Funktionelle und zelluläre Untersuchungen zur Rolle des antiapoptotischen Proteins HAX1

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Aus der Klinik für Pädiatrische Hämatologie und Onkologie der Medizinischen Hochschule Hannover

Direktor: Prof. Dr. Dr. med. Christoph Klein

Funktionelle und zelluläre Untersuchungen zur Rolle des antiapoptotischen Proteins HAX1

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin (Dr. med.) an der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von

Rebecca Elisabeth Lydia Rittner

geboren am 08.10.1982 in Oldenburg

Hannover, 2009

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 04. Mai 2010 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Dr. med. Christoph Klein

Referentin: Prof.’in Dr. med. Anke Franzke

Korreferentin: Prof.’in Dr. med. Heike Bantel Tag der mündlichen Prüfung: 04. Mai 2010

Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. med. Alexander Kapp, PD Dr. med. Lorenz Grigull, Prof. Dr. med. Stefan Kubicka

Meinen Eltern und Geschwistern gewidmet

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung... 1

1.1. Schwere kongenitale Neutropenie... 1

1.2. Granulopoese... 2

1.3. Pathogenese und genetische Ursachen von SCN ... 3

1.4. Kostmann-Syndrom und HS1-associated protein X-1 (HAX1)... 7

1.5. Funktionen von HAX1 und Charakterisierung der Mutationen... 8

1.5.1. HAX1 und das Zytoskelett ... 9

1.5.2. HAX1 und Apoptose ... 10

1.5.3. Weitere Funktionen von HAX1... 16

1.5.4. Lokalisation von HAX1... 17

1.6. Zielsetzung ... 18

2. Material und Methoden... 19

2.1. Methoden ... 19

2.1.1. Molekularbiologische Methoden ... 19

2.1.2. Zellbiologische Methoden ... 24

2.1.3. Immunologische Methoden ... 27

2.2. Material... 35

2.2.1. Chemikalien... 35

2.2.2. Kits ... 35

2.2.3. Pufferlösungen... 36

2.2.4. Medien und Seren... 37

2.2.5. Enzyme und Antikörper... 38

2.2.6. Geräte, Instrumente, Materialien ... 39

3. Ergebnisse... 41

3.1. Charakterisierung des Konstrukts pMMP-HAX1-FLAG-IRES-CD24... 41

3.1.1. Generierung der FLAG-getaggten HAX1-cDNA... 41

3.1.2. Nachweis der CD24-Expression auf transduzierten HT1080-Zellen... 42

3.1.3. Transduktion der Zielzellen mit pMMP-HAX1-FLAG... 42

3.1.4. Nachweis der HAX1-Expression in CD24-positiven Zellen ... 43

3.2. Subzelluläre Lokalisation von HAX1 in transduzierten HeLa-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie... 44

3.2.1. Nukleus und HAX1-Lokalisation ... 45

3.2.2. Zytoskelett und HAX1-Lokalisation ... 46

3.2.3. Lysosom und HAX1-Lokalisation... 47

3.2.4. Golgi-Apparat und HAX1-Lokalisation ... 48

3.2.5. Endoplasmatisches Retikulum und HAX1-Lokalisation ... 49

3.2.6. Mitochondrium und HAX1-Lokalisation ... 50

3.3. Analyse der mitochondrialen Lokalisation von HAX1 in Fibroblasten mittels Fluoreszenz- und 2-Photonen-Mikroskopie... 51

3.4. Auswirkungen auf die Lokalisation von HAX1 bei Apoptoseinduktion in transduzierten HeLa-Zellen ... 55

3.4.1. Einleitung der Apoptose mit Staurosporin... 56

3.4.2. Einleitung der Apoptose durch FCS-Deprivation... 57

3.4.3. Einleitung der Apoptose mit Doxorubicin... 58

3.5. Interferon-β-Expression von HAX1-defizienten- und Normalspender- Fibroblasten... 59

4. Diskussion... 62

4.1. Methodendiskussion... 62

4.1.1. Fluoreszenzmikroskopie und 2-Photonen-Mikroskopie ... 62

4.1.2. Apoptoseinduktion... 67

4.1.3. IFN-β... 68

4.2. Lokalisation im Mitochondrium... 69

4.3. Wirkung auf die Apoptosestimulation ... 72

4.4. Toll-like receptor 3... 73

4.5. Bedeutung von HAX1 für das Kostmann-Syndrom und Ausblick... 74

5. Zusammenfassung... 77 6. Abkürzungen... VI 7. Literaturverzeichnis... X 8. Danksagung ...XX 9. Curriculum vitae... XXI 10. Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 5 und 6... XXIII

1. EINLEITUNG

1.1. Schwere kongenitale Neutropenie

Die schwere chronische Neutropenie (SCN) ist ein primärer Immundefekt durch Störungen im hämatopoetischen System, der durch eine starke Verminderung der Anzahl neutrophiler Granu- lozyten (ANC – absolute neutrophil count) und damit assoziierten wiederkehrenden bakteriellen Infektionen gekennzeichnet ist. Mit einer geschätzten Inzidenz von 1-2/ 10⁶ zählt SCN zu der Gruppe seltener angeborener Immundefekte im Kindesalter mit identischem Geschlechtsver- hältnis (Welte und Dale, 1996; Skokowa et al., 2007). Unter SCN werden verschiedene Erkran- kungen zusammengefasst, die sich alle durch einen ANC mit weniger als 500/µl im peripheren Blut auszeichnen. Vor mehr als 50 Jahren beschrieb erstmals Rolf Kostmann „Infantile genetic agranulocytosis“ als eine angeborene Form von Neutropenie des Menschen (Kostmann, 1956).

Bis dahin verstand man unter Agranulozytose eine durch toxische Substanzen oder Infektionen erworbene Erkrankung (Carlsson et al., 2006). Erworbene Neutropenien treten am häufigsten unter Chemotherapie bei Erwachsenen auf, aber auch im Zusammenhang mit Infekten, Stamm- zelldefekten (Leukämie), durch Medikamente, Vitamin B12- oder Folsäure-Mangel. Angebore- ne Neutropenien hingegen zeichnen sich durch seit der Geburt stetig niedrigen ANC aus (Schaffer und Klein, 2007).

Die Erkrankung tritt in den ersten Lebenswochen eines Neugeborenen durch wiederkehrende schwere, zum Teil lebensbedrohliche, bakterielle Infektionen in Erscheinung. Dabei handelt es sich um Infekte der obere Luftwege, Haut- und Leberabszesse, Pneumonien, Otitiden, Stomati- tiden, Gingivitiden, Tonsillitiden und Septikämien. Nabelinfektionen können dabei einen ersten Hinweis auf einen Immundefekt im Säuglingsalter geben. Die häufigsten Erreger sind Staphy- lokokken und Streptokokken, aber auch Pseudomonaden. Im Differentialblutbild findet sich meist wiederholt einen ANC von weniger als 200/µl (Zeidler und Welte, 2006). Monozyten und eosinophile Granulozyten sind erhöht. Im Gegensatz zur Autoimmun-Neutropenie gibt es keine spezifischen Antikörper gegen Neutrophile (Bux et al., 1998; Carlsson et al., 2006; Skokowa et al., 2007). Für die Diagnose SCN ist das Ergebnis einer Knochenmarksbiopsie ausschlagge- bend. Charakteristisch ist trotz normaler Zellularität des übrigen Knochenmarks ein Ausrei- fungsstopp der neutrophilen Granulozyten im Promyelozyten-/Myelozyten-Stadium (Kostmann, 1956). In 1.2 wird zu diesem Punkt die Granulopoese näher erläutert.

Vor 1987 erfolgte die Behandlung von SCN ausschließlich mit Antibiotika, was jedoch auf die schlechte Prognose der Erkrankung keine Auswirkungen hatte. Seit der Entdeckung und Pro- duktion von rekombinantem, humanem, Granulozyten-Kolonien stimulierendem Faktor (rHuG- CSF) kann SCN seit Anfang der 90er Jahre erfolgreich behandelt werden. G-CSF ist ein Zyto- kin, das unreife Vorläuferzellen zu Proliferation und Reifung anregt und ihre Apoptose (pro- grammierter Zelltod) verzögert (Souza et al., 1986; Bonilla et al., 1989). Durch diese Therapie normalisiert sich der ANC weitestgehend mit folglich weniger Infektionen der Patienten und

einer höheren Lebenserwartung. Bei akuten Infektionen werden weiterhin Breitbandantibiotika eingesetzt. Trotz des revolutionären Therapieerfolgs mit G-CSF leiden viele Patienten weiterhin an wiederkehrender Gingivitis und schwerer Peridontitis (Carlsson et al., 2006), deren Ursache noch nicht ausreichend geklärt ist. Zudem zeigen Langzeitstudien, dass besonders die Patienten unter G-CSF-Behandlung, die schlecht auf das Medikament ansprachen und demzufolge höhere Dosen (i.e. >8 µg/kg/Tag) bekamen, ein erhöhtes Risiko (>40% nach 10 Jahren) haben, an Mye- lodysplastischem Syndrom (MDS) oder an einer akuten myeloischen Leukämie (AML) zu er- kranken (Rosenberg et al., 2006). In diesem Zusammenhang wird eine maligne Transformation des G-CSF-Rezeptors (CSF3R) diskutiert, die ungefähr 80% der mit G-CSF behandelten SCN Patienten aufweisen, die AML oder MDS entwickelten (Dale et al., 2003; Germeshausen et al., 2007). Den Low-Respondern wird deshalb eine Stammzelltransplantation von HLA (human leukocyte antigen) -identischen Spendern (z.B. Geschwistern) empfohlen (Rosenberg et al., 2006).

