis...131

Abkürzungen

AA amino acid

ACL ATP-Citrat-Lyase

Ad5 humaner Adenovirus vom Serotyp 5

AK Antikörper

AP Alkalische Phosphatase

APS Ammoniumperoxodisulfat

AS Antisense-Oligonukleotid

ATP Adenosin-5’-triphosphat

BAD Bcl-2/Bcl-XL antagonist causing cell death

BCA Bicinchoninsäure

bp Basenpaare

BSA Bovines Serumalbumin

°C Grad Celsius

cAMP cyclisches Adenosin-3’,5’-monophosphat

cDNA copy-DNA cGMP cyclisches Guanidin-3’,5’-monophosphat Ci Curie CMV Cytomegalie-Virus-Promoter CoA Coenzym A CsCl Cäsiumchlorid d Tag DAG Diacylglycerol

DMEM Dulbelcos Modified Eagle Medium

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynucleosidtriphosphat

DTT Dithiothreitol

ECL enhanced chemoluminescence

E.coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGF epidermal growth factor

FCS fetal calf serum

g Gramm

Gα Alpha-Untereinheit heterotrimerer G-Proteine Gβ Beta-Untereinheit heterotrimerer G-Proteine Gγ Gamma-Untereinheit heterotrimerer G-Proteine

GDP Guanidin-5’-diphosphat

GFP grün fluoreszierendes Protein

GTP Guanidin-5’-triphosphat

h Stunde

HEK human embryonic kidney

HEPES 2-[-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure I-1/I-2 Inhibitorprotein 1 und 2

Ig Immunoglobulin

IP3 Inositol-1,4,5-triphosphat

JUN-Kinase c-JUN N-terminale Kinase (JNK)

K Kontrolle

kDa Kilodalton

l Liter

LB Luria Bertani

M Mol/Liter

MAPKs mitogene-activated protein kinases

MCS multiple cloning site

MEM Modified Eagles Medium

MG Molekulargewicht

µg Mikrogramm

min Minute

MMLV-RT Maloney-Maus-Leukämie-Virus-Reverse-Transkriptase

mRNA messenger RNA

MS Missense-Oligonukleotid NDP Nukleosiddiphosphat NDPK Nukleosid-Diphosphat-Kinase nm Nanometer N-Terminus Amino-Terminus NTP Nukleosidtriphosphat OD Optische Dichte

ori origin of replication

PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese

PBS phosphate buffered saline

PCR Polymerase chain reaction

PD proportionale Distanz

PEI Polyethylenimin

pfu plaque forming units

PHP Protein-Histidin-Phosphatase PIP2 Phosphatidyl-Inositol-biphosphat PK C Proteinkinase C PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid PNPP p-Nitrophenylphosphat PP Proteinphosphatase

PP1 Proteinphosphatase vom Typ 1

PP2 Proteinphosphatase vom Typ 2

PPM Magnesium abhängige Proteinphosphatasen

PPP Phosphoprotein-Phosphatasen

PTEN phosphatase and tensin homolog

PTO Phosphothionat

PTP Protein-Tyrosin-Phosphatase

PVDF Polyvinylidendifluorid

RNA Ribonukleinsäure

rpm revolutions per minute

RT Reverse Transkriptase s Sekunde SD Standardabweichung SDS Sodiumdodecylsulfat STS Staurosporin SV 40 Simian Virus 40 TAE Tris/Essigsäure/EDTA

TBST Tris buffered saline/Tween 20

TCA Trichloressigsäure

TE Tris/EDTA

TCID50 tissue culture infective dose 50

Tris Tris-hydroxymethyl-aminomethan

U Unit

UV ultraviolett

V Volt

1 Einleitung

1.1 Die reversible Phosphorylierung

Kinasen sind Enzyme, die in ihrer Eigenschaft als Phospotransferasen, Phosphatreste auf bestimmte Aminosäuren von Proteinen übertragen. Ihre Gegenspieler sind die Phosphatasen, welche die kovalent gebundenen Phosphatreste wieder hydrolytisch abspalten können. Durch diesen Vorgang, die so genannte reversible Phosphorylierung von Proteinen, wird eine Vielzahl von Vorgängen in der eukaryontischen Zelle ausgelöst oder auch beendet. Durch das An- und Abhängen des Phosphatrestes ändert sich die Konformation eines Enzyms, wodurch es entweder aktiviert oder inaktiviert wird (Abbildung 1-1).

Abbildung 1-1 Die reversible Phosphorylierung

Ein Protein wird mit Hilfe einer Proteinkinase phosphoryliert. Durch Konformationsänderung wird das Enzym aktiviert bzw. deaktiviert. Die Dephosphorylierung mittels Proteinphosphatase versetzt das Enzym wieder in seinen Ausgangszustand. + NTP - Pi

P

Proteinkinase

Proteinphosphatase

Dieser Mechanismus dient somit in der Zelle der Eukaryonten als eine Art Ein- und Ausschalter enzymatischer Prozesse. Auch die Regulation von Rezeptoren, Ionenkanälen und Transkriptionsfaktoren unterliegt der reversiblen Phosphorylierung. Daher spielt diese bei den regulatorischen Vorgängen innerhalb des Organismus eine wichtige Rolle. Durch Regulierung der Transkription wirkt sie zum Beispiel an der Entstehung und dem Aufbau der Zellen mit. Sie ist an der Signalweiterleitung der Zellen untereinander und innerhalb der einzelnen Zellen beteiligt (Krebs, 1986) und wirkt letztendlich auch bei der Entscheidung mit, ob eine Zelle abstirbt (Apoptose) oder nicht (Ruvolo et al., 2001). Es ist bekannt, dass circa ein Drittel aller eukaryontischen Enzyme kovalent an Phosphat gebunden sind, und schon allein das menschliche Genom codiert 500 Proteinkinasen und 170 Proteinphosphatasen (Cohen, 2001).

Die ersten Hinweise auf die Phosphorylierung von Proteinen fand man schon in den Dreißiger Jahren des vorigen Jahrhunderts, als man die Bindung von Phosphat an die Aminosäure Serin entdeckte (Lipmann und Levene, 1932). In den Fünfzigern stieß man auch auf die Phosphorylierung von Threonin (Burnett und Kennedy, 1954), kurz darauf auf die von Histidin (Boyer et al., 1962) und schließlich Ende der Siebziger auf die Tyrosinphosphorylierung (Eckhart et al., 1979). Die Bedeutung der reversiblen Phosphorylierung für die Regulation der enzymatischen Aktivität endeckten schließlich Fisher und Krebs, die die stoffwechselregulierende Phosphorylase-Kinase, eine Serinkinase, reinigen konnten und herausfanden, dass das Stoffwechselenzym Glycogen-Phosphorylase nur in seiner aktiven, phosphorylierten Form Glycogen in Glukose-1-phosphat umwandeln kann (Fisher et

al., 1959). Für diese Arbeiten bekamen sie 1992 den Nobelpreis verliehen. Im

Folgenden wurden weitere Kinasen wie zum Beispiel die cAMP-abhängige Proteinkinase, die Proteine an Serin-/Threoninresten phosphoryliert (Erikson et al., 1979) oder die Gruppe der Tyrosinkinasen (Hunter, 1987) entdeckt.

Somit konnte das Wissen über die Bedeutung der reversiblen Phosphorylierung stetig erweitert werden. Vor allem stellte man aber fest, dass der so einfach erscheinende Mechanismus bei weitem komplizierter ist als er auf den ersten Blick aussehen mag. Viele Zielproteine besitzen nicht nur eine, sondern mehrere Phosphorylierungsstellen, die abhängig oder unabhängig voneinander phosphoryliert bzw. dephosphoryliert werden können (Roach, 1990). So hat zum Beispiel das nur aus 204 Aminosäuren bestehende, proapoptotische Protein BAD sieben bekannte

Phosphorylierungsstellen (Klumpp et al., 2004b; Yu et al., 2004) über deren gegenseitigen Wechselwirkungen man bis heute noch kaum etwas weiß. Hinzu kommt, dass auch die Kinasen und Phosphatasen selber reversibel phosphoryliert werden können. Die reversible Phosphorylierung von Proteinen ist also nicht nur ein wichtiger, sondern auch ein sehr komplexer Vorgang, mit dessen Hilfe es möglich ist eine koordinierte Kontrolle der Enzyme im Organismus zu gewährleisten.

