3. Ergebnisse
3.4. Auswirkungen auf die Lokalisation von HAX1 bei Apoptoseinduktion in
Bisher konnte nachgewiesen werden, dass HAX1 in HeLa-Zellen und Fibroblasten in den Mito-chondrien lokalisiert ist. Es sollte nun überprüft werden, ob sich die Lokalisation von HAX1 unter Stressbedingungen ändert. Eine Translokation in den Nukleus würde auf eine Rolle von HAX1 bei der Regulation von Genen als Transkriptionsfaktor während der Apoptose hinweisen.
Apoptose kann durch viele unterschiedliche Stimuli ausgelöst werden. Zu den Stimuli gehören neben physikalischen Reizen wie γ-, UV-Strahlung und Hitze auch Chemotherapeutika, Tumor-Suppressorgene wie p53, Wachstumsfaktorentzug, Toxine, Infektionen, TNF-α und APO-1 (Sachs und Lotem, 1993; Reed, 1994). Für die Apoptoseinduktion in den folgenden Experimen-ten wurden unterschiedliche Methoden angewandt (2.1.3.4): Wachstumsfaktorentzug (FCS-Deprivation), Stimulation mit einem Proteinkinaseinhibitor (Staurosporin) und einem
Anthra-cyclin-Antibiotikum (Doxorubicin). Zwar haben die genannten Stimuli verschiedene primäre Angriffspunkte, um Apoptose auszulösen, aber alle führen über den intrinsischen/ mito-chondrialen Weg mit der Freisetzung von Cytochrom c zu Apoptose (Green und Reed, 1998).
Nach der Exposition gegenüber apoptotischen Reizen wurde eine indirekte Immunfluoreszenz mit dem FLAG-Antikörper und DAPI zur Färbung des Kerns in transduzierten HeLa-Zellen durchgeführt. Die Apoptoseeinleitung wurde durch Kondensation des Kerns in der DAPI-Färbung und Änderung der Morphologie durch Adhärenzverlust festgestellt. Die HAX1-Lokalisation wurde vor und nach der Induktion fluoreszenzmikroskopisch verglichen. Die Er-gebnisse der unterschiedlichen Methoden sind im Folgenden dargestellt.
3.4.1. Einleitung der Apoptose mit Staurosporin
Abbildung 20: HAX1-Lokalisation nach Staurosporin-Stimulation. Transduzierte HeLa-Zellen wur-den 20 h mit 1 µM Staurosporin (ST) stimuliert (E-H). Zu verschiewur-denen Zeitpunkten der Stimulation wurden Zellen fixiert und FLAG-HAX1 markiert (detektiert mit Alexa Fluor 488, grün). Der Zellkern wurde mit DAPI (blau) nachgewiesen. Als Kontrolle dienten unstimulierte HeLa-Zellen (A-D), die zu den gleichen Zeitpunkten fixiert und gefärbt wurden. Türkis zeigt die Kolokalisation von HAX1 mit dem Nukleus. (Vergrößerung: 64x)
Die Stimulation mit dem Proteinkinaseinhibitor Staurosporin zeigte schon nach 2 h, dass die HeLa-Zellen zunehmend durch die fehlenden zytoplasmatischen Ausläufer kugeliger wurden (vergleiche Abbildung 20 E und F). Außerdem verklumpten die Zellen und bildeten Aggregate von mehreren Dutzend Zellen, was erste Anzeichen für die beginnende Apoptose sind. Die grü-ne Fluoreszenz von HAX1 ist zu allen betrachteten Zeitpunkten im Zytoplasma zu erkengrü-nen, jedoch gibt es auch fluoreszierende Anteile im Nukleus. Durch die morphologischen Verände-rungen der Zelle nach der Apoptoseinduktion kann jedoch fluoreszenzmikroskopisch über eine mögliche Translokation in den Kern keine eindeutige Aussage getroffen werden. Die Kolokali-sation von HAX1 und dem Zellkern könnte bei den kugeligen Zellen auch bedeuten, dass
auf-A B C D
2 h 6 h 20 h
E F G H
0 h –ST
+ST
grund des geringen Zytoplasmasaums HAX1 entweder im Zellkern oder über dem Zellkern im Zytoplasma lokalisiert ist.
3.4.2. Einleitung der Apoptose durch FCS-Deprivation
Abbildung 21: HAX1-Lokalisation in Zellen nach FCS-Deprivation. Transduzierte HeLa-Zellen wurden 12 h mit serumfreien Medium inkubiert. Anschließend wurden die HeLa-Zellen fixiert und FLAG-HAX1 mit einem Anti-FLAG-Antikörper markiert (detektiert mit Alexa Fluor 488, grün). Der Zellkern wurde mit DAPI (blau) nachgewiesen. Als Kontrolle dienten unstimulierte HeLa-Zellen. Der Pfeil stellt eine repräsentative Zelle dar (Vgl. unten). Türkis zeigt die Kolokalisation von HAX1 und dem Nukleus. (Vergrößerung: 64x)
Die Ergebnisse der Apoptoseinduktion mittels Serummangel sind in Abbildung 21 dargestellt.