1.2. Granulopoese

Zum angeborenen Immunsystem gehören Phagozyten (Mikrophagen, Makrophagen), dendriti- sche Zellen, natürliche Killerzellen, Komplement und spezielle Zytokine und Chemokine (Marodi und Notarangelo, 2007). Granulozyten werden in neutrophile, eosinophile und basophi- le eingeteilt. Im peripheren Blut sind diese Phagozyten ganz unterschiedlich stark vertreten, wobei Neutrophile mit 50-70% den größten Anteil bilden. Die Hauptaufgabe der neutrophilen Granulozyten besteht darin, Bakterien zu phagozytieren, um den Organismus vor schweren bakteriellen Infektionen zu schützen (Segal, 2005). Nach der Phagozytose der Bakterien schlie- ßen die Neutrophilen die Erreger in eine Vakuole (Phagosom) ein, die mit spezifischen Granula und Lysosomen fusioniert (Phagolysosom). In den Granula befinden sich toxische Moleküle und Proteasen, mit denen die bakteriellen Proteine aufgeschlossen werden (Segal, 2005). Da die toxischen Substanzen in den Granula nicht nur für die Erreger giftig sind, sondern auch für die Neutrophilen, werden die Neutrophilen apoptotisch und sterben.

Die Reifung von Granulozyten aus einer pluripotenten Stammzelle vollzieht sich im roten blut- bildenden Knochenmark. Aus der pluripotenten Stammzelle gehen multipotente myeloische und lymphatische Stammzellen hervor. Die myeloische Stammzelle kann sich weiter zur uni- und bipotenten Progenitorzelle differenzieren, die auch als CFU (colony forming unit) bezeichnet wird. Aus der Progenitorzelle entwickelt sich im Falle der Myelopoese die erste spezifische Vorläuferzelle, der Myeloblast. Dieses erste Glied der myeloischen Zellreihe wird nicht mehr zum Stammzellpool, sondern zum Teilungs- und Reifungspool gezählt. Die Differenzierung endet mit dem segmentkernigen Granulozyten. In Abbildung 1 ist die Entwicklung der eosi- nophilen, basophilen und neutrophilen Granulozyten aus einem Myeloblasten dargestellt. Die Differenzierung über den Promyelozyt, Myelozyt zum Metamyelozyt bringt eine charakteristi- sche Veränderung des Kerns und Zytoplasmas mit sich. Der Myeloblast besteht aus einem gro-

ßen Kern und es fehlen ihm noch Granula im Zytoplasma. Im Myelozyten-Stadium bilden dann sich die basophilen und eosinophilen Granula der jeweiligen Granulozyten. Der neutrophile Granulozyt zeichnet sich besonders durch die Morphologie des Kerns aus, der nach der abge- schlossenen Reifung seine charakteristische segmentartige Form annimmt. Der Metamyelozyt verliert seine Fähigkeit sich zu teilen und reift von da ab nur noch vom stabkernigen zum seg- mentkernigen Granulozyten weiter (Reifungsphase). Die reifen Granulozyten verbleiben zum größten Teil als funktionelle Reserve im Knochenmark zurück, um bei Infektionen in die Blut- bahn ausgeschüttet zu werden.

Abbildung 1: Granulopoese. Dargestellt sind die unterschiedlichen Reifungsstufen vom Myeloblast bis hin zum reifen Granulozyt. Modifiziert nach (Junqueira et al., 1998).

1.3. Pathogenese und genetische Ursachen von SCN

Heute fasst man unter SCN eine heterogene Gruppe von Krankheiten zusammen, welche auto- somal-dominant, autosomal-rezessiv oder an das X-Chromosom gebunden autosomal-rezessiv vererbt werden oder sporadisch bzw. im Zusammenhang mit einem Syndrom auftreten (Schaffer und Klein, 2007). Nach der Erstbeschreibung von kongenitaler Neutropenie (Kostmann, 1956) wurde von Horwitz und Mitarbeitern 1999 eine heterozygote Mutation im Gen der neutrophilen Elastase (ELA2) auf Chromosom 19p13.3 als Ursache der zyklischen Neutropenie entdeckt (Horwitz et al., 1999). Die zyklische Neutropenie ist eine Form der Neutropenie, bei der die Anzahl der neutrophilen Granulozyten ca. 21-tägig periodisch von normalen Werten bis weniger als 200/µl im peripheren Blut oszilliert. Nach weiteren Analysen wurden auch bei Patienten mit schwerer kongenitaler Neutropenie ELA2-Mutationen entdeckt (Dale et al., 2000; Ancliff et al., 2003). Mittlerweile werden zyklische Neutropenie und ca. 30-

Myeloblast Promyelozyt Früher eosinophiler

Myelozyt

Früher neutrophiler

Myelozyt

Später eosinophiler

Myelozyt

Eosinophiler Metamyelozyt

Stabkerniger neutrophiler Granulozyt

Reifer eosinophiler

Granulozyt Reifer basophiler Granulozyt

Reifer neutrophiler

Granulozyt Später

basophiler Myelozyt

Später neutrophiler

Myelozyt Früher

basophiler Myelozyt

50% der autosomal-dominanten Form der SCN in Verbindung mit Mutationen im Gen ELA2 gebracht (Skokowa et al., 2007). Es sind bisher mehr als 50 unterschiedliche Mutationen be- kannt, die über die gesamte Gensequenz verteilt und häufig missense-Mutationen sind (Bellanne-Chantelot et al., 2004; Xia und Link, 2008). Die neutrophile Elastase ist eine Se- rinprotease in den azurophilen Granula der neutrophilen Granulozyten (Baggiolini, 1972). Ihre Hauptaufgabe ist es, durch Modulierung der biologischen Aktivität und Aktivierung von Che- mokinen, Zytokinen und Zelloberflächenrezeptoren vor Infektionen mit gramnegativen Bakteri- en zu schützen (Belaaouaj et al., 1998; Pham, 2006). Die Mutation in ELA2 führt zu Akkumula- tion von nicht-funktionellem, falsch-gefaltetem Protein im Zytoplasma und endoplasmatischen Retikulum (ER). Es kommt außerdem zu Störungen des intrazellulären Transports in Neutrophi- len, welche die Aktivierung der Unfolded Protein Response verursachen (Köllner et al., 2006;

Grenda et al., 2007). Es wird diskutiert, ob der dadurch hervorgerufene ER-Stress zur Apoptose von granulozytären Vorläuferzellen führt (Xia und Link, 2008). Interessanterweise ist ELA2- mRNA in SCN-Patienten unabhängig von einer ELA2-Mutation vermindert (Sera et al., 2005).

Die ELA2-Expression ist von myeloiden Transkriptionsfaktoren wie C/EBPα abhängig, die wiederum durch den Transkriptionsfaktor LEF-1 (lymphoid enhancer-binding factor) reguliert werden (Skokowa et al., 2006). Skokowa und Kollegen stellten fest, dass LEF-1 bei SCN herun- terreguliert ist, wodurch sich die verminderte ELA2-Expression erklärt (Skokowa et al., 2006).

Die Verbindung zwischen den Mutationen bei SCN und der LEF-1-Herunterregulation ist noch nicht weiter bekannt und bedarf weiterer Untersuchungen.

Eine andere seltene Mutation wurde bei SCN-Patienten in dem Gen GFI-1 (growth factor inde- pendent 1) gefunden (Person et al., 2003). Nachdem zunächst bei Gfi1-defizienten Mäusen un- erwarteter Weise eine Neutropenie festgestellt wurde (Karsunky et al., 2002), entdeckten Person und Kollegen bei der Sequenzierung der genomischen DNA von SCN-Patienten ohne ELA2- Mutation heterozygote Mutationen in GFI1 (Person et al., 2003). Gfi1 ist ein nukleärer Transkriptionsrepressor der Zink-Finger-Protein-Familie, der an der Differenzierung von vielen hämatopoetischen Zellen beteiligt ist (Hock et al., 2003).

Bei Mutationen im Wiskott-Aldrich Syndrom Protein (WASP) tritt das Wiskott-Aldrich Syn- drom oder SCN mit X-chromosomal-rezessivem Vererbungsmodus auf. Das Wiskott-Aldrich Syndrom zeichnet sich durch Mikrothrombozytopenie, wiederkehrende Infektionen und Ekzeme aus. Die von Devriendt und Kollegen entdeckte neue missense Mutation in WAS führte zu Neutropenie mit wiederkehrenden Infektionen ohne Ekzeme (Devriendt et al., 2001). WASP hat Funktionen in der Polymerisierung des Aktinzytoskeletts, das u.a. für Zellmigration, Zellteilung und Vesikeltransport wichtig ist (Miki und Takenawa, 2003). Durch die Mutation ist die WASP-Autoinhibierung gestört, was zu einem konstitutiv-aktiven WAS-Protein führt. Moul- ding und Kollegen zeigten, dass durch die unregulierte Aktinpolymerisierung Mitose und Zyto- kinese gestört sind, was die Hemmung der Myelopoese und die daraus resultierende Neutrope- nie erklären könnte (Moulding et al., 2007).

