Aus der Abteilung für
Pädiatrische Hämatologie und Onkologie der Medizinischen Hochschule Hannover Angefertigt im Rahmen der strukturierten
Doktorandenausbildung StrucMed
Etablierung eines in vitro-Modells zur molekularen Charakterisierung von HAX1
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Jan Christian Beime aus Oldenburg
Hannover 2008
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer/Kobetreuer: Prof. Dr. Christoph Klein/PD Dr. Heike Bantel Referent:
Korreferent:
Tag der mündlichen Prüfung: 20.12.2010
Promotionsausschussmitglieder:
Frau Prof. Dr. Anke Schwarz Herr Prof. Dr. Hueseyin Bektas Frau Prof. Dr. Bettina Wedi
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Schwere angeborene Neutropenie (SCN) – Diagnostik und Therapie 1.2 SCN – Klassifikation der angeborenen Neutropenien
1.2.1 Autosomal-dominante SCN 1.2.2 X-chromosomal-rezessive SCN 1.2.3 Autosomal-rezessive SCN 1.3 SCN und Apoptose
1.3.1 Apoptose – der programmierte Zelltod 1.3.2 HAX1
1.3.3 HAX1 und Apoptose 1.4 Zielsetzung der Arbeit
1 1
5
12 2 Methoden
2.1 Molekularbiologische Methoden
2.1.1 Überlappende PCR/Combination-PCR 2.1.2 Gelelektrophorese
2.1.3 Ligation
2.1.4 Transformation
2.1.5 Präparation von Plasmid-DNA 2.1.6 Restriktionsverdau
2.1.7 Sequenzierung 2.2 Zellbiologische Methoden
2.2.1 Zellkultur 2.2.2 Transfektion 2.2.3 Transduktion 2.3 Biochemische Methoden
2.3.1 Durchflusszytometrie 2.3.2 Western Blot
13
19
23
3 Material
3.1 Chemikalien 3.2 Kits
3.3 Pufferlösungen 3.4 Medien und Seren
27 27 27 29
3.5 Enzyme und Antikörper
3.6 Geräte, Instrumente und Materialien 3.7 Probenmaterial
30 31 32 4 Ergebnisse
4.1 Deletion der HAX1-Domänen
4.2 Prokaryotisches in vitro-System für VPRBDΔHAX1
4.3 Eukaryotisches in vitro-Systems für VPRBDΔHAX1-pET24d
4.3.1 Klonierung von pMMP-VPRBDΔHAX1-FLAG-CD24 4.3.2 Transduktion der Fibroblasten
4.3.3 Western Blot
31 36 37
5 Diskussion 45
Zusammenfassung 52
Literaturverzeichnis 53
Lebenslauf 61
Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 PromO 62
Danksagung 63
Anhang 64
Für Wienke und meine Familie
1 Einleitung
1.1 Schwere angeborene Neutropenie – Diagnostik und Therapie
Die schwere angeborene Neutropenie (Severe congenital neutropenia, SCN) ist ein primärer Immundefekt, bei dem es bedingt durch einen Mangel an Neutrophilen Granulozyten gehäuft zu Infekten kommt. Entsprechend der Funktion der Neutrophilen Granulozyten als Teil des angeborenen Immunsystems manifestiert sich die Erkrankung in früher Kindheit durch zahlreiche, typischerweise bakterielle Infekte (Nathan et al. 2006; Alter et al. 2007).
Diagnostiziert wird eine SCN anhand der Anzahl von Neutrophilen Granulozyten im peripheren Blut (Absolute neutrophil count, ANC). Ab einem ANC von 1500/µl spricht man von Neutropenie, ab einem ANC von 500/ µl von einer schweren Neutropenie.
Die Inzidenz der SCN wird heute auf 1:200000 geschätzt (Skokowa et al. 2007).
Die Prognose einer unbehandelten SCN ist aufgrund rezidivierender, schwerer Infekte infaust.
Durch die Einführung von rekombinantem G-CSF (Granulocyte colony-stimulating factor) in die Therapie liegt das erwartete mediane Überleben der SCN-Patienten heute bei 50 Jahren (Alter et al. 2007). Unter der Gabe von 5-10µg/kg/Tag G-CSF normalisiert sich bei den meisten Patienten der ANC auf einen therapeutischen Zielwert von über 1500/µl.
