3. Ergebnisse
3.2. Subzelluläre Lokalisation von HAX1 in transduzierten HeLa-Zellen mittels
Nach der Charakterisierung des Konstrukts wurden die transduzierten Zellen mit Doppelim-munfluoreszenztechnik untersucht, um zu zeigen, wo HAX1 in der Zelle lokalisiert ist. Zu-nächst wurde die Färbung der Zellen mit dem FLAG-Antikörper standardisiert. Vorarbeiten mit einem biotinilierten Anti-FLAG BioM2 Antikörper hatten gezeigt, dass mit diesem Antikörper nur im Western Blot spezifische Signale detektiert werden konnten (nicht gezeigt). Des Weite-ren erwiesen sich nur wenige Fibroblasten bei fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen als positiv, obwohl ein eindeutiger Nachweis der Proteinexpression des CD24-Markers im FACS und von HAX1 im Western Blot erbracht werden konnte. Deshalb wurde zur Etablierung der Färbung auf ein anderes Zellmodell (HeLa-Zellen) zurückgegriffen. Nach der Standardisierung der immunhistochemischen Färbung wurden zweifach und dreifach Färbungen mit Zellorga-nellmarkern durchgeführt (2.1.3.3). Es wurden im Einzelnen folgende Organellen und zellulären Strukturen angefärbt: Nukleus, Zytoskelett, Lysosom, Golgi-Apparat, endoplasmatisches Reti-kulum (ER) und Mitochondrium. Als Kontrollen dienten nicht transduzierte HeLa-Zellen und Isotyp-Kontrollen zu den jeweiligen Antikörpern (nicht gezeigt). Durch Überlagerung der Ein-zelbilder wurde überprüft, ob HAX1 mit den untersuchten Zellorganellen kolokalisiert.
3.2.1. Nukleus und HAX1-Lokalisation
Abbildung 10: HAX1-Expression und Nukleus. 2×105 transduzierte HeLa-Zellen wurden nach 48 h Kultivierung fixiert und permeabilisiert. Für den Nachweis von FLAG-HAX1 wurde ein polyklonaler Anti-FLAG-Antikörper (1:200) verwendet, der mit dem grün fluoreszierenden Alexa Fluor 488-Antikörper (1:1000) detektiert wurde. Die Kerne wurden mit DAPI in Mowiol gegengefärbt (blau) und mit einem Zeiss Axiovert 200M fotografiert Das rechte Bild (merge) ist die Überlagerung der beiden Einzelbilder. Unten ist ein Ausschnitt aus der Überlagerung vergrößert. (Vergrößerung 64x, unteres Bild zusätzlich zweifach digitaler Zoom).
Auf den Bildern ist zu erkennen, dass HAX1 (FLAG) hauptsächlich diffus im Zytoplasma loka-lisiert ist und es eine distinkt punktförmige Verteilung zeigt. Die Einzelzellvergrößerung zeigt, dass HAX1 möglicherweise zu einem sehr geringen Teil im Zellkern lokalisiert, was an der türkisen Mischfarbe der Punkte im Nukleus zu erkennen ist.
DAPI FLAG merge
3.2.2. Zytoskelett und HAX1-Lokalisation
Abbildung 11: HAX1-Expression und Zytoskelett. Transduzierte HeLa-Zellen wurden erst mit einem Anti-FLAG-Antikörper und anschließend mit einem Alexa-Fluor-Antikörper zum Nachweis von HAX1 (grün) angefärbt. Zur Darstellung des Zytoskeletts (rot) wurde ein gegen F-Aktin gerichteter Phalloidin-TRITC-Antikörper (1:100) verwendet. Der Zellkern wurde mit DAPI (blau) nachgewiesen. Die beiden Bilder in der zweiten Reihe (merge) zeigen die Überlagerungen von zwei bzw. drei Einzelbildern. Das untere Foto stellt vergrößert eine Zelle aus der Überlagerung dar. (Vergrößerung 64x, unteres Bild zusätz-lich zweifach digitaler Zoom).
In Abbildung 11 ist HAX1 zusammen mit dem Aktinzytoskelett (Phalloidin) angefärbt. Aus den überlagerten Bildern geht hervor, dass HAX1 größtenteils unabhängig von den Aktinfila-menten des Zytoskeletts exprimiert wird. Geringe Teile kolokalisieren miteinander (gelbe Mischfarbe).
DAPI FLAG Phalloidin
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3.2.3. Lysosom und HAX1-Lokalisation
Abbildung 12: HAX1-Expression und Lysosom. Transduzierte HeLa-Zellen wurden für die Immunflu-oreszenz wie bereits beschrieben für HAX1 (grün) und mit einem LAMP- 3-Antikörper (1:25) zum Nachweis der Lysosome (detektiert mit TRITC konjugierten Sekundärantikörper in rot; 1:100) angefärbt.