1.2 Phosphatasen

Dadurch, dass die Entdeckung der reversiblen Phosphorylierung vor allem mit dem Auffinden von Kinasen und deren Regulation zum Beispiel über Calcium (Krebs et

al., 1959), cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) (Walsh et al., 1968) oder

cyclisches Guanidinmonophosphat (cGMP) (Kuo und Greengard, 1970) begonnen hatte, standen die Phosphatasen bei der Untersuchung der Phosphorylierung von Proteinen lange im Schatten der Kinasen, obwohl ihre Existenz schon früh bekannt war (Krebs und Beavo, 1979). In den letzten Jahren rückten sie aber zunehmend in den Blickwinkel des Interesses.

Die zuerst entdeckte Gruppe von Phosphatasen waren die Serin-/Threoninphosphatasen. Ursprünglich wurden diese nach biochemischen Gesichtspunkten, wie Substratspezifität, Sensitivität gegenüber bestimmten Inhibitoren und Kationenabhängigkeit in zwei Gruppen aufgeteilt. Die Serin-/Threonin-Proteinphosphatase vom Typ 1 (PP1) kann durch die hitzestabilen Proteine Inhibitor 1 und 2 (I-1/I-2) gehemmt werden und bevorzugt die β-Untereinheit der Phosphorylase-Kinase als Substrat. Die Serin-/Threonin-Proteinphosphatase vom Typ 2 (PP2) ist dagegen nicht durch I-1 und I-2 hemmbar und dephosphoryliert die α-Untereinheit der Phosphorylase-Kinase. Die Typ 2 Proteinphosphatasen unterteilen sich weiterhin in kationenunabhängige (PP2A), in calciumabhängige (PP2B = Calcineurin) und in magnesiumabhängige Phosphatasen (PP2C) (Ingebritsen und Cohen, 1983). Die Serin-/Threoninphosphatasen gehören zwei verschiedenen Genfamilien an: PP1, PP2A und PP2B gehören zur Familie der Phosphoprotein-Phosphatasen (PPP-Familie), während die PP2C zur Familie der magnesiumabhängigen Proteinphosphatasen (PPM) gehört. Inzwischen sind noch viele neue Phosphatasen entdeckt worden, die man ebenfalls in diese Ordnung einfügen kann.

Eine weitere Gruppe von Phosphatasen sind die in den achtziger Jahren entdeckten Tyrosinphosphatasen (PTP) (Tonks et al., 1988). Man unterteilt sie aufgrund ihres Vorkommens und ihrer Spezifität in drei Gruppen: In transmembrane, zytosolische und dual-spezifische Tyrosinphosphatasen. Sie besitzen alle eine hochkonservative Sequenz im aktiven Zentrum, die ein Cystein und ein fünf Aminosäuren entfernt liegendes Arginin enthält. Ansonsten ähneln sich die PTPs aber kaum in ihrer Sequenz. Sie sind unabhängig von Metallionen und dephosphorylieren bevorzugt Tyrosinreste, obwohl die dual-spezifischen PTPs auch in der Lage sind Serin- und Threoninreste anzugreifen. Vom Tumorsupressor PTEN, der ebenfalls der Familie der Tyrosinphosphatasen angehört, weiß man, dass er sogar Inositolphospholipide als Substrat erkennt (Maehama and Dixon, 1998).

1.3 Signaltransduktion in Prokaryonten

Die reversible Phosphorylierung ist ein Vorgang, den man hauptsächlich in eukaryontischen Zellen beobachtet. Dabei spielen wie gesehen Serin-, Threonin- und Tyrosinreste eine zentrale Rolle. Aber auch in prokaryontischen Zellen ist das Übertragen von Phosphatresten ein entscheidender Vorgang in der Signaltransduktion.

Bakterien bedienen sich dabei des so genannten Zwei-Komponenten-Systems, welches an dem an der Chemotaxisregulation beteiligten Enzym CheA aus E.coli hinreichend charakterisiert worden ist (Alex und Simon, 1994). Dieses Zwei-Komponenten-System besteht in der Hauptsache aus einer Sensordomäne und einem Antwort-Regulator. Ein äußerer Reiz wie zum Beispiel das Absinken des pH-Wertes oder die Erhöhung des Nahrungsangebotes in der direkten Umgebung des Bakteriums ruft eine Konformationsänderung des Sensorproteins hervor. Dadurch kommt es zu einer autokatalytischen Phosphorylierung eines Histidinrestes. Dieser Phosphatrest wird von dort auf ein Aspartat des Antwortregulators übertragen. Die dadurch hervorgerufene Änderung der Konformation ruft ein Signal hervor (Parkinson und Kofoid, 1992). Das Bakterium reagiert also auf den äußeren Reiz. Wie man sieht, läuft die Signaltransduktion der Bakterien also nicht über Serin, Threonin oder Tyrosin, sondern über die Aminosäuren Histidin und Aspartat. Das Zwei-Komponenten-System ist im Reich der Bakterien weit verbreitet (Swanson et

und Aspartatphosphorylierung und deren Dephosphorylierung nur in Prokaryonten findet, während die Phosphorylierung beziehungsweise Dephosphorylierung an Serin, Threonin und Tyrosin den Eukaryonten vorbehalten ist. Diese These ist allerdings nicht mehr haltbar. So fand man zum Beispiel in Bakterien Homologe zu den bekannten Serin-/Threonin- und Tyrosinphosphatasen (Kennelly und Potts, 1996) und auch in Bezug auf die Histidinphosphorylierung in Eukaryonten hat sich das Bild in den vergangenen Jahren wesentlich verändert.

1.4 Histidinphosphorylierung in Eukaryonten

Proteinhistidinphosphat wurde schon in den 1960er Jahren von Boyer und Kollegen im Vertebraten gefunden (Boyer et al., 1962; Bieber und Boyer, 1966). Dennoch dauerte es danach fast 30 Jahre, bis man neue Erkenntnisse auf diesem Gebiet sammeln konnte. Das liegt vor allem daran, dass der Nachweis von Phosphohistidinproteinen nicht ganz einfach ist. Phosphohistidin ist säurelabil und wird dadurch bei den herkömmlichen Untersuchungsmethoden wie zum Beispiel der Sequenzierung von Aminosäuren oft nicht erfasst. Man hat es im Eukaryonten nicht gefunden, weil es im Laufe der Untersuchungen einfach zerstört wurde und somit undetektiert blieb. Hinzu kommt, dass es nicht möglich ist, Antikörper gegen Phosphohistidin herzustellen, weil diese Verbindung zu schnell hydrolisiert. Phosphohistidin weist das höchste Energiepotential unter den Phosphoproteinen auf. Daher findet man bei enzymatischen Reaktionen auch oft Histidinproteinintermediate. Dies ist zum Beispiel bei einer Reihe von Stoffwechselenzymen wie der Succinyl-CoA-Synthetase, der ATP-Citrat-Lyase, der Pyruvatphosphat-Kinase oder der Glucose-6-Phosphatase der Fall. Die Untersuchungsmethoden haben sich im Laufe der Zeit den Bedürfnissen der Phosphohistidinproteine angepasst (Noiman und Shaul, 1995) und man konnte neben den zuvor beschriebenen Histidinintermediaten von Enzymen auch noch eine Reihe weiterer an Histidin phosphorylierter Proteine finden. Inzwischen konnten auch einige von ihnen im Vertebraten identifiziert werden.

Das erste an Histidin phosphorylierte Protein, welches man fand, war das Kernprotein Histon H4 (Chen et al., 1974). Da es möglich war dieses Protein mit Hilfe einer aus der Hefe isolierten Proteinhistidinkinase zu phosphorylieren, verwendete man es in der Folgezeit auch als Substrat zum Auffinden einer

Proteinhistidinphosphatase im Vertebraten. Die Dephosphorylierung gelang auch. Man musste aber leider feststellen, dass die angreifenden Phosphatasen die lange bekannten Serin-/Threoninphosphatasen PP1, PP2A und PP2C waren (Kim et al., 1993; Matthews, 1995), womit dieser Ansatz wieder verworfen werden musste.

Ein weiteres an Histidin phosphoryliertes Protein ist das Annexin I (Muimo et al., 2000). Es ist ein 37 kDa großes Protein, das zur Familie der calciumabhängigen Phospholipid-Bindeproteine gehört. P-Selektin ist ein Leukozytenadhäsionsmolekül, das nach der Aktivierung von Thrombozyten mit Thrombin oder Kollagen an Histidin phosphoryliert war (Crovello et al., 1995). Auch die β-Untereinheit des trimeren G-Proteins wird an einem Histidin phosphoryliert (Wieland et al., 1993).

