3.3 Methoden zur Herstellung eines rekombinanten Adenovirus
3.3.8 Amplifikation der Adenoviren in HEK 293-Zellen
Das Ziel bei der Herstellung von rekombinanten Adenoviren ist es, diese in möglichst großer Menge zu erhalten. Daher werden die Viren durch mehrmalige Infektion von HEK 293-Zellen amplifiziert. Als Kontrolle der Virusinfektion dient das vom Vektor ebenfalls kodierte GFP.
Die mittels Polyfect® transfizierten Zellen werden daher nach der Zelllyse (10 Tage nach Transfektion) mit dem Medium sorgfältig von der Kulturschale gespült und in einem 15 ml Falcongefäß gesammelt. Dieses wird 3-mal hintereinander abwechselnd in flüssigem Stickstoff schockgefrostet und bei 37°C wieder aufgetaut. Die noch intakten Zellen brechen bei dieser Prozedur auf. Der Virus wird freigesetzt. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation bei 2500 rpm über 2 min bei 4°C (Universal 16R, Hettich) abgetrennt.
Eine größere Schale mit HEK 293-Zellen (Ø 10 cm), die zu 60-80% bewachsen ist, wird erst mit PBS und dann mit FCS-reduziertem DMEM gewaschen. Dann werden 2 ml FCS-reduziertes Medium und 2 ml des virushaltigen Überstandes auf die Schale mit den HEK 293-Zellen gegeben. In diesem relativ kleinen Medienvolumen infiziert der Virus die Zellen sehr leicht. Man inkubiert die Schale 20 min bei 37°C im Brutschrank. Anschließend werden weitere 6 ml Medium auf die Platte gegeben und sie wird weiterhin bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert.
Nach 9 Tagen hat der Virus die HEK 293-Zellen der 10 cm-Schale ebenfalls lysiert.
Die Zellen haben sich zum größten Teil von der Platte gelöst und schwimmen im Medium. Die Zellen werden wiederum mit ihrem Medium von der Schale gespült und 3-mal hintereinander mit Stickstoff schockgefroren und bei 37°C wieder aufgetaut.
Anschließend werden die Zelltrümmer durch Zentrifugation (2500 rpm, 2 min, 4°C (Universal 16R, Hettich)) abgetrennt. Mit dem virushaltigen Überstand werden diesmal zwei 15 cm-Schalen mit HEK-293 Zellen infiziert.
Nach 3 Tagen sind auch diese Zellen lysiert. Die Zellen werden geerntet wie oben bereits beschrieben, 3-mal eingefroren und der Zellüberstand nach der Zentrifugation auf 10 Schalen (Ø 15 cm) mit HEK 293-Zellen gegeben.
Schon am nächsten Tag sind diese Zellen allesamt vom Virus infiziert, stehen aber noch kurz vor der Lyse. Das erkennt man daran, dass die HEK 293-Zellen vor Beginn der Lyse „aufquellen“. Zu diesem Zeitpunkt ist der Großteil der Viren fertig hergestellt, aber noch innerhalb der Zellen, aus denen man den Virus anschließend reinigen wird (3.3.9). Man nimmt das Medium bis auf 5 ml von den Schalen ab, spült
die Zellen mit diesen verbleibenden 5 ml von der Platte und sammelt die HEK-Zellen in einen 50 ml Falcongefäß. Das überschüssige Medium wird separat aufgehoben.
Die 50 ml werden bei 1000 rpm und 4°C für 2 min zentrifugiert (Universal 16R, Hettich). 30 ml des Überstandes werden abgenommen und einzeln aufgehoben. Die restlichen 20 ml mit dem, den Virus enthaltenen Niederschlag, werden in flüssigem Stickstoff eingefroren. Der Adenovirus wird anschließend daraus gereinigt (Übersicht siehe Abbildung 3-2).