Eine von Bohn et al. entdeckte homozygote Punktmutation in p14, einem endosomalen Adap- terprotein, verursacht SCN mit partiellem Albinismus, Kleinwuchs und Mangel an B- und zyto- toxischen T-Zellen. Aufgrund der Mutation wird p14 vermindert exprimiert und weist eine a- normale lysosomale Funktion auf (Bohn et al., 2007b). Das Adaptermolekül p14 spielt eine Rolle in dem Mitogen-aktivierten Protein-Kinase Signalweg, der für subzelluläre Kompartmen- talisierung von Signalen (Teis et al., 2002), Zellproliferation und Differenzierung wichtig ist (Bohn et al., 2007a). Die neutrophilen Granulozyten der p14-defizienten Patienten sind in der bakteriellen Abwehr durch eine verminderte antimikrobielle Aktivität in Phagosomen gestört (Bohn et al., 2007a).

Der genetische Defekt klassischer autosomal-rezessiver SCN (Kostmann-Syndrom) wurde 2006 von unserer Arbeitsgruppe durch Linkage-Analysen in drei nicht verwandten kurdischen Fami- lien entdeckt (Klein et al., 2007). Es wurden zunächst drei unterschiedliche homozygote Non- sense-Mutationen im Gen HAX1 (HS-1 associated protein X-1) gefunden (W44X, R86X, Q190X), wobei eine der Mutationen auch in dem von Kostmann beschriebenen Original- Stammbaum entdeckt wurde (Klein et al., 2007). Alle Patienten hatten homozygote Mutationen in HAX1, während die gesunden Verwandten heterozygot waren, was auf einen rezessiven Erb- gang schließen ließ. Damit ist das Kostmann-Syndrom auf eine Mutation in HAX1 zurückzufüh- ren. ELA2 und HAX1 bilden somit nach dem heutigen Stand zwei verschiedene Gruppen von SCN mit unterschiedlichem Erbgang, die sich jedoch weder klinisch noch durch Knochmarks- biopsie unterscheiden lassen. Rund 30% der SCN mit autosomal-rezessivem Erbgang werden mittlerweile auf eine Mutation in HAX1 zurückgeführt (Palmblad und Papadaki, 2008). Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit dem Protein HAX1, das in den Abschnitten 1.4 und 1.5 beschrieben wird.

Weitere Subtypen von SCN und deren genetische Ursachen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Es wird unterschieden zwischen Neutropenien im Zusammenhang mit Hypopigmentation, Stoff- wechselerkrankungen und Syndromen, außerdem werden die klinischen Symptome kurz be- schrieben.

Erkrankung Erbgang Mutation Besonderheiten

SCN AD ELA2 (40-50%) Klassische SCN mit wiederkeh-

renden bakteriellen Infektionen

SCN AD GFI1 Sehr selten

Zyklische Neutropenie AD ELA2 Über ca. 21 Tage ANC-

Schwankungen

Kostmann-Syndrom AR HAX1 (30%) Wiederkehrende bakterielle In-

fektionen

SCN XL WAS Wiederkehrende bakterielle In-

fektionen, sehr selten Mit Stoffwechseldefekt:

Shwachman-Diamond- Syndrom

AR SBDS Stoffwechseldefekt: Pankreasin-

suffizienz; Chondrodysplasie Pearson-Syndrom mitochondrial Mitochondriale Deleti-

on

Stoffwechseldefekt: Pankreasin- suffizienz; Thrombozytopenie, Anämie

Glykogenose Typ 1b AR SLC37A4 Stoffwechseldefekt, Hypoglykä-

mie, Hepatomegalie, Retardie- rung

Methylmalonacidurie AR MUT, MMAA, MMAB Stoffwechseldefekt, Retardierung, Pankreatitis

Mit Hypopigmentation:

Chédiak-Higashi- Syndrom

AR LYST Hypopigmentation, Störung NK-

Zellen, neurologische Defekte

Griscelli-Syndrom 2 AR RAB27A Hypopigmentation, Störung zyto-

toxischer Lymphozyten Hermansky-Pudlak-

Syndrom 2

AR AP3B1 Hypopigmentation, Blutungsnei-

gung, Störung zytotoxischer T- und NK-Zellen

p14- Defizienz AR p14 Hypopigmentation, Minder-

wuchs, Hypo-

gammaglobulinämie, B-Zell- u.

zytotoxischer T-Zell-Defekt Dyskeratosis congenita AD, XL, AR TERC/TERT, DKC1,

und Unbekannte

Hypopigmentation, Ulzera, prä- maligne Disposition

Mit Syndrom:

WHIM-Syndrom AD CXCR4 Warzen, Hypogammaglobulin-

ämie, Infektionen, Myelokathexis (WHIM)

Barth-Syndrom XL TAZ Dilatative Kardiomyopathie,

Myopathie der Skelettmuskulatur

Cohen-Syndrom AR VPS13B Adipositas, Hypotonie, Retardie-

rung, kraniofasciale und Skelett- anomalien

Knorpel-Haar- Hypoplasie

AR RMRP Zwergwuchs, wenig Haare, Anä-

mie, erhöhte prämaligne Disposi- tion

Tabelle 1: Subtypen kongenitaler Neutropenien, ursächliche Gendefekte, Vererbung und klinische Symptome. Autosomal-dominant (AD), autosomal-rezessiv (AR), X-linked (XL). Modifiziert nach (Schaffer und Klein, 2007) mit Ergänzungen aus (Deodato et al., 2006; Kirwan und Dokal, 2008).

1.4. Kostmann-Syndrom und HS1-associated protein X-1 (HAX1)

1956 veröffentlichte Rolf Kostmann seine Doktorarbeit in Acta paediatrica mit dem Titel „In- fantile genetic agranulocytosis – an new recessive lethal disease in man“ (Kostmann, 1956). Er beschrieb damals eine Erkrankung, die gehäuft bei Kindern aus Norrbotten, der nördlichsten Provinz Schwedens, auftrat und zu wiederkehrenden bakteriellen Infektionen führte, die meist letal endeten. Häufig litten die Patienten schon 1-3 Wochen nach der Geburt unter septischen Hautinfektionen (Furunkel, Phlegmone, Abszesse) und Fieber. Er untersuchte vierzehn Kinder aus neun Familien, wovon die meisten Kinder blutsverwandter Eltern waren und somit gemein- same Vorfahren hatten. Kostmann vermutete damals, dass die Erkrankung auf die gleiche, re- zessiv vererbte Mutation zurückzuführen sei. Besonders auffällig erschien ihm die schwere Granulozytopenie bis hin zur Agranulozytose, die sich im Knochenmarksausstrich als Reifungs- arrest im Promyelozyten-/Myelozyten-Stadium darstellte (Kostmann-Syndrom). 50 Jahre später wurde von Klein und Mitarbeitern die genetische Ursache des Kostmann-Syndroms gefunden:

Eine Mutation im Gen HAX1. (Kostmann, 1956; Carlsson et al., 2006; Klein et al., 2007) HAX1 wurde 1997 als ein Interaktionspartner von HS1 (hematopoetic lineage cell-specific pro- tein 1) mit der Yeast Two-Hybrid Technik von Suzuki und Mitarbeitern entdeckt und deshalb HS-1 associated protein X-1 genannt (Suzuki et al., 1997). Das „X“ steht für den im Yeast Two- Hybrid genutzten „X-Gal colony filter“ (Schaffer und Klein, 2007). HS1, lokalisiert auf Chro- mosom 3q13, kodiert ein 75 kDa großes Protein, das ein Substrat der Familie der rezeptorge- koppelten Tyrosinkinasen ist. HS1 ist für die Signaltransduktion in Antigenrezeptoren bei der klonalen Expansion/Deletion lymphatischer Zellen zuständig. HAX1 ist auf Chromosom 1q21.3 lokalisiert und besteht aus sieben Exons und sechs Introns. Neben der Isoform a gibt es eine weitere kürzere Splicevariante (Isoform b), die sich durch eine Verkürzung des Exons 2 von der Isoform a unterscheidet (Abbildung 3). Das Protein HAX1 ist aus 279 Aminosäuren aufgebaut und besitzt eine molekulare Größe von 35 kDa. Die Aminosäuresequenz von HAX1 weist schwache Homologien zu Nip3 (Bcl-2/adenovirus E1B nineteen kDa interacting protein-3) auf, einem proapoptotischen Mitglied der Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) -Familie (Bruick, 2000). Zu- dem enthält HAX1 eine PEST-Sequenz, womit die Aminosäuren Prolin (P), Glutaminsäure (E), Serin (S) und Threonin (T) gemeint sind. Proteine, die eine PEST-Sequnz enthalten, werden schneller intrazellulär abgebaut (Rogers et al., 1986). Zwei Bereiche in der Aminosäuresequenz (37-56 und 74-89) zeigen Homologien zur Bcl-2-Familie. Die Proteine der Bcl-2-Genfamilie, die eine oder mehrere homologe Domänen zu Bcl-2 (BH1, -2, -3, -4) und meist eine C- terminale Transmembran-Domäne besitzen, spielen eine Rolle bei Apoptose und können pro- oder antiapoptotisch agieren (Youle und Strasser, 2008). HAX1 besitzt eine putative Trans- membran-Domäne am C-Terminus und die beiden Domänen BH1 und BH2, für die eine antia- poptotische Funktion postuliert wird (Yin et al., 1994). (Suzuki et al., 1997)

Abbildung 2: Aminosäure- Struktur von HAX1 mit seinen Domänen.

1.5. Funktionen von HAX1 und Charakterisierung der Mutationen

HAX1 ist ein ubiquitär exprimiertes Protein, das mit mehreren anderen Proteinen interagiert.