Ein weiteres, sehr interessantes an Histidin phosporyliertes Protein ist die Nukleosid-Diphosphat-Kinase (NDPK) (Postel, 1998), die je nach Organismus aus 4-6 identischen Untereinheiten von jeweils 16-20 kDa besteht. Die beiden Isoenzyme des Proteins (NDPK A und B; im Folgenden als NDPKs bezeichnet) katalysieren die Übertragung von Phosphatresten von Nukleosidtriphosphaten (NTP, z.B. ATP) auf Nukleosiddiphosphate (NDP, z.B. GDP) und sorgen damit für die Bereitstellung der für die jeweilige Stoffwechsellage notwendigen Nukleosidtri- bzw. diphosphate. Dieser Vorgang verläuft über einen so genannten „Ping-Pong-Mechanismus“ an dem ein an Histidin phosphoryliertes Intermediat beteiligt ist (Parks und Agarwal, 1973):

NDPK-His + N1TP
NDPK-His-P + N1DP (Autophosporylierung NDPK)

NDPK-His-P + N2DP
NDPK-His + N2TP (Phosphotransfer auf NDP)

Was die NDPKs für die Histidinphosphorylierung aber so interessant macht, ist nicht ihre Fähigkeit Phosphatreste zwischen Nukleosidphosphaten auszutauschen, sondern die Tatsache, dass sie auch Phosphatreste auf Proteine übertragen können. So wird zum Beispiel die ATP-Citrat-Lyase durch NDPKs an Histidin phosphoryliert (Wagner und Vu, 1995). Dasselbe gilt auch für die Aldolase (Wagner und Vu, 2000). Des Weiteren konnte NDPK B als die Kinase identifiziert werden, die die Gβ-Untereinheit des trimeren G-Proteins phosphoryliert (Cuello, et al., 2003; Hippe et al., 2003). Die Nukleosid-Diphosphat-Kinase ist damit nicht nur ein an Histidin phosphoryliertes Protein, sie fungiert auch als Histidinkinase. Eine weitere Histidinkinase, die allerdings bisher weder gereinigt noch sequenziert worden ist, wurde in den Inselzellen des Pankreas gefunden und beschrieben (Kowoluru, 2002).

Zusammenfassend kann also festgestellt werden, dass die Phosphorylierung an Histidinresten in Eukaryonten vielfältig gezeigt werden konnte.

1.5 Die Protein-Histidin-Phosphatase (PHP)

An Histidin phosphorylierte Proteine im Säuger sind bekannt und auch Histidinkinasen konnten entdeckt werden. Daher ist es nicht weiter verwunderlich, dass inzwischen auch die erste Protein-Histidin-Phosphatase (PHP) aus Vertebraten gereinigt und sequenziert worden ist. Im Jahre 2002 veröffentlichten zwei verschiedene Arbeitsgruppen (Klumpp et al., 2002b; Ek et al., 2002; Klumpp et al., 2004a) unabhängig voneinander Berichte über ein 13,7 kDa großes, monomeres Protein, das aus 125 Aminosäuren aufgebaut ist und in der Lage war, Phosphat von Histidinresten hydrolytisch abzuspalten. Diese Histidinphosphatase ist im Zytosol lokalisiert und wird ubiquitär im Organismus exprimiert (Hermesmeier, 2000). Das Enzym ist nur in höheren Organismen wie dem Menschen, der Ratte, dem Kaninchen oder C.elegans zu finden nicht aber in Bakterien oder Hefen. Das humane PHP-Gen ist auf dem Chromosom 9 (9q34.3) lokalisiert.

Die PHP zeigt keine Gemeinsamkeiten zu den bekannten eukaryontischen Serin-/Threonin- oder Tyrosinphosphatasen auf. Die für diese Phosphatasen typischen Substrate wie pNitrophenylphosphat (PNPP), phosphoryliertes Casein oder der EGF-Rezeptor werden von der PHP nicht dephosphoryliert. Auch eine Abhängigkeit von Metallionen wie Calcium oder Magnesium, wie man sie von den Serin-/Threoninphosphatasen her kennt, war nicht zu beobachten. Gängige Phosphataseinhibitoren wie die hitzestabilen Inhibitorproteine I-1 und I-2, Okadainsäure (Cohen, et al., 1990) oder Vanadat (Gordon, 1991) hatten keinen Einfluss auf das Protein. Homologien zu anderen Phosphatasen, auch zu den bakteriellen oder den in Hefen vorkommenden, konnten nicht festgestellt werden. Demnach gehört die PHP einer eigenständigen Klasse von Phosphatasen an (Hermesmeier, 2000).

Über den Mechanismus der von der Phosphatase katalysierten Dephosphorylierung und über die Funktion des Proteins im Organismus ist noch wenig bekannt. Allerdings konnte vor einiger Zeit (Klumpp et al., 2003a) das erste physiologisch relevante Substrat der PHP entdeckt werden, was erste Schlussfolgerungen in Bezug auf die physiologische Bedeutung des Enzyms zuließ.

1.6 Die Substrate der PHP

Das erste Protein, welches von der PHP an einem Histidinrest dephosphoryliert werden konnte, war das bakterielle Enzym CheA, das für die Chemotaxisregulation in E.coli verantwortlich ist (Alex und Simon, 1994). Es diente als nützliches Testsystem für die Entdeckung und Charakterisierung der PHP (Hermesmeier, 2000; Klumpp et al., 2002b). Als prokaryontisches Protein hatte es aber keinerlei physiologische Bedeutung für die ausschließlich in Eukaryonten exprimierte PHP. Das gleiche galt für das an Histidin phosphorylierte Phosphopeptid, welches eine schwedische Forschergruppe (Ek et al., 2002) für die Identifizierung und Untersuchung der Phosphatase synthetisiert hatte.

Im Jahre 2003 konnte jedoch ein an Histidin phosphoryliertes Protein, welches von der PHP dephosphoryliert werden konnte, aus der Kaninchenleber isoliert werden (Klumpp et al., 2003a). Die anschließende Sequenzierung ergab, dass es sich dabei um die ATP-Citrat-Lyase (ACL) handelte. Die ACL ist ein homotropes allosterisches Enzym mit einem Molekulargewicht von 440 kDa, das aus vier fast identischen Untereinheiten von je 110 kDa aufgebaut ist (Srere, 1959; Singh et al., 1976). Genau wie die PHP ist es ubiquitär im eukaryontischen Organismus vorhanden, was dafür spricht, dass es ein physiologisches Substrat der Phosphatase ist.

Abbildung 1-2 Schematische Darstellung der humanen ATP-Citrat-Lyase

Die ACL wird an Histidin760, welches in der Nähe der Bindedomänen von CoA, Magnesium und ATP liegt, phosphoryliert. An Threonin446, Serin450 und Serin454 wird das Enzym ebenfalls phosphoryliert.

N

---//--I---I---I---I---I--//--- C

P

Die PHP dephosphoryliert die ACL an Histidin760 _{(Klumpp et al., 2003a), einem}

Histidinrest, der im katalytischen Zentrum des Enzyms (Ramakrishna et al., 1989) lokalisiert ist und an dem sich die humane ACL in Gegenwart von Mg2+ und ATP autokatalytisch phosphoryliert. Wagner und Vu fanden 1995 heraus, dass die ACL auch durch NDPKs am Histidin760 phosphoryliert werden kann (Wangner und Vu, 1995). Welche Bedeutung dies für die ACL hat, ist allerdings nicht bekannt. Andere Phosphorylierungsstellen des Enzyms, über die auch dessen Aktivität reguliert wird, sind Threonin446, Serin450 und Serin454 (Abbildung 1-2).

Die ACL ist eine Lyase und katalysiert unter Verbrauch von ATP die Umsetzung von Citrat und Coenzym A (CoA) zu Acetyl-CoA und Oxalacetat. Dadurch stellt sie Acetyl-CoA für die Lipidsynthese bereit (Pilkis et al., 1988) und ist ebenfalls an der Synthese des Neurotransmitters Acetylcholin beteiligt (Patel und Owen, 1976). Die ACL ist somit ein physiologisch bedeutendes Protein. Inzwischen gibt es erste Hinweise darauf, dass die Aktivität der ACL bei Dephosphorylierung durch die PHP sinkt, die PHP also einen regulatorischen Einfluss auf die ACL hat (Persönliche Mitteilung, Prof. Krieglstein u. M. Lehmann, Universität Marburg). Somit könnte auch die Phosphatase bei der Lipid- und der Acetylcholinsynthese des Organismus eine Rolle spielen.

