(Cuello, 2003). Die PHP könnte, indem sie den Phosphatrest übernimmt, diesen Mechanismus unterbinden.
Die Phosphorylierung der Gβ-Untereinheit kann aber auch einen direkten Einfluss auf die Effektoren der G-Proteine haben. So konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass eine Überexpression von NDPK B, welches Gβ phosphoryliert, in der Zelle zu einer Erhöhung der cAMP-Bildung führt (Niromaad et al., 2001). Ebenso konnte man beobachten, dass die Zugabe von phosphorylierten Gβγ-Dimeren die G-Proteine humaner Thrombozyten aktiviert, wodurch die Adenylatcyclase stimuliert wurde (Wieland et al., 1992). Auch in diese Mechanismen könnte die PHP regulierend eingreifen, indem sie die Phosphorylierung an Gβ aufhebt und dadurch die Aktivierung der Adenylatcyclase verhindert oder terminiert. Auf diesem Wege könnte die PHP Abläufe innerhalb der Zelle regulieren. Weitere Versuche in dieser Richtung werden zeigen müssen, wie weit der Einfluss der Phosphatase tatsächlich reicht und ob sie in der Lage ist, die vielfältigen Funktionen der G-Proteine zu regulieren. Sollte dies allerdings der Fall sein, so würde der PHP eine wichtige Rolle in der zellulären Signaltransduktion zukommen.
Dephosphorylierung der Gβ-Untereinheit für die Regulationsmechanismen der Zelle hat und wie bedeutsam die Rolle der PHP in der durch G-Proteine vermittelten Signaltransduktion ist.
Immerhin besteht die Möglichkeit, dass beide Befunde miteinander zusammenhängen, da die Apoptose zum Beispiel über eine Regulierung von Proteinen vermittelt werden könnte (Adams und Brown, 2001). Mit Hilfe von G-Proteinen kann es zum Einstrom von Calciumionen in die Zelle kommen oder auch zur Aktivierung der PK C. Da es sowohl durch erhöhte Calciumwerte in der Zelle als auch durch die Aktivierung der PK C zum Auslösen der Apoptose kommen kann (Cross et al., 2000), wäre ein solcher Zusammenhang zumindest denkbar, auch wenn er momentan rein spekulativ ist.
Auf jeden Fall zeigen die gefundenen Ergebnisse, dass die Histidinphosphorylierung in Eukaryonten durchaus von Bedeutung ist und sie neben der Serin-/Threonin- und Tyrosinphosphorylierung ebenfalls eine essentielle Rolle in der Regulation der Zellen spielt.
6 Zusammenfassung
Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit sollte die erste im Säugetier entdeckte Protein-Histidin-Phosphatase (PHP) weiter charakterisiert und ihre physiologische Funktion in der Zelle näher untersucht werden. Aus diesem Grund wurde versucht, ein geeignetes Modellsystem zu entwickeln, mit dessen Hilfe man die Expressionsrate des Enzyms zuverlässig verändern konnte, um funktionelle Untersuchungen durchführen zu können. Des Weiteren wurde nach einem neuen Substrat der PHP gesucht, mit dessen Hilfe man ebenfalls Rückschlüsse auf die Funktion des Enzyms ziehen konnte.
Zuerst wurde die Expression der PHP in embryonalen Neuronen mittels technologie herabreguliert. Es zeigte sich, dass die Zugabe der Antisense-Oligonukleotide die Zellen bei einer durch Staurosporin hervorgerufenen, apoptotischen Schädigung vor dem Zelltod bewahrt. Dieser Schutz konnte mit unterschiedlichen Antisense-Oligonukleotiden, die gegen verschiedene Stellen der PHP-Sequenz gerichtet waren, gezeigt werden. Der Effekt war somit spezifisch und es war davon auszugehen, dass die PHP an der Regulation der Apoptose in neuronalen Zellen beteiligt ist. Da es aber nicht möglich war, die schützende Wirkung der Oligonukleotide und eine gleichzeitige Herabregulierung der PHP-Expression auf Proteinebene zu zeigen, gab es keinen direkten Beweis dafür, dass der 20-30%ige Rückgang der Apoptose in den mit Antisense-Oligonukleotiden und Staurosporin behandelten Zellen tatsächlich auf eine geringere PHP-Menge innerhalb der Neurone zurückzuführen war. Auffällig war allerdings, dass, wie Untersuchungen mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden zeigten, auch nur 20-30% der Neurone überhaupt mit den Antisense-Oligonukleotiden transformiert werden konnten. Dieser Prozentsatz korrelierte mit dem Rückgang der Schädigung nach Staurosporinzugabe und unterstützte somit die Annahme, dass die PHP an der Regulation des Zelltods beteiligt ist.