Hierbei fällt insbesondere die antiapoptotische Funktion von HAX1 auf. Jedoch spielt HAX1 auch im Zytoskelett, der Signaltransduktion etc. eine Rolle. Die einzelnen Interaktionspartner werden in den folgenden Abschnitten näher beschrieben (1.5.1- 1.5.3).

Es sind bislang zehn verschiedene homozygote Mutationen im HAX1-Gen bekannt, wovon die meisten Exon 2 betreffen (Abbildung 3). Am häufigsten tritt die Mutation p.Trp44X (W44X) auf (Klein et al., 2007; Germeshausen et al., 2008b). Die Mutationen sind entweder Nonsense- oder Frameshift-Mutationen durch Einzel-Nukleotid-Insertionen oder Einzel-Basen- Substitutionen, die alle zu einem vorzeitigen Stopp-Codon führen. Dadurch wird das Protein nicht exprimiert und die Patienten leiden an einer HAX1-Defizienz (Klein et al., 2007). In neu- esten Veröffentlichungen wurde beschrieben, dass bei manchen Patienten zusätzlich zu der Neutropenie neurologische Symptome wie Epilepsie und/oder mentale und psychomotorische Retardierung auftreten. Die Analyse des Mutationsschemas ergab, dass dies nur bei Patienten mit Mutationen, die beide Splice-Varianten (Isoform a und b) betreffen, auftritt (Abbildung 3).

Die kleinere Transkriptvariante 2 hat eine erhöhte Expression im Gehirngewebe. Durch die Mutation könnte das Protein eine gestörte Funktion im Gehirn aufweisen. Der Phänotyp bei HAX1-Defizienz ist demnach abhängig von der Lokalisation der betreffenden Mutation. Ob jedoch die Transkriptvarianten für zwei unterschiedliche Proteine mit verschiedenen Funktionen kodieren, ist noch unklar. (Matsubara et al., 2007; Rezaei et al., 2007; Carlsson et al., 2008;

Germeshausen et al., 2008b)

1 279

BH1 BH2

PEST-Domäne Transmembran-Domäne

226 263 188 52 107 91 260

Intron 1 Intron 2 Intron 3 Intron 4 Intron 5 Intron 6

Exon 1 Exon 2 a Exon 3

Exon 4

Exon 5 Exon 6 Exon 7

p.Glu31LysfsX54 p.Ser43LeufsX11

p.Trp44X

p.Arg86X

R126fsX

p.Gln190X

226 119 188 52 107 91 260

Intron 1 Intron 2 Intron 3 Intron 4 Intron 5 Intron 6

Exon 1 Exon 2 b Exon 3

Exon 4 Exon 5 Exon 6 Exon 7

p.Arg86X

p.Glu59X p.Glu60fs

p.Gln123fs p.Val144fs

R126fsX

p.Gln190X p.Gln123fs

p.Val144fs Isoform a

Isoform b

Abbildung 3: Die beiden Isoformen von HAX1 und die bisher entdeckten Mutationen, die zum Kostmann-Syndrom führen. Mit sind die Orte der Mutation gekennzeichnet. Kursiv sind die Mutati- onen mit zusätzlichen neurologischen Defiziten dargestellt. Fett gedruckt ist die häufigste Mutation des Kostmann-Syndroms. 49. Meeting of the American Society of Hematology, Atlanta 2007, (Klein et al., 2007; Germeshausen et al., 2008b)

1.5.1. HAX1 und das Zytoskelett

Das Zytoskelett einer Zelle besteht aus drei Klassen von Proteinfilamenten: Intermediärfilamen- te, Mikrotubuli und Aktinfilamente. Die Intermediärfilamente weisen die höchste Strapazierbar- keit auf und stabilisieren die Zelle bei mechanischer Beanspruchung. Mikrotubuli bestehen aus zwei Untereinheiten, den α- und β-Tubulin-Molekülen, und sind für den intrazellulären Trans- port von Vesikeln, Organellen und anderen Zellbestandteilen, z.B. der Mitosespindel für den Transport von Chromosomen, zuständig. Sie bilden eine Art Schienensystem, an dem sich Mo- torproteine (Dynein und Kinesin) entlang bewegen. Aktinfilamente sind Aktinmonomere, die sich zu Aktinpolymeren zusammenlagern können (Aktinpolymerisation). Sie sind für die Stabi- lisierung der äußeren Form der Zelle zuständig und befinden sich meist direkt unter der Plas- mamembran (Zellkortex). Außerdem sind sie für die Fortbewegung von Zellen wichtig. Sie bilden flache, blattartige Auswüchse (Lamellipodien), die ein dichtes, gitterartiges Geflecht aus Aktinfilamenten enthalten. Zusammen mit dünnen, steifen Zellfortsätzen (Filopodien) spielen sie bei der Zellmigration eine Rolle. (Alberts et al., 2005)

Die Anordnung der Aktinfilamente wird durch GTPasen der Rho-Familie organisiert, die extra- zelluläre Signale an das Aktinzytoskelett weiterleiten (Ridley, 2001). Der Aufbau eines neuen Filaments wird durch den Arp2/3-Komplex (actin related complex) initiiert (Weed et al., 2000).

Dieser Komplex wird wiederum durch Cortactin aktiviert, wodurch der Abbau des Komplexes gehemmt wird (Weaver et al., 2001).

HAX1 interagiert mit den Proteinen PKD2 (polycystic kidney disease 2) und Gα₁₃, die Funktio- nen im Zytoskelett einnehmen. Gallagher und Mitarbeiter zeigten im Zusammenhang mit der Polyzystischen Nierenerkrankung, dass murines Hax1 mit dem „Loop 5“ des C-Terminus des mutierten Proteins PKD2 interagiert (Gallagher et al., 2000). PKD2 ist ein intrazelluläres Katio- nenkanalprotein in Nierenepithelien (Vafiadaki et al., 2007). Hax1 und PKD2 interagieren zu- dem mit endogenem Cortactin und befinden sich beide im Zytoplasma und in den Lamellipo- dien von Zellen (Gallagher et al., 2000).

Gα₁₃, eine G-Protein α-Untereinheit der heterotrimeren G12-Proteinfamilie (Radhika und Dha- nasekaran, 2001), ist primär an der Regulierung der Zellbewegung beteiligt (Offermanns et al., 1997). Für die Zellbewegung ist die Polymerisation und Depolymerisation von Aktin wichtig, die von Cortactin und anderen Aktin-verwandten Proteinen reguliert wird (Patel et al., 1998;

Uruno et al., 2003). Radhika und Mitarbeiter stellten die Interaktion zwischen Hax1 und Gα₁₃ fest. Bei Hax1-Überexpression wurde die durch Gα13 vermittelte Zellmigration gefördert. Zu- dem bildete Hax1 mit Cortactin und der für Zellbewegung und Lamellipodienbildung verant- wortlichen GTPase Rac einen Komplex. Radhika schloss daraus, dass Hax1 und Gα13 Teil eines Signalkomplexes sind, der für Zellbewegung verantwortlich ist (Radhika et al., 2004).

1.5.2. HAX1 und Apoptose

Die Homöostase in einem Gewebe ist abhängig von Zellproliferation und Zelltod. In einer Zelle gibt es zwei verschiedene Arten von Zelltod: Apoptose (griechisch - das Fallen der Blätter) und Nekrose (griechisch – Tod, Absterben). Der Unterschied zwischen Apoptose und Nekrose be- steht darin, dass Nekrose mit einer Entzündungsreaktion verbunden ist, da sich die Permeabilität der Zellmembran erhöht und unkontrolliert intrazelluläre Bestandteile in die Zellumgebung ausgeschüttet werden, während Apoptose als programmierter Zelltod bezeichnet wird. Morpho- logisch zeichnet sich Apoptose durch Chromatinkondensation, Blasenbildung der Membran, Schrumpfung der Zelle, Auflösung der Kernmembran und Formung von Apoptosekörperchen aus. Diese Abschnürungen der Zellmembran werden von benachbarten Zellen oder Makropha- gen phagozytiert, um eine Entzündungsreaktion zu vermeiden (Kerr et al., 1972). Der Apopto- seprozess kann 30-60 min andauern (Thornberry und Lazebnik, 1998). Deregulierung führt zu vielen Erkrankungen wie Krebs, Immunerkrankungen und neurodegenerativen Erkrankungen (Thompson, 1995).

Apoptose wird durch unterschiedliche Stimuli wie DNA-Schäden oder death receptor- Aktivierung ausgelöst. Dadurch wird entweder über innere Stimuli der intrinsische, mito- chondriale Weg oder über äußere Stimuli, die zur Aktivierung des death receptor führen, der extrinsische Weg der Apoptose ausgelöst (Antonsson, 2001). Beide Wege haben die gleiche Endstrecke, indem sie die Cystein-Proteasen (Caspasen) 3 und 7 aktivieren (Thornberry und Lazebnik, 1998; Yan und Shi, 2005). Caspasen sind inaktive Zymogene, die durch proteolyti-

sche Spaltung aktiviert werden. Eine ihrer Funktionen ist, Proteine zu inaktivieren, die die Zelle vor dem Zelltod schützen (antiapoptotische Proteine), oder auch direkt Zellstrukturen wie die Kernlamina abzubauen, was zur Chromatinkondensation beiträgt (Thornberry und Lazebnik, 1998). Caspasen lassen sich einteilen in Initiatorcaspasen (Caspasen 2, 8, 9, 10), die sich unter apoptotischen Bedingungen durch autokatalytische Spaltung selbst aktivieren, und Effektor- caspasen (Caspasen 3, 6, 7), die durch andere Initiatorcaspasen aktiviert werden (Shi, 2002). Sie liegen in der Zelle in ihrer inaktiven Form als Vorstufen (Procaspasen) vor, die nur eine geringe katalytische Aktivität vorweisen (Thornberry und Lazebnik, 1998).