1.7 Fragestellung

Die reversible Phosphorylierung von Proteinen ist ein in Eukaryonten wichtiger Regulationsmechanismus. Jahrelang dachte man, dass daran nur die Kinasen und Phosphatasen, die an den Aminosäureresten Serin, Threonin und Tyrosin angreifen, beteiligt sind. Inzwischen haben sich jedoch die Hinweise verdichtet, dass die reversible Phosphorylierung im Eukaryonten ebenso gut an einem Histidinrest stattfinden kann. Somit sind also auch die am Histidin angreifenden Kinasen und Phosphatasen an den Regulationsmechanismen der Zelle beteiligt, und es ist wichtig mehr über ihre Eigenschaften und Funktionen zu lernen, um die in den Zellen ablaufenden Prozesse besser verstehen zu können. Daher war das Ziel der hier vorliegenden Arbeit, das immer noch relativ neue und unbekannte Protein PHP weiter zu charakterisieren und mehr über seine möglichen Funktionen in der Zelle herauszufinden. Dabei wurden zwei verschiedene Ansätze verfolgt:

Eine Möglichkeit die Funktion eines Proteins aufzudecken ist es, die Expressionsrate des Enzyms in der Zelle zu verändern. Man kann untersuchen, ob die Zelle mit einer geringeren oder größeren Menge des betreffenden Enzyms noch lebensfähig ist und ob sie unter diesen Bedingungen auf äußere Einflüsse anders reagiert als die unveränderte Zelle dies tut. Aus diesem Grund wurde die Expressionsrate der PHP zum einen mit Antisense-Oligonukleotiden nach unten, zum anderen mit Hilfe eines rekombinanten Adenovirus nach oben reguliert und die Reaktion der Zellen daraufhin unter verschiedenen Bedingungen getestet.

Ein anderer Ansatz etwas über ein Protein herauszufinden, ist die Suche nach neuen Substraten. Es gibt in Eukaryonten eine Reihe an Histidin phosphorylierter Proteine, die durch eben diese Histidinphosphorylierung potentielle Substrate der an Histidin angreifenden PHP sind. Das Auffinden neuer Substrate könnte, wie das bei der bereits entdeckten ACL der Fall war, Rückschlüsse auf eine mögliche Funktion des Enzyms zulassen. Deshalb sollten die bekannten Phosphohistidinproteine näher untersucht werden.

2 Materialien

2.1 Proteinbiochemische Materialien

2.1.1 Chemikalien

Acrylamid/Bisacrylamid 30% (37,5:1) Roth

Alkalische Phosphatase Sigma-Aldrich

2-Amino-2-hydroxymetyldiamin (Tris) Amersham Life Science

Ammoniumperoxodisulfat AppliChem

Benzamidin Sigma-Aldrich

BioRAD Protein Assay BioRAD Laboratories

Borsäure Sigma-Aldrich

Bovines Serumalbumin Sigma-Aldrich

Bromphenolblau Sigma-Aldrich

Calpaininhibitor Sigma-Aldrich

Cäsiumchlorid Merck

Chloroform Merck

Coomassie Brilliant Blue R-250 BioRAD Laboratories

Di-Natriumhydrogenphosphat Sigma-Aldrich

Dithiothreitol Sigma-Aldrich

Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich

ECLTM Amersham Pharmacia Biotech

Entwickler AGFA-Gevaert Essigsäure Merck Ethanol Merck Ethylendiamintetraessigsäure Serva Fixierer AGFA-Gevaert Folin-Ciocalteau-Phenol-Reagenz Merck Formalin Merck

[gamma32P]GTP Amersham Bioscience

Glycerin Sigma-Aldrich

Glycin Sigma-Aldrich

Guanosin-5’-triphosphat Sigma-Aldrich

Harnstoff Merck

HEPES Sigma-Aldrich

Hoechst 33258 (Bisbenzimid) Sigma-Aldrich

Isopropanol Merck

Kaliumchlorid Merck

Kaliumdihydrogenphosphat Sigma-Aldrich

Kaliumhydroxid Merck

Kalium-Natriumtartrat Merck

Kupfersulfat Riedel de Haën

Magermilchpulver Merck

Magnesiumchlorid Merck

Magnesiumsulfat Sigma-Aldrich

2-Mercaptoethanol Fluka

MicroBCA Protein Assay System Interchim Natriumacetat Roth Natriumazid Sigma-Aldrich Natriumcarbonat Merck Natriumchlorid Merck Natriumdodecylphosphat Fluka Natriumhydroxid Merck Natriumtetraborat Sigma-Aldrich N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin Sigma-Aldrich Paraformaldehyd Sigma-Aldrich

peqGOLD prestainded Protein Marker III Peqlab peqGOLD prestainded Protein Marker IV Peqlab

Phenylmethylsulfonylfluorid Serva

Polyethylenimin Sigma-Aldrich

Poly-L-Lysin Sigma-Aldrich

Ponceau S Sigma-Aldrich

PPM-Marker low range Roche

Protein-Histidin-Phosphatase, eukaryontisch Merck

Protein-Histidin-Phosphatase, baktriell N. Bäumer, AK Klumpp

Rattenschwanz-Kollagen Upstate

Saccharose Serva

Salzsäure 37 % Riedel de Haën

Staurosporin Sigma-Aldrich

Trichloressigsäure Merck

Trichlortrifluorethan Merck

Trypsin 1:250, Schweinepankreas Sigma-Aldrich Trypsininhibitor Type II-6 Sigma-Aldrich

Tween® 20 Serva

2.1.2 Antikörper

Anti-Gβ-(T20) Santa Cruz Biotechnologies

Anti-mouse-Ig Amersham Pharmacia Biotech

Anti-PHP/N-Terminus (Klumpp et al., 2002b)

Anti-rabbit-Ig Amersham Pharmacia Biotech

Anti-α-Tubulin Sigma-Aldrich

2.2 Molekularbiologische Materialien

2.2.1 Chemikalien und Enzyme

Agarose (low melting) Sigma-Aldrich

Bacto-Agar DIFCO Laboratories

Bacto-Hefeextrakt DIFCO Laboratories

DNAse I Roche

dNTPs New England Biolabs

Ethidiumbromid Stratagene

1 kb-ladder Gene Reader

MMLV-RT Sigma-Aldrich

Oligo(dT)-10-Primer MWG Biotech

Oligonukleotide MWG Biotech

PCR-Primer MWG Biotech

PCR-Puffer Roche

Polyfect®Transfection Reagent Quiagen

Restriktionsenzyme und Puffer New England Biolabs/Roche

Rnase-Inhibitor Promega

T4-Ligase und Puffer Stratagene

ThermoPrime Plus DNA-Polymerase Advanced Biotechnologies

2.2.2 Medien und Zusätze

Aminosäuren, nicht essentiell Gibco BRL

B27 Supplement Gibco BRL

DMEM Gibco BRL

Fötales Kälberserum PAA/Gibco BRL

Gentiamicinsulfat Sigma-Aldrich

L-Glutamin Sigma-Aldrich

Ham’s F12 Gibco BRL

Kanamycin Gibco BRL

MEM Gibco BRL

Neurobasal® Medium Sigma-Aldrich

OptiMEM® Gibco BRL

Pen/Strep-Lösung Gibco BRL

2.2.3 Kits

GenEluteTM _{Plasmid Midiprep Kit Sigma-Aldrich}

GenEluteTM Plasmid Miniprep Kit Sigma-Aldrich High Pure PCR Purification Kit Roche

