Molekularbiologische Methoden

2.1.1.1. Klonierungsstrategie für die Generierung des retroviralen Vektors pMMP-HAX1-IRES-CD24

Zur Lokalisation von HAX1 wurde zunächst ein HAX1-Antikörper (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) an Fibroblasten von Patienten und Normalspendern getestet, der jedoch keine spezi-fische Bindung zeigte, so dass zur Detektion von HAX1 ein 3’FLAG-HAX1-Konstrukt gene-riert wurde. Das FLAG-Tag ist eine häufig in der Immunfluoreszenz angewendete Peptidse-quenz zum Markieren von zellulären Proteinen, für die kein spezifischer Antikörper zu Verfü-gung steht. Um dieser Schwierigkeit zu entgehen, wird das Protein mit einer bekannten Peptid-sequenz („Tag“) fusioniert. Das FLAG-Tag ist ein hydrophiles Oktapeptid (DYKDDDDK=

Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) und stammt ursprünglich aus dem Bakteriophagen T7 (Hopp et al., 1988; Witzgall et al., 1994; Chubet und Brizzard, 1996).

Die cDNA von HAX1 wurde freundlicherweise von G. Appaswamy (AG Klein) zur Verfügung gestellt (Klein et al., 2007) und in einer PCR-Reaktion (Polymerase chain reaction) amplifiziert (2.1.1.2). Über den Forward-Primer wurde eine BspH1-Schnittstelle und über den Reverse-Primer das FLAG-Tag sowie eine BamH1-Schnittstelle eingefügt. Das PCR-Produkt wurde in den Vektor pGEM-T subkloniert und sequenziert, um PCR bedingte Mutationen auszuschlie-ßen. Nach der Verifizierung der HAX1-Sequenz wurde die cDNA mit BspHI und BamHI aus pGEM-T geschnitten und in den mit NcoI und BamHI linearisierten retroviralen Vektor pMMP-IRES-CD24 (matrix metalloproteinase vector- internal ribosome entry site- CD24) eingefügt.

Dieser besitzt als Marker ein verkürztes murines CD24-Molekül, welches die Identifizierung von positiven Zellen über die Färbung mit einem FITC-markierten Anti-Maus-CD24-Antikörpers ermöglicht (Klein et al., 2007).

Im Folgenden werden im molekularbiologischen Teil die einzelnen Schritte der Klonierung und im zellbiologischen Teil (2.1.2) die Produktion von retroviralen Partikeln beschrieben.

2.1.1.2. Herstellung von hHAX1-FLAG

Zur Herstellung des 3’FLAG-hHAX1 Konstrukts wurde zuerst eine Polymerase-Kettenreaktion mit HAX1 cDNA (NM_006118.3) als Template durchgeführt (Klein et al., 2007). Mit Hilfe einer PCR werden definierte Nukleinsäure-Abschnitte mit zwei sequenzspezifischen

Oligo-nukleotidprimern durch eine DNA-Polymerase amplifiziert. Die PCR besteht aus 25 - 40 Zyk-len, die jeweils in drei Teilschritte untergliedert sind. Erst wird das Template, die Ausgangs-DNA, für kurze Zeit auf eine hohe Temperatur erhitzt, so dass die DNA denaturiert und ein-zelsträngig vorliegt (Denaturierung). An die Einzelstrang-DNA lagern sich im Annealing-Schritt die Primer an die komplementäre Sequenz des Templates an. Die Annealing-Temperatur richtet sich dabei nach der Schmelztemperatur der Oligonukleotidprimer. Im letzten Schritt, der Elongation, heftet die DNA-Polymerase die entsprechenden Nukleotide an das 3´-OH-Ende der Primer und synthetisiert einen komplementären Strang zur Ausgangs-DNA. Die Temperatur dieses Schrittes ist dabei je nach Polymerase um die 70°C und die Dauer hängt von der Länge der zu amplifizierenden Nukleotid-Sequenz ab. Durch Wiederholung dieser Schritte erfolgt eine exponentielle Vermehrung der Zielsequenz, weil auch die neu entstandenen DNA-Fragmente als Vorlage zur Amplifizierung durch die Polymerase dienen.

