Denkbar wäre es auch, dass die PHP über ihr Substrat, die ACL einen Einfluss auf das Überleben einer Zelle hat. Mit Hilfe der ACL wird ein Drittel des für die Synthese des Neurotransmitters Acetylcholin notwendigen Acetyl-CoAs hergestellt (Ricny und Tucek, 1982; Patel und Owen, 1976). Sollten sich die Versuche bestätigen, dass die PHP die Aktivität der ACL reguliert, dann wäre es möglich, dass die Phosphatase dadurch auch den Acetylcholin-Haushalt der Zellen kontrolliert und einen Einfluss auf den Verlauf degenerativer Erkrankungen der cholinergen Neurone, wie es zum Beispiel auch der Morbus Alzheimer darstellt, nimmt (Canu und Calissano, 2003).
Durch die Bereitstellung von Acetyl-CoA ist die ACL ebenfalls an der Lipidsynthese der Zelle beteiligt. Es konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des Enzyms zu einer Reduzierung der Fettsäure- und Cholesterinsynthese in einer Vielzahl von Geweben führt (Sullivan et al., 1974). Durch eine Regulation des Fettstoffwechsels und damit letztendlich des Energiehaushalts der Zelle über ihr Substrat die ACL könnte die PHP auch auf diesem Weg das Überleben von Zellen beeinflussen.
Untersuchungen sind in dieser Richtung allerdings noch nicht unternommen worden.
Dephosphorylierung von Gβ durch die PHP, was zeigte, dass die Reaktion nicht nur am isolierten, sondern auch am in der Membran festsitzenden G-Protein stattfand.
Die Dephosphorylierungsreaktion war zudem relativ spezifisch: Gβ wurden nur durch die PHP, nicht aber durch die alkalische Phosphatase angegriffen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Gβ-Untereinheit und die PHP in vielen Geweben gemeinsam vorkommen. Somit besteht die Möglichkeit, dass beide innerhalb der Zelle interagieren können und die gefundene Reaktion auch eine physiologische Relevanz besitzt. Weitere Versuche bewiesen zudem, dass die Phosphorylierung der Gβ-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins in Zellen, in denen man die PHP überexprimiert hatte, eindeutig zurück ging (Persönliche Mitteilung, Prof. Wieland, Universität Heidelberg). Die Dephosphorylierung von Gβ durch die PHP findet also in intakten Zellen tatsächlich statt und ist damit auch physiologisch von Bedeutung.
Abbildung 5-1 Die reversible Phosphorylieung des G-Proteins
Die Gβ-Untereinheit des G-Proteins wird durch NDPK B an Histidin phosphoryliert.
Die Dephosphorylierung erfolgt mit Hilfe der PHP.
+ GTP - Pi
NDPK B
PHP
α β
γ
┌
Histidin- P
α β
γ
┌
HistidinAußerdem kann man festhalten, dass die Gβ-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins reversibel an einem Histidin phosphoryliert wird. NDPK B ist die Kinase, die PHP die dazugehörige Phosphatase. Somit ist die reversible Phosphorylierung eines Proteins am Histidin auch im Eukaryonten gegeben (Abbildung 5-1).
Das G-Protein konnte also neben der ACL als neues Substrat der PHP identifiziert werden. Welche Rückschlüsse ließ diese Entdeckung aber nun auf die Funktion der Phosphatase im Organismus zu?
5.2.2 G-Proteine
Über G-Proteine weiß man, dass sie eine wichtige Rolle in der Signaltranduktion spielen und für gewöhnlich gekoppelt mit einem Rezeptor vorliegen. Dieser Rezeptor besitzt sieben transmembranäre Helices und eine an der extrazellulären Seite befindliche Erkennungsstelle für Signalmoleküle. An der intrazellulären Seite sitzt das G-Protein. Dieses G-Protein hat eine heterotrimere Struktur und besteht aus einer Gα-, einer Gβ- und einer Gγ-Untereinheit (Stryer und Bourne, 1986; Birnbaumer et al., 1990). Die Gα-Untereinheit, von der man über 20 Subtypen kennt (Simon et al., 1991), ist 39-52 kDa groß und enthält eine Guaninnukleotidbindestelle (Gilmann, 1987). Des Weiteren verfügt sie über eine intrinsische GTPase-Aktivität, die GTP unter Abspaltung eines Phosphatrestes hydrolysiert (Cassel und Selinger, 1976).
Von der Gβ-Untereinheit, die ein Molekulargewicht von 33-36 kDa besitzt, sind 5 Subtypen bekannt (Watson et al., 1994). Von dieser Untereinheit (Gβ1-4) weiß man zudem, dass sie mit Hilfe von NDPK B am Histidin266 phosphoryliert (Cuello et al., 2003) und durch die PHP wieder dephosphoryliert werden kann. Über die Gγ-Untereinheit ist noch sehr wenig bekannt. Mittlerweile sind aber 12 Subtypen identifiziert worden (Offermanns und Schultz, 1994).
Im inaktiven Zustand liegt das G-Protein als Heterotrimer vor, an dessen Gα-Untereinheit GDP gebunden ist. Bindet nun ein spezifischer Agonist an den mit dem G-Protein gekoppelten Rezeptor, so induziert dies eine Konformationsänderung des Rezeptorproteins und es kommt zur Interaktion mit dem G-Protein. Als Folge dieser Interaktion dissoziiert GDP von der Gα-Untereinheit des G-Proteins ab und wird durch GTP ersetzt. Durch diesen Guaninnukleotidaustausch trennt sich das G-Protein von seinem Rezeptor und zerfällt in die GTP-tragende Gα-Untereinheit und das freie Gβγ-Dimer, die beide in der Lage sind mit unterschiedlichen Effektoren zu
interagieren. Das G-Protein liegt nun aktiv vor. Die intrinsische GTPase-Aktivität der Gα-Untereinheit bewirkt die Hydrolyse von GTP zu GDP und Phosphat, wodurch es wieder zum Zusammenschluss mit dem Gβγ-Dimer zum inaktiven Heterotrimer kommt (Stryer and Bourne, 1986; Gilmann, 1987; Birnbaumer et al., 1990) (Abbildung 5-2).