RNeasy-Kit Quiagen

2.2.4 Vektoren

pAd-easy-1 Stratagene

pAd-Track-CMV Stratagene

2.2.5 Zelllinien

E.coli -BJ5183 Stratagene

E.coli -XL10-Gold Stratagene

HEK 293-Zellen Stratagene

SH-SY5Y-Zellen Prof. Krieglstein, Marburg

TSA-Zellen Prof. Wieland, Heidelberg

2.3 Geräte und Verbrauchsmittel

2.3.1 Geräte

Agarosegelkammer Biometra Agagel-Midi-Wide

Analysenwaage Satorius CP1245

Blotapparaturen BioRAD Miniprotean 3 cell,

BioRAD Trans-Blot SD

Brutschrank Heraeus Hera all 240

Digitalwaagen Satorius BP1200, CP8201,

BL3100,

Mettler PL200

Eismaschine Castel MAC, Icematic D100

Elektroporator BioRAD Gene Pulser

Fluoreszenzmikroskop Zeiss Axiovert 150, Axiovert 25

Geltrockner BioRAD Gel Dryer Model 583

Geldokumentationssystem Raytest Cybertech Cs 1,

Cybertech ICC/4,

Mitsubishi Thermodrucker K61B

Glasschliffhomogenisatoren Braun

Heizblock Eppendorf Thermomixer 5436

Imager Alpha Innotech Cooperation

MultiImage Light Cabinet

Inkubationsschüttelhaube New Brunswick Scientific

inn va 4000

Konfokales Laserscanning-Mikroskop Zeiss LSM 510

Kühlschränke/-truhe Privileg, Privileg Öko,

Liebherr Profiline, Heraeus Hera Freeze

Kühlzentrifugen Hettich Universal 16R,

Heraeus Megafuge 1.0R, Hermle Z 323 K,

Beckmann Microfuge K, Heraeus Biofuge fresco

Laborbänke Heraeus Hera safe,

Heraeus Lamin Air ELB 2448

Lichtmikroskop Olympus OM-4Ti

Micropistille Eppendorf

Mikrowelle Privileg 2026

pH-Meter WTW pH 525

Phosphoimager Raytest AIDA Image Analyser,

Eraser

Fujifilm BAS-1800 II

Photometer Pharmacia Biotech

Ultrospec 1000, 2000

Platten-Reader Titertek Multiscan MCC/340

Röntgenfilm-Entwicklermaschine Protec Gerätebau Compact 35

Schüttler Heidolph Promax 1020,

Duomax 1030

SpeedVac UniEquip Univapo 100H

Stromquellen BioRAD Power Pac 200, 300,

1000

Trockenschrank WTB Binder

Ultraschallgerät Branson Sonic Power Company

Sonifier B-R

Ultrazentrifuge Beckmann L5-65

UV-Lampe Desaga

Vakuumpumpe UniEquip Unijet II

Vortexer Scientific Industries

Vortex-Genie 2

Wasserbad Kötermann 3043

Zentrifugen Eppendorf 5415C,

Heraeus Biofuge pico, Hettich Rotixa/K, Hettich EBA 3S

2.3.2 Verbrauchsmittel

Deckgläser Kobe

Einmalküvetten Brand

Einmalpipetten Greiner Labortechnik

Falcon

-Gefäße (15 und 50 ml) Greiner Labortechnik

Filterpapier Schleicher & Schuell

Kanülen (20G) Becton Dickinson

Kulturflaschen, -schalen Fisher Scientific

Minireaktionsgefäße Greiner Labortechnik

Nitrocellulosemembran, Hybond ECL Amersham Pharmacia Biotech

Objekträger IDL

Parafilm

American National Can.

Pasteurpipetten Volac

Phosphoimagerplatten Fujifilm

Pipettenspitzen Greiner Labortechnik

PVDF-Membran Schleicher & Schuell

Röntgenfilme X-OMAT XAR-5 Sigma-Aldrich/EastmanKodak

Spritzen Becton Dickinson

Well-Platten Greiner Labortechnik

3 Methoden

3.0 Allgemeine Bemerkungen

Alle Arbeiten mit Zellkulturen verlaufen unter sterilen Bedingungen. Es wird unter einer sterilen Werkbank gearbeitet und die verwendeten Materialien (Glaswaren, Zellkulturgefäße, Pipetten etc.) werden hitzesterilisiert, autoklaviert oder liegen steril verpackt vor. Wässrige Lösungen werden mit reinst H2O hergestellt. Die

verwendeten Zellkulturmedien werden vor Benutzung im Wasserbad auf 37°C erwärmt. Die Kultivierung der Zellen verläuft standardmäßig bei 37°C und 5% CO2.

Die Arbeiten mit dem rekombinanten Adenovirus werden in einem S2-Labor durchgeführt.

3.1 Allgemeine proteinbiochemische Methoden

3.1.1 Aufarbeitung von Rattengeweben

3.1.1.1 Homogenate für G-Protein-Versuche

Die Gehirne von zwei erwachsenen Fischer-Ratten sind von Frau Martina Lehmann vom Arbeitskreis Krieglstein der Universität Marburg in Kortex, Cerebellum, Striatum, Hippokampus und rechte Hemisphere zerlegt worden. Des Weiteren wurden verschiedene Organe (Herz, Hirn, Leber, Milz, Lunge und Niere) von zwei schwangeren Fischerratten präpariert und zur Verfügung gestellt.

Die Gehirnteile und Organe werden einzeln ausgewogen und mit der vierfachen Menge Homogenisationspuffer versetzt. Mit Hilfe eines Handhomogenisators (Micropistille/Eppendorf bzw. Glasschliffhomogenisator/Braun) werden die Proben auf Eis homogenisiert. Der Proteingehalt wird nach Lowry (3.1.2.2) gegen bovines Serumalbumin (BSA) als Standard bestimmt und die Proben bei -80°C gelagert.

Homogenisationspuffer: 20 mM Tris/HCl pH 7,5 0,1 mM EDTA

0,1% 2-Mercaptoethanol 1 mM Benzamidin

0,1 mM PMSF

3.1.1.2 Zytosolische Proben für PHP-Versuche

Embryonalen (E18), postnatalen (P2) und adulten Fischer-Ratten sowie erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten wird jeweils Kortex, Cerebellum, Striatum und Hippokampus entnommen. Die Präperation ist von Dr. Carsten Culmsee vom Arbeitskreis Krieglstein der Universität Marburg vorgenommen worden.

Die Gehirnteile werden mit der in Tabelle 3-1 angegebenen Menge Homogenisationspuffer versetzt und mit Hilfe des Handhomogenisators (Micropistille/ Eppendorf) auf Eis homogenisiert. Anschließend werden die Proben mit 13 500 rpm (Kühlzentrifuge Z 323 K, Hermle) bei 4°C 1 h zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und der Proteingehalt nach Bradford (3.1.2.1) mit BSA als Standard bestimmt. Niederschlag und Überstand werden bei -80°C gelagert.

Homogenisationspuffer: 20 mM Tris/HCl pH 7,5 0,1 mM EDTA 300 mM Saccharose 0,1% 2-Mercaptoethanol 1 mM Benzamidin 0,1 mM PMSF

Tabelle 3-1 Eingesetzte Puffermengen bei Aufarbeitung der Proben

adult postnatal embryonal

Kortex 200 µl 150 µl 70 µl

Cerebellum 250 µl 100 µl 50 µl

Striatum 150 µl 100 µl 50 µl

3.1.2 Proteinbestimmung

3.1.2.1 Modifizierter Bradford / BioRAD

Die Methode nach Bradford (Bradford, 1976) eignet sich gut zur Bestimmung löslicher Proteine. Maximal 200 µl Proteinprobe werden mit H2O auf 800 µl aufgefüllt

und mit 200 µl BioRad-Reagenz 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es bildet sich ein blauer Farbstoff. Diese Farbveränderung basiert auf der Verschiebung des Absorptionsmaximums einer sauren Coomassie-Brilliantblau-Lösung in Gegenwart von Proteinen von 465 nm nach 595 nm. Bei dieser Wellenlänge werden die Proben photometrisch vermessen. Als Standard dient eine BSA-Reihe von 2–10 µg Protein.

BioRad-Reagenz: 50% Phosphorsäure 25% Essigsäure

0,1% Coomassie-Brilliant Blue G-250

3.1.2.2 Lowry

Bei dieser Proteinbestimmungsmethode (Lowry et al., 1951), die sich anders als die Methode nach Bradford (3.1.2.1) auch für membrangebundene Proteine eignet, wird eine Proteinprobe (maximal 100 µl) mit 2 ml Lowry-Reagenz für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. In dieser Zeit bildet das im Reagenz enthaltene Kupfer einen Komplex mit dem Protein. 100 µl Folin-Ciocalteau-Phenol-Reagenz werden unter sofortigem kräftigem Mischen zugegeben. Durch Reduktion des Reagenzes bildet sich ein blauer Farbstoff, der nach 30 min Inkubation bei einer Wellenlänge von 720 nm photometrisch vermessen wird. Zur Erstellung der Kalibriergerade werden 10-60 µg BSA verwendet.

Lowry-Reagenz: 100 Teile Lösung A: 2% Na2CO3 in 0,1 M NaOH

+ 1 Teil Lösung B: 1% CuSO4

+ 1 Teil Lösung C: 2,7% Kalium-Natriumtartrat

3.1.2.3 BCA-Methode:

Bei dieser Proteinbestimmungsmethode (Smith et al., 1985) werden 5 µl der Proteinprobe mit H2O auf 100 µl aufgefüllt. Dazu gibt man 500 µl BCA-Reagenz,

mischt und inkubiert die Proben für 30 min bei 60°C. Die Proteine der Probe reduzieren dabei das im Reagenz enthaltene Cu2+ zu Cu+, welches mit der ebenfalls

im Reagenz vorhandenen Bicinchoninsäure (BCA) zusammen einen purpurfarbenen Komplex bildet, der bei einer Wellenlänge von 562 nm absorbiert. Nach der Inkubation werden je 200 µl der Proben in eine Mikrotiterplatte gegeben und photometrisch vermessen. Als Vergleich dient eine BSA-Reihe von 5–50 µg Protein. Zur Durchführung wurde das MicroBCA Protein Assay System Kit der Firma Interchim verwendet.