Folgender Ansatz (20 µl) wurde in ein 0,5 ml Eppendorfröhrchen auf Eis pipettiert:

50- 100 ng

PCR Puffer (Roche Diagnostics, Mannheim) dNTPs (Roche Diagnostics, Mannheim) Forward-Primer

Reverse-Primer

DMSO (Sigma, Deisenhofen)

Taq Polymerase, High fidelity (Roche Diagnostics, Mannheim)

Nach einer initial 10-minütigen Denaturierungsphase bei 95°C, wurde die DNA in 30 Zyklen mit den folgenden Konditionen amplifiziert:

Denaturierung 95°C 10 min

Annealing 58°C 30 sec

Elongation 72°C 1 min

Nach Beendigung des letzten Zyklus schloss sich ein 10-minütiger finaler Syntheseschritt bei 72°C an, wonach die Probe bei 4°C gekühlt wurde.

Folgende Primer wurden verwendet (5’→ 3’):

Forward-Primer (BspHI-hHAX1):

5’- TCA TGA GCC TCT TTG ATC TCT T-3’ (BspHI- Restriktionsschnittstelle) Reverse-Primer (3’FLAG-hHAX1):

5’- GGA TCC CTA CTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA ATC CCG GGA CCG GAA CCA ACG-3’(BamH1-Restriktionsschnittstelle, FLAG)

2.1.1.3. Agarose-Gelelektrophorese

Mit Hilfe eines Agarosegels können DNA-Fragmente elektrophoretisch aufgetrennt werden.

Das Anlegen eines elektrischen Feldes bewirkt, dass die aufgrund ihrer Phosphatgruppen nega-tiv geladenen DNA-Fragmente zum Pluspol wandern, so dass eine Auftrennung nach ihrer Grö-ße erfolgt. Je nach GröGrö-ße der erwarteten Fragmente wurden 0,7- 1,5% Gele (Biozym, Hess.

Oldendorf) angesetzt mit 0,05% Ethidiumbromid (AppliChem, Darmstadt) versetzt. Ethidi-umbromid ist ein roter Phenantridin Farbstoff, der sich in die DNA interkaliert. Als Laufpuffer wurde 1× TBE-Puffer (Tris-Borat-EDTA) verwendet. Die HAX1-cDNA wurde mit 1× Ladepuf-fer auf ein 1%-iges Agarosegel aufgetragen und die Elektrophorese fand bei einer Spannung von 13 V/cm statt. Anhand eines mitlaufenden Markers (100 bp-Leiter, PEQLAB; 1 kb-Leiter, New England Biolabs) konnten die Größen der Fragmente unter UV-Licht bestimmt werden.

2.1.1.4. Isolation und Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen

Das gewünschte Fragment wurde mit einem DNA-Marker identifiziert, mit einem Skalpell aus-geschnitten und in ein Eppendorfröhrchen überführt. Mittels des QIAquick Gel Extraction Kits (QIAGEN, Hilden) wurde nach Anweisungen des Herstellers die DNA aus dem Gelstück eluiert und aufgereinigt. Das Aufreinigungsprinzip basiert auf der Bindung der DNA an eine Silikon-membran. Die Konzentration der DNA wurde im Anschluss photometrisch bestimmt (2.1.1.5).

2.1.1.5. Photometrische Quantifizierung von Nukleinsäuren und Proteinen in Lösung

Die Konzentration von Nukleinsäuren und Proteinen wurde mit einem Spektrophotometer (Ep-pendorf) bestimmt. Die Proben wurden in unterschiedlichen Verdünnungsstufen mit dH₂O in einer Quarzküvette gemessen, nachdem das Photometer zuvor mit einer Leerwertmessung mit dH₂O eingestellt wurde. Die Messung erfolgte mit UV-Licht bei einer Wellenlänge von 260 nm für Nukleinsäuren und 595 nm für Proteine nach der Bradford-Methode (2.1.3.5). Dabei ent-spricht eine Extinktion von 1 OD (optische Dichte) bei 260 nm etwa 50 g/ml Doppelstrang-DNA oder 30 µg/ml Oligonukleotid.

2.1.1.6. Ligation in Vektor pGEM-T

Das PCR-Produkt wurde in den Vektor pGEM-T (Promega, Madison, WI, USA) subkloniert.

Der pGEM-T-Vektor besitzt an seinen 5´-Enden Thymidinüberhänge, welche von der T4-DNA-Ligase (New England Biolabs, Frankfurt/Main) mit den Adenosinüberhängen, die von der Taq-Polymerase (Roche, Mannheim) am PCR-Produkt generiert wurden, verknüpft werden.

