Fluoreszenzmikroskopie und 2-Photonen-Mikroskopie

Für die Lokalisation von endogenem HAX1 in Fibroblastenzellen wurden zunächst fluores-zenzmikroskopische Experimente mit einem kommerziell erhältlichen Anti-HAX1-Antikörper durchgeführt. Endogenes HAX1 ließ sich jedoch in den Zellen nicht nachweisen. In der Litera-tur sind unterschiedliche Methoden zur Lokalisierung von HAX1 angegeben. Der mikroskopi-sche Nachweis von endogenem HAX1 in B-Zellen und Fibroblasten ist bei Suzuki und Kawa-guchi erfolgreich beschrieben worden (Suzuki et al., 1997; KawaKawa-guchi et al., 2006). Hingegen

konnten Vafiadaki und Mitarbeiter den Nachweis des endogenen Proteins in kardialen Myozy-ten nicht reproduzieren (Vafiadaki et al., 2007). Eine verlässliche Methode zur Detektion von endogenen Proteinen stellt die Fusion des betreffenden Proteins mit einem Peptidstretch, einem so genannten „Tag“ dar, wodurch der Nachweis des Proteins mittels eines Tag-spezifischen Antikörpers erfolgen kann. Es wurde deshalb ein HAX1-Fusionskonstrukt mit einem FLAG-Tag konstruiert, dessen erfolgreiche Verwendung schon von der Arbeitsgruppe von Kasashima und Kollegen publiziert wurde (Kasashima et al., 2006).

Ein FLAG-Tag (Hopp et al., 1988) wird vielfach in der Immunfluoreszenz angewendet, wenn kein Antikörper für das endogene Protein vorhanden ist oder wenn dieser nicht für Immunfluo-reszenz-Färbungen verwendbar ist. Es ist eine Oligopeptid-Sequenz mit einer Größe von 1,01 kDa und lässt sich durch die Anti-FLAG-Antikörper M1, M2 und M5 einfach nachweisen. Die Fusion mit dem gewünschten Protein kann N- oder C-terminal erfolgen.

Das Fusionskonstrukt mit C-terminalen FLAG wurde nach Subklonierung in pGEM-T in den retroviralen Vektor (pMMP-IRES-CD24) überführt. Mithilfe einer Verpackungszelllinie wur-den retrovirale Überstände für die darauf folgende Transduktion von Zielzelllinien hergestellt.

Als Zielzelllinien wurden exemplarisch HeLa-Zellen und von Normalspendern und HAX1-defizienten Patienten Fibroblasten ausgewählt. HeLa-Zellen sind entartete humane Epithelzellen des Zervixkarzinoms. Aufgrund ihres schnellen Wachstums und der einfachen Kultivierung werden sie häufig für zellbiologische Experimente genutzt. Fibroblastenzellen sind humane Bindegewebszellen und haben den Vorteil gegenüber HeLa-Zellen, dass sie aufgrund ihrer Grö-ße für mikroskopische Untersuchung besser geeignet sind. Jedoch unterliegen sie, da sie nicht immortalisiert sind, einer kürzeren Lebensdauer und können nur eine begrenzte Zeitspanne kul-tiviert werden.

Der Nachweis funktionsfähiger Viren erfolgte mittels FACS-Analyse und Western Blot nach stabiler Transduktion der Zielzellen mit pMMP-HAX1-FLAG-IRES-CD24 (siehe 3.1.3 und 3.1.4). Da es sich um ein bicistronisches Konstrukt handelte, sollte der CD24-Oberflächenmarker ebenso wie das HAX1-FLAG Protein in den Zellen exprimiert werden, was mit den beiden Methoden überprüft wurde. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass die Zielzellen den Oberflächenmarker CD24 exprimierten, wodurch auf die Funktionalität der generierten retroviralen Konstrukte geschlossen werden konnte (siehe 3.1.3). Auffallend bei der Analyse war, dass die HeLa-Zellen eine stärkere Fluoreszenzintensität als die Fibroblasten auf-wiesen. Eine mögliche Erklärung hierfür wäre, dass die Viren im Überstand so zahlreich waren, dass mehrere Viren eine Zelle infizieren konnten und somit mehr Transgen (CD24) in den Zel-len gebildet wurde. Die HeLa-ZelZel-len wurden trotz Verwendung der gleichen MOI wie die Fibroblasten von mehr viralen Partikeln infiziert. Auch im Western Blot und in den mikroskopi-schen Untersuchungen konnten in den HeLa-Zellen mehr FLAG-HAX1-Protein detektiert

wer-den, weshalb die mikroskopischen Experimente überwiegend mit den transduzierten HeLa-Zellen durchgeführt wurden.

Es sind bereits Studien sowohl zur Lokalisation von HAX1 in verschiedenen Zellorganellen als auch zur Interaktion von HAX1 mit anderen Proteinen in Daudi-, Cos7-, DG75-, HeLa-, HEK293-Zellen und ARCMs (adult rat cardiac myocyte) durchgeführt worden (Suzuki et al., 1997; Gallagher et al., 2000; Dufva et al., 2001; Yedavalli et al., 2005; Han et al., 2006;

Kasashima et al., 2006; Kawaguchi et al., 2006; Vafiadaki et al., 2008). Ein Überblick über die verwendeten Zellarten, Antikörper, Mikroskopietechniken und die Lokalisation von HAX1 gibt Tabelle 6. Es wird deutlich, dass HAX1 vornehmlich in den Mitochondrien lokalisiert wurde, je nach verwendeter Zellart und Antikörper es aber auch andere Lokalisationsorte gibt. Das könnte auf unterschiedliche Funktionen von HAX1 je nach Zellart hindeuten (Vgl. 4.2).