DMEM (serumreduziert): (Herstellung siehe 3.3.7)
Abbildung 3-2 Zeitverlauf der Amplifkation des Adenovirus in HEK 293-Zellen Eine Kulturschale (Ø 6 cm) wird mit der Virus-DNA transfiziert. Der Virus vermehrt sich in den Zellen, wird bei Zell-Lyse geerntet und auf immer größere Schalen mit Zellen gegeben, bis eine ausreichende Menge an Virus gebildet ist. Diese wird geerntet und eingefroren.
1. Tag
(Transfektion)
6 cm
11. Tag 10 cm
15 cm 15 cm
15 cm 15 cm 15 cm
15 cm
15 cm 15 cm
15 cm 15 cm
15 cm 15 cm
18. Tag
21. Tag
22. Tag Ernte und Einfrieren
3.3.9 Reinigung des Virus mittels Cäsiumchloridgradient
Eine Standardmethode zur Reinigung und Konzentrierung von Viren ist die Reinigung mittels Cäsiumchloridgradient. Bei dieser Methode werden die infizierten HEK 293-Zellen wie oben beschrieben (3.3.8) bei beginnender Lyse geerntet.
Die 20 ml, die den Hauptteil des in den HEK 293-Zellen entstandenen Virus enthalten (3.3.8), werden aufgetaut und noch zweimal hintereinander in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei 37°C wieder aufgetaut. Anschließend inkubiert man die Virussuspension bei 37°C für 30 min mit 35 mM MgCl2 und 6 µg/ml DNAse I im Wasserbad. Danach wird für 30 min und 4°C bei 1500 rpm zentrifugiert (Universal 16R, Hettich). Der Überstand wird 3 x 2 min mit dem gleichen Volumen Trichlortrifluorethan extrahiert. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation vom virushaltigen Überstand (je 3 min bei 1500 rpm und 4°C (Universal 16R, Hettich)) abgetrennt. Ferner dient die Extraktion der Entfernung von Membranlipiden.
Nach der Extraktion wird der virushaltige Überstand vorsichtig auf den CsCl-Gradienten geschichtet. Dieser CsCl-Dichtegradient wird hergestellt, indem zuerst die Lösung mit der geringeren Dichte (22,4%) in ein Zentrifugationsröhrchen pipettiert wird und vorsichtig mit der CsCl-Lösung höherer Dichte (42,2%) unter Zuhilfenahme einer Spritze mit Kanüle unterschichtet wird (Tabelle 3-6).
Tabelle 3-6 Zusammensetzung Cäsiumchloridgradient
Leichte CsCl-Phase Schwere CsCl-Phase
CsCl 11,02 g 21,1 g
Virus-Storage-Buffer (VBS) ad 50,00 g ad 50,00 g
Dichte 22,4% 42,2%
Gewicht 1 ml entspricht 1,2 g 1 ml entspricht 1,46 g
Zentrifugiert wird anschließend in einem Schwenkbecher-Rotor. In diesen werden am Rand des Rotorkörpers bewegliche Zentrifugenbecher eingehängt, die während des Laufes ausschwingen. Die Zentrifugation läuft über 12 h bei 100 000 x g und 4°C (Ultrazentrifuge Model L5-65, Beckmann).
Während der Zentrifugation stellt sich ein kontinuierlicher Dichtegradient ein.
Makromoleküle, die sich bei der Zentrifugation in der CsCl-Lösung befinden, bilden
an der Stelle des Gradienten, die ihrer Dichte entspricht, eine Bande. Für DNA liegt die Dichte bei etwa 1,7 g/cm3. Deshalb sammelt sich der Virus, der in der Hauptsache aus DNA besteht, dort, wo auch der CsCl-Gradient in etwa diese Dichte aufweist. Proteine, wie zum Beispiel leere Viruscapside, haben dagegen eine geringere Dichte und bilden daher eine eigene Bande oberhalb des Virus. Um den Virus zu isolieren, werden die Ultrazentrifugenröhrchen mit einer Spritze an der entsprechenden Stelle angestochen, die Viren abgesaugt und gesammelt (Abbildung 3-3).