BCA-Reagenz: 25 Teile Lösung A: Na2CO3 /NaHCO3, Natriumtartrat,

2 M NaOH

+ 24 Teile Lösung B: 4% Bicinchoninsäure in H2O

+ 1 Teil Lösung C: 4% CuSO4 x 5 H2O in H2O

3.1.3. Polyacrylamid-Gelelktrophorese (PAGE)

Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist eine Methode zur Trennung von Proteinen in einer Polyacrylamid-Matrix. Die Trennung wird unter denaturierenden Bedingungen, also unter Zusatz von Sodiumdodecylsulfat (SDS), durchgeführt (SDS-PAGE). Das negativ geladene SDS lagert sich an die Proteine und überdeckt deren Eigenladung, so dass die Trennung der Proteine nur aufgrund ihrer Größe und nicht auch ihrer Ladung erfolgt (Laemmli, 1970).

Die Polyacrylamidminigele (9 x 9,5 x 0,5 cm) stammen aus Eigenproduktion (Tabelle 3-2). Sie bestehen aus einem engmaschigen Trenngel, in dem die eigentliche Auftrennung der Proteine stattfindet, und einem weitmaschigen Sammelgel, in dem die Proteine vorkonzentriert werden. Es wird also eine so genannte „Diskontinuierliche PAGE“ durchgeführt.

Acrylamid/Bisacrylamid, der Trenngelpuffer, Wasser und TEMED werden gemischt und die Polymerisation, welche über eine radikalische Reaktion verläuft, durch Zugabe von APS gestartet. Die Lösung wird in die Gelgießapparatur gegossen und sofort mit Isopropanol überschichtet. So wird der Ausschluss von Sauerstoff während der Polymerisation gewährleistet. Nach 60 min wird der Isopropanol abgegossen. Reste werden durch Nachspülen mit dest. H2O entfernt. Dann wird das Trenngel mit

der Mischung für das Sammelgel überschichtet. Die Kämme werden sofort gesteckt und das Sammelgel härtet für weitere 30 min aus. Die fertigen Gele werden in

befeuchtete Frischhaltefolie gepackt und können im Kühlschrank bei 4°C für 2 Wochen gelagert werden.

Tabelle 3-2 Zusammensetzung von Trenn- und Sammelgel (für 10 Gele)

Trenngel 15% Sammelgel 4,5% Acrylamid/Bisacrylamid (30%) 30 ml Acrylamid/Bisacrylamid (30%) 3 ml Trenngelpuffer (4 x) 15 ml Sammelgelpuffer (4 x) 5 ml H2O 15 ml H2O 12 ml TEMED 50 µl TEMED 30 µl APS (20%) 100 µl APS (20%) 60 µl Trenngelpuffer (4 x): 0,5 M Tris/HCl pH 8,8 0,4% SDS 0,02% NaN3 Sammelgelpuffer (4 x): 0,5 M Tris/HCl pH 6,8 0,4% SDS 0,02% NaN3 APS 20%: 20% Ammoniumperoxodisulfat in H2O

Maximal 15 µl Proteinlösung werden vor der Elektrophorese mit 5 µl SDS-Probenpuffer versetzt, 5 min bei 95°C gekocht und kurz zentrifugiert. Der Anoden- und Kathodenraum der Gelelektrophorese-Apparatur wird mit je 250 ml Laufpuffer gefüllt. Dann pipettiert man die Proben in die Geltaschen (Fassungsvermögen max. 20 µl). Als Proteingrößenstandard wird ein ungefärbter oder ein vorgefärbter Marker mit aufgetragen. Man legt eine Spannung von 100 V an. Haben die Proben das Sammelgel durchlaufen, erhöht man die Spannung auf 200 V.

Laufpuffer: 25 mM Tris 0,1% SDS 190 mM Glycin

SDS-Probenpuffer: 130 mM Tris/HCl pH 6,8 10% SDS

10% 2-Mercaptoethanol 20% Glycerin

0,06% Bromphenolblau

(pH-Wert-Einstellung vor Bromphenolblauzugabe)

3.1.4 Coomassie-Färbung

Coomassie-Brilliant Blue R-250 ist ein blauer Trimethylmethanfarbstoff, der besonders mit basischen Aminosäuren wie Arginin oder Lysin Komplexe bildet. Daher wird er zur unspezifischen Anfärbung von Proteinen verwendet. Die Nachweisgrenze der Methode liegt bei 100 ng Protein pro Bande.

Zum Nachweis gibt man das Gel nach der Elektrophorese für mindestens 1 h in die Coomassie-Färbelösung. Diese enthält neben dem Farbstoff auch Ethanol und Essigsäure, wodurch die Proteine auf dem Gel fixiert werden (Alkohol-Säure-Fällung). Die Färbelösung wird abgegossen (kann wieder verwendet werden) und das Gel mit dest. H2O gespült. Dann gibt man es in die Entfärbelösung. Mit dieser

wird unter mehrmaligem Wechseln der Lösung überschüssiger Farbstoff entfernt, so dass die Proteinbanden deutlich sichtbar werden. Das Gel wird über Nacht in dest. H2O gelagert. Dadurch treten die Banden noch deutlicher hervor.

Coomassie-Färbelösung: 0,2% Coomassie Brilliant Blue R-250 50% Methanol

10% Essigsäure

Coomassie-Entfärbelösung: 30% Ethanol 7,5% Essigsäure

3.1.5 Blotting-Verfahren

3.1.5.1 Semidry-Blottig

Beim Semidry-Blotting transferiert man elektrophoretisch Proteine in einer Apparatur horizontaler Anordnung vom Trenngel auf eine Nitrocelluslose- oder PVDF-Membran (Kyhse-Andersen, 1984; Towbin et al., 1979).

Das Trenngel, die Membran und die Blottingpapiere werden für 5 min in Transferpuffer äquilibriert. Wird eine PVDF-Membran verwendet, so wird diese vorher je 1 min in Methanol und dest. H2O eingelegt. Auf die Anode der

Blot-Apparatur legt man drei Whatman-Blottingpapiere (dienen als Pufferreservoir), die Membran, das Trenngel und drei weitere Blottingpapiere übereinander. Dann rollt man mit einem Glasstab über dieses so genannte Sandwich, um eventuell enthaltene Luftblasen zu entfernen. Die Kathode wird auf die Apparatur aufgesetzt und eine Spannung von 10 V für 1 h angelegt. In dem so entstehenden elektrischen Feld wandern die Proteine vom Gel auf die Membran. Zur Kontrolle des Transfers wird der mit auf das Gel aufgetragene (3.1.3) vorgefärbte und damit sichtbare Größenstandard verwendet. Sieht man ihn nach dem Blotting auf der Membran, so sind auch alle anderen Proteine übertragen worden.

Transferpuffer: 25 mM Tris 190 mM Glycin 10% Methanol

3.1.5.2 Tankblotting

Beim Tankblotting werden Proteine ebenfalls elektrophoretisch vom Trenngel auf eine Membran transferiert. Man arbeitet allerdings in einer Apparatur vertikaler Anordnung.

Blottingpapiere, Membran und Trenngel werden in Transferpuffer äquilibriert, übereinandergelegt (2 Blottingpapiere, Membran, Gel, 2 Blottingpapiere) und vertikal zusammen mit einem Kühlelement in die Apparatur eingespannt. Die Apparatur wird dann vollständig mit Transferpuffer (1 – 2 l) aufgefüllt. Es wird für 1 h eine Spannung von 100 V angelegt. Als Kontrolle der vollständigen Übertragung der Proteine dient auch hier der vorgefärbte Größenstandard (vgl. 3.1.5.1).

Transferpuffer: 20 mM Tris 80 mM Glycin 20% Methanol

3.1.6 Ponceau S-Färbung

Ponceau S ist ein roter Azofarbstoff, der Proteine unspezifisch anfärben kann (Salinovich und Montelaro, 1986). Man verwendet ihn, um Proteine, die auf eine Membran transferiert worden sind, nachzuweisen bzw. die Effizienz des Proteintransfers zu überprüfen. Des Weiteren fixiert die Färbelösung, die auch TCA enthält, die Proteine auf der Membran. Bei nachfolgenden Waschschritten werden sie daher nicht so leicht von der Membran gespült. Die Färbung mit Ponceau S ist zudem reversibel, so dass anschließende Nachweisreaktionen nicht gestört werden. Nach dem Blot-Vorgang (3.1.5) wird die Membran für 10 min in der Färbelösung inkubiert. Danach wird die Membran mit dest. H2O solange gewaschen bis die

Banden gut zu sehen sind. Durch Inkubation mit TBST-Puffer wird die Membran anschließend wieder vollkommen entfärbt.

