Zellbiologische Methoden

2.1.2.1. Zellkultur

Für die Experimente dieser Doktorarbeit wurden Fibroblasten-, HeLa-, HT1080-, 293T- und 293GPG-Zelllinien verwendet, die alle adhärent wachsen. Die verwendeten Medien werden in 2.2.4 beschrieben. Die Zellkultur wurde unter sterilen Bedingungen in Sicherheitsbänken der Klasse 1 und 2 (Herasafe, Heraeus, Osterode) durchgeführt. Die Kultivierung der Zellen wurde in Zellkulturflaschen (Sarstedt, Nümbrecht) in Brutschränken (Labotec C200, Göttingen; Ther-mo Forma, Waltham, MA, USA) mit 5% CO2 bei 37°C durchgeführt. Die Zellen wurden bei einer Konfluenz von ca. 90% in einem Verhältnis von 1:5 gesplittet und jeden zweiten bis drit-ten Tag wurde das Medium gewechselt. HeLa-Zellen wurden aufgrund ihres schnelleren Wachstums in einem Verhältnis von 1:10 gesplittet. Unter dem Lichtmikroskop wurde die Kon-fluenz und Morphologie überprüft und eine mögliche Kontamination ausgeschlossen.

Für das Passagieren der Zellen wurden diese nach dem Waschen mit PBS (Phosphate buffered saline) kurz mit Trypsin inkubiert (3 min, 37°C). Das Trypsin wurde durch Zugabe von Medi-um inaktiviert und die Zellen pelletiert (210 x g, 5 min). Die Zellen wurden in MediMedi-um re-suspendiert und je nach Zellart in unterschiedlichen Verdünnungen in eine mit Medium befüllte Flasche überführt.

Die Zellen wurden zum Einfrieren erst trypsinisiert und zentrifugiert und dann im Verhältnis 1:10 mit DMSO in FCS (Fetal calf serum) resuspendiert. Darauf folgte die Überführung in ein Cryoröhrchen (Greiner Bio-One, Frickenhausen), das in einem Freezingboy (Nalgene,

Roches-ter, NY, USA) langsam auf -80°C gekühlt wurde. Die langfristige Lagerung fand bei -196°C im Stickstofftank statt.

Zum Auftauen der Zellen wurden diese erst im Wasserbad bei 37°C angetaut. Die Zellen wur-den in etwas Medium resuspendiert und in ein 15 ml Röhrchen, welches schon Medium enthielt, überführt. Anschließend wurden die Zellen 5 min bei 210 x g und RT zentrifugiert, um das DMSO, in dem die Zellen gelagert wurden, zu entfernen. Das Pellet wurde nach Resuspension mit Medium in Zellkulturflaschen gegeben.

Zur Bestimmung der Zellzahl wurden die resuspendierten Zellen mit Trympanblau (1:10) ge-mischt und unter dem Lichtmikroskop in einer geeichten Neubauer-Zählkammer gezählt. Die lebenden Zellen nahmen die blaue Farbe nicht an und konnten deshalb gegen den dunklen Hin-tergrund gezählt werden. Anschließend wurde die Zellzahl pro ml mit der folgenden Formel

Die Fibroblasten und HeLa-Zellen wurden für die Immunhistochemie in 6-Loch-Platten kulti-viert. Dazu wurden 4-5 runde Glasplättchen in die Vertiefungen der Platte gelegt, auf die 10⁵ Zellen und Medium gegeben wurde. Die Zellen wurden 48 h inkubiert, danach fixiert und ge-färbt.

Tabelle 2: Zellkulturzellen

Fibroblasten Humane Bindegewebszellen, die aus Hautstanzen von einem Normalspender und einer HAX1-defizienten Patientin gewonnen wurden. Sie wurden mit viralen Über-ständen von pMMP-HAX1-FLAG-IRES-CD24 transduziert und anschließend für mikroskopische Untersuchungen, Western Blot, ELISA und FACS-Analyse verwen-det.

HeLa-Zellen Humane Epithelzellen des Zervixkarzinoms einer Patientin (Henrietta Lacks). Die Zellen wurden für Mikroskopie, Western Blot, und FACS-Analyse genutzt.

HT1080 Humane Fibrosarkom Zellen, die zur Bestimmung des Virustiters verwendet wur-den.

(HEK) 293T Humane embryonale Nierenzellen (Human embryonic kidney-HEK), die mit dem humanen Adenovirus 5 transformiert worden sind und das SV40T Antigen, ein On-kogen, exprimieren. Sie wurden zum Erlernen der Mikroskopiertechniken verwen-det.

293GPG Retrovirale Verpackungszelllinie, abgeleitet von HEK293-Zellen. Die Zellen enthal-ten Gene, welche für die Produktion von retroviralen Partikeln benötigt werden.

