3.4 Methoden zur Antisensebehandlung
3.4.4 Test auf Toxizität der Oligonukleotide
Um sicher zu gehen, dass die Oligonukleotide nicht toxisch für die Zellen sind, werden zwei Schälchen mit 6 Tage alten, hippokampalen Neuronen, die eine normale Morphologie zeigen, mit 2 µM oder 20 µM des Antisense- bzw. des Missense-Oligonukleotids versetzt und über Nacht für 24 h inkubiert. Anschließend wird die Morphologie der Zellen unter dem Mikroskop angeschaut, um festzustellen, ob die Neurone die Behandlung vertragen.
3.4.5. Antisensebehandlung der Primärkulturen
3.4.5.1 Unmodifizierte und PTO-Antisense-Oligonukleotide
Es werden embryonale (E18) hippokampale bzw. kortikale Neurone, die 6-8 Tage in Kultur waren, verwendet. Das Kulturmedium (Neurobasal®-Medium pH 7,2) wird abgenommen und durch serumfreies Neurobasal®-Medium pH 7,2 (ohne B27 Supplement), dem man die Oligonukleotide (Miss- oder Antisense) in einer Konzentration von 2 µM oder 20 µM beigibt, ersetzt. Kontrollkulturen bekommen nur serumfreies Neurobasal®-Medium pH 7,2 zugesetzt. Die Inkubation erfolgt über 3-24 h im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2.
Neurobasal®-Medium pH 7,2: (Herstellung siehe 3.4.1)
Neurobasal®-Medium (serumfrei): 4,4 mM HEPES 1,2 mM L-Glutamin 0,001% Gentamicinsulfat
in Neurobasal®-Medium (pH 7,2)
3.4.5.2 FITC-markierte Antisense-Oligonukleotide
Es werden embryonale (E18) hippokampale, auf Glas (Deckglas) ausgesäte Neurone, die 7 Tage in Kultur waren, verwendet. Neurobasal®-Medium pH 7,2 wird abgenommen und durch serumfreies Neurobasal®-Medium pH 7,2, dem man das FITC-markierte PHP-Antisense-1 in einer Konzentration von 2 µM beigibt, ersetzt.
Kontrollkulturen bekommen nur serumfreies Neurobasal®-Medium pH 7,2 zugesetzt.
Die Inkubation erfolgt über 8 oder 24 h im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2. Nach
der Inkubation werden die Zellen 20 min mit Formalinlösung fixiert. Anschließend wird das Deckglas mit den Neuronen (Zellen nach unten) auf einen Objekträger mit 8 µl PBS gegeben und dort mit Lack fixiert. Die Präparation ist von Frau Daniela Faber vom Arbeitskreis Krieglstein, Universität Marburg durchgeführt worden.
Nun kann man die Zellen und das grün fluoreszierende FITC (Exzitationsmaximum 494 nm, Emissionmaximum 518 nm) unter dem konfokalen Laserscanning-Mikroskop untersuchen. Die Bedienung des Laserscanning-Mikroskops ist von Frau Sandra Engel vom Arbeitskreis Krieglstein, Universität Marburg übernommen worden.
Neurobasal®-Medium pH 7,2: (Herstellung siehe 3.4.1)
Neurobasal®-Medium (serumfrei): (Herstellung siehe 3.4.5.1)
PBS: 1 mM KH2PO4
3 mM Na2HPO4 150 mM NaCl
Formalinlösung: 80 mM Na2HPO4
12 mM NaH2PO4 10% Formalin
3.4.6 Staurosporinschädigung der Antisense behandelten Neurone
Hippokampale Neurone werden wie oben beschrieben (3.4.5.1) mit den Oligonukleotiden behandelt. Anschließend gibt man Staurosporin (STS), einen nicht-selektiven Proteinkinase-Inhibitor (Herbert et al., 1990) aus Streptomyces spp. in einer Konzentration 200 nM bei und inkubiert über 12 oder 24 weitere Stunden im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2. Staurosporin ist cytotoxisch und löst in vielen Zelllinien und Primärkulturen Apoptose aus (Tamaoki et al., 1986). Nach 12 bzw.