Das Insert wurde mit Hilfe der folgenden Formel für den Einbau in den Vektor optimiert:

[ ] [ ]

Die Ligation wurde mit 50 ng Vektor-DNA, einem dreifachen molaren Überschuss des zu klo-nierenden DNA-Fragmentes (43 ng) und einer Einheit T4-DNA-Ligase in dem vom Hersteller mitgelieferten Reaktionspuffer durchgeführt. Der Ansatz wurde über Nacht bei 4°C inkubiert.

2.1.1.7. Kultivierung von E.coli-Bakterien

Die Anzucht von E.coli-Bakterien erfolgte in LB-Medium (Luria-Bertani-Medium). Die Bakte-rien wurden über Nacht bei 37 °C unter Zusatz von 100 µg/ml Ampicillin inkubiert. Vorkultu-ren wurden mit einer Kolonie einer Agar-Platte angeimpft. Die Zusammensetzung von LB-Medium und LB-Agar-Platten wird in 2.2.3 beschrieben.

2.1.1.8. Transformation von E.coli-Zellen

Die Transformation wurde mit chemisch kompetenten XL10-Gold E.coli-Bakterien durchge-führt (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Kompetente Bakterien sind chemisch (z.B. mit Kalzium-chlorid) oder auch elektrisch behandelte Bakterien, die in der Lage sind, freie DNA aus dem Medium aufzunehmen. Die bei -80°C gelagerten Bakterien wurden auf Eis aufgetaut und 50-200 ng Plasmid mit 50 µl Bakterien gemischt und für 30 min inkubiert, wodurch sich das Plas-mid an die Bakterienmembran anlagerte. Ein Röhrchen ohne Zugabe von PlasPlas-mid diente als Negativkontrolle. Im nächsten Schritt wurde das Gemisch für exakt 2 min bei 42°C erhitzt (Hit-zeschock) und dann sofort 2 min auf Eis inkubiert. Dadurch wurde die Permeabilität der Bakte-rienmembran erhöht und die DNA von den Bakterien aufgenommen. Anschließend wurden die Bakterien bei 37°C 1 h in 200 l LB-Medium bei leichtem Schütteln inkubiert. Der Transforma-tionsansatz wurde auf einer LB-Ampicillin-Agarplatte ausgestrichen und bei 37°C über Nacht inkubiert (2.1.1.7). Der Vektor pGEM-T verleiht den Bakterien durch das β-Laktamase-Gen Ampicillin-Resistenz, so dass nur Bakterien, die den Vektor aufgenommen haben, auf der Platte wachsen. Dadurch werden sie von den anderen selektiert.

2.1.1.9. Plasmidpräparation

Die Plasmid Mini-Präparation erfolgte nach dem Prinzip der alkalischen Lyse nach Maniatis (Maniatis, 1982). Die verwendeten Lösungen werden unter 2.2.3 aufgeführt.

Eine Einzelkolonie wurde in LB-Medium mit 0,1 g/ml Ampicillin überführt und bei 37°C auf einem Schüttler (CERTOMAT^®HK, B.Braun Biotech international, Melsungen) bei 250 rpm über Nacht inkubiert. Von der Kultur wurden 1,5 ml in ein Eppendorfröhrchen überführt. Der Rest der Kultur wurde bei 4°C gelagert. Der Überstand wurde pelletiert (30 sec, 12.000 g) und es folgte die alkalische Lyse der Bakterien. Das Pellet wurde erst in 100 l der eiskalten Lösung 1 resuspendiert und mit 200 l der Lösung 2 durch schnelles Umdrehen des Röhrchens

mischt. Zur Neutralisation wurde 150 l der eiskalten Lösung 3 hinzupipettiert und 10 sec ge-mixt. Nach der Lagerung für 3 - 5 min auf Eis wurden die Zelltrümmer bei 12.000 g für 2 min abzentrifugiert und der Überstand in ein neues Röhrchen überführt. Das Pelletieren wurde ein-mal wiederholt. Um die Nukleinsäuren von den Proteinen in der Probe zu trennen, wurde der Überstand mit der Plasmid-DNA unter dem Abzug (Heraeus, Osterode) mit 450 l Phenol-Chloroform versetzt und 2 min bei 12.000 g zentrifugiert. Phenol und Phenol-Chloroform denaturieren Proteine, die sich daraufhin in der Phenol-Phase anreichern, weil Phenol durch hydrophobe Wechselwirkungen Aminosäureseitenketten bindet. Die denaturierten Proteine und Membran-bestandteile wurden von der Plasmid-haltigen oberen Phase getrennt, die in ein neues Eppen-dorfgefäß überführt wurde. Die DNA wurde mit 2 Vol Ethanol bei Raumtemperatur (RT) ge-fällt, 2 min inkubiert und schließlich bei 12.000 g 5 min abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Im letzten Schritt wurde die Plasmid-DNA in 30 - 50 l dH2O gelöst und bei -20°C gelagert.