Diese Gene (gag, pol, env) stammen von MLV (murine leukemia virus). Außerdem enthalten die Zellen das Hüllprotein G (vesicular stomatitis virus G). Da

VSV-G für die 293VSV-GPVSV-G-Zellen toxisch ist, wurde das VSV-Gen unter einen Tetrazyklin-regulierbaren Promotor gestellt. Durch Gabe von Tetrazyklin in das Medium, kann die Produktion des Hüllproteins abgeschaltet werden. (Ory et al., 1996)

2.1.2.2. Transfektion von 3’FLAG-HAX1 in HeLa-Zellen

Für die Produktion retroviraler Überstände wurden 293GPG-Zellen mittels Kalziumphosphat Präzipitation transient transfiziert (Bacchetti und Graham, 1977). Die Zusammensetzung der Puffer ist in 2.2.3 aufgeführt.

293GPG-Zellen wurden in 175 cm² Flaschen bis zu einer Konfluenz von 60% in Tetrazyklin-haltigem DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) kultiviert, um die VSV-G-Expression zu unterdrücken. Für die Transfektion wurden in zwei Röhrchen folgende Lösungen angesetzt:

In dem ersten Röhrchen A wurden 25 µg des Transfer Vektor und 147 µl 2 M CaCl₂ mit Low TE-Puffer bis zu 1,2 ml aufgefüllt und gut vermischt. Das Röhrchen B enthielt 1,2 ml 2x HBS (pH= 7,2). Der Inhalt des Röhrchens A wurde Tropfen für Tropfen zu dem Gemisch B dazuge-geben, in welches Luftblasen pipettiert wurden. Dadurch wurde die Plasmid-DNA an das ausge-fällte Calciumphosphat gebunden. Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei RT wurde das Medium der 293GPG-Zellen ausgetauscht und der Mix aus A und B tröpfchenweise zu den Zellen gegeben. Nach 12 h bei 37°C wurden die Zellen mit PBS gewaschen und 25 ml neues Tetrazyklin-freies Medium hinzugegeben. Innerhalb der 12 h hatten die 293GPGs das an das Calciumphosphat gebundene Plasmid durch Endozytose aufgenommen. Die Zellen wurden dar-aufhin 24 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde das Medium gegen frisches Tetrazyklin-freies Medium ausgetauscht. Alle 24 h wurde das Medium gewechselt und der Virusüberstand gesammelt. Der Überstand wurde erst bei 4°C gelagert und anschließend, um Zelltrümmer zu entfernen, mittels eines Filters (Millipore, USA) filtriert und bei -80°C gelagert.

Der virale Titer der Überstände wurde mit Hilfe von HT1080-Zellen bestimmt. Es wurden 5×10⁴ HT1080-Zellen pro Loch einer 6-Loch-Platte pipettiert und mit Medium aufgefüllt. Nach 4-6 h Inkubation bei 37°C wurde der Überstand abgenommen und durch Virusüberstand in un-terschiedlichen Verdünnungsstufen (1:1, 1:3, 1:10, 1:30) und 8 µg/ml Polybrene (Sigma; Dei-senhofen) ersetzt (Klein et al., 2000). 24 h nach der Transduktion wurden die Überstände durch frisches Medium ausgetauscht und weitere 48 h inkubiert. Danach wurden die Zellen mit einer FACS-Analyse (2.1.3.1) auf die Expression des CD24-Markers mit FITC-Anti-Maus-CD24-Antikörper [1:1500] (BD Pharmigen) überprüft. Die „Plaque Forming Unit“ (PFU) des Virus und die “multiplicity of infection“ (MOI) wurden mit folgenden Formeln berechnet.

Loch

Zellzahl

Für die mikroskopischen Experimente wurden Fibroblasten von einem gesunden Spender, einer HAX1-defizienten Patientin und HeLa-Zellen mit den retroviralen Überständen von pMMP-HAX1-FLAG-IRES-CD24 stabil transduziert. Die Transduktion der Zielzellen fand nach dem folgenden Protokoll statt. Einen Tag vor der Transduktion wurden 5×10⁵ Zellen in die oberen und 2×10⁶ Zellen in die unteren drei Löcher einer 6-Loch-Platte gegeben. Am nächsten Tag wurde das Medium entfernt und unterschiedliche Verdünnungen des Virusüberstands (1:2; 1:3) in Anwesenheit von 0,8 µg/ml Polybrene auf die Zellen gegeben. Zwei Löcher wurden als Kon-trollen nur mit Medium gefüllt. Nach 24 h wurden alle Zellen in frisches Medium überführt und weitere 48 h im Brutschrank inkubiert. Am dritten Tag wurde die Transduktionseffizienz mittels einer FACS-Analyse (2.1.3.1) anhand der CD24-positiven Zellen bestimmt. Die Zellen mit der höchsten Transduktionseffizienz wurden expandiert.