Der intrinsische Weg der Apoptose zeichnet sich dadurch aus, dass Mitglieder der Bcl-2- Proteinfamilie durch innere Stimuli wie DNA-Schäden post-translational oder durch Konforma- tionsänderung aktiviert werden. Die Mitglieder der Bcl-2-Familie teilen sich in proapoptotische und antiapoptotische Proteine. Zu der proapoptotischen Untergruppe gehören die Multidomän- Besitzer Bax und Bak und die Proteine, die nur eine BH3-Domäne besitzen (Bid, Bad, Box, Bim, PUMA, NOXA). Bcl-2, Bcl-x_L, Bcl-w und Mcl-1 repräsentieren Mitglieder der antiapop- totischen Untergruppe (Cory et al., 2003; Jiang und Wang, 2004; Youle und Strasser, 2008).

Überwiegen die proapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie, sinkt das mitochondriale Membranpotential, und proapoptotische Faktoren wie Cytochrom c, AIF (apoptosis inducing factor), Endonuclease G (Endo G), Omi/HtrA2 (high temperature requirement A2) und Smac/DIABLO (second mitochondria derived activator of Caspases/ direct IAP-binding protein with low pI) werden aus dem Intermembranraum der Mitochondrien freigesetzt (Antonsson, 2001; Garrido und Kroemer, 2004). Dort bildet sich das Apoptosom, ein heptago- naler Komplex aus Cytochrom c, Apaf-1 (apoptotic protease activating factor 1) und (d)ATP, der die Selbstaktivierung der Initiatorcaspase des intrinsischen Systems (Procaspase 9) bewirkt (Li et al., 1997; Boatright und Salvesen, 2003). Daraus folgt die Aktivierungskaskade der Effek- torcaspasen 3 und 7, die durch Caspase 9 in ihre aktive Form gespalten werden (Li et al., 1997).

Die anderen aus den Mitochondrien freigesetzten Moleküle Smac/DIABLO und Omi/HtrA2 verstärken die Apoptose durch Hemmung von IAPs (inhibitory apoptosis proteins), deren Auf- gabe es ist Caspasen zu inhibieren. Zudem steigert Omi/HtrA2 die Caspasenaktivität (Hegde et al., 2002; Martins et al., 2002). Endo G bewirkt nach Freisetzung ins Zytosol und Translokation in den Nukleus die Fragmentation von DNA (Garrido und Kroemer, 2004). AIF markiert die apoptotischen Zellen für Makrophagen durch Externalisierung von Phosphatidylserin auf die Außenseite der Plasmamembran. Des weiteren transloziert AIF zum Nukleus und induziert die Kondensation von Chromatin (Susin et al., 1999; Ye et al., 2002). (Siehe Abbildung 4)

Der extrinsische Weg der Apoptose wird durch Bindung von Todesliganden der TNF (Tumor Nekrose Faktor)- Rezeptorfamilie wie TNF-α, Fas/CD95 Ligand und Apo2 Ligand/TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) an einen membranständigen Todesrezeptor ausgelöst (Ashkenazi und Dixit, 1998; Yan und Shi, 2005). Todesrezeptoren der TNF- Rezeptorproteinfamilie (TNFR1, Fas, Apo2) besitzen eine konservierte, zytoplasmatische To-

desdomäne, die bei Bindung des Todesliganden trimerisiert wird. Dadurch wird das apoptoti- sche Signal intrazellulär weitergeleitet. Rezeptor-assoziierte Adaptermoleküle wie FADD (Fas associated death domain) und TRADD (TNF receptor associated death domain) und andere Effektorproteine interagieren mit dieser Todesdomäne und bilden einen Komplex. Dieser wird als DISC (death inducing signaling complex) bezeichnet. Durch die Todeseffektordomäne (DED) von FADD werden drei Procaspasen 8 rekrutiert, die durch die hohe räumliche Konzent- ration von Procaspase-Molekülen von ihrer latenten Pro-Form in aktive Proteasen prozessiert werden (Yan und Shi, 2005). Caspase 8 liegt durch die Aktivierung als Heterotetramer vor und kann Caspase 3 aktivieren, wodurch wiederum Caspase 7 aktiviert wird (Caspasen-Kaskade).

Zusätzlich spaltet Caspase 8 ein weiteres Substrat, das proapoptotische Mitglied der Bcl-2- Familie Bid, das in seiner gekürzten Form (tBid) zu den Mitochondrien transloziert und dort durch Freisetzung proapoptotischer Faktoren (u.a. Cytochrom c) eine Verbindung zum intrinsi- schen Weg der Apoptose herstellt (Luo et al., 1998; Yan und Shi, 2005).

Die Caspasen-Kaskade übernimmt schließlich die Ausführung der Apoptose. Beteiligt sind die Effektorcaspasen 3, 6 und 7, die durch proteolytische Spaltung von verschiedenen Substraten die Struktur der Zelle zerstören. Letztlich wird sie durch Abschnürungen der Zellmembran in kleinen Vesikel (Apoptosekörperchen) abgebaut und von Fresszellen phagozytiert.

Mitochondrialer Stress

Cytochrom c Bid

Apaf-1 dATP/ATP

Procaspase 9 Smac

Apoptosom

Caspase 9 IAPs

Caspase 7 Caspase 3 Omi

AIF Endo G Todesligand

Todes- rezeptor

Extrinsisch

Intrinsisch

Todesdomäne

Phosphatidylserin Externalisierung FADD

DISC

Procaspase 8

Caspase 8

tBid

Apoptose

Caspase- Kaskade

DNA- Fragmentation

Abbildung 4: Schematische Darstellung des extrinsischen und intrinsischen Weges der Apoptose.

In der Literatur werden mehrere Interaktionspartner von HAX1 im Zusammenhang mit Apopto- se erwähnt, weshalb eine antiapoptotische Rolle von HAX1 nahe liegend ist. Die antiapoptoti- sche Funktion von HAX1 wurde durch Interaktion mit viralen Proteinen, der proapoptotischen Protease Omi/HtrA2, dem Transmembranprotein Phospholamban, Caspase 3 und 9 und bei der Untersuchung des mitochondrialen Membranpotentials beschrieben, die im Folgenden erläutert werden. Außerdem wurde durch Analyse der Genstruktur festgestellt, dass HAX1 entfernte Homologien zu Bcl-2-Domänen und Nip3 besitzt (Suzuki et al., 1997).

Viren machen sich multiple antiapoptotische Strategien zunutze, um die apoptotischen Mecha- nismen der Wirtszelle als Zellantwort auf virale Infektionen zu antagonisieren (Thomson, 2001). Die antiapoptotische Funktion von HAX1 wurde bei der Interaktion von HAX1 mit drei viralen Proteinen beschrieben: Kaposi Sarkom assoziiertes Herpes Virus, HIV (Human immu- nodeficiency virus), EBV (Epstein-Barr Virus).

K15 ist ein Protein des Kaposi Sarkom assoziierten Herpes Virus, das die Genexpression der Wirtszelle beeinflussen kann und an der Signaltransduktion beteiligt ist (Schulz, 2000; Brink-

mann et al., 2007). HAX1 und K15 interagieren miteinander und befinden sich laut Sharp et al.

beide im endoplasmatischen Retikulum und in den Mitochondrien. Außerdem wurde gezeigt, dass Bax-induzierte Apoptose durch HAX1 inhibiert werden kann, worauf K15 jedoch keinen Einfluss hat (Sharp et al., 2002).

Vpr (HIV 1 viral protein R) ist bei einer HIV-1-Infektion am nukleären Import des HIV-1 Präin- tegrationskomplexes und der Transaktivierung von LTR (Long terminal repeat) und Zielgenen beteiligt. Zudem ist Vpr bei Apoptose, der Verbesserung der Genauigkeit der reversen Transkriptase und der Arretierung des Zellzyklus in der G2-Phase involviert (Andersen und Planelles, 2005; Le Rouzic und Benichou, 2005; Dehart und Planelles, 2008). Vpr depolarisiert bei Apoptose das mitochondriale Transmembranpotential, was die Freisetzung von Proteinen aus den Mitochondrien zur Folge hat (Jacotot et al., 2000). Yedavalli et al. stellten fest, dass Vpr an HAX1 bindet und HAX1 ins Zytoplasma transloziert, wenn durch Vpr-Überexpression Apoptose ausgelöst wird. Die Überexpression von HAX1 bewirkte einen antiapoptotischen Effekt (Yedavalli et al., 2005).

Die viralen Proteine EBNA (EBV nuclear antigen) -1, -2, -3A, 3C, -LP (leader protein) und LMP-1 (latent membrane protein 1) spielen im Rahmen einer EBV-Infektion bei der Immortali- sierung von B-Zellen eine Rolle. HAX1 interagiert mit EBNA-LP und EBNA-5 (Kawaguchi et al., 2000; Dufva et al., 2001). EBNA-LP ist ein Phosphoprotein, das die EBV-induzierte Trans- formation des B-Zellwachstums reguliert (Mannick et al., 1991). Durch seine Interaktion mit HAX1 könnte EBNA-LP dessen Funktion (Apoptoseregulation und Rezeptor-vermittelte Signaltransduktion) im B-Zell-Immortalisierung-Prozess beeinflussen (Kawaguchi et al., 2000).

