3.1 Allgemeine proteinbiochemische Methoden
3.1.2 Proteinbestimmung
3.1.2.3 BCA-Methode
Bei dieser Proteinbestimmungsmethode (Smith et al., 1985) werden 5 µl der Proteinprobe mit H2O auf 100 µl aufgefüllt. Dazu gibt man 500 µl BCA-Reagenz, mischt und inkubiert die Proben für 30 min bei 60°C. Die Proteine der Probe reduzieren dabei das im Reagenz enthaltene Cu2+ zu Cu+, welches mit der ebenfalls
im Reagenz vorhandenen Bicinchoninsäure (BCA) zusammen einen purpurfarbenen Komplex bildet, der bei einer Wellenlänge von 562 nm absorbiert. Nach der Inkubation werden je 200 µl der Proben in eine Mikrotiterplatte gegeben und photometrisch vermessen. Als Vergleich dient eine BSA-Reihe von 5–50 µg Protein.
Zur Durchführung wurde das MicroBCA Protein Assay System Kit der Firma Interchim verwendet.
BCA-Reagenz: 25 Teile Lösung A: Na2CO3 /NaHCO3, Natriumtartrat, 2 M NaOH
+ 24 Teile Lösung B: 4% Bicinchoninsäure in H2O + 1 Teil Lösung C: 4% CuSO4 x 5 H2O in H2O
3.1.3. Polyacrylamid-Gelelktrophorese (PAGE)
Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist eine Methode zur Trennung von Proteinen in einer Polyacrylamid-Matrix. Die Trennung wird unter denaturierenden Bedingungen, also unter Zusatz von Sodiumdodecylsulfat (SDS), durchgeführt (SDS-PAGE). Das negativ geladene SDS lagert sich an die Proteine und überdeckt deren Eigenladung, so dass die Trennung der Proteine nur aufgrund ihrer Größe und nicht auch ihrer Ladung erfolgt (Laemmli, 1970).
Die Polyacrylamidminigele (9 x 9,5 x 0,5 cm) stammen aus Eigenproduktion (Tabelle 3-2). Sie bestehen aus einem engmaschigen Trenngel, in dem die eigentliche Auftrennung der Proteine stattfindet, und einem weitmaschigen Sammelgel, in dem die Proteine vorkonzentriert werden. Es wird also eine so genannte
„Diskontinuierliche PAGE“ durchgeführt.
Acrylamid/Bisacrylamid, der Trenngelpuffer, Wasser und TEMED werden gemischt und die Polymerisation, welche über eine radikalische Reaktion verläuft, durch Zugabe von APS gestartet. Die Lösung wird in die Gelgießapparatur gegossen und sofort mit Isopropanol überschichtet. So wird der Ausschluss von Sauerstoff während der Polymerisation gewährleistet. Nach 60 min wird der Isopropanol abgegossen.
Reste werden durch Nachspülen mit dest. H2O entfernt. Dann wird das Trenngel mit der Mischung für das Sammelgel überschichtet. Die Kämme werden sofort gesteckt und das Sammelgel härtet für weitere 30 min aus. Die fertigen Gele werden in
befeuchtete Frischhaltefolie gepackt und können im Kühlschrank bei 4°C für 2 Wochen gelagert werden.
Tabelle 3-2 Zusammensetzung von Trenn- und Sammelgel (für 10 Gele)
Trenngel 15% Sammelgel 4,5%
Acrylamid/Bisacrylamid (30%) 30 ml Acrylamid/Bisacrylamid (30%) 3 ml Trenngelpuffer (4 x) 15 ml Sammelgelpuffer (4 x) 5 ml
H2O 15 ml H2O 12 ml
TEMED 50 µl TEMED 30 µl
APS (20%) 100 µl APS (20%) 60 µl
Trenngelpuffer (4 x): 0,5 M Tris/HCl pH 8,8 0,4% SDS
0,02% NaN3
Sammelgelpuffer (4 x): 0,5 M Tris/HCl pH 6,8 0,4% SDS
0,02% NaN3
APS 20%: 20% Ammoniumperoxodisulfat in H2O
Maximal 15 µl Proteinlösung werden vor der Elektrophorese mit 5 µl SDS-Probenpuffer versetzt, 5 min bei 95°C gekocht und kurz zentrifugiert. Der Anoden- und Kathodenraum der Gelelektrophorese-Apparatur wird mit je 250 ml Laufpuffer gefüllt. Dann pipettiert man die Proben in die Geltaschen (Fassungsvermögen max.