Zelltyp Kostrukt vs.

endogen

Lokalisation Antikörper Referenz

Humane

Fibroblasten endogen - Zytoplasma

*Nukleus +

Tabelle 6: Neuste Studien zur immunhistochemischen Lokalisation von HAX1. Es sind der Zelltyp, das verwendete Konstrukt bzw. endogenes HAX1, der Lokalisationsort und die Antikörper für die Im-munfluoreszenz aufgeführt. Mitochondrium (M), endoplasmatisches Retikulum (ER), besondere Hinwei-se (*)

Der Nachweis des HAX1-Proteins mittels Western Blot zeigte, dass sowohl HAX1 als auch FLAG in den Zielzellen exprimiert wird (siehe 3.1.4). HAX1 konnte hingegen nicht in nativen Normalspender-Fibroblasten, die als Kontrollen dienten, nachgewiesen werden, obwohl Fibroblasten endogenes HAX1 exprimieren (Kawaguchi et al., 2006). Möglicherweise lässt sich das dadurch erklären, dass für die Detektion des HAX1-Proteins in Fibroblasten eine größere Menge Protein (>25 µg) benötigt wird, um eine stärkere, nachweisbare Antigen-Antikörper Bindung zu erhalten. Diese Beobachtung bestätigte sich in weiteren Versuchen der Arbeits-gruppe.

Für die Lokalisation von HAX1 wurde ein etabliertes Verfahren, die Doppelimmunfluoreszenz-technik, verwendet (siehe 3.2). HAX1 konnte mithilfe dieser Methode eindeutig in den Mito-chondrien lokalisiert werden (Suzuki et al., 1997; Dufva et al., 2001; Yedavalli et al., 2005; Han et al., 2006; Kasashima et al., 2006; Vafiadaki et al., 2007). Eine Lokalisation im Nukleus, ER und Zytoskelett ließ sich durch diese Untersuchungsmethode nicht ganz ausschließen, da kleine Mengen von HAX1 auch dort detektiert wurden, wie auch von den Arbeitsgruppen von Suzuki, Gallagher und Dufva gezeigt wurde (Suzuki et al., 1997; Gallagher et al., 2000; Dufva et al., 2001).

Durch Fluoreszenzmikroskopie können Zellen nur in zweidimensionaler Ebene dargestellt wer-den. Für weiterführende Studien musste daher auf ein genaueres Verfahren (2-Photonen-Mikroskopie) zurückgegriffen werden. 2-Photonen-Mikroskopie ist eine relativ neu angewandte Technik, bei der sich nur im direkten Fokus eines gepulsten Laserstrahls genügend Photonen befinden, um eine Fluoreszenz anzuregen. So wird ausschließlich in dieser Fokusebene Fluores-zenz erzeugt. FluoresFluores-zenzen aus der näheren Umgebung, die das Bild verfälschen könnten, wer-den nicht angeregt und ein nahezu störfreies, dreidimensional rekonstruiertes Bild entsteht. Die-se Methode ist Die-sehr präziDie-se und aussagekräftiger als Fluoreszenzmikroskopie. Durch den Ein-satz von langwelligem, infrarotem Licht ist zudem ein sehr schonender Umgang mit biologi-schem Material möglich (Konig, 2000).

Durch die Untersuchungen von Fibroblastenzellen mittels 2-Photonen-Mikroskopie wurde zu-nächst mit einer weiteren Methode die Lokalisation von HAX1 in den Mitochondrien bestätigt (vgl. 3.3). Zudem ergaben sich durch die dreidimensionalen Aufnahmen und die nähere Unter-suchung des Zellkerns in den folgenden Apoptosestudien keine weiteren Anhalte für die Lokali-sation von HAX1 im Zellkern (siehe 3.3 und 3.4). Dies hätte beispielsweise auf eine Rolle von HAX1 als Transkriptionsfaktor hindeuten können, der im Zellkern Gene ab- und anschalten kann.

Die Fluoreszenzmikroskopie und 2-Photonen-Mikroskopie erwiesen sich zusammen als geeig-nete Methoden zur Lokalisation von HAX1. Für ein allgemeines Screening der Zellen auf den Lokalisationsort ist die Fluoreszenzmikroskopie der komplizierten, zeitaufwändigen und teuren Photonen-Mikroskopie überlegen. Jedoch konnte bei der detaillierteren Betrachtung die

2-Photonen-Mikrokopie für eine bessere Bildschärfe hinzugezogen werden, wodurch Fehler mi-nimiert wurden. Mit den präzisesten Methoden wurde so die Lokalisation von HAX1 in den Mitochondrien bestätigt.

Weitere Möglichkeiten zur Lokalisation und der Charakterisierung der Rolle von HAX1 könn-ten in Zukunft Elektronenmikroskopie und Spinning Disk Verfahren biekönn-ten. In der Elektronen-mikroskopie werden Proteine in einer wesentlich höheren Auflösung dargestellt (200 nm mit Lichtmikroskop im Gegensatz zu 0,1 nm mit Elektronenmikroskop). Die Proteine werden dazu mit elektronendichten Markern wie beispielsweise Immungold-Antikörpern gekoppelt. Das Spinning Disc Verfahren bietet die Möglichkeit, Proteine live in der Zelle beobachten zu kön-nen und Bewegungen des Proteins innerhalb der Zelle aufzuzeichkön-nen. Diese Methode wäre be-sonders bei den Apoptoseinduktions-Experimenten von Interesse, da dadurch eine Translokati-on des Proteins beobachtet werden könnte.