24 h werden die Zellen entweder geerntet und mittels Westernblot (3.1.7) auf PHP hin untersucht, oder sie werden mit Paraformaldehyd beziehungsweise Formalin fixiert, mit Hoechst 33258 gefärbt (3.4.7) und ihre apoptotische Schädigungsrate ermittelt.
3.4.7 Hoechst-Färbung
Die Hoechst-Färbung ist eine Methode, mit der man apoptotische Zellen anfärben kann. Dazu wird Hoechst 33258 verwendet, ein lipophiler Fluoreszenzfarbstoff, der in der Lage ist, die Membran von Zellen zu durchdringen. Im Zellkern bindet er an AT-reiche DNA-Sequenzen (Latt und Wohlleb, 1975; Latt und Stetten, 1976). Dadurch kommt es zu einer blauen Färbung des Nukleus, die man unter dem Fluoreszenzmikroskop sehen kann. Gesunde und apoptotische Zellen unterscheiden sich dadurch, dass letztere einen geschrumpften bzw. fragmentierten Zellkern mit kondensiertem Chromatin besitzen. Zudem fluoreszieren sie stärker und sind somit, leicht zu erkennen.
Zwölf oder 24 h nach der Staurosporin-Schädigung wird das Medium von den Zellen abgesaugt, die Kulturen mit PBS gewaschen und die Zellen 20 min mit 4%iger Paraformaldehyd-Lösung oder Formalinlösung fixiert. Anschließend werden die Zellen noch einmal mit PBS gewaschen. Dann werden sie mit methanolischer Hoechstfärbelösung (10 µg/ml) unter Lichtausschluss für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Bevor der Anteil der apoptotischen Zellkerne unter dem Fluoreszenzmikroskop (Exzitationsmaximum 352 nm, Emissionsmaximum 461 nm) gezählt wird, werden die Zellen nochmals mit PBS gewaschen. Um den prozentualen Anteil an apoptotischen Zellen statistisch richtig zu erfassen, werden an mehreren Stellen der Kulturschalen mindestens 200 Zellen ausgezählt. Die Zählung wurde von Herrn Dr. Carsten Culmsee und Frau Daniela Faber durchgeführt.
Hoechst-Färbelösung: 1% Hoechst 33258 in Methanol
Paraformaldehyd 4%: 4% Paraformaldehyd in H2O
Formalinlösung: (Herstellung siehe 3.4.5)
3.4.8 Extraktion von RNA
Die Extraktion der RNA aus den hippokampalen Neuronen erfolgte mit Hilfe des
„RNeasy-Kits“ der Firma Quiagen. Die Zellen werden mit 600 µl RLT-Puffer, der denaturierend wirkt und zudem das chaotrophe Salz Guanidinisothiocyanat enthält,
geerntet und anschließend durch 5-maliges Aufziehen mit einer Spritze (20G) homogenisiert. Dann versetzt man die Proben mit 600 µl 70%igem Ethanol. Die gesamte RNA wird anschließend durch Zentrifugation bei 10 000 rpm über 1 min (Microfuge R, Beckmann) auf der Silica-Gel-Membran des Zentrifugenröhrchens adsorbiert. Aufgrund der Membraneigenschaften und den hohen Salzkonzentrationen der verwendeten Waschpuffer kann die RNA in den nachfolgenden Zentrifugationsschritten gereinigt werden. Mit 50 µl Aqua bidest. wird die RNA anschließend von der Säule eluiert. Der Gehalt und die Reinheit der Lösung werden photometrisch bestimmt (3.2.4). Die Lagerung erfolgt bei -80°C.