Abbildung 3-3 Reinigung des Virus mittels Cäsiumchloridgradient
Die so erhaltene Virussuspension (circa 3 ml) wird in einen Dialyseschlauch, der vorher mit PBS äquilibriert worden ist, gegeben. Sie wird gegen 1 l PBS über Nacht bei 4°C dialysiert. Am Morgen wird die Lösung weitere 3 h gegen 1 l Virus-Lagerungspuffer (VBS) dialysiert. Anschließend wird die Virussuspension mit der gleichen Menge Glycerin versehen, zu je 500 µl aliquotiert und bei -20°C gelagert.
Virus-Lagerungspuffer: 140 mM NaCl
10 mM Tris/HCl pH7,4 1 mM KCl
2 mM MgCl2
PBS: (siehe 3.3.6.1)
leere Capside (Protein) Interphase
Viren (DNA)
leere Capside (Protein) Interphase
Viren (DNA)
leere Capside (Protein) Interphase
Viren (DNA)
leere Capside (Protein) Interphase
Viren (DNA)
leere Capside (Protein) Interphase
Viren (DNA)
leere Capside (Protein) Interphase
Viren (DNA)
3.3.10 Titerbestimmung des Virus mit Hilfe der Viabilitätsmethode
Eine Petrischale (Ø 10 cm) mit HEK 293-Zellen (3.3.5.1) oder TSA-Zellen (3.3.5.2) wird in 5 ml serumreduziertem DMEM aufgenommen. Mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer wird die Zelldichte bestimmt und auf 20 000 Zellen pro 100 µl eingestellt. Nun wird eine 96-Lochplatte mit je 100 µl der eingestellten Zellsuspension pro Vertiefung beschickt. Die Zellen werden mit aufsteigenden Verdünnungen der gereinigten Virussuspension (3.3.9) für 4 d infiziert. Dazu werden Virusverdünnungen in einer Endkonzentration von 10-5–10-10 in serumreduzierten DMEM hergestellt. Mit jeder Verdünnung werden je 12 Vertiefungen der Lochplatte infiziert. Als Negativkontrolle werden 9 Vertiefungen mit Zellsuspension nicht infiziert. Als Positivkontrolle infiziert man 3 der mit Zellsuspension beschickten Vertiefungen mit dem unverdünnten Virus (Abbildung 3-4).
Abbildung 3-4 Infektion von TSA-Zellen mit verschiedenen Virusverdünnungen Die TSA-Zellen werden auf einer 96er-Lochplatte mit verschiedenen Verdünnungen des Virus (10-5 – 10-10) für vier Tage inkubiert. Dabei werden je 12 Vertiefungen (entspricht einer Reihe (1-12)) mit je einer der Verdünnungen infiziert. Als Negativkontrolle sind in 9 Vertiefungen die Zellen nicht infiziert worden (K-). Als Positivkontrolle (K+) dienen 3 Vertiefungen mit TSA-Zellen, die mit je 1 µl unverdünnter Virussuspension infiziert sind.
Nach 4 Tagen wird die Anzahl der Bohrungen mit infizierten bzw. ohne infizierte Zellen anhand der GFP-Expression unter dem Fluoreszenz-Mikroskop ermittelt und der Prozentsatz der Infektion berechnet.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
10-5 10-6 10-7
10-9 10-10
K - = Negativkontrolle K + = Positivkontrolle
= TSA-Zellen
10-8
K+ K+
K- K- K- K- K- K- K- K- K- K+
Daraus ermittelt man zunächst die proportionale Distanz (PD) von tatsächlicher Infektionsrate und einer Infektionsrate von 50%. Mit Hilfe der PD lässt sich die TCID50, die Titerkonzentration der Virusverdünnung, die eine 50%ige Infektionsrate der Zellen bewirkt, berechnen. Um den Titer für das tatsächlich eingesetzte Volumen zu bestimmen, rechnet man 1/TCID50/Verdünnungsvolumen. Der so erhaltenen Wert wird mit der Konstante 0,69 (Enleinsche Zahl) multipliziert, um den TCID50 in „plaque forming units“ umzurechnen. Dadurch ergibt sich zum Beispiel für den frisch gereinigten Ad5-PHP ein Virustiter von 1,7 x 1010 pfu/ml.
