2. Material und Methoden
2.1. Methoden
2.1.3. Immunologische Methoden
2.1.3.1. Zellsortierung
Das nach der Transduktion von Fibroblasten und HeLa-Zellen exprimierte Oberflächenantigen CD24 wurde für die Zellsortierung mit einem fluoreszierenden Antikörper markiert. Dazu wur-den die Zellen dreimal mit PBS (5 min, 210 x g) gewaschen, um wur-den Virusüberstand gründlich zu entfernen und um die Zellen auf die Sicherheitsstufe 1 herunterzustufen. Die Zellen wurden in 10% FCS in PBS aufgenommen und 20 min lichtgeschützt auf Eis mit einem FITC-Anti-Maus-CD24-Antikörper (BD Pharmigen, Heidelberg) nach Angaben des Herstellers gefärbt.
Nach erneutem Waschen mit PBS wurden sie wieder in 10% FCS in PBS resuspendiert, über einen Nylonfilter gefiltert und in Sortier-Röhrchen überführt. Die fluoreszenzaktivierte Zellsor-tierung (MoFloTM, Dako Cytomation) wurde freundlicherweise von M. Ballmaier (MHH) durchgeführt und anschließend mit einer weiteren FACS-Analyse überprüft.
2.1.3.2. Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie (Fluorescence Activated Cell Sorting - FACS) ist eine Methode, um Einzelzellen nach ihren physikalischen und molekularen Eigenschaften zu charakterisieren. Es werden quantitativ die Größe und Granularität einer Zellsuspension und durch fluoreszenzmar-kierte Antikörper spezifische Eigenschaften der einzelnen Zellen bestimmt.
Die Zellen werden durch hydrodynamische Fokussierung in einem Flüssigkeitsstrom an einem Laserstrahl vorbeigeführt und erzeugen dadurch je nach Zelltyp unterschiedliches Streulicht.
Das Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) gibt Auskunft über die Größe der Einzelzelle.
Je größer die Zelle ist, desto größer ist der Winkel der Ablenkung des Laserstrahls in Vorwärts-richtung. Das Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC) verändert sich umso stärker wie die Granu-larität der Zelle zunimmt. Durch die Messung der Größe und GranuGranu-larität können Blutzellen (Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten) voneinander differenziert oder auch tote und lebende Zellen voneinander unterschieden werden.
Im Folgenden wird die Messung mit Antikörpern markierter transduzierter Zellen beschrieben.
Sind die Zellen mittels eines Antikörpers markiert, der an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt ist, absorbieren die Fluorochrome durch Anregung des Lasers Licht. Die Elektronen werden auf ein höheres Energieniveau gehoben. Beim Verlassen des Laserpulses fallen die Elektronen wie-der auf ihr ursprüngliches Energieniveau ab und geben Energie in Form von Photonen frei. Die-se Emission, die sich proportional zur Menge der an die Zelle gebundenen Antikörper verhält, wird von einem Photodetektor gemessen und analysiert. Die Fluorochrome besitzen unter-schiedliche Exzitationsspektren, weshalb auch mehrere Antikörpermarkierungen gleichzeitig erfolgen können. Zur Identifizierung von transduzierten Zellen wurden die Zellen auf die Ex-pression des CD24-Markers überprüft. Da nur transduzierte Zellen den Marker CD24 exprimie-ren, können sie durch Inkubation mit einem FITC (Fluoreszeinisothiocyanat, Exzitation: 495 nm, Emission: 520 nm) konjugierten Anti-CD24-Antikörper markiert und anschließend sortiert werden. Für die Durchführung einer FACS-Analyse wurden die Zellen mit PBS gewaschen und ca. 1-2×105 Zellen in 10% FCS in PBS geblockt. Die Färbung erfolgte 15-20 min in Dunkelheit auf Eis unter Zugabe des FITC-Anti-Maus-CD24-Antikörpers (1: 600, BD Pharmigen, Heidel-berg). Dann wurden die Zellen erneut mit PBS gewaschen (5 min, 210 x g) und das Pellet in PBS resuspendiert. Die durchflusszytometrische Analyse der Proben wurde mit dem FACScan (Becton und Dickinson) durchgeführt und anschließend mit CellQuest (BD Bioscience) evalu-iert.