Durch fehlende Wachstumsfaktoren und Mitogene aus dem Serum wurde in den Zellen Apopto-se eingeleitet. Nach zwölf Stunden zeigte sich kein signifikanter Unterschied zu den Kontroll-zellen und morphologische Veränderungen wie bei der Staurosporin Behandlung konnten nur in schwach ausgeprägter Form festgestellt werden. Im letzten Bild der Abbildung 21 ist eine re-präsentative Zelle dargestellt, die noch zytoplasmatische Ausläufer besitzt (Pfeil). HAX1 ist in dieser Zelle sehr geringfügig im Nukleus lokalisiert im Gegensatz zu den kugeligen Nachbarzel-len. Die Lokalisation im Kern ist demnach nur bei den Zellen festzustellen ist, die ein kugeliges Aussehen haben. Jedoch ist durch die Zweidimensionalität der Aufnahme keine exakte Aussage möglich, ob sich HAX1 vor oder im Zellkern dieser Zellen befindet. Auch in diesem Modell der Apoptoseinduktion durch FCS-Deprivation konnte keine eindeutige Translokation von HAX1 in den Nukleus festgestellt werden.
Kontrolle
FCS-Deprivation
DAPI FLAG merge
DAPI FLAG merge
3.4.3. Einleitung der Apoptose mit Doxorubicin
Abbildung 22: HAX1-Lokalisation in HeLa-Zellen nach sechsstündiger Doxorubicin-Stimulation.
Transduzierte HeLa-Zellen wurden mit 2 µM Doxorubicin stimuliert und nach 2, 4, 6, 10 und 24 h fixiert.
Die Immunfluoreszenzfärbung für FLAG-HAX1 wurde mit einem Anti-FLAG-Antikörper durchgeführt (detektiert mit Alexa Fluor 488, grün). Der Zellkern wurde mit DAPI (blau) nachgewiesen. Türkis zeigt die Kolokalisation von HAX1 und dem Nukleus. Exemplarisch ist eine Zelle in unterschiedlichen Ebenen des Zellkerns 6 h nach Doxorubicin-Exposition dargestellt (A-C). Der Pfeil in C zeigt FLAG-HAX1-Signale in Zellkernnähe (Vgl. unten). In D sind ebenfalls nach sechsstündiger Stimulation mehrere Zellen dargestellt. (Vergrößerung in A-C: 100x; D: 64x)
Durch Stimulation mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin (Exzitation: 480 nm, Emission:
575 nm), welches in die DNA interkaliert und die Topoisomerase II inhibiert, ließ sich schon nach einer Stunde lichtmikroskopisch eine rote Färbung der Zellen feststellen, die bei längerer Doxorubicin-Exposition an Intensität zunahm. Fluoreszenzmikroskopisch nahm zunächst die Färbung des Kerns im roten Cy3-Kanal mit steigender Expositionszeit zu, bis schließlich nach zehn Stunden die gesamte Zelle ein rotes Signal abgab (nicht gezeigt). Außerdem veränderten sich die Zellen morphologisch dahingehend, dass sich ihre Ausläufer rundlich aufblähten. Diese Veränderungen bestätigen, dass die Zellen apoptotisch wurden. Eine repräsentative Zelle ist in
DAPI FLAG merge
DAPI FLAG merge
DAPI FLAG merge
DAPI FLAG merge
A
B
C
D
Abbildung 22 nach sechs Stunden Stimulation dargestellt. Da die Frage nach der nukleären Translokation von HAX1 aus den Vorexperimenten noch nicht eindeutig beantwortet werden konnte, wurde diese Zellen in einer 100-fachen Vergrößerung in verschiedenen Fokusebenen aufgenommen (Abbildung 22, A-C), um der Dreidimensionalität der Zelle gerecht zu werden.
In den letzten drei Bildern der Einzelzelle (C) befindet man sich oberhalb der Fokusebene des Nukleus, da er nur noch unscharf abgebildet ist. Die FLAG-HAX1-Signale sind nur in diesen Bildern an der gleichen Stelle wie der Nukleus zu erkennen (Pfeil). Dies spricht für die Beo-bachtungen aus den anderen Modellen der Apoptoseinduktion. Die scheinbar vermehrte nukleä-re Lokalisation von HAX1 in den runden, apoptotischen Zellen stellt sich heraus als Lokalisati-on über bzw. unterhalb des Zellkerns, wie die Bildfolge A-C verdeutlicht.
Zusammenfassend zeigt sich, dass sich durch Exposition der HeLa-Zellen mit unterschiedlichen apoptotischen Reizen keine Translokation von HAX1 in den Zellkern nachweisen ließ.