3. Ergebnisse
3.1. Charakterisierung des Konstrukts pMMP-HAX1-FLAG-IRES-CD24
3.1.1. Generierung der FLAG-getaggten HAX1-cDNA
Es wurde für die subzelluläre Lokalisation des HAX1-Proteins zunächst ein Protein-getaggtes HAX1-Konstrukt hergestellt, um exogenes HAX1 indirekt durch die Markierung mit einem Antikörper gegen das Protein-Tag nachzuweisen. Der direkte Nachweis von endogenem HAX1 durch einen HAX1-Antikörper brachte keine Erfolge, da sich keine spezifischen Bindungen in Normalspender-Fibroblasten im Vergleich zur Kontrollgruppe der HAX1-defizienten Patienten-Fibroblasten fluoreszenzmikroskopisch nachweisen ließen (nicht gezeigt). Es wurde ein FLAG-Tag, das sich mittels kommerziell erhältlicher Antikörper u.a. im Western Blot und in der Im-munhistochemie nachweisen lässt, verwendet. Die Generierung des 3’FLAG-HAX1 Konstrukts erfolgte mittels PCR (2.1.1.2). Über den Forward-Primer wurde eine BspHI-Schnittstelle am 5´-Ende der cDNA eingebracht und über den Reverse-Primer das FLAG-Tag sowie eine BamHI-Schnittstelle an das 3´-Ende. Zudem fügte die Polymerase Adenosin-Überhänge am 3’- und 5’-Ende hinzu. Das PCR-Produkt wurde in den mit Thymidin-Überhängen versehenen Expressi-onsvektor pGEM-T ligiert (2.1.1.5) und die generierten Subklone mittels Restriktionsanalyse mit EagI und Sequenzierung überprüft. Die FLAG-getaggte HAX1-cDNA von 864 bp wurde durch Restringierung mit BspHI und BamHI aus den generierten Sub-Klonen gewonnen und in den mit NcoI und BamHI linearisierten retroviralen pMMP-IRES-CD24-Vektor ligiert (Abbildung 6). Die generierten Klone (pMMP-HAX1-FLAG) wurden in einer Restriktionsana-lyse mit den Enzymen ApaI und XmaI überprüft.
NcoI BamHI
LTR IRES LTR
HAX1 FLAG
BspHI5‘ 3‘BamHI
CD24
Abbildung 6: Schema des retroviralen Vektors pMMP-IRES-CD24 und der FLAG-getaggten HAX1-cDNA. Der pMMP-IRES-CD24-Vektor ist ein retroviraler Vektor der von dem MoMLV (Molo-ney murine leukaemia virus) abgeleitet ist (Shinnick et al., 1981). Der retrovirale Vektor enthält keine
viralen Strukturproteine (Gag, Pol, Env). Diese müssen zusätzlich beispielsweise von einer Produzenten-zelllinie zur Verfügung gestellt werden, um ein funktionstüchtiges Virus bilden zu können. Da diesem jedoch die genetischen Informationen der Strukturproteine fehlen, kann es nur einmalig eine Zelle infizie-ren und ist replikationsinkompetent. Der Vektor besitzt eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES), die die Translation des bicistronischen Transkripts ermöglicht. Bei dem murinen CD24-Marker ist die zy-toplasmatische Domäne deletiert, so dass es zu keiner Signalübertragung kommen kann. Der CD24-Marker dient zur Identifizierung transduzierter Zellen und kann mittels Anfärbung mit einem FITC-markierten anti-murinen CD24-Antikörper im FACS (2.1.3.1) nachgewiesen werden. In der Abbildung sind zudem die dazugehörigen Restriktionsseiten dargestellt. LTR (Long terminal repeat)
3.1.2. Nachweis der CD24-Expression auf transduzierten HT1080-Zellen
Für die funktionellen Analysen des retroviralen Vektors wurde überprüft, ob funktionstüchtige virale Partikel gebildet werden können. Dazu wurden Zellen stabil mit pMMP-HAX1-FLAG transduziert und auf Expression des trunkierten CD24-Oberflächenmoleküls getestet.
HT1080-Zellen wurden mit unterschiedlichen Verdünnungen der retroviralen Überstände von pMMP-HAX1-FLAG infiziert (2.1.2.2 - 2.1.2.3) und nach 48 h auf die Expression des CD24-Markers mittels FACS überprüft (2.1.3.1). Die FACS-Analyse der Virustitration ist in Abbildung 7 dargestellt. Bei der Analyse ist eine Fluoreszenzverschiebung der transduzierten im Vergleich zu den nicht transduzierten Zellen ersichtlich. Die Verschiebung nimmt mit Zu-nahme der Viruskonzentration zu. Als Maß für die relative Transduktionseffizienz wurde der prozentuale Anteil der CD24-exprimierenden Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen ange-geben. Bei einer 1:1 Verdünnung waren annähernd alle Zellen CD24-positiv. Aus dem Ergebnis lässt sich schließen, dass aus dem retroviralen Vektor funktionstüchtige virale Partikel gebildet werden können.