Ponceau S-Färbelösung: 0,2% Ponceau S

3% Trichloressigsäure (TCA)

TBST: 10 mM Tris/HCl pH 7,6

150 mM NaCl 0,1% Tween 20

3.1.7 Nachweis von Proteinen mittels Antikörper

Mit dieser immunologischen Methode (Westernblot) lassen sich elektrophoretisch getrennte und auf eine Membran transferierte Proteine mit spezifischen Antikörpern selektiv markieren und in einer Farb- oder Fluoreszenzreaktion detektieren (Burnette, 1981).

Eine Proteinprobe wird elektrophoretisch getrennt (3.1.3), auf eine Membran geblottet (3.1.5) und mit Ponceau S gefärbt (3.1.6). Nach der Entfärbung wird die

Membran 1 h mit einer Milchpulversuspension (Blockierlösung) blockiert. Nach 3-maligem Waschen mit TBST (1 x 15 min, 2 x 5 min), wird die Membran unter Schütteln über Nacht bei 4°C mit dem ersten Antikörper, der spezifisch gegen das gesuchte Antigen gerichtet ist, inkubiert. Verwendet werden dazu Antikörper, die spezifisch gegen den N-Terminus der PHP gerichtet sind, gegen die Gβ–Untereinheit des G-Proteins oder gegen α-Tubulin, das in Zellen konstitutiv exprimiert wird und als Vergleich dient, ob pro Spur die gleiche Proteinmenge aufgetragen ist (Tabelle 3-3). Anschließend wird die Membran erneut 3-mal mit TBST (1 x 15 min, 2 x 5 min) gewaschen und für 1 h bei Raumtemperatur mit dem zweiten Antiköper inkubiert. Der zweite Antikörper ist gegen die konstanten Bereiche des ersten gerichtet und erkennt diesen somit speziesspezifisch. Verwendet werden anti-Kaninchen- oder anti-Maus-Antikörper in einer Verdünnung 1:2500 in TBST.

Nach 3-maligem Waschen in TBST, wird die Membran 1 min (ohne Schütteln) in ECL-Reagenz (1 ml Lösung 1 + 1 ml Lösung 2) eingelegt. Die an den zweiten Antikörper gekoppelte Peroxidase katalysiert dabei die Reduktion von Wasserstoffperoxid zu Wasser und atomarem Sauerstoff. Dieser Sauerstoff oxidiert das im Reagenz ebenfalls enthaltene Luminol. Dabei wird Licht abgestrahlt. Die Membran wird auf eine Glasplatte gelegt und in Frischhaltefolie eingepackt. Dann wird ein Röntgenfilm aufgelegt (10 s – 30 min), und dieser anschließend maschinell entwickelt.

TBST: (Herstellung siehe 3.1.6)

Blockierlösung: 5% Milchpulver in TBST

Tabelle 3-3 Verwendete Antikörper und ihre Verdünnungen

1. Antikörper Verdünnung 1. AK 2. Antikörper Verdünnung 2. AK

Anti-PHP/N (Kaninchen) 1:400 in TBST + 1% BSA Anti-Kaninchen 1:2500 in TBST Anti-Gβ (Kaninchen) 1:2000 in TBST Anti-Kaninchen 1:2500 in TBST Anti-α-Tubulin (Maus) 1:5000 in TBST Anti-Maus 1:2500 in TBST

3.1.8 Autoradiographie

Radioaktiv markierte Proteine werden mittels Autoradiographie detektiert. Dazu wird das Trenngel nach der Elektrophorese (3.1.3) für 5–10 min in Fixierlösung gegeben. Überschüssige Radioaktivität wird mit Hilfe einer Rasierklinge durch Abtrennen der unteren Bereiche des Gels (Schnitt in Höhe der Bromphenolblaubande) entfernt. Das Gel wird anschließend bei 80°C für 20 min unter Vakuum zwischen Filterpapier und Frischhaltefolie getrocknet. Die Auswertung erfolgt danach entweder durch Belichtung und Entwicklung eines Röntgenfilms oder digital mit Hilfe des Phosphoimagers (AIDA-System).

Fixierlösung: 25% Methanol 5% Essigsäure

3.1.9 Phosphorylierung und Dephosphorylierung von Proteinen

3.1.9.1 Phosphorylierung von Transducin

Das G-Protein Trasducin wurde von Herrn Prof. Dr. T. Wieland von der Universität Heidelberg zur Verfügung gestellt. Die Fraktion entstammt der Reinigung von α-Transducin aus der Rinderretina (Cuello et al., 2003) und enthält ausreichende Mengen der Gβ-Untereinheit, wie eine Coomassie-Färbung (3.1.4) beweist.

Die Phosphorylierung des Transducins wird in einem 10 µl Ansatz durchgeführt. Fünf Mikroliter Transducin werden für 10 min bei 37°C in Gegenwart von 25 mM Tris/HCl (pH 7,5), 1 µM GTP, welches 2 µCi [γ-32P]GTP enthält, und 5 mM EDTA phosphoryliert. Die Reaktion wird anschließend entweder mit 5 µl Probenpuffer gestoppt oder die Dephosphorylierungsreaktion wird direkt im Anschluss durchgeführt.

3.1.9.2 Phosphorylierung von H10-Zellmembranen

Auch diese Probe wurde von Herrn Prof. Dr. T. Wieland von der Universität Heidelberg zur Verfügung gestellt. Sie enthält die präparierten Zellmembranen von H10-Zellen. H10-Zellen sind Kardiomyozyten von Ratten, die Gβ enthalten und die NDPKs in dreifacher Menge überexprimieren (Hippe et al., 2003).

Wiederum wird die Phosphorylierung in einem 10 µl Ansatz durchgeführt. Vier Mikroliter der H10-Zellmembranen werden in Gegenwart von 25 mM Tris/HCl (pH 7,5), 1 mM MgCl2 und 1 µM GTP, welches 2 µCi [γ-32P]GTP enthält, bei 37°C 2 min

lang phosphoryliert. Die Reaktion wird mit 5 mM EDTA gestoppt. Entweder erfolgt dann die Zugabe von 5 µl Probenpuffer oder die Probe wird sofort anschließend dephosphoryliert.

3.1.9.3 Phosphorylierung von Leberextrakt

Neunzig Mikrogramm Protein des Leberextraktes (Bechmann, 2004) werden in einem 10 µl Ansatz in Gegenwart von 5 mM EDTA, 25 mM Tris/HCl (pH 7,5) und 1 µM GTP, welches 2 µl Ci [γ-32P]GTP enthält, bei 37°C 15 min lang phosphoryliert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 5 µl Probenpuffer gestoppt.

3.1.9.4 Dephosphorylierung

Die Dephosphorylierung (15 µl Ansatz) verläuft bei allen verwendeten Proben identisch. Zu den phosphorylierten Proteinen wird entweder 1 µg in Bakterien exprimierte PHP oder 2,4 µg in SF9-Zellen exprimierte PHP in Gegenwart von 25 mM Tris/HCl (pH 7,5) und 5 mM EDTA gegeben. Bei der Dephosphorylierung mit alkalischer Phosphatase wurden 0,3 µg Enzym (0,25 U) eingesetzt. Der dabei verwendete Puffer enthielt 25 mM Tris/HCl (pH 7,9). Die Inkubation verlief bei 37°C und wurde nach 30 min durch die Zugabe von 5 µl Probenpuffer gestoppt.

Die Proben wurden dann auf ein 15%iges Minigel aufgetragen, elektrophoretisch getrennt (3.1.3) und autoradiographisch (3.1.8) ausgewertet.

Probenpuffer: 15 mM Tris/HCl pH 6,8 4% SDS 2% 2-Mercaptoethanol 10% Saccharose 10 mM EDTA 8 M Harnstoff 0,06% Bromphenolblau

3.1.10 Säure-Lauge-Behandlung

Mit Hilfe der Säure-Lauge-Behandlung ist es möglich, die verschiedenen Phosphoproteine zu unterscheiden. Diese Methode nutzt dabei die unterschiedliche chemische Stabilität der Phosphoproteinverbindungen gegenüber starker Säure und Lauge (Tabelle 3-4).