20 µl). Als Proteingrößenstandard wird ein ungefärbter oder ein vorgefärbter Marker mit aufgetragen. Man legt eine Spannung von 100 V an. Haben die Proben das Sammelgel durchlaufen, erhöht man die Spannung auf 200 V.
Laufpuffer: 25 mM Tris 0,1% SDS 190 mM Glycin
SDS-Probenpuffer: 130 mM Tris/HCl pH 6,8 10% SDS
10% 2-Mercaptoethanol 20% Glycerin
0,06% Bromphenolblau
(pH-Wert-Einstellung vor Bromphenolblauzugabe)
3.1.4 Coomassie-Färbung
Coomassie-Brilliant Blue R-250 ist ein blauer Trimethylmethanfarbstoff, der besonders mit basischen Aminosäuren wie Arginin oder Lysin Komplexe bildet.
Daher wird er zur unspezifischen Anfärbung von Proteinen verwendet. Die Nachweisgrenze der Methode liegt bei 100 ng Protein pro Bande.
Zum Nachweis gibt man das Gel nach der Elektrophorese für mindestens 1 h in die Coomassie-Färbelösung. Diese enthält neben dem Farbstoff auch Ethanol und Essigsäure, wodurch die Proteine auf dem Gel fixiert werden (Alkohol-Säure-Fällung). Die Färbelösung wird abgegossen (kann wieder verwendet werden) und das Gel mit dest. H2O gespült. Dann gibt man es in die Entfärbelösung. Mit dieser wird unter mehrmaligem Wechseln der Lösung überschüssiger Farbstoff entfernt, so dass die Proteinbanden deutlich sichtbar werden. Das Gel wird über Nacht in dest.
H2O gelagert. Dadurch treten die Banden noch deutlicher hervor.
Coomassie-Färbelösung: 0,2% Coomassie Brilliant Blue R-250 50% Methanol
10% Essigsäure
Coomassie-Entfärbelösung: 30% Ethanol 7,5% Essigsäure
3.1.5 Blotting-Verfahren
3.1.5.1 Semidry-Blottig
Beim Semidry-Blotting transferiert man elektrophoretisch Proteine in einer Apparatur horizontaler Anordnung vom Trenngel auf eine Nitrocelluslose- oder PVDF-Membran (Kyhse-Andersen, 1984; Towbin et al., 1979).
Das Trenngel, die Membran und die Blottingpapiere werden für 5 min in Transferpuffer äquilibriert. Wird eine PVDF-Membran verwendet, so wird diese vorher je 1 min in Methanol und dest. H2O eingelegt. Auf die Anode der Blot-Apparatur legt man drei Whatman-Blottingpapiere (dienen als Pufferreservoir), die Membran, das Trenngel und drei weitere Blottingpapiere übereinander. Dann rollt man mit einem Glasstab über dieses so genannte Sandwich, um eventuell enthaltene Luftblasen zu entfernen. Die Kathode wird auf die Apparatur aufgesetzt und eine Spannung von 10 V für 1 h angelegt. In dem so entstehenden elektrischen Feld wandern die Proteine vom Gel auf die Membran. Zur Kontrolle des Transfers wird der mit auf das Gel aufgetragene (3.1.3) vorgefärbte und damit sichtbare Größenstandard verwendet. Sieht man ihn nach dem Blotting auf der Membran, so sind auch alle anderen Proteine übertragen worden.
Transferpuffer: 25 mM Tris 190 mM Glycin 10% Methanol
3.1.5.2 Tankblotting
Beim Tankblotting werden Proteine ebenfalls elektrophoretisch vom Trenngel auf eine Membran transferiert. Man arbeitet allerdings in einer Apparatur vertikaler Anordnung.