Um diesem Hinweis weiter nachzugehen, wurde im Folgenden ein rekombinanter Adenovirus hergestellt, in dessen Genom man die genetische Information der PHP integrierte. Zellen, die mit diesem Virus (Ad5-PHP) infiziert wurden, waren anschließend in der Lage die PHP stabil überzuexprimieren. Dies gelang auch in
SH-Virus, so konnte man schon nach 24 h bei einem Teil von ihnen Veränderungen der Zellmorphologie feststellen. Sie wurden klein und kugelig und schienen die aus der Infektion resultierende Überexpression der PHP, nicht zu vertragen. Untersuchungen auf Apoptose zeigten, dass von den mit Ad5-PHP infizierten Zellen nach 3 Tagen signifikant mehr geschädigt waren, als das bei Vergleichskulturen, die zur Kontrolle mit einem Adenovirus, dem das PHP-Gen nicht einkloniert worden war, der Fall gewesen war. Der Tod der Zellen war also nicht auf die Virusinfektion als solche, sondern auf die Überexpression der PHP, die man mittels Westernblot auch während des gesamten Versuchs zeigen konnte, zurückzuführen. Somit war es das erste Mal möglich gewesen, eine Funktion der PHP aufzudecken: Bei Überexpression des Enzyms sterben neuronale Zellen apoptotisch ab. Die PHP ist in diesen Zellen an der Regulation des programmierten Zelltods beteiligt.
Des Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Gβ-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins ein neues, physiologisch relevantes Substrat der PHP ist.
Gβ wird durch die Nukleosid-Diphosphat-Kinase B (NDPK B) an Histidin266 phosphoryliert und durch die PHP dephosphoryliert. Diese Dephosphorylierung ist spezifisch für die PHP. Mit der alkalischen Phosphatase konnte sie nicht beobachtet werden. Für eine physiologische Relevanz der Dephosphorylierungsreaktion spricht zudem, dass Gβ und die PHP in den Geweben unterschiedlicher Organe wie Herz, Hirn oder Lunge und auch in den verschiedenen Gehirnregionen wie Kortex, Striatum, Cerebellum und Hippokampus kolokalisiert sind.
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8 Anhang
Veröffentlichungen
Orginalarbeiten
Klumpp, S., Bechmann G., Mäurer A., Selke D., Krieglstein J. (2003). ATP-citrate lyase as a substrate of protein histidine phosphatase in vertebrates. Biochem Biophys Res Commun 306: 110-115.
Klumpp, S., Mäurer A., Zhu Y., Aichele D., Pinna L.A., Krieglstein J. (2004). Protein kinase CK2 phosphorylates BAD at threonine-117. Neurochem Int 45: 747-752.
Mäurer et al. (2005). The Gβ-subunit of heterotrimeric G-proteins as a substrate of protein histidine phosphatase. (in preparation)
Übersichtsartikel, Buchbeiträge
Klumpp S., Hermesmeier J., Bechmann G., Mäurer A., Selke D., Krieglstein J.
(2003). Protein histidine phosphatase: A new enzyme with neuronal relevance.
Pharmacology of Cerebral Ischemia 2002, medapharm Scientific Publishers Stuttgart, pp 59-65.
Klumpp S., Bechmann G. Mäurer A., Krieglstein J. (2004). Protein histidine phosphatases in signal trasduction and metabolism. Topics in Current Genetics 5:
131-144.
Posterpräsentationen
G. Bechmann, A. Mäurer, J. Krieglstein, S. Klumpp: „ATP-citrate lyase: A substrate of protein histidine phosphatase“, EuroPhosphatases 2003, Barcelona, Spain
A. Mäurer, S. Klumpp, Y. Zhu, D. Aichele, L. A. Pinna, J. Krieglstein: „The proapoptotic protein BAD is phosphorylated at threonine-117 by protein kinase CK2“
Protein Phosphatases 2004, Snowmass, Colorado, USA
G. Bechmann, M. Lehmann, D. Faber, A. Mäurer, N. Bäumer, S. Klumpp, J.
Krieglstein: „Protein histidine phosphatase reduces ATP-citrate lyase activity by dephosphorylation.“ 10th International Symposium on Pharmacology of Cerebral Ischemia 2004, Marburg
Teilnahme an Kongressen
08.-12. Juli 2001 EMBO Conference, Marburg
„Protein Phosphorylation and Protein Phosphatases“
21.-24. Juli 2002 9th International Symposium on
Pharmacology of Cerebral Ischemia, Marburg
29. Juni -03. Juli 2003 EMBO Conference / FEBS Advanced Course
„EuroPhosphatases 2003” Barcelona, Spanien
17.-22. Juli 2004 FASEB Summer Research Conferences
„Protein Phosphatases“ Snowmass, Colorado, USA
25.-28. Juli 2004 10th International Symposium on
Pharmacology of Cerebral Ischemia, Marburg