3.3.11 Infektion von TSA- und SH-SY5Y-Zellen
Vor der Infektion nimmt man das Kulturmedium von den Zellen ab. Sie werden mit dem entsprechenden serumreduzierten Medium (TSA-Zellen: DMEM mit 2% FCS, SH-SY5Y-Zellen: OptiMEM®) gewaschen und bekommen dann 2 ml (Kulturschale Ø 3,5 cm, 12er-well-Platte) bzw. 6 ml (Kulturschale Ø 6 cm) serumreduziertes Medium für die anschließende Infektion aufgegeben. Dies ist notwendig, da FCS die Infektion der Zellen mit Viren behindert.
Die TSA-Zellen werden auf einer 12er-well-Platte kultiviert. Durch Zugabe von 10 oder 50 µl der gereinigten Virus-Glycerin-Suspension (3.3.9) ins serumreduzierte Kulturmedium werden die Zellen infiziert. Als Negativkontrolle dienen nicht infizierte TSA-Zellen und Zellen, die mit 10 oder 50 µl Leervektor (Ad5-GFP), der nur GFP kodiert, infiziert werden. Die 12er-well-Platte wird über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert.
Die SH-SY5Y-Zellen werden durch Zugabe von 10 oder 20 µl (3,5 cm Kulturschale) bzw. mit 30 µl (6 cm Kulturschale) der gereinigten Virus-Glycerin-Suspension (3.3.9) ins serumreduzierte Kulturmedium infiziert. Als Negativkontrolle werden nicht infizierte SH-SY5Y-Zellen und Zellen, die mit 50 µl (3,5 cm Kultursschale) oder 150 µl (6 cm Kulturschale) eines ungereinigten, Ad5-GFP enthaltenen Zellüberstandes infiziert werden, verwendet. Die Inkubation erfolgt über 24, 48 oder 72 h im Brutschrank bei 37°C.
Zur Kontrolle der Virusinfektion dient das vom Vektor ebenfalls kodierte und von den erfolgreich infizierten Zellen exprimierte GFP, welches unter dem Fluoreszenz-Mikroskop grün leuchtet.
3.3.12 Aufarbeitung der infizierten Zellen
Um die Zellen nach einer Infektion einer Untersuchung mittels Westernblot zuzuführen, müssen sie von den Kulturgefäßen geerntet und aufgearbeitet werden.
HEK 293-Zellen, die auf einer Kulturschale mit 3,5 cm wachsen, werden nach Entfernen des Mediums und Waschen mit PBS mit 500 µl TE-Puffer von der Kulturschale geschabt. Die Suspension wird durch mehrmaliges Aufziehen mit einer Spritze homogenisiert.
TSA-Zellen, die auf einer 12er-well-Platte kultiviert werden, nimmt man das Kulturmedium ab, wäscht sie mit PBS und schabt sie in je 300 µl PBS von der Platte.
Die Zellen werden durch mehrmaliges Aufziehen mit einer Spritze homogenisiert.
Von den SH-SY5Y-Zellen nimmt man, nach der Inkubation im Brutschrank, das Medium ab und wäscht sie mit PBS. In 40 µl denaturierendem Lysispuffer schabt man die Zellen von fünf 3,5 cm Ø Schalen oder von zwei 6 cm Ø Schalen. Die Zellsuspension wird in einem Minireaktionsgefäß gesammelt und 5 s mit Ultraschall behandelt. Nach 5 min Zentrifugation bei 13 000 rpm (Biofuge pico, Heraeus) und 4°C wird der Niederschlag, der die aufgebrochenen, zerstörten Zellen enthält, verworfen. Der Überstand wird weiterverwendet.
TE-Puffer: 10 mM Tris/HCl pH 7,5
0,5 mM EDTA
Lysis-Puffer : 250 mM Tris/HCl pH 6,8 3% SDS
1% Glycerol
1 mM PMSF
0,1 µM Calpaininhibitor 0.06% Trypsininhibitor
(Zugabe Proteaseinhibitoren kurz vor Verwendung)