4.1 Regulierung der PHP-Expression mittels Antisensetechnologie
4.1.3 Staurosporinschädigung Antisense behandelter Neurone
Das Gehirn ist eines der wichtigsten Organe des Organismus. Ist es geschädigt, hat dies meist weitreichende Konsequenzen für das gesamte Individuum, da durch den Untergang von Nervenzellen wichtige motorische, sensorische oder auch Gedächtnisfunktionen verloren gehen können. Bei einem Schlaganfall sterben durch die Unterversorgung des betroffenen Hirnareals mit Sauerstoff und Glukose viele Zellen ab. Aber auch nach dem Infarkt, wenn das Areal wieder ausreichend versorgt wird, kommt es noch zum Tod vieler Zellen. Oft sterben diese apoptotisch ab. Es ist daher von großem Interesse, welche Vorgänge dabei in den Zellen ablaufen. Um zu untersuchen, ob die PHP, die im Gehirn in großer Menge vorhanden ist, an diesen Vorgängen beteiligt ist, wurden cerebrale Neurone, nachdem ihre PHP-Expression durch Behandlung mit Antisense-Oligonukleotiden herunterreguliert worden war, mit Staurosporin (STS), einem nicht selektiven Kinaseinhibitor, der Zellen apoptotisch schädigt, versetzt. Unter normalen Kulturbedingungen hatten die bisher verwendeten Oligonuleotide keinen Effekt auf die Überlebensfähigkeit der Neurone gehabt. Unter Stressbedingungen, wie eine Schädigung es für Zellen darstellt, war es dennoch möglich, dass die Behandlung das Überleben der Neuronen vor- oder nachteilig beeinflusste.
Für diese Versuche wurden Kulturen hippokampaler Neurone verwendet, da hippokampales Gewebe meist sehr sensibel auf eine Schädigung reagiert. Zudem hatten histochemische Untersuchungen vermuten lassen (Daten nicht gezeigt), dass die PHP-Expression dieser Neurone ebenfalls mit Hilfe der Antisense-Oligonukleotide herunterreguliert werden kann. Somit war bei einem Wechsel zu diesen Zellen, nicht mit Schwierigkeiten zu rechnen.
4.1.3.1 Beobachtung auf zellulärer Ebene
Hippokampale Neurone wurden 8 h mit 20 µM Antisense-Oligonukleotid (PHP-Antisense-1 (3.4.3)) behandelt. Ein anderer Teil der Neurone wurde zur Kontrolle entweder mit 20 µM Missense-Oligonukleotid (PHP-Missense-1 (3.4.3)) oder nicht mit Nukleotiden (Kontrolle) behandelt und den gleichen Bedingungen (3.4.5) wie die Antisense behandelten Neurone ausgesetzt. Nach den 8 h wurde ein Teil der Neurone aller 3 Gruppen (Antisense, Missense, Kontrolle) mit 200 nM Staurosporin über 24 h geschädigt (3.4.6). Anschließend wurden die Neurone mit Paraformaldehyd fixiert und mittels Hoechstfärbung (3.4.7) der Anteil der apoptotischen Zellen bestimmt.
Abbildung 4-4 Auswertung der Hoechstfärbung Antisense behandelter hippokampaler Neurone nach Staurosporinschädigung
Mit 20 µM Antisense-Oligonukleotiden (AS) vorbehandelte Neurone sind nach Staurosporinschädigung (STS) (200 nM) weniger geschädigt als die Kontrollen (K u.
MS).
(###p<0,001 bezogen auf Neurone ohne STS; **p<0,01 bezogen auf K+STS, MS+STS; ANOVA, Scheffé)
Es zeigte sich (Abbildung 4-4), dass die Neurone, die mit Antisense-Oligonukleotiden behandelt worden waren, deren PHP-Expression also herunterreguliert war, nach
0 20 40 60 80 100
K AS MS
K+STS
AS+STS
MS+STS
ApoptotischeKerne (%)
### ###
**
0 20 40 60 80 100
K AS MS
K+STS
AS+STS
MS+STS
ApoptotischeKerne (%)
### ###
**
Dies galt sowohl gegenüber den unbehandelten als auch gegenüber den mit Missense-Oligonukleotiden behandelten Staurosporin geschädigten Neuronen. Der beobachtete Effekt war also spezifisch. Dies bedeutete, dass die Zugabe der PHP-Antisense-Oligonukleotide vor apoptotischer Schädigung schützt und dass die PHP offensichtlich eine Rolle bei der Apoptose spielt.