Fluoreszenzintensität
Zellzahl
50,23% 88,23% 98,53% 99,43%
1:30 1:10 1:3 1:1
Abbildung 7: Virustitration mit HT1080 Zellen. 48 h nach Transduktion von HT1080-Zellen mit pMMP-HAX1-FLAG wurden die Zellen mit einem FITC-Anti-CD24-Antikörper markiert und durch-flusszytometrisch untersucht. Die Ergebnisse der unterschiedlichen Verdünnungen des viralen Überstands sind in abnehmender Verdünnungsstufe von links nach rechts dargestellt. In grau ist die nicht transdu-zierte Kontrollpopulation dargestellt und in schwarz die transdutransdu-zierten HT1080-Zellen. Die Diagramme stellen die Fluoreszenzintensität (Abzisse) der Zellzahl (Ordinate) gegenüber. Die Prozentangaben bezie-hen sich auf den Anteil der erfolgreich transduzierten Zellen.
3.1.3. Transduktion der Zielzellen mit pMMP-HAX1-FLAG
Für die mikroskopischen Experimente wurden HeLa-Zellen und Fibroblasten von Normalspen-dern und HAX1 defizienten Patienten mit pMMP-HAX1-FLAG mit einer MOI (multiplicity of
infection) von 50 transduziert. Es sollte zunächst überprüft werden, ob die Zielzellen auch er-folgreich mit dem Virusüberstand infiziert werden können. Der Nachweis der CD24-Expression konnte ebenfalls in diesem Zelltyp durch eine 48 h nach Transduktion durchgeführte FACS-Analyse erbracht werden (nicht gezeigt). Um mit einer reinen Zellpopulation zu arbeiten, wur-den die CD24-positiven Zellen mit einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer sortiert (2.1.3.1) und für die sich anschließenden Experimente expandiert. Die Reinheit der Sortierung wurde mittels FACS überprüft (Abbildung 8) und betrug für Normalspender (ND)-Fibroblasten 86,48%, Patienten-Fibroblasten 93,18% und für HeLa-Zellen 93,95%.
Fluoreszenzintensität
Zellzahl
ND Patient HeLa
Abbildung 8: FACS-Analyse nach Sortierung der transduzierten Fibroblasten und HeLa-Zellen.
(ND) Normalspender-Fibroblasten; (Patient) Patienten-Fibroblasten; (HeLa) HeLa-Zellen. Nach Trans-duktion und Separation wurden die Zellen mit einem FITC-gekoppelten Antikörper gegen murines CD24 markiert und im Vergleich zu nicht transduzierten Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Im Histogramm ist in grau die nicht transduzierte Kontrollpopulation dargestellt. Die schwarze Linie stellt die CD24-Expression dar.
3.1.4. Nachweis der HAX1-Expression in CD24-positiven Zellen
Nach dem Nachweis des Oberflächenmarkers CD24 sollte die Expression des FLAG-HAX1-Fusionsproteins in den Zellen überprüft werden. Um dieses nachzuweisen, wurde ein Western Blot (2.1.3.6) der transduzierten Zellen mit einem HAX1- und FLAG-Antikörper durchgeführt.
35 kDa
35 kDa
untr. transd. Pat ND Pat ND HeLa
transduzierte
Fibroblasten Fibroblasten
HAX-1
FLAG 35 kDa
35 kDa
Abbildung 9: Western Blot-Analyse von transduzierten HeLa-Zellen, Patienten- und Normalspen-der-Fibroblasten. Es wurden 25 µg des Proteinlysats der Fibroblasten und HeLa-Zellen durch denaturie-rende Gelelektrophorese in einem 10%igen SDS-Gel aufgetrennt und mittels Nass-Blot-Verfahren auf
eine PVDF-Membran geblottet. Die Detektion der Proteine wurde mit einem Anti-HAX1 (1:250) und polyklonalen Anti-FLAG Antikörper (1:1000) durchgeführt. (Pat) Patienten-Fibroblasten; (ND) Normal-spender-Fibroblasten; (transd.) transduzierte, (untr.) untransduzierte HeLa-Zellen.
Wie auf dem oberen, mit HAX1-Antikörper gefärbten Blot zu erkennen ist, konnte ein Signal bei 35 kDa detektiert werden (Abbildung 9). Bei der untransduzierten Kontrolle, den Patienten-Fibroblasten, konnte kein Signal nachgewiesen werden. Auch bei den Normalspender-Fibroblasten ist keine Bande zu erkennen, obwohl sie endogenes HAX1 exprimieren. Auf dem mit Anti-FLAG inkubierten Blot (unterer Blot) zeigten sich aufgrund des polyklonalen Antikör-pers viele unspezifische Banden, jedoch an der Stelle des erwarteten Fusionsproteins, ist nur eine Bande in den transduzierten Zellen auf der Höhe 35 kDa zu erkennen (Spur 2-4). Aus die-sen Beobachtungen wird deutlich, dass sich das Fusionsprotein mit beiden Antikörpern bei 35 kDa nachweisen lässt. Allerdings ist die Sensitivität des Anti-FLAG-Antikörpers höher, da FLAG nur durch die Einbringung des Konstrukts in die Zelle exprimiert werden kann und nicht endogen gebildet wird.