2.1.3.3. Immunhistochemie
In der Immunhistochemie werden Antikörper benutzt, um bestimmte Strukturen in Zellen durch Antigen-Antikörper-Reaktion darzustellen. Es gibt zwei Methoden der Immunfluoreszenz: di-rekte und indidi-rekte Immunfluoreszenz. Bei der ersten Methode sind die Antikörper direkt an einen fluoreszierenden Stoff oder ein Enzym, was nach Zugabe eines Substrats einen Farbstoff bildet, gebunden (direkte Immunfluoreszenz). Für die zweite Methode benötigt man zwei Anti-körper. Der Primärantikörper ist gegen das zelluläre Antigen und der Sekundärantikörper, der wiederum an ein Fluorochrom oder Enzym gebunden ist, gegen die Spezies gerichtet, in der der Primärantikörper hergestellt worden ist (indirekte Immunfluoreszenz).
Für die subzelluläre Lokalisation des HAX1-Proteins wurden transduzierte HeLa-Zellen und Fibroblasten unter einem Fluoreszenzmikroskop und einem 2-Photonen-Mikroskop untersucht.
Dabei wurden die unterschiedlichen Zellorganellen mit spezifischen Organell-Markern ange-färbt. Durch Kolokalisation der Organelle mit HAX1 wurde bestimmt, wo HAX1 in der Zelle lokalisiert ist. Die mitochondriale Färbung erfolgte mit Mitotracker Red CMX Ros. Dieser Farb-stoff akkumuliert in vivo im Mitochondrium und geht eine Bindung mit Thiolgruppen mito-chondrialer Proteine und Peptide ein, die bei Anregung rot fluoreszieren. Das endoplasmatische Retikulum (ER) wurde mit einem Calnexin-Antikörper angefärbt. Calnexin ist ein membran-ständiges, Kalzium-bindendes Protein des ER. Die Darstellung der Lysosomen erfolgte durch die Färbung des lysosomalen Proteins LAMP-3 (Lysosomal associated membrane protein 3).
Der Golgi-Apparat wurde mittels eines Anti-Golgin-97-Antikörpers detektiert. Golgin-97 ist ein Membranprotein des Golgi-Apparates. Um das Zytoskelett anzufärben wurde das an F-Aktin bindende Toxin Phalloidin gebraucht. Phalloidin wird aus dem grünen Knollenblätterpilz (A-manita phalloides) gewonnen. Der Zellkern wurde mit DAPI (4’,6-Diamidin-2’-Phenylindol-Dihydrochlorid) gefärbt, ein Farbstoff, der mit der DNA stark fluoreszierende Komplexe bildet.
HAX1 wurde mittels seines FLAG-Protein-Tags und einem Anti-FLAG-Antikörper detektiert.
Da der Zweitantikörper FITC-konjugiert war und somit grünes Licht emittierte und alle Orga-nellen im roten Spektrum Licht emittierten, konnte eine Kolokalisation durch gelb emittiertes Licht im Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden.
Tabelle 3: In der Fluoreszenzmikroskopie verwendete Antikörper.
Primärantikörper Hersteller
Phalloidin-TRITC Sigma 1:100 540/570 Zytoskelett
Fluoreszenzfarbstoffe Mitotracker® Red
CMX Ros
Molecular Probes 150 nM 579/599
Mitochondri-um
DAPI (DABCO) Sigma 0,25 M 340/488 Nukleus
Eine typische Färbung wurde nach dem folgenden Protokoll durchgeführt.
Es wurden 2×105 Zellen pro Loch einer 6-Loch-Platte ausgesät, in der sich bereits fünf sterile Deckgläschen (Menzel) befanden. Nach 48 h wurde das Medium entfernt und die Zellen vor-sichtig mit warmen PBS gewaschen. Bei einer Mitochondrien-Färbung wurde 150 nM Mitotra-cker Red CMX Ros in warmem Medium auf die Zellen gegeben und lichtgeschützt 60 min bei 37°C inkubiert. Die Fixierung und Permeabilisierung fand nach dem Waschen der Zellen mit PBS mit 1% PFA (Paraformaldehyd, Sigma) und 0,1% Triton-X (Sigma) in PBS 10 min bei RT statt. Die Zellen wurden mit 1× TBS-T (Tris buffered saline + 0,1% Tween) abermals gewa-schen. Um unspezifische Bindungen abzusättigen wurde mit 2% FCS und 0,5% BSA in TBS-T für 10 min geblockt. Die Färbung erfolgte daraufhin nach folgendem Schema. Der Primäranti-körper wurde mit der Block-Lösung auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Für jedes Deckgläschen wurde ein Tropfen Antikörper-Gemisch (ca. 20µl) auf ein Stück Parafilm (Brand, Wertheim) pipettiert und das Deckgläschen aufgelegt. Nach einer Inkubationszeit von 60 min unter lichtgeschützten Bedingungen wurden die Zellen wieder mit TBS-T drei- bis viermal 3 min gewaschen. Der Sekundärantikörper wurde ebenfalls mit Block-Lösung verdünnt und 45- 60 min je nach Angaben des Herstellers inkubiert. Die Zellen wurden dreimal 3 min gewaschen und mit 0,25 M DAPI in Mowiol, einem Polyvinylalkohol, auf einem Objektträger eingebettet.