Der Zellkern wurde mit DAPI (blau) nachgewiesen. Die beiden Bilder in der zweiten Reihe (merge) zeigen die Überlagerungen von zwei bzw. drei Einzelbildern. Das untere Foto stellt vergrößert eine Zelle aus der Überlagerung dar. (Vergrößerung 64x, unteres Bild zusätzlich zweifach digitaler Zoom)
In der Abbildung 12 weisen Lysosome (LAMP-3) wie HAX1 eine diffus punktförmige Vertei-lung im Zytoplasma auf, jedoch ist das HAX1-Protein zahlreicher vertreten. In der Überlage-rung der Bilder ist keine Kolokalisation der Lysosome mit HAX1 zu erkennen.
DAPI FLAG LAMP-3
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3.2.4. Golgi-Apparat und HAX1-Lokalisation
Abbildung 13: HAX1-Expression und Golgi-Apparat. Transduzierte HeLa-Zellen wurden mit Anti-FLAG-Antikörper für die HAX1 Darstellung (detektiert mit Alexa Fluor 488 in grün) und dem Antikör-per für den Golgi-Apparat Anti-Golgin-97 (1:200; detektiert mit Alexa Fluor 594 in rot; 1:200) angefärbt.
Der Zellkern wurde mit DAPI (blau) nachgewiesen. Die beiden Bilder in der zweiten Reihe (merge) zeigen die Überlagerungen von zwei bzw. drei Einzelbildern. Das untere Foto stellt vergrößert eine Zelle aus der Überlagerung dar. (Vergrößerung 64x, unteres Bild zusätzlich zweifach digitaler Zoom)
Der Golgi-Apparat ist ein in der Nähe des Zellkerns lokalisiertes Organell (Abbildung 13).
Seine Lokalisation ist sehr zentriert und dem Zellkern angelagert. HAX1 hingegen ist diffus im gesamten Zytoplasma verteilt und kolokalisiert nicht mit dem Golgi-Apparat.
DAPI FLAG Anti-Golgin
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3.2.5. Endoplasmatisches Retikulum und HAX1-Lokalisation
Abbildung 14: HAX1-Expression und endoplasmatisches Retikulum. Transduzierte HeLa-Zellen wurden wie beschrieben für HAX1 und mit einem Calnexin-Antikörper (1:25; detektiert mit TRITC kon-jugierten Sekundärantikörper in rot; 1:100) zur Darstellung des endoplasmatischen Retikulums angefärbt.
Der Zellkern wurde mit DAPI (blau) nachgewiesen. Die beiden Bilder in der zweiten Reihe (merge) zeigen die Überlagerungen von zwei bzw. drei Einzelbildern. Das untere Foto stellt vergrößert eine Zelle aus der Überlagerung dar. (Vergrößerung 64x, unteres Bild zusätzlich zweifach digitaler Zoom)
In Abbildung 14 ist das ER mit einem Antikörper gegen das ER-Protein Calnexin angefärbt und zusammen mit HAX1 dargestellt. Das ER erstreckt sich diffus über das Zytoplasma. Die Verteilungsmuster von HAX1 und ER sind auf den ersten Blick ähnlich, aber es gibt keine ein-deutige Kolokalisation.
DAPI FLAG Calnexin
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3.2.6. Mitochondrium und HAX1-Lokalisation
Abbildung 15: HAX1 ist im Mitochondrium lokalisiert. Transduzierte HeLa-Zellen wurden mit Mi-totracker CMX Ros (150 nM, rot) in Medium zum Nachweis der Mitochondrien inkubiert und nach Fi-xierung und Permeabilisierung mit Triton-X und PFA in PBS gefärbt. HAX1 wurde mit einem Anti-FLAG-Antikörper markiert und mittels eines Alexa Fluor 488-Antikörpers (grün) detektiert. Der Zell-kern wurde mit DAPI (blau) nachgewiesen. Die beiden Bilder in der zweiten Reihe (merge) zeigen die Überlagerungen von zwei bzw. drei Einzelbildern. Das untere Foto stellt vergrößert eine Zelle aus der Überlagerung dar. Zwischen den Pfeilen ist exemplarisch ein Bereich der Kolokalisation zwischen Mi-totracker und FLAG markiert. (Vergrößerung 64x, unteres Bild zusätzlich zweifach digitaler Zoom) In Abbildung 15 sind die Mitochondrien mit Mitotracker CMX Ros markiert und HAX1 ist angefärbt. Sowohl die Mitochondrien als auch HAX1 weisen eine sehr punktuelle, diffuse Ver-teilung im Zytoplasma der HeLa-Zellen auf. Auch die Größe der Punkte stimmt weitestgehend überein. In der Überlagerung kolokalisiert HAX1 mit den Mitochondrien.
DAPI FLAG Mitotracker
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