Außerdem zeigten Matsuda et al., dass EBNA-LP in Anwesenheit von HAX1 virale und zellu- läre Bcl-2-Proteine wie Bcl-2 und BHRF1 (BamHI fragment H rightward open reading frame 1) beeinflusst und in vitro mit diesen einen Komplex bildet (Matsuda et al., 2003).

Auch bei der Interaktion mit anderen Proteinen ließ sich die antiapoptotische Funktion von HAX1 beobachten. Humanes Prohibitin 2 (PHB2), ein Tumorsuppressorgen, bildet mit HAX1 einen Komplex im Mitochondrium. Der Knockdown von PHB2 löst in HeLa-Zellen Apoptose aus. Kasashima und Kollegen vermuteten, dass sich dies durch Herunterregulation von HAX1 erklären lässt, was zu Caspase abhängiger Apoptose führt (Kasashima et al., 2006). Mirmo- hammadsadegh machte bei der Untersuchung von psoriatrischen Keratinozyten ähnliche Beo- bachtungen der Apoptosesteigerung bei verminderter HAX1-Expression (Mirmohammadsadegh et al., 2003).

Cilenti und Kollegen entdeckten HAX1 als ein Substrat der proapoptotischen, mitochondrialen Serinprotease Omi/HtrA2 (Cilenti et al., 2004). Es wurde gezeigt, dass HAX1 das mito- chondriale Membranpotential stabilisiert und bei Apoptoseinduktion noch im Mitochondrium von Omi/HtrA2 gespalten und inaktiviert wird, bevor Omi/HtrA2 ins Zytoplasma transloziert.

Chao und Mitarbeiter zeigten zudem, dass Hax1 mit der mitochondrialen Protease PARL (pre-

senilin-associated, rhomboid-like) interagiert, wodurch PARL Omi/HtrA2 zur aktiven Protease prozessiert (Chao et al., 2008). Das prozessierte Omi/HtrA2 wird in den Intermembranraum freigesetzt und verhindert die Anreicherung von Bax und somit die Apoptoseauslösung.

HAX1 greift über die Inhibition von Caspasen in die Apoptose ein. Han und Kollegen zeigten die Interaktion von HAX1 mit Caspase 9. In kardialen Myozyten stellten sie eine erhöhte Caspase-9 Expression fest, jedoch eine erniedrigte Apoptoserate und Caspase 9-Aktivierung (Han et al., 2006). Fluoreszenzmikroskopisch wurde nach Apoptoseinduktion die Translokation von Caspase 9 in die Mitochondrien festgestellt, wo ihre Aktivierung vermutlich von HAX1 inhibiert wird. Die exakte Wirkungsweise, ob direkt oder indirekt über andere Adapterproteine, wird in diesem Zusammenhang noch diskutiert (Shaw und Kirshenbaum, 2006).

Vafiadaki und Mitarbeiter zeigten, dass HAX1 mit Phospholamban (PLN) interagiert und Caspase 3 inhibiert (Vafiadaki et al., 2007). PLN ist ein Transmembranprotein des kardialen sarkoplasmatischen Retikulums, das für Ca²⁺-Homöostase und Kontraktilität verantwortlich ist (MacLennan und Kranias, 2003). Mit myc-HAX1 transient transfizierte HEK293-Zellen zeigten erhöhte Resistenz gegenüber dem Apoptose auslösenden Stimulus H2O2. Dieser protektive Ef- fekt von HAX1 konnte durch Co-Transfektion mit PLN noch gesteigert werden. Vafiadaki schloss daraus, dass HAX1 durch Caspase 3-Inhibition antiapoptotisch wirkt, da die Expression von Caspase 3 in den Zellen erniedrigt war (Vafiadaki et al., 2007). Außerdem sei es möglich, dass HAX1 wie Bcl-2 das Überleben von Zellen durch Regulation der Ca²⁺-Homöostase im ER moduliert (Vafiadaki et al., 2007; Vafiadaki et al., 2008).

Zudem wirkt HAX1 modulierend in den Mitochondrien. Die Mitochondrien üben eine Schlüs- selfunktion in der Apoptose aus, da durch Permeabilisierung der inneren Mitochondrienmemb- ran Apoptose eingeleitet wird. Die Veränderung des Membranpotentials wurde deshalb durch unsere Arbeitsgruppe an HAX1-defizienten Patienten- und Normalspenderzellen untersucht (Klein et al., 2007). HAX1-defiziente Neutrophile und Fibroblasten wiesen im Vergleich zu Normalspendern eine höhere spontane und durch TNF-α bzw. Valinomycin ausgelöste Apopto- serate auf. Beide HAX1-defizienten Zellarten zeigten eine schnellere Depolarisation des mito- chondrialen Membranpotentials. Zudem nahm die Spaltung von Caspase 3 und 7 zu. HAX1 ist demnach an der Stabilisierung des mitochondrialen Membranpotentials beteiligt. Dies bestätigt die These von Carlsson und Mitarbeiter, die noch vor der Entdeckung des Gendefekts beim Kostmann-Syndrom die gestörte mitochondriale Apoptose als ursächlichen Pathomechanismus für den Reifearrest in der Myelopoese annahmen (Carlsson et al., 2004; Palmblad und Papadaki, 2008). Bei HAX1-Defizienz führt nur die Funktionsstörung in den hämatopoetischen Zellen zum Krankheitsbild SCN, obwohl HAX1 ubiquitär exprimiert wird. Es bleibt deshalb noch un- klar, warum auch Fibroblasten als nicht hämatopoetische Zellen einen erhöhten Membranpoten- tialverlust bei Apoptoseinduktion aufweisen, dies jedoch auf den Phänotyp der Erkrankung kei- ne Auswirkungen zu haben scheint (Klein et al., 2007).

Abbildung 5: Hypotheti- sches Apoptoseschema mit der Rolle von HAX1. Durch mitochondrialen Stress oder Stimulation mit Bid wird Cytochrom c aus dem Mito- chondrium freigesetzt, was zur Bildung des Apoptosoms mit Apaf-1 und dATP führt.

Dadurch kann sich Procaspa- se 9 selbst aktivieren und die Caspasen-Kaskade wird aus- gelöst, was zur Exekution der Apoptose führt. HAX1 und IAPs können die Caspasen inhibieren und werden selbst durch Smac und Omi/HtrA2 gehemmt.

Modifiziert nach (Crow et al., 2004; Carlsson et al., 2007)

1.5.3. Weitere Funktionen von HAX1

Neben der bereits besprochenen antiapoptotischen Funktion spielt HAX1 auch bei der Signaltransduktion, Zellmigration und beim Transport von Molekülen in der Zelle eine Rolle.

In der Erstveröffentlichung über HAX1 1997 wurde über den Interaktionspartner HS1 berichtet (Suzuki et al., 1997). HS1 ist ein in hämatopoetischen und lymphoiden Zellen exprimiertes Pro- tein, das u.a. Aufgaben in der Signaltransduktion besitzt (Yamanashi et al., 1993; Kitamura et al., 1995). Laut Suzuki und Mitarbeitern könnte HAX1 deshalb eine Funktion in der B-Zell- Rezeptor vermittelten Signaltransduktion haben.

Ramsay und Mitarbeiter zeigten im Zusammenhang mit der Interaktion von HAX1 mit dem Adhäsionsmolekül Integrin αvβ6 in Karzinomzellen eine mögliche Funktion bei der Migration von Zellen. In Mundkrebszellen war sowohl die Expression von HAX1 als auch von Integrin α_vβ₆ erhöht, was eine verstärkte Zellmigration und Clathrin-vermittelte Endozytose von Integrin αvβ6 bewirkte. Dadurch erklärt sich die Entwicklung und das invasive Wachstum des Tumors (Ramsay et al., 2007). Des weiteren stellten Yin et al. eine Interaktion zwischen HAX1 und dem inflammatorischen Zytokin Interleukin-1α NTP (N-terminales Peptid) fest, das in verschiedene Immunantworten involviert ist (Yin et al., 2001). Sie legten HAX1 eine Funktion in der Motili- tät oder Zelladhäsion nahe. Kawaguchi und Kollegen zeigten an Fibroblasten von Patienten mit Systemischer Sklerose, dass HAX1 eine Shuttlefunktion in Zellen ausübt, da es den Vorläufer

Mitochondrialer Stress

Cytochrom c Bid

Apaf-1 dATP/ATP

Procaspase 9 Smac Bcl-2

APOPTOSE Apoptosom

Caspase 9

IAPs

Caspase 7 Caspase 3

HAX 1 Omi

von IL-1α in einem Komplex mit IL-1RII (Interleukin-1 Rezeptor Typ II) bindet, der in den Zellkern transloziert (Kawaguchi et al., 2006). Die Bildung dieses Komplexes bewirkt eine vermehrte IL-6- und Prokollagen-Bildung, was zum sklerotischen Krankheitsbild führt. Weitere Funktionen könnte HAX1 im Zusammenhang mit Vimentin bei der mRNA-Translation und der perinukleären Lokalisation haben (Al-Maghrebi et al., 2002). In Hepatozyten interagiert HAX1 mit dem ABC-Transporter BSEP (bile salt export protein) und unterstützt zusammen mit Cor- tactin dessen Internalisierung (Ortiz et al., 2004).

Eine gute tabellarische Übersicht der Interaktionspartner bietet die Veröffentlichung von Vafia- daki et al. (Vafiadaki et al., 2008).