4.1.3.2 Beobachtungen auf Proteinebene
Der Versuch 4.1.3.1 hatte gezeigt, dass die Zugabe des Antisense-Oligonukleotids die Zellen vor der durch Staurosporin hervorgerufenen apoptotischen Schädigung schützt. Er sagte aber noch nichts darüber aus, ob die Expressionsrate der PHP dabei wirklich durch die Antisense-Oligonukleotide gesenkt worden war. Deshalb wurde der Versuch dahingehend erweitert, dass man nach 7 h Antisensebehandlung und anschließenden 12 h Staurosporinbehandlung einen Teil der Neurone aller Gruppen (Kontrolle, Antisense, Missense mit und ohne STS) extrahierte und die Expressionsrate der PHP mittels Westernblot untersuchte.
Die Proben wurden entsprechend Protokoll B (3.4.2.2) extrahiert, da hippokampale Neurone weniger dicht bewachsene Kulturen ergeben als kortikale und die Ausbeute an Protein nach diesem Protokoll bedeutend höher war. Fünfzehn Mikrogramm Protein wurden pro Bahn aufgetragen und nach Transfer auf eine Membran mittels Antikörpern gegen den N-Terminus der PHP untersucht. Zur Kontrolle, dass in allen Spuren die gleiche Proteinmenge aufgetragen worden war, wurden die Proben ebenfalls mit Antikörpern gegen α-Tubulin detektiert.
Die parallel laufende Hoechstfärbung ergab das gleiche Ergebnis wie in 3.4.2.1, nämlich, dass die Zugabe des Antisense-Oligonukleotids die Zellen vor der durch Staurosporin induzierten Apoptose schützte. Wobei allerdings auffiel, dass nach 12 h Schädigung, im Gegensatz zu den im vorherigen Versuch angewendeten 24 h, der Schutz der Antisense-Oligonukleotide gegenüber STS-Schädigung nicht signifikant besser als der der Missense-Oligonukleotide war. Diese wiesen auch gegenüber der Kontrolle keine Signifikanz auf, sondern lagen vielmehr zwischen den Werten von Kontrolle und Antisensebehandlung.
Der Westernblot zeigte unerwarteterweise keinerlei Änderungen der Expressionsrate der PHP (Abbildung 4-5). Also gab es keinen Beweis, dass die schützende Wirkung des Antisense-Oligonukleotids mit einer Herabregulierung der Expression der PHP in Zusammenhang stand.
Abbildung 4-5 Expression der PHP und Auswertung der Hoechstfärbung von Antisense behandelten Neuronen mit Staurosporinschädigung
Westernblot Antisense behandelter (20 µM) hippokampaler Neurone mit und ohne STS-Schädigung (200 nM) detektiert mit Antikörpern gegen den N-Terminus der PHP (A) und mit Antikörpern gegen α-Tubulin (B). Auswertung Hoechstfärbung (C).
Die Schädigungsrate der Antisense behandelten Neurone liegt nach STS-Schädigung mit 28% deutlich unter der der Kontrolle mit 45%. (###p<0,001 bezogen auf Neurone ohne STS; *p<0,05 bezogen auf K+STS; ANOVA, Scheffé)
4.1.3.3 Beobachtungen auf Ebene der mRNA
Nach der Behandlung mit Antisense-Oligonukleotiden hatte sich keine Veränderung der PHP-Expressionsrate auf Proteinebene zeigen lassen. Deshalb wurde nun mit Hilfe einer RT-PCR (3.4.9) untersucht, ob denn auf der Ebene der mRNA eine Herabregulierung der PHP zu beobachten war.