2.1.1.10. Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen

Die Identität des Vektors wurde mittels einer Restringierung mit EagI (Fermentas, St.Leon-Rot) überprüft. EagI besitzt zwei Schnittstellen links und rechts der MCS (multiple cloning site) des pGEM-T-Vektors, so dass nach Restringierung festgestellt werden konnte, ob das PCR-Produkt im Vektor inseriert war. Es wurden dafür 2,5 U EagI, 150 ng Plasmid, der vom Hersteller ange-gebene Puffer und dH2O in einem Gesamtvolumen von 20 µl 3 h bei 37°C inkubiert. Darauf folgte die Analyse der Restriktionsfragmente in einem Agarosegel (2.1.1.3).

2.1.1.11. Sequenzierung von 3’FLAG-hHAX1 und Maxi-Präparation

Um PCR-bedingte Mutationen in der HAX1-cDNA auszuschließen, wurden zur Verifizierung positive Klone mittels Sequenzierung überprüft. Die Sequenzierungen wurden freundlicherwei-se von der Arbeitsgruppe Germershaufreundlicherwei-sen (MHH) durchgeführt. Das Ergebnis wurde mit der HAX1- und FLAG-Sequenz aus der Literatur verglichen (HAX1-GenID 10456) (Klein et al., 2007). Ein Klon, der frei von Mutationen war, wurde mit Hilfe einer Maxi-Präparation verviel-fältigt. Die Maxi-Präparation erfolgte nach Angaben des Herstellers mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN, Hilden).

2.1.1.12. Ligation in den finalen retroviralen Vektor

Der Vektor pMMP-IRES-CD24 wurde freundlicherweise G. Köhne (AG Klein) zur Verfügung gestellt. Die 3’FLAG-HAX1-cDNA wurde mit BspHI/BamHI aus pGEM-T exzisiert und in den mit NcoI/BamHI geöffneten Vektor pMMP-IRES-CD24 inseriert.

Für die Linearisierung des Vektors pMMP-IRES-CD24 wurde 10 U NcoI, 5 U BamHI, 8,5 µg Plasmid, ein an die Restriktionsenzyme angepasster Puffer und die entsprechende Menge BSA (Bovines Serumalbumin) mit dH₂O auf 30 µl Endvolumen aufgefüllt. Der Verdau wurde über

Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Fragmente mithilfe eines Agarosegels (2.1.1.3) voneinander getrennt und mit dem QIAquick Gel extraction Kit (QIAGEN, Hilden) nach Anweisungen des Herstellers aufgereinigt. Die Ligation wurde mit der T4-Ligase (New England Biolabs, Frankfurt/Main) bei 4°C über Nacht durchgeführt. Es wurden 50 ng lineari-sierter Vektor mit einem fünffachen molaren Überschuss an Insert mit 1 U Ligase in Reaktions-puffer ligiert. Die Ligation fand bei 4°C über Nacht statt.

Anschließend wurde, wie schon unter 2.1.1.7 und 2.1.1.9 beschrieben, eine Transformation und Plasmidpräparation durchgeführt. Die Klone wurden mittels eines Restriktionsverdaus mit ApaI oder XmaI zur Verifizierung der Ligation überprüft. Dazu wurden nach Angaben des Herstellers 2 µg DNA, 5 U ApaI bzw. 1 U XmaI, Puffer und BSA vermischt. Der Ansatz wurde mit dH₂O auf 20 µl Endvolumen aufgefüllt und bei 37°C (XmaI) bzw. 25°C (ApaI) über Nacht inkubiert.

Anschließend wurde das Fragmentgemisch elektrophoretisch (2.1.1.3) aufgetrennt. Der ausge-wählte positive Klon (pMMP-HAX1-FLAG-IRES-CD24) wurde mit dem QIAGEN Maxi Pre-paration Kit (QIAGEN, Hilden) vervielfältigt.