1.5.4. Lokalisation von HAX1

Durch die immunhistochemische Lokalisation eines Proteins in der Zelle lässt sich auf dessen Funktion schließen. In der Literatur finden sich über die Lokalisation von HAX1 mehrere Quel- len, die fast alle die Mitochondrien als Lokalisationsort benennen. Andere mögliche Lokalisati- onsorte sind im endoplasmatischen Retikulum, Nukleus, Lammelipodien oder im Zytoplasma (Suzuki et al., 1997; Gallagher et al., 2000; Dufva et al., 2001; Han et al., 2006; Kasashima et al., 2006; Kawaguchi et al., 2006; Vafiadaki et al., 2007). Bei der Koexpression mit Proteinen wie Vpr veränderte sich die Lokalisation von HAX1 (Yedavalli et al., 2005). Methodisch wur- den neben der mikroskopischen Darstellung auch andere Methoden, wie z.B. die subzelluläre Fraktionierung, angewandt. HAX1 wurde mit dieser Methode im ER und den Mitochondrien (Sharp et al., 2002) und von Cilenti und Mitarbeitern ausschließlich in den Mitochondrien loka- lisiert (Cilenti et al., 2004).

1.6. Zielsetzung

Seit der Entdeckung der Mutation des Gens HAX1 bei Patienten mit SCN im Jahre 2006 ist die genetische Ursache des autosomal-rezessiv vererbten Kostmann-Syndroms aufgeklärt. Jedoch bleiben noch viele Fragen über die Pathogenese und die Auswirkungen der Mutationen auf zel- lulärer Ebene offen.

Einen entscheidenden Hinweis auf die noch nicht vollständig geklärte Funktion von HAX1 in der Zelle kann dabei die subzelluläre Lokalisation des Proteins geben. Da es bisher teils wider- sprüchliche Veröffentlichungen über die Lokalisation in der Zelle gibt (1.5.4), soll als erstes Ziel dieser Arbeit mit modernen verfügbaren technischen Möglichkeiten die Lokalisation von HAX1 untersucht werden. Die Lokalisation soll in zwei unterschiedlichen Zellarten fluores- zenzmikroskopisch und mittels 2-Photonen-Mikroskopie charakterisiert werden. Zur Lokalisati- on in den verschiedenen Zellorganellen sollen Doppelfärbungen mit Markern für die Zellorga- nellen bzw. zellulären Strukturen und HAX1 durchgeführt werden. Außerdem soll die Verände- rung der Proteinlokalisation auf apoptotische Reize hin untersucht werden, um weitere Erkennt- nisse über die Funktion von HAX1 während der Apoptose zu gewinnen.

Einen zweiten Ansatz zur Klärung der Pathophysiologie der SCN soll die Messung der Zytoki- nausschüttung bei Stimulation des TLR3 (Toll-like receptor 3) HAX1-defizienter im Gegensatz zu Normalspender Zellen bieten. So kann auf die Funktionalität des Rezeptors geschlossen wer- den, was Aufschlüsse über die molekularbiologischen Ursachen des Immundefekts geben soll.

2. MATERIAL UND METHODEN 2.1. Methoden

Die Zusammensetzung der verwendeten Puffer und Medien sind in den Abschnitten 2.2.3 und 2.2.4 aufgelistet.

2.1.1. Molekularbiologische Methoden

2.1.1.1. Klonierungsstrategie für die Generierung des retroviralen Vektors pMMP-HAX1-IRES-CD24

Zur Lokalisation von HAX1 wurde zunächst ein HAX1-Antikörper (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) an Fibroblasten von Patienten und Normalspendern getestet, der jedoch keine spezi- fische Bindung zeigte, so dass zur Detektion von HAX1 ein 3’FLAG-HAX1-Konstrukt gene- riert wurde. Das FLAG-Tag ist eine häufig in der Immunfluoreszenz angewendete Peptidse- quenz zum Markieren von zellulären Proteinen, für die kein spezifischer Antikörper zu Verfü- gung steht. Um dieser Schwierigkeit zu entgehen, wird das Protein mit einer bekannten Peptid- sequenz („Tag“) fusioniert. Das FLAG-Tag ist ein hydrophiles Oktapeptid (DYKDDDDK=

Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) und stammt ursprünglich aus dem Bakteriophagen T7 (Hopp et al., 1988; Witzgall et al., 1994; Chubet und Brizzard, 1996).

Die cDNA von HAX1 wurde freundlicherweise von G. Appaswamy (AG Klein) zur Verfügung gestellt (Klein et al., 2007) und in einer PCR-Reaktion (Polymerase chain reaction) amplifiziert (2.1.1.2). Über den Forward-Primer wurde eine BspH1-Schnittstelle und über den Reverse- Primer das FLAG-Tag sowie eine BamH1-Schnittstelle eingefügt. Das PCR-Produkt wurde in den Vektor pGEM-T subkloniert und sequenziert, um PCR bedingte Mutationen auszuschlie- ßen. Nach der Verifizierung der HAX1-Sequenz wurde die cDNA mit BspHI und BamHI aus pGEM-T geschnitten und in den mit NcoI und BamHI linearisierten retroviralen Vektor pMMP- IRES-CD24 (matrix metalloproteinase vector- internal ribosome entry site- CD24) eingefügt.

Dieser besitzt als Marker ein verkürztes murines CD24-Molekül, welches die Identifizierung von positiven Zellen über die Färbung mit einem FITC-markierten Anti-Maus-CD24- Antikörpers ermöglicht (Klein et al., 2007).

Im Folgenden werden im molekularbiologischen Teil die einzelnen Schritte der Klonierung und im zellbiologischen Teil (2.1.2) die Produktion von retroviralen Partikeln beschrieben.

2.1.1.2. Herstellung von hHAX1-FLAG

Zur Herstellung des 3’FLAG-hHAX1 Konstrukts wurde zuerst eine Polymerase-Kettenreaktion mit HAX1 cDNA (NM_006118.3) als Template durchgeführt (Klein et al., 2007). Mit Hilfe einer PCR werden definierte Nukleinsäure-Abschnitte mit zwei sequenzspezifischen Oligo-

nukleotidprimern durch eine DNA-Polymerase amplifiziert. Die PCR besteht aus 25 - 40 Zyk- len, die jeweils in drei Teilschritte untergliedert sind. Erst wird das Template, die Ausgangs- DNA, für kurze Zeit auf eine hohe Temperatur erhitzt, so dass die DNA denaturiert und ein- zelsträngig vorliegt (Denaturierung). An die Einzelstrang-DNA lagern sich im Annealing- Schritt die Primer an die komplementäre Sequenz des Templates an. Die Annealing-Temperatur richtet sich dabei nach der Schmelztemperatur der Oligonukleotidprimer. Im letzten Schritt, der Elongation, heftet die DNA-Polymerase die entsprechenden Nukleotide an das 3´-OH-Ende der Primer und synthetisiert einen komplementären Strang zur Ausgangs-DNA. Die Temperatur dieses Schrittes ist dabei je nach Polymerase um die 70°C und die Dauer hängt von der Länge der zu amplifizierenden Nukleotid-Sequenz ab. Durch Wiederholung dieser Schritte erfolgt eine exponentielle Vermehrung der Zielsequenz, weil auch die neu entstandenen DNA-Fragmente als Vorlage zur Amplifizierung durch die Polymerase dienen.

Folgender Ansatz (20 µl) wurde in ein 0,5 ml Eppendorfröhrchen auf Eis pipettiert:

50- 100 ng 1×

0,2 mM 0,5 µM 0,5 µM 0,5 % 0,6 U

DNA

PCR Puffer (Roche Diagnostics, Mannheim) dNTPs (Roche Diagnostics, Mannheim) Forward-Primer

Reverse-Primer

DMSO (Sigma, Deisenhofen)

Taq Polymerase, High fidelity (Roche Diagnostics, Mannheim)

Nach einer initial 10-minütigen Denaturierungsphase bei 95°C, wurde die DNA in 30 Zyklen mit den folgenden Konditionen amplifiziert:

Denaturierung 95°C 10 min

Annealing 58°C 30 sec

Elongation 72°C 1 min

Nach Beendigung des letzten Zyklus schloss sich ein 10-minütiger finaler Syntheseschritt bei 72°C an, wonach die Probe bei 4°C gekühlt wurde.

Folgende Primer wurden verwendet (5’→ 3’):

Forward-Primer (BspHI-hHAX1):

5’- TCA TGA GCC TCT TTG ATC TCT T-3’ (BspHI- Restriktionsschnittstelle) Reverse-Primer (3’FLAG-hHAX1):

5’- GGA TCC CTA CTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA ATC CCG GGA CCG GAA CCA ACG-3’(BamH1-Restriktionsschnittstelle, FLAG)

2.1.1.3. Agarose-Gelelektrophorese

Mit Hilfe eines Agarosegels können DNA-Fragmente elektrophoretisch aufgetrennt werden.

Das Anlegen eines elektrischen Feldes bewirkt, dass die aufgrund ihrer Phosphatgruppen nega- tiv geladenen DNA-Fragmente zum Pluspol wandern, so dass eine Auftrennung nach ihrer Grö- ße erfolgt. Je nach Größe der erwarteten Fragmente wurden 0,7- 1,5% Gele (Biozym, Hess.

Oldendorf) angesetzt mit 0,05% Ethidiumbromid (AppliChem, Darmstadt) versetzt. Ethidi- umbromid ist ein roter Phenantridin Farbstoff, der sich in die DNA interkaliert. Als Laufpuffer wurde 1× TBE-Puffer (Tris-Borat-EDTA) verwendet. Die HAX1-cDNA wurde mit 1× Ladepuf- fer auf ein 1%-iges Agarosegel aufgetragen und die Elektrophorese fand bei einer Spannung von 13 V/cm statt. Anhand eines mitlaufenden Markers (100 bp-Leiter, PEQLAB; 1 kb-Leiter, New England Biolabs) konnten die Größen der Fragmente unter UV-Licht bestimmt werden.