Blottingpapiere, Membran und Trenngel werden in Transferpuffer äquilibriert, übereinandergelegt (2 Blottingpapiere, Membran, Gel, 2 Blottingpapiere) und vertikal zusammen mit einem Kühlelement in die Apparatur eingespannt. Die Apparatur wird dann vollständig mit Transferpuffer (1 – 2 l) aufgefüllt. Es wird für 1 h eine Spannung von 100 V angelegt. Als Kontrolle der vollständigen Übertragung der Proteine dient auch hier der vorgefärbte Größenstandard (vgl. 3.1.5.1).
Transferpuffer: 20 mM Tris 80 mM Glycin 20% Methanol
3.1.6 Ponceau S-Färbung
Ponceau S ist ein roter Azofarbstoff, der Proteine unspezifisch anfärben kann (Salinovich und Montelaro, 1986). Man verwendet ihn, um Proteine, die auf eine Membran transferiert worden sind, nachzuweisen bzw. die Effizienz des Proteintransfers zu überprüfen. Des Weiteren fixiert die Färbelösung, die auch TCA enthält, die Proteine auf der Membran. Bei nachfolgenden Waschschritten werden sie daher nicht so leicht von der Membran gespült. Die Färbung mit Ponceau S ist zudem reversibel, so dass anschließende Nachweisreaktionen nicht gestört werden.
Nach dem Blot-Vorgang (3.1.5) wird die Membran für 10 min in der Färbelösung inkubiert. Danach wird die Membran mit dest. H2O solange gewaschen bis die Banden gut zu sehen sind. Durch Inkubation mit TBST-Puffer wird die Membran anschließend wieder vollkommen entfärbt.
Ponceau S-Färbelösung: 0,2% Ponceau S
3% Trichloressigsäure (TCA)
TBST: 10 mM Tris/HCl pH 7,6
150 mM NaCl 0,1% Tween 20
3.1.7 Nachweis von Proteinen mittels Antikörper
Mit dieser immunologischen Methode (Westernblot) lassen sich elektrophoretisch getrennte und auf eine Membran transferierte Proteine mit spezifischen Antikörpern selektiv markieren und in einer Farb- oder Fluoreszenzreaktion detektieren (Burnette, 1981).
Eine Proteinprobe wird elektrophoretisch getrennt (3.1.3), auf eine Membran geblottet (3.1.5) und mit Ponceau S gefärbt (3.1.6). Nach der Entfärbung wird die
Membran 1 h mit einer Milchpulversuspension (Blockierlösung) blockiert. Nach 3-maligem Waschen mit TBST (1 x 15 min, 2 x 5 min), wird die Membran unter Schütteln über Nacht bei 4°C mit dem ersten Antikörper, der spezifisch gegen das gesuchte Antigen gerichtet ist, inkubiert. Verwendet werden dazu Antikörper, die spezifisch gegen den N-Terminus der PHP gerichtet sind, gegen die Gβ–Untereinheit des G-Proteins oder gegen α-Tubulin, das in Zellen konstitutiv exprimiert wird und als Vergleich dient, ob pro Spur die gleiche Proteinmenge aufgetragen ist (Tabelle 3-3).
Anschließend wird die Membran erneut 3-mal mit TBST (1 x 15 min, 2 x 5 min) gewaschen und für 1 h bei Raumtemperatur mit dem zweiten Antiköper inkubiert. Der zweite Antikörper ist gegen die konstanten Bereiche des ersten gerichtet und erkennt diesen somit speziesspezifisch. Verwendet werden anti-Kaninchen- oder anti-Maus-Antikörper in einer Verdünnung 1:2500 in TBST.