Nach eintägiger Trocknung bei 4°C wurden die Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Axiovert 200M, Jena) analysiert. Aufgrund der Grenze der Anwendungsmöglichkeiten der Flu-oreszenzaufnahmen wurde zusätzlich die 2-Photonen-Mikroskopie angewendet. Die Bearbei-tung der gewonnen Daten der 2-Photonen-Mikroskopie erfolgte mit dem LSM Image Browser.
2.1.3.4. Apoptoseinduktion
Man kann den programmierten Zelltod (Apoptose) auf unterschiedliche Weise in Zellen indu-zieren. Methoden zur Einleitung der Apoptose stellen z.B. Serummangel (FCS-Deprivation), oxidativer Stress und Inkubation mit einem Proteinkinaseinhibitor oder Zytostatika dar. Die Apoptose-Assays wurden in HeLa-Zellen durchgeführt. Bei der FCS-Deprivation wurden die Zellen über Nacht in FCS-freiem Medium inkubiert. FCS schützt die Zellen durch Wachstums-faktoren und Mitogene vor Apoptose. Am folgenden Tag wurden sie immunhistochemisch ge-färbt und mittels Fluoreszenzmikroskopie ausgewertet.
Oxidativer Stress wurde durch Inkubation der Zellen mit Wasserstoffperoxid ausgelöst. Es wur-den 60 µl H2O2 (VWR international) pro ml Medium auf die Zellen gegeben und nach festge-legten Zeitpunkten (0, 2, 30, 45, 60, 90, 105, 120 min) die Zellen gefärbt und mittels eines 2-Photonen-Mikroskops (Zeiss, Deisenhofen) dank freundlicher Unterstützung von C. Pfeffer (Harvard University, Cambridge, USA) analysiert.
Staurosporin, ein Proteinkinaseinhibitor, wurde in einer Konzentration von 1 µM auf die Zellen gegeben, um den programmierten Zelltod auszulösen. Durch die Stimulation mit Staurosporin
wird von den Mitochondrien Cytochrom c freigesetzt, wodurch die Zellen apoptotisch werden (Kluck et al., 1997). Zu den jeweiligen Zeitpunkten (0, 2, 4, 6, 20 h) wurden die Zellen fixiert, gefärbt und mit dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.
Als Zytostatikum wurde das Anthrazyklin Doxorubicin verwendet. Doxorubicin interkaliert in die DNA und hemmt die Topoisomerase II. Die Zellen wurden für 1, 2, 4, 6, 10 und 24 h mit 2 µM Doxorubicin inkubiert und nach Färbung fluoreszenzmikroskopisch analysiert.
2.1.3.5. SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese
Western Blotting ist eine Methode, um Proteine aus einem Proteingemisch zu identifizieren und zu quantifizieren. Dabei werden die Proteine erst gelelektrophoretisch nach ihrer Größe aufge-trennt und danach mittels eines elektrischen Feldes auf eine Nitrozellulosemembran transferiert.
Auf der Membran erfolgt der Nachweis der Proteine durch spezifische Antikörper. Es können die molekulare Masse und Menge des Proteins bestimmt werden. Eine typische Western Blot-Durchführung wird im Folgenden beschrieben.
Für die Isolation zytoplasmatischer Proteine wurden die kultivierten Zellen trypsinisiert und zweimal mit PBS gewaschen. Das Pellet wurde in 400 µl hypotonem Puffer (pH= 7,6) re-suspendiert, 5 min inkubiert und zentrifugiert (4000 rpm, 4°C, 5 min). Der Überstand enthielt die zytoplasmatischen Proteine und wurde bei -80°C gelagert.
Die Konzentration des Proteinlysats wurde nach der Bradford Methode bestimmt (Bradford, 1976). Bei dieser Methode bilden die Proteine mit dem Bradford-Reagenz, einem Coomassie Brillantblau G-250 Farbstoff, Komplexe. Der Protein-Farbstoffkomplex absorbiert Licht von 595 nm Wellenlänge und kann photometrisch nachgewiesen werden. Anhand einer Eichkurve unterschiedlicher BSA-Verdünnungen kann die Konzentration des Proteingemischs photomet-risch ermittelt werden.