2.1.1.4. Isolation und Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarose- Gelen

Das gewünschte Fragment wurde mit einem DNA-Marker identifiziert, mit einem Skalpell aus- geschnitten und in ein Eppendorfröhrchen überführt. Mittels des QIAquick Gel Extraction Kits (QIAGEN, Hilden) wurde nach Anweisungen des Herstellers die DNA aus dem Gelstück eluiert und aufgereinigt. Das Aufreinigungsprinzip basiert auf der Bindung der DNA an eine Silikon- membran. Die Konzentration der DNA wurde im Anschluss photometrisch bestimmt (2.1.1.5).

2.1.1.5. Photometrische Quantifizierung von Nukleinsäuren und Proteinen in Lösung

Die Konzentration von Nukleinsäuren und Proteinen wurde mit einem Spektrophotometer (Ep- pendorf) bestimmt. Die Proben wurden in unterschiedlichen Verdünnungsstufen mit dH₂O in einer Quarzküvette gemessen, nachdem das Photometer zuvor mit einer Leerwertmessung mit dH₂O eingestellt wurde. Die Messung erfolgte mit UV-Licht bei einer Wellenlänge von 260 nm für Nukleinsäuren und 595 nm für Proteine nach der Bradford-Methode (2.1.3.5). Dabei ent- spricht eine Extinktion von 1 OD (optische Dichte) bei 260 nm etwa 50 g/ml Doppelstrang- DNA oder 30 µg/ml Oligonukleotid.

2.1.1.6. Ligation in Vektor pGEM-T

Das PCR-Produkt wurde in den Vektor pGEM-T (Promega, Madison, WI, USA) subkloniert.

Der pGEM-T-Vektor besitzt an seinen 5´-Enden Thymidinüberhänge, welche von der T4-DNA- Ligase (New England Biolabs, Frankfurt/Main) mit den Adenosinüberhängen, die von der Taq- Polymerase (Roche, Mannheim) am PCR-Produkt generiert wurden, verknüpft werden.

Das Insert wurde mit Hilfe der folgenden Formel für den Einbau in den Vektor optimiert:

[ ] [ ]

[ ]

[ ]

Vektor Insert Ratio kb

Vektor

kb Insert ng

Vektor

=

× ×

Die Ligation wurde mit 50 ng Vektor-DNA, einem dreifachen molaren Überschuss des zu klo- nierenden DNA-Fragmentes (43 ng) und einer Einheit T4-DNA-Ligase in dem vom Hersteller mitgelieferten Reaktionspuffer durchgeführt. Der Ansatz wurde über Nacht bei 4°C inkubiert.

2.1.1.7. Kultivierung von E.coli-Bakterien

Die Anzucht von E.coli-Bakterien erfolgte in LB-Medium (Luria-Bertani-Medium). Die Bakte- rien wurden über Nacht bei 37 °C unter Zusatz von 100 µg/ml Ampicillin inkubiert. Vorkultu- ren wurden mit einer Kolonie einer LB-Agar-Platte angeimpft. Die Zusammensetzung von LB- Medium und LB-Agar-Platten wird in 2.2.3 beschrieben.

2.1.1.8. Transformation von E.coli-Zellen

Die Transformation wurde mit chemisch kompetenten XL10-Gold E.coli-Bakterien durchge- führt (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Kompetente Bakterien sind chemisch (z.B. mit Kalzium- chlorid) oder auch elektrisch behandelte Bakterien, die in der Lage sind, freie DNA aus dem Medium aufzunehmen. Die bei -80°C gelagerten Bakterien wurden auf Eis aufgetaut und 50- 200 ng Plasmid mit 50 µl Bakterien gemischt und für 30 min inkubiert, wodurch sich das Plas- mid an die Bakterienmembran anlagerte. Ein Röhrchen ohne Zugabe von Plasmid diente als Negativkontrolle. Im nächsten Schritt wurde das Gemisch für exakt 2 min bei 42°C erhitzt (Hit- zeschock) und dann sofort 2 min auf Eis inkubiert. Dadurch wurde die Permeabilität der Bakte- rienmembran erhöht und die DNA von den Bakterien aufgenommen. Anschließend wurden die Bakterien bei 37°C 1 h in 200 l LB-Medium bei leichtem Schütteln inkubiert. Der Transforma- tionsansatz wurde auf einer LB-Ampicillin-Agarplatte ausgestrichen und bei 37°C über Nacht inkubiert (2.1.1.7). Der Vektor pGEM-T verleiht den Bakterien durch das β-Laktamase-Gen Ampicillin-Resistenz, so dass nur Bakterien, die den Vektor aufgenommen haben, auf der Platte wachsen. Dadurch werden sie von den anderen selektiert.

2.1.1.9. Plasmidpräparation

Die Plasmid Mini-Präparation erfolgte nach dem Prinzip der alkalischen Lyse nach Maniatis (Maniatis, 1982). Die verwendeten Lösungen werden unter 2.2.3 aufgeführt.

Eine Einzelkolonie wurde in LB-Medium mit 0,1 g/ml Ampicillin überführt und bei 37°C auf einem Schüttler (CERTOMAT^®HK, B.Braun Biotech international, Melsungen) bei 250 rpm über Nacht inkubiert. Von der Kultur wurden 1,5 ml in ein Eppendorfröhrchen überführt. Der Rest der Kultur wurde bei 4°C gelagert. Der Überstand wurde pelletiert (30 sec, 12.000 g) und es folgte die alkalische Lyse der Bakterien. Das Pellet wurde erst in 100 l der eiskalten Lösung 1 resuspendiert und mit 200 l der Lösung 2 durch schnelles Umdrehen des Röhrchens ge-

mischt. Zur Neutralisation wurde 150 l der eiskalten Lösung 3 hinzupipettiert und 10 sec ge- mixt. Nach der Lagerung für 3 - 5 min auf Eis wurden die Zelltrümmer bei 12.000 g für 2 min abzentrifugiert und der Überstand in ein neues Röhrchen überführt. Das Pelletieren wurde ein- mal wiederholt. Um die Nukleinsäuren von den Proteinen in der Probe zu trennen, wurde der Überstand mit der Plasmid-DNA unter dem Abzug (Heraeus, Osterode) mit 450 l Phenol- Chloroform versetzt und 2 min bei 12.000 g zentrifugiert. Phenol und Chloroform denaturieren Proteine, die sich daraufhin in der Phenol-Phase anreichern, weil Phenol durch hydrophobe Wechselwirkungen Aminosäureseitenketten bindet. Die denaturierten Proteine und Membran- bestandteile wurden von der Plasmid-haltigen oberen Phase getrennt, die in ein neues Eppen- dorfgefäß überführt wurde. Die DNA wurde mit 2 Vol Ethanol bei Raumtemperatur (RT) ge- fällt, 2 min inkubiert und schließlich bei 12.000 g 5 min abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Im letzten Schritt wurde die Plasmid-DNA in 30 - 50 l dH2O gelöst und bei -20°C gelagert.

2.1.1.10. Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen

Die Identität des Vektors wurde mittels einer Restringierung mit EagI (Fermentas, St.Leon-Rot) überprüft. EagI besitzt zwei Schnittstellen links und rechts der MCS (multiple cloning site) des pGEM-T-Vektors, so dass nach Restringierung festgestellt werden konnte, ob das PCR-Produkt im Vektor inseriert war. Es wurden dafür 2,5 U EagI, 150 ng Plasmid, der vom Hersteller ange- gebene Puffer und dH2O in einem Gesamtvolumen von 20 µl 3 h bei 37°C inkubiert. Darauf folgte die Analyse der Restriktionsfragmente in einem Agarosegel (2.1.1.3).

2.1.1.11. Sequenzierung von 3’FLAG-hHAX1 und Maxi-Präparation

Um PCR-bedingte Mutationen in der HAX1-cDNA auszuschließen, wurden zur Verifizierung positive Klone mittels Sequenzierung überprüft. Die Sequenzierungen wurden freundlicherwei- se von der Arbeitsgruppe Germershausen (MHH) durchgeführt. Das Ergebnis wurde mit der HAX1- und FLAG-Sequenz aus der Literatur verglichen (HAX1-GenID 10456) (Klein et al., 2007). Ein Klon, der frei von Mutationen war, wurde mit Hilfe einer Maxi-Präparation verviel- fältigt. Die Maxi-Präparation erfolgte nach Angaben des Herstellers mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN, Hilden).

2.1.1.12. Ligation in den finalen retroviralen Vektor

Der Vektor pMMP-IRES-CD24 wurde freundlicherweise G. Köhne (AG Klein) zur Verfügung gestellt. Die 3’FLAG-HAX1-cDNA wurde mit BspHI/BamHI aus pGEM-T exzisiert und in den mit NcoI/BamHI geöffneten Vektor pMMP-IRES-CD24 inseriert.

Für die Linearisierung des Vektors pMMP-IRES-CD24 wurde 10 U NcoI, 5 U BamHI, 8,5 µg Plasmid, ein an die Restriktionsenzyme angepasster Puffer und die entsprechende Menge BSA (Bovines Serumalbumin) mit dH₂O auf 30 µl Endvolumen aufgefüllt. Der Verdau wurde über