3.4.9 Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
3.4.9.1 Reverse Transkription
Bei der reversen Transkription wird mRNA in cDNA umgeschrieben. Ein Oligo(dT)-10 Primer, der zum Poly-A-Schwanz der mRNA komplementär ist, dient dabei als Ansatzstelle der Reversen Transkriptase. Für die reverse Transkription werden jeweils 3,5 µg RNA im folgenden Reaktionsansatz eingesetzt:
PCR-Puffer (10 x) 5 µl
MgCl2 25 mM 5 µl
dNTP-Mix (dATP, dGTP, dCTP, dTTP je 10 mM) 12,5 µl
DTT 0,1 mM 2,5 µl
Oligo-dT-Primer 100 pmol/µl 2,5 µl
Aqua bidest. ad 45 µl
Im Thermocycler werden die Proben (3,5 µg RNA) zuerst bei 60°C für 10 min denaturiert. Man kühlt auf 37°C ab und gibt 1 µl RNAsin (RNAse-Inhibitor) und 250 U Maloney-Maus-Leukämie-Virus-Reverse-Transkriptase (MMLV-RT) zu, um die Reaktion zu starten. Man inkubiert 1 h bei 37°C. In dieser Zeit wird die mRNA in cDNA umgeschrieben. Anschließend wird die MMLV-RT durch 5 min Inkubation bei 95°C denaturiert. Die Lagerung der cDNA erfolgt bei -80°C.
3.4.9.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Mit Hilfe der PCR, einem Verfahren, welches zur selektiven Vervielfältigung von DNA-Sequenzen dient, wird die über die reverse Transkription erhaltene cDNA in großer, für Nachweisreaktionen ausreichender Menge hergestellt. Die PCR verläuft in drei Schritten: Der Denaturierung der doppelsträngigen DNA, dem Anlagern der Oligonukleotid-Primer an die DNA (Annealing) und der Synthese der komplementären DNA durch eine hitzestabile Polymerase (Elongation).
Folgende Primer werden verwendet:
PHP-Sense-Primer: 5’-CAA-AGT-GTC-AGG-CGA-ACT-GC-3’
Position auf der cDNA-Sequenz: 174 – 193 bp Aminosäuresequenz: KVSGEL (59-64 AA)
PHP-Antisense -Primer: 5’-CAT-CAT-CAG-CCC-AGG-TGA-CC-3’
Position auf der cDNA-Sequenz: 351 – 371 bp Aminosäuresequenz: VTWADD (118-123 AA)
Die Länge des amplifizierten Stückes beträgt 197 bp.
Von der cDNA-Lösung aus der RT-Reaktion werden 15 µl für die PCR verwendet.
Sie werden dem folgenden PCR-Ansatz beigegeben:
PCR-Puffer (10 x) 4 µl
MgCl2 25 mM 3 µl
dNTP-Mix (dATP, dGTP, dCTP, dTTP je 2 mM) 12,5 µl Sense-Primer 10 pmol/µl 1 µl Antisense-Primer 10 pmol/µl 1 µl
Aqua bidest. ad 30 µl
Im Thermocycler werden die Proben für 2 min auf 95°C erhitzt, um möglicherweise vorliegende cDNA-RNA-Hybride und Sekundärstrukturen der cDNA aufzulösen.
Dann lässt man abkühlen und gibt bei 70°C je Ansatz 1 U ThermoPrime Plus
DNA-Polymerase in 5 µl 1x PCR-Puffer zu. Dann wird die cDNA in folgenden zyklischen Temperaturschritten amplifiziert:
Denaturierung 95°C 30 sec
Annealing 53°C 60 sec
Elongation 70°C 120 sec
Es wurden insgesamt 30 Zyklen durchlaufen. Dann wurde die Reaktion beendet.
3.4.9.3 Auswertung der RT-PCR
Es wird ein 2%iges Agarosegel mit Ethidiumbromid gegossen. Die Proben werden mit DNA-Probenpuffer versetzt und in die Taschen des Gels eingefüllt. Dann legt man zur Trennung der Proben eine Spannung von 120 V an das Gel an. Die Auswertung erfolgte unter UV-Licht (vgl. 3.2.2).
3.4.10 Statistik
Die statistische Auswertung erfolgt mit Hilfe der Computerprogramme Microsoft Excel und WinSTAT.
Zum Vergleich der Gruppen der Zellkultur-Experimente wird eine Varianzanalyse kombiniert mit dem Scheffé-Test durchgeführt.
Alle Ergebnisse sind als Mittelwert +/- Standardabweichung (SD) angegeben. Ein Signifikanzniveau von p<0,05 wurde als signifikant betrachtet.
Signifikanzniveau (p) Symbol (#, +, oder *)
<0,05 #
<0,01 ##
<0,001 ###