Die diskontinuierliche Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde nach Laemmli durchgeführt (Laemmli, 1970). Dabei werden die Proteine, die in Anwe-senheit von SDS eine negative Ladung annehmen, aufgrund ihres Molekulargewichts voneinan-der getrennt. Das HAX1-Protein mit einem Molekulargewicht (MW) von 35 kDa wurde in ei-nem 10%-igen Polyacrylamid-Trenngel analysiert. Die Zusammensetzung der verwendeten Gele ist in Tabelle 4 und der verwendeten Puffer in 2.2.3 dargestellt.
Das 10%-ige Trenngel wurde zwischen zwei Glasplatten gegossen und für eine glatte Oberflä-che mit dH2O überschichtet. Nach 10-15 min war das Trenngel vollständig polymerisiert und das Wasser wurde verworfen. Dem 6%-igen Sammelgel wurde erst kurz vor dem Gießen Am-moniumpersulfat (APS) hinzugegeben, um vorzeitiges Polymerisieren zu vermeiden. Das Gel enthielt zudem TEMED (Tetramethylethylendiamin), einen Polymerisationsbeschleuniger.
Nach dem Gießen wurde ein Gelkamm eingesetzt, der nach erfolgter Polymerisation (10-15 min) gezogen wurde. Das Gel wurde in eine Elektrophorese-Kammer (Bio-Rad, München)
um-gespannt und mit Laufpuffer überschichtet. Zur Vorbereitung der Proben wurden jeweils 25 µg Protein im Verhältnis 1:6 mit Laemmli-Puffer und 3% β-Mercaptoethanol versetzt. Die Proteine wurden 10 min bei 95°C denaturiert. Dabei wurde durch die Anwesenheit von SDS die räumli-che Struktur der Proteine aufgehoben (Sekundär- und Tertiärstruktur) und durch das β-Mercaptoethanol wurden Disulfidbrücken gespalten. Nach Abkühlung auf RT wurden die Pro-ben auf das Gel aufgetragen. Für die spätere Größenabschätzung der Proteine wurde nePro-ben den Proben ein Molekulargewichtsstandard (10- 220 kDa, Benchmark Prestained Protein ladder, Invitrogen) aufgetragen. Die Gelelektrophorese wurde bis zum Übertritt der Proteinbanden in das Trenngel bei 80 mV und bis zum Erreichen der Bromphenolblau-Front des unteren Gelen-des bei 120 mV durchgeführt. Das Sammelgel wurde mit einem Skalpell entfernt und das Trenngel 10 min in Transfer-Puffer überführt, um SDS-Reste zu entfernen.
Tabelle 4:
Sammelgel (6%) Trenngel (10%)
dH2O 2,7 ml 4,0 ml
Acryl-Bisacrylamid 0,67 ml 3,3 ml
0,5 M TrisHCl (pH= 6,8) 0,5 ml 2,5 ml
10% SDS 40 µl 100µl
10% APS 40 µl 100 µl
TEMED 4 µl 4 µl
2.1.3.6. Western Blot
Der anschließende Proteintransfer aus dem Polyacrylamid-Gel auf die Polyvinylidenfluorid-Membran (Roti®-PVDF, Roth) wurde mittels Nass-Blot-Verfahren durchgeführt. Die PVDF-Membran wurde zunächst 1 min in Methanol inkubiert und für 5 min in Transferpuffer äqui-libriert. In den Spannrahmen wurden luftblasenfrei Filterpapier, Polyacrylamidgel und PVDF-Membran eingespannt und in eine Transferkammer überführt (1 h, 100 V, 4 °C). Um den Erfolg des Blotvorgangs zu überprüfen wurden die Proteine durch reversible Ponceau-Färbung (5 min) sichtbar gemacht.
Für die Detektion der Proteine auf der PVDF-Membran wurden diese immunologisch nachge-wiesen. Dazu wurden zuerst die freien Bindungsstellen durch Inkubation bei 4°C über Nacht in Blockpuffer (PBS-T, 5 % Magermilchpulver) abgesättigt. Die Membran wurde danach zweimal 2 min mit PBS gewaschen und auf dem Schüttelinkubator (Fröbel, Lindau) mit dem Primäranti-körper in Blockpuffer inkubiert. Nach vier Waschvorgängen mit PBS-T erfolgte die Inkubation mit dem mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugierten Sekundärantikörper in Blockpuffer.