Abbildung 5-2 Aktivierung heterotrimerer G-Proteine
Durch Bindung eines Agonisten (A) kommt es zum Austausch von GDP zu GTP an der Gα-Untereinheit des G-Proteins. Es zerfällt in Gα-Untereinheit und Gβγ-Dimer, die beide mit einem Effektor interagieren können. Durch Hydrolyse des an Gα gebundenen GTPs zu GDP bildet sich wieder das inaktive Heterotrimer.
Lange Zeit ging man davon aus, dass nur die Gα-Untereinheit in der Lage sei mit anderen Proteinen zu interagieren und Effekte in der Zelle hervorzurufen. Gα aktiviert beziehungsweise hemmt zum Beispiel die Adenylatcyclase (Northup et al., 1983;
Simmonds et al., 1989) und beeinflusst dadurch den cAMP-Spiegel der Zelle. Auch 7-Transmembranrezeptor
α β
γ
γ β
Effektor α
GTP
α
GTP
α β
γ
&
GDP
- P
iGDP
GTP
A
α
Sie bindet auch an K+- oder Ca2+-Kanäle (Yatani et al., 1988a/b) und kann die Phospholipase C (Smrcka et al., 1991) aktivieren, wodurch deren Substrat Phosphatidyl-Inositol-biphosphat (PIP2) in Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) gespalten wird. IP3 bewirkt die Freisetzung von Ca2+ während DAG die Proteinkinase C (PK C) aktiviert.
Inzwischen weiß man jedoch, dass auch das Gβγ-Dimer alleine Effekte hervorrufen kann und nicht nur dazu dient, die Gα-Untereinheit in der Membran zu verankern (Sternweis, 1994). Beispielsweise kann das Gβγ-Dimer ebenfalls mit einigen Isoenzymen der Phospholipase C (Blank et al., 1992) und der Adenylatcyclase (Tausig et al., 1993) interagieren. Auch K+-Kanäle (Reuveny et al., 1994) und die Phospholipase A2 (Jelsema und Axelrod, 1987) gelten als Substrate. Weiterhin vermitteln Gβγ-Dimere die durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren ausgelöste Aktivierung der MAP- oder JUN-Kinase-Kaskade (Touhara et al., 1995).
Über die Aktivierung und die vielfältigen Funktionen des G-Proteins und seiner Untereinheiten ist also sehr viel bekannt. Über die Rolle, die die Phosphorylierung der Gβ-Untereinheit in diesem Zusammenhang spielt, weiß man allerdings bisher noch recht wenig.
5.2.3 Die Phosphorylierung der G β -Untereinheit
Es ist bekannt, dass die Gβ-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins mit NDPK B einen Komplex bildet und dadurch am Histidin266 phosphoryliert wird (Cuello et al., 2003). Dies gilt aber nur für einen Teil der G-Proteine der Zelle und längst nicht für alle. Bisher geht man davon aus, dass der Phosphattransfer von NDPK B auf das Histidin der Gβ-Untereinheit ein Mechanismus der basalen rezeptorunabhängigen Aktivierung von G-Proteinen ist (Niromaad et al., 1997). Dabei wird unter Umgehung des klassischen, oben bereits beschriebenen rezeptorvermittelten Aktivierungsweges der G-Proteine, das Phosphat von Gβ auf das GDP der Gα-Untereinheit übertragen.
Es entsteht GTP, wodurch das G-Protein aktiviert wird. Gegen diese These spricht allerdings, dass das Histidin266 auf Grund der dreidimensionalen Struktur des G-Proteins relativ weit von der Gα-Untereinheit entfernt ist (Cuello et al., 2003). Gα kann GDP jedoch auch ohne Stimulus abgeben. Dieses kann durch Phosphattransfer vom Histidin266 zu GTP werden, welches wieder an Gα bindet und so das G-Protein auf diesem Wege doch rezeptorunabhängig aktiviert werden kann
(Cuello, 2003). Die PHP könnte, indem sie den Phosphatrest übernimmt, diesen Mechanismus unterbinden.
Die Phosphorylierung der Gβ-Untereinheit kann aber auch einen direkten Einfluss auf die Effektoren der G-Proteine haben. So konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass eine Überexpression von NDPK B, welches Gβ phosphoryliert, in der Zelle zu einer Erhöhung der cAMP-Bildung führt (Niromaad et al., 2001). Ebenso konnte man beobachten, dass die Zugabe von phosphorylierten Gβγ-Dimeren die G-Proteine humaner Thrombozyten aktiviert, wodurch die Adenylatcyclase stimuliert wurde (Wieland et al., 1992). Auch in diese Mechanismen könnte die PHP regulierend eingreifen, indem sie die Phosphorylierung an Gβ aufhebt und dadurch die Aktivierung der Adenylatcyclase verhindert oder terminiert. Auf diesem Wege könnte die PHP Abläufe innerhalb der Zelle regulieren. Weitere Versuche in dieser Richtung werden zeigen müssen, wie weit der Einfluss der Phosphatase tatsächlich reicht und ob sie in der Lage ist, die vielfältigen Funktionen der G-Proteine zu regulieren. Sollte dies allerdings der Fall sein, so würde der PHP eine wichtige Rolle in der zellulären Signaltransduktion zukommen.