α-Tubulin K AS
MS K+STS K AS
MS
AS+STS STS
7 h +12 h
45_ PHP kDa
K AS MS
K+STS K AS
MS
AS+STS MS+STS 14_
kDa
7 h +12 h
0 10 20 30 40 50
K AS MS
K+STS
AS+STS
MS+STS
ApoptotischeKerne (%) ###
*
A BC
α-Tubulin K AS
MS K+STS K AS
MS
AS+STS STS
7 h +12 h
45_ PHP kDa
K AS MS
K+STS K AS
MS
AS+STS MS+STS 14_
kDa
7 h +12 h
0 10 20 30 40 50
K AS MS
K+STS
AS+STS
MS+STS
ApoptotischeKerne (%) ###
*
A BC
α-Tubulin K AS
MS K+STS K AS
MS
AS+STS STS
7 h +12 h
45_ PHP kDa
K AS MS
K+STS K AS
MS
AS+STS MS+STS 14_
kDa
7 h +12 h
0 10 20 30 40 50
K AS MS
K+STS
AS+STS
MS+STS
ApoptotischeKerne (%) ###
*
0 10 20 30 40 50
K AS MS
K+STS
AS+STS
MS+STS
ApoptotischeKerne (%) ###
*
0 10 20 30 40 50
K AS MS
K+STS
AS+STS
MS+STS
ApoptotischeKerne (%) ###
*
A BC
Abbildung 4-6 Auswertung der RT-PCR Antisense behandelter hippokampaler Neurone
Das Agarosesgel (A) zeigt, dass die PHP-cDNA-Menge nach 3 und nach 6 h mit und ohne Oligonukleotidbehandlung gleich ist. Die Negativkontrollen –RT (RT-Ansatz ohne RNA) und –PCR (PCR-Ansatz ohne DNA) zeigten keine Bande. Eine 1 kb-Leiter (M) war als Größenstandard mitaufgetragen worden.
Der Westernblot (B) zeigte, dass auch auf Proteinebene nach 3 h kein Unterschied der PHP-Expression zwischen Antisense behandelten (AS) und Kontroll-Neuronen (K und MS) bestand. Die Detektion des Blots mit Antikörpern gegen α–Tubulin zeigte, dass von den Proben gleiche Proteinmengen aufgetragen worden waren.
Dazu wurden hippokampale Neurone, die 8 Tage in Kultur gewesen waren, mit 20 µM Antisense-Oligonukleotid behandelt. Zur Kontrolle dienten weitere Neurone, die entweder mit 20 µM Missense-Oligonuleotid oder gar nicht behandelt worden waren (3.4.5). Da eine Herabregulierung der PHP auf Ebene der mRNA früher eintritt als auf Proteinebene, wurde die mRNA schon nach 3 beziehungsweise nach 6 h aus den Neuronen extrahiert (3.4.8). Um festzustellen, ob man die Auswirkungen der
M -PCR -RT K AS MS K AS MS M
6 h 3 h
1000
500400 200300 100
--
--
-bp
K AS MS
α-Tubulin 45
-kDa
K AS MS
14 - PHP kDa
A
B
M -PCR -RT K AS MS K AS MS M
6 h 3 h
1000
500400 200300 100
--
--
-bp
K AS MS
α-Tubulin 45
-kDa
K AS MS
14 - PHP kDa
A
B
Antisensebehandlung auf Proteinebene zu einem früheren Zeitpunkt als den bisher betrachteten 7 h feststellen konnte, wurde auch das Protein für den parallel laufenden Westernblot schon nach 3 h isoliert (3.4.2.2). Die mRNA wurde mit Hilfe der reversen Transkriptase an einem Oligo-dT-Primer in cDNA umgeschrieben (3.4.9.1). Die so erhaltene DNA wurde mittels der PCR vervielfältigt (3.4.9.2), mit einem ethidiumbromidhaltigen Agarosegel getrennt und unter UV-Licht ausgewertet (3.4.9.3).
Auf dem Agarosegel (Abbildung 4-6 A) ist zu erkennen, dass es auch auf mRNA-Ebene keine Unterschiede zwischen den mit Antisense-Oligonukleotiden behandelten Proben und den Kontrollen gab. Die Signale waren überall gleich stark.
Dasselbe Ergebnis zeigte auch der Westernblot (Abbildung 4-6 B) der nach 3 h Antisensebehandlung extrahierten Proteine. Also konnte auch zu einem früheren Zeitpunkt und auch auf mRNA-Ebene keine Auswirkung der Antisensebehandlung auf die Expression der PHP beobachtet und mit den auf zellulärer Ebene beobachteten Effekten in Verbindung gebracht werden.