Nach wiederholtem gründlichem Waschen mit PBS-T (4×10 min) wurde die Membran mit ECL-Lösung (Amersham, Buckinghamshire, UK) inkubiert. Die Peroxidase katalysierte die
Umsetzung des Substrats (Luminol), das sich in der ECL-Lösung befand. Die bei dieser Reakti-on entstandene Chemilumineszenz wurde mit einem LAS-3000-Gerät (Fujifilm, Tokio, Japan) detektiert.
Tabelle 5: Beim Western Blot verwendete Antikörper.
Primärantikörper Inkubationszeit
Nach der ersten Detektion wurde der Blot mit einem GAPDH-Antikörper reanalysiert.
Um die auf der PVDF-Membran gebundenen Antikörper zu entfernen, wurde der alte Primäran-tikörper mit Stripping-Puffer von der Membran gewaschen. 100 mM β-Mercaptoethanol wurde zu dem Puffer gegeben und mit der Membran für 15 min im Wasserbad (55-60°C) inkubiert.
Dieser Vorgang wurde zweimal mit frischem Puffer wiederholt. Die Membran wurde daraufhin viermal mit PBS-T gewaschen und in Blockpuffer inkubiert. Die weiteren Schritte wurden wie bereits beschrieben durchgeführt.
2.1.3.7. ELISA
Der ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) ist ein immunologisches Verfahren zum Nachweis antigener Strukturen wie z.B. Antikörper in der HIV-Diagnostik. Dabei ist eine Mikrotiter-Platte mit einem Antikörper beschichtet, an den sich die antigenen Strukturen einer Probe binden. Nach mehrmaligem Waschen wird im zweiten Schritt ein weiterer Antikörper dazugegeben, der an einer anderen Stelle an das Antigen bindet („Sandwich“-ELISA). Der Zweitantikörper ist an ein Enzym (z.B. Merrettich-Peroxidase) gekoppelt, das eine Reaktion mit einem Chromogen katalysiert, woraufhin ein Farbumschlag der Lösung stattfindet. Dieser Farb-umschlag, der proportional zur Antigen-Menge ist, kann mithilfe einer Standard-Verdünnungsreihe photometrisch bestimmt werden.
Um das Interferon-β-Sekretionsverhalten von Normalspender- gegenüber HAX1-defizienter Fibroblasten zu untersuchen, wurde nach Poly (I:C) (polyinosinicpolycytidylic acid) -Stimulation die Interferon-β (IFN-β)-Konzentration mit einem Human IFN-β ELISA Kit (Fujire-bio, Japan) nach Angaben des Herstellers bestimmt. Durch Stimulation der Zellen mit viraler Doppelstrang-RNA, deren synthetisches Analogon im Poly (I:C) enthalten ist, wird der TLR3
aktiviert (Alexopoulou et al., 2001). Dieser ist ein Rezeptor des angeborenen Immunsystems, der in Kontakt mit Krankheitserregern eine Zytokinausschüttung induziert. Bei Aktivierung des TLR3 wird u.a. IFN-β ausgeschüttet. Diese Immunantwort wurde mit dem ELISA erfasst.
Es wurden 5×103 Fibroblasten (Normalspender und Patient jeweils transduziert mit 3’FLAG-HAX1 und nicht transduziert) in einer 96-Loch-Platte ausgesät. Als Kontrollgruppe fungierten nicht-stimulierte Fibroblasten. Nach einem Tag Wachstum wurden die zu untersuchenden Zel-len für 24 h mit 50 µg/ml Poly (I:C) stimuliert (Yang et al., 2005). 100µl des Überstands wur-den abgenommen und zusammen mit einem BSA-Standard (0- 200 IU/ml) auf eine Mikrotiter-Platte gegeben, die mit polyklonalem IFN-β-Antikörper beschichtet war. Es wurde ein HRP-Sekundärantikörper dazugegeben, der an den immobilisierten Antigen-Antikörper-Komplex aus Primärantikörper und IFN-β band (one-step sandwich method). Nach Zugabe eines Farbent-wicklers (Tetramethylbezidin) katalysierte die Peroxidase die Umsetzung des farblosen Farb-substrats in ein gefärbtes Produkt. Dieser Farbumschlag ist proportional zur IFN-β-Konzentration und wurde photospektrometrisch (Molecular Devices, MWG-Biotech, Sunnyva-le, CA, USA) bei 450 nm detektiert. Im Vergleich zur Standard-Eichkurve aus festgelegten BSA-Konzentrationen wurde die IFN-β-Konzentration in IU/ml bestimmt.