Ein vierfacher Ansatz des Proteins wird mit [γ-32P]GTP phosphoryliert und in 4 Spuren auf ein Minigel aufgetragen. Die Proteine werden elektrophoretisch (3.1.3) getrennt und anschließend mittels Semidry-Blotting (3.1.5.1) auf eine PVDF-Membran übertragen. Diese wird in vier Teile (pro Teil ein Phosphorylierungsansatz) zerschnitten. Ein Teil wird in 1 N KOH und ein weiteres in 6 N HCl für 2 h unter gelegentlichem Umschütteln bei 45°C inkubiert. Zur Kontrolle wird das dritte Teil unter den gleichen Bedingungen aber in neutralem 100 mM Tris pH 7,5 inkubiert. Das vierte Teil dient ebenfalls als Kontrolle. Es wird keiner erhöhten Temperatur ausgesetzt und verbleibt 2 h im Kühlschrank bei 4°C.

Anschließend werden das in HCl und das in KOH inkubierte Membranteil mit 100 mM Tris pH 7,5 neutralisiert. Die gesamte Membran wird dann im Trockenschrank getrocknet und in Folie verpackt. Die Auswertung erfolgt entweder durch Belichtung und Entwicklung eines Röntgenfilms oder digital mit Hilfe des Phosphoimagers (AIDA-System).

Tabelle 3-4 Stabilität von Phosphoverbindungen gegenüber Säure und Lauge (Kamps, 1991)

( * nach Kamps (1991) ist Cystein stabil gegen Säure, nach Seno et al. (1988) ist es das nicht.)

S-Phosphat: pCystein Acylphosphat: pAspartat, pGlutamat Phosphoamidat: pHistidin, pLysin, pArginin Phosphoester: pSerin, pThreonin pTyrosin

Stabilität gegen Lauge Stabilität gegen Säure

Phosphatverbindung

+

_

_

+

+

_

_

+

+

*

3.1.11 Temperaturbehandlung

Histidinphosphat ist temperaturempfindlich. Diese Eigenschaft kann man daher neben der genaueren Säure-Lauge-Behandlung zur Identifizierung einer Histidinphosphorylierung heranziehen. Transducin wird wie beschrieben (3.1.9.1) phosphoryliert und anschließend für 30 bzw. 60 min im Thermoblock einer Temperatur von 95°C ausgesetzt. Die Proben werden anschließend elektrophoretisch getrennt (3.1.3) und mittels Autoradiographie (3.1.8) ausgewertet.

3.2 Allgemeine molekularbiologische Methoden

3.2.1 Restriktionsverdau von DNA

3.2.1.1 Durchführung

Restriktionsendonukleasen erkennen spezifische, meist palindromische DNA-Sequenzen, an denen sie die DNA spalten. Mit Hilfe dieser Enzyme kann man DNA zerschneiden bzw. Fragmente aus der DNA ausschneiden. Diese Eigenschaft kann man sowohl zur Identifizierung als auch zur Isolierung von DNA-Fragmenten nutzen. Die DNA wird in einem Ansatz von 10-200 µl wie in Tabelle 3-5 aufgeführt mit dem Restriktionsenzym versetzt (Enzym höchstens 1/10 des Gesamtvolumens) und 2-24 h im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Puffer werden nach Herstellerangaben (New England Biolabs (NEB) oder Roche) verwendet. Die Reaktionsprodukte werden anschließend gereinigt (3.2.1.2) oder in einem 1%igen Agarosegel (3.2.2) getrennt und analysiert.

Tabelle 3-5 Verwendete Restriktionsenzyme

Vektor (DNA) Restriktionsenzym Puffer Bedingungen

pAd-Track-CMV Not I _{Hind III} 3 (NEB) _{B (Roche)} 50 µl, 3 h, 37°C _{120 µl, 24 h, 37°C} pVL-1392-PHP Not I _{Hind III} 3 (NEB) _{B (Roche)} 50 µl, 3 h, 37°C _{120 µl, 24 h, 37°C} pAd-Track-CMV-PHP Not I und EcoR V 3 (NEB) 10 µl, 2 h, 37°C pAd-Track-CMV-PHP Pme I 4 (NEB) 100 µl, 3 h, 37°C pAd-easy-PHP Pac I und Nde I 1 (NEB) und H (Roche) 20 µl, 2 h, 37°C

3.2.1.2 Reinigung der DNA

Die verschiedenen Restriktionsenzyme benötigen, wie Tabelle 3-5 zeigt, verschiedene Puffer. Stört einer dieser Puffer einen an den Verdau anschließenden Versuch, zum Beispiel einen weiteren Verdau mit einem anderen Restriktionsenzym, so muss der Ansatz gereinigt werden. Dazu wird das „High Pure PCR Product Purification Kit“ von Roche verwendet. Gemäß den Herstellerangaben wird die DNA zuerst mit einem Guaninidinthiocyanat enthaltenden Bindepuffer (3 M Guaninidinthiocyanat, 10 mM Tris/HCl (pH 7,5), 5% Ethanol) versetzt. In Gegenwart hoher Konzentrationen dieses chaotrophen Salzes bindet die DNA selektiv an eine Glasfasermembran. Die gebundene DNA wird in mehreren Schritten mit ethanolischem Puffer (20 mM NaCl, 2 mM Tris/HCl (pH 7,5), 80% Ethanol) gewaschen. Dadurch werden freie Nukeotide, Salze oder Proteine, die nicht oder nicht fest an die Membran binden können, abgetrennt. Die Elution der DNA von der Membran erfolgt mit einem Puffer niedriger Salzkonzentration (10 mM Tris/HCl (pH 8,5)). Erwärmen dieses Elutionspuffers auf 56°C erhöht die Effizenz der Elution.

3.2.2 Agarose-Gelelektophorese

DNA-Fragmente lassen sich gemäß ihrer Größe in einem Agarosegel elektrophoretisch auftrennen. Dazu werden die Ansätze mit DNA-Probenpuffer (Fermentas) in einem Verhältnis von 4:1 versetzt und mit Hilfe eines 1%igen Low-melting-point-Agarosegels (LMP-Agarosegel) in einer horizontalen Gelkammer bei 120 V über 20-60 min getrennt. Die Gele (20 x 8 x 1 cm) werden mit TAE-Puffer pH 8, welcher ebenfalls als Laufpuffer verwendet wird, hergestellt. Pro Spur können 40 µl Probe aufgetragen werden. Die im Probenpuffer enthaltenen Farbstoffe Bromphenolblau (blau) und Xylencyanol (grün) ermöglichen es, den Verlauf der Trennung zu verfolgen. Durch Zusatz des in die DNA interkalierenden Farbstoffes Ethidiumbromid (1 µg/ml) zum Gel kann diese anschließend unter UV-Licht (302 nm) sichtbar gemacht und analysiert werden. Zur Größenbestimmung der DNA-Fragmente wird die 1 kb-Leiter (Gene Reader) als Größenstandard verwendet.

TAE-Puffer pH 8 (1x): 40 mM Tris 5% Essigsäure 1 mM EDTA

3.2.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Elektrophoretisch getrennte bzw. isolierte DNA-Fragmente werden aus dem Agarosegel extrahiert. Dazu wird standardmäßig das „High Pure PCR Product Purification Kit“ von Roche verwendet (vgl. 3.2.1.2). Unter UV-Licht (302 nm) wird die zu betrachtende Bande mit dem Skalpell zügig aus dem Gel herausgeschnitten und in ein Reaktionsgefäß überführt. Innerhalb von 10 min wird das Agarosefragment bei 56°C in dem das chaothrophe Salz Guaninidinthiocyanat enthaltenden Bindepuffer aufgelöst. Anschließend wird die DNA den Herstellerangaben entsprechen wie in 3.2.1.2 beschrieben gereinigt.

3.2.4 Photometrische Gehaltsbestimmung von DNA und RNA

Der DNA bzw. RNA-Gehalt einer Lösung kann durch photometrische Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt werden. Der Absorptionswert 1 der DNA bzw. der RNA bei einer Schichtdicke von 1 cm (molarer Absorptionsquofizient) entspricht einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml bzw. einer RNA-Konzentration von 40 µg/ml. Die Konzentration berechnet sich daher folgendermaßen:

c DNA [µg/ml] = OD260 x 50 [µg/ml] x Verdünnungsfaktor

c RNA [µg/ml] = OD260 x 40 [µg/ml] x Verdünnungsfaktor

Um die Reinheit einer Probe zu bestimmen, wird diese zusätzlich auch bei einer Wellenlänge von 280 nm vermessen. Dort absorbieren die aromatischen Reste von Aminosäuren. Das Verhältnis OD260/280 ist also ein Maß für die Reinheit der Probe.

Bei einer reinen DNA-Probe sollte es zwischen 1,8 und 2,0 liegen.

Ist die gemessene DNA-Konzentration zu niedrig, wird die DNA-Lösung in der SpeedVac für 30 min unter Vakuum eingedampft, in einer geringeren Menge Elutionspuffer oder H2O wieder aufgenommen und erneut vermessen.