Nach 3-maligem Waschen in TBST, wird die Membran 1 min (ohne Schütteln) in ECL-Reagenz (1 ml Lösung 1 + 1 ml Lösung 2) eingelegt. Die an den zweiten Antikörper gekoppelte Peroxidase katalysiert dabei die Reduktion von Wasserstoffperoxid zu Wasser und atomarem Sauerstoff. Dieser Sauerstoff oxidiert das im Reagenz ebenfalls enthaltene Luminol. Dabei wird Licht abgestrahlt. Die Membran wird auf eine Glasplatte gelegt und in Frischhaltefolie eingepackt. Dann wird ein Röntgenfilm aufgelegt (10 s – 30 min), und dieser anschließend maschinell entwickelt.
TBST: (Herstellung siehe 3.1.6)
Blockierlösung: 5% Milchpulver in TBST
Tabelle 3-3 Verwendete Antikörper und ihre Verdünnungen
1. Antikörper Verdünnung 1. AK 2. Antikörper Verdünnung 2. AK Anti-PHP/N
(Kaninchen)
1:400 in TBST
+ 1% BSA Anti-Kaninchen 1:2500 in TBST Anti-Gβ
(Kaninchen) 1:2000 in TBST Anti-Kaninchen 1:2500 in TBST Anti-α-Tubulin
(Maus) 1:5000 in TBST Anti-Maus 1:2500 in TBST
3.1.8 Autoradiographie
Radioaktiv markierte Proteine werden mittels Autoradiographie detektiert. Dazu wird das Trenngel nach der Elektrophorese (3.1.3) für 5–10 min in Fixierlösung gegeben.
Überschüssige Radioaktivität wird mit Hilfe einer Rasierklinge durch Abtrennen der unteren Bereiche des Gels (Schnitt in Höhe der Bromphenolblaubande) entfernt. Das Gel wird anschließend bei 80°C für 20 min unter Vakuum zwischen Filterpapier und Frischhaltefolie getrocknet. Die Auswertung erfolgt danach entweder durch Belichtung und Entwicklung eines Röntgenfilms oder digital mit Hilfe des Phosphoimagers (AIDA-System).
Fixierlösung: 25% Methanol 5% Essigsäure
3.1.9 Phosphorylierung und Dephosphorylierung von Proteinen
3.1.9.1 Phosphorylierung von Transducin
Das G-Protein Trasducin wurde von Herrn Prof. Dr. T. Wieland von der Universität Heidelberg zur Verfügung gestellt. Die Fraktion entstammt der Reinigung von α-Transducin aus der Rinderretina (Cuello et al., 2003) und enthält ausreichende Mengen der Gβ-Untereinheit, wie eine Coomassie-Färbung (3.1.4) beweist.
Die Phosphorylierung des Transducins wird in einem 10 µl Ansatz durchgeführt. Fünf Mikroliter Transducin werden für 10 min bei 37°C in Gegenwart von 25 mM Tris/HCl (pH 7,5), 1 µM GTP, welches 2 µCi [γ-32P]GTP enthält, und 5 mM EDTA phosphoryliert. Die Reaktion wird anschließend entweder mit 5 µl Probenpuffer gestoppt oder die Dephosphorylierungsreaktion wird direkt im Anschluss durchgeführt.
3.1.9.2 Phosphorylierung von H10-Zellmembranen
Auch diese Probe wurde von Herrn Prof. Dr. T. Wieland von der Universität Heidelberg zur Verfügung gestellt. Sie enthält die präparierten Zellmembranen von H10-Zellen. H10-Zellen sind Kardiomyozyten von Ratten, die Gβ enthalten und die NDPKs in dreifacher Menge überexprimieren (Hippe et al., 2003).
Wiederum wird die Phosphorylierung in einem 10 µl Ansatz durchgeführt. Vier Mikroliter der H10-Zellmembranen werden in Gegenwart von 25 mM Tris/HCl (pH 7,5), 1 mM MgCl2 und 1 µM GTP, welches 2 µCi [γ-32P]GTP enthält, bei 37°C 2 min lang phosphoryliert. Die Reaktion wird mit 5 mM EDTA gestoppt. Entweder erfolgt dann die Zugabe von 5 µl Probenpuffer oder die Probe wird sofort anschließend dephosphoryliert.
3.1.9.3 Phosphorylierung von Leberextrakt
Neunzig Mikrogramm Protein des Leberextraktes (Bechmann, 2004) werden in einem 10 µl Ansatz in Gegenwart von 5 mM EDTA, 25 mM Tris/HCl (pH 7,5) und 1 µM GTP, welches 2 µl Ci [γ-32P]GTP enthält, bei 37°C 15 min lang phosphoryliert.
Die Reaktion wird durch Zugabe von 5 µl Probenpuffer gestoppt.
3.1.9.4 Dephosphorylierung
Die Dephosphorylierung (15 µl Ansatz) verläuft bei allen verwendeten Proben identisch. Zu den phosphorylierten Proteinen wird entweder 1 µg in Bakterien exprimierte PHP oder 2,4 µg in SF9-Zellen exprimierte PHP in Gegenwart von 25 mM Tris/HCl (pH 7,5) und 5 mM EDTA gegeben. Bei der Dephosphorylierung mit alkalischer Phosphatase wurden 0,3 µg Enzym (0,25 U) eingesetzt. Der dabei verwendete Puffer enthielt 25 mM Tris/HCl (pH 7,9). Die Inkubation verlief bei 37°C und wurde nach 30 min durch die Zugabe von 5 µl Probenpuffer gestoppt.
Die Proben wurden dann auf ein 15%iges Minigel aufgetragen, elektrophoretisch getrennt (3.1.3) und autoradiographisch (3.1.8) ausgewertet.
Probenpuffer: 15 mM Tris/HCl pH 6,8 4% SDS
2% 2-Mercaptoethanol 10% Saccharose 10 mM EDTA 8 M Harnstoff
0,06% Bromphenolblau
(pH-Wert vor Bromphenolblauzugabe einstellen)
3.1.10 Säure-Lauge-Behandlung
Mit Hilfe der Säure-Lauge-Behandlung ist es möglich, die verschiedenen Phosphoproteine zu unterscheiden. Diese Methode nutzt dabei die unterschiedliche chemische Stabilität der Phosphoproteinverbindungen gegenüber starker Säure und Lauge (Tabelle 3-4).
Ein vierfacher Ansatz des Proteins wird mit [γ-32P]GTP phosphoryliert und in 4 Spuren auf ein Minigel aufgetragen. Die Proteine werden elektrophoretisch (3.1.3) getrennt und anschließend mittels Semidry-Blotting (3.1.5.1) auf eine PVDF-Membran übertragen. Diese wird in vier Teile (pro Teil ein Phosphorylierungsansatz) zerschnitten. Ein Teil wird in 1 N KOH und ein weiteres in 6 N HCl für 2 h unter gelegentlichem Umschütteln bei 45°C inkubiert. Zur Kontrolle wird das dritte Teil unter den gleichen Bedingungen aber in neutralem 100 mM Tris pH 7,5 inkubiert.
Das vierte Teil dient ebenfalls als Kontrolle. Es wird keiner erhöhten Temperatur ausgesetzt und verbleibt 2 h im Kühlschrank bei 4°C.
Anschließend werden das in HCl und das in KOH inkubierte Membranteil mit 100 mM Tris pH 7,5 neutralisiert. Die gesamte Membran wird dann im Trockenschrank getrocknet und in Folie verpackt. Die Auswertung erfolgt entweder durch Belichtung und Entwicklung eines Röntgenfilms oder digital mit Hilfe des Phosphoimagers (AIDA-System).
Tabelle 3-4 Stabilität von Phosphoverbindungen gegenüber Säure und Lauge (Kamps, 1991)
( * nach Kamps (1991) ist Cystein stabil gegen Säure, nach Seno et al. (1988) ist es das nicht.)
S-Phosphat:
pCystein
Acylphosphat:
pAspartat, pGlutamat Phosphoamidat:
pHistidin, pLysin, pArginin
Phosphoester:
pSerin, pThreonin pTyrosin
Stabilität gegen Lauge Stabilität gegen Säure
Phosphatverbindung
+ _
+/-