Bei SCN-Patienten unter Therapie mit G-CSF ist jedoch das Risiko für die Entwicklung einer akuten myeloischen Leukämie (AML) oder eines Myelodysplastischen Syndroms signifikant erhöht (Gilman et al. 1970).
1.2 SCN - Klassifikation der angeborenen Neutropenien
Als Ursachen von angeborenen Neutropenien sind eine gestörte Bildung, unzureichende Freisetzung, eine kürzere Lebensspanne oder ein gesteigerter Verbrauch der Neutrophilen Granulozyten möglich.
Angeborene Neutropenien bilden eine genetisch heterogene Gruppe von Erkrankungen. Eine mögliche Klassifikation erfolgt daher entsprechend ihres Vererbungsmodus in autosomal- dominante, und -rezessive sowie X-chromosomal-rezessive Formen der SCN. Als eine weitere Gruppe lassen sich davon die syndromalen Erkrankungen abgrenzen, die SCN als ein Symptom beinhalten.
Einleitung
1.2.1 Autosomal-dominante SCN
Die häufigste Form der SCN ist verursacht durch eine heterozygote Mutation im Gen der Neutrophilen Elastase (ELA2), die sich in ungefähr 60% der SCN-Patienten nachweisen lässt.
Zum ersten Mal wurden ELA2-Mutationen im Zusammenhang mit Zyklischer Neutropenie beschrieben (Horwitz et al. 1999).
Eine Zyklische Neutropenie manifestiert sich, wie die meisten angeborenen Neutropenien, schon im Kleinkindesalter und ist charakterisiert durch eine regelmäßig alle 21 Tage auftretende Neutropenie mit zwischenzeitig normalen ANCs.
Neben der zyklischen Neutropenie sind ELA2-Mutationen auch bei sporadischen und familiären Formen der SCN (Dale et al. 2000) beschrieben.
Der genaue Pathomechanismus der ELA2-Mutation, der letztlich zum Phänotyp der Neutropenie führt, ist bislang nicht vollständig aufgeklärt. Physiologischerweise spaltet die Neutrophile Elastase bakterielle Proteine bei der Infektabwehr.
Ferner gibt es Hinweise, dass auch die Interaktion von ELA2 mit N2N (Duan et al. 2004), G- CSF oder dessen Rezeptor (Hunter et al. 2003) den Phänotyp bedingen könnte.
Auch Fehlfaltungen des mutierten ELA2 führen in vitro zu gesteigerter Apoptose und würden auf diese Weise einen Mangel an Neutrophilen erklären (Köllner et al. 2006).
Eine weitere, seltenere Ursache einer autosomal-dominanten SCN ist bedingt durch eine Mutation des Transkriptionsfaktors GFI-1, die möglicherweise wiederum über eine Interaktion mit ELA2 zu einer SCN führen könnte (Person et al. 2003).
1.2.2 X-chromosomal-rezessive SCN
Diese primäre Neutropenieform mit X-chromosomal-rezessivem Vererbungsmuster ist bedingt durch aktivierende Mutationen im Gen des Wiskott-Aldrich-Syndrom-Proteins (WASP) und bisher bei drei Patienten beschrieben (Devriendt et al. 2001; Ancliff et al.
2006).
Zum ersten Mal wurde das WASP in Zusammenhang mit dem Wiskott-Aldrich-Syndrom beschrieben, einem primären Immundefekt mit rezidivierend auftretenden Infekten, Ekzem und einer thrombopeniebedingten Blutungsdiathese.
1.2.3 Autosomal-rezessive SCN
Die klassische Form der SCN, das Kostmann-Syndrom, wurde bereits 1956 erstmalig beschrieben. Basierend auf seinen Beobachtungen von sechs betroffenen Kindern einer
rezessive Form der Agranulozytose, die unbehandelt innerhalb des ersten Lebensjahres zum Tod führt (Kostmann et al. 1956).
Die Erkrankung manifestiert sich bereits kurz nach der Geburt und ist durch neutropeniebedingte Komplikationen, wie rezidivierende fieberhafte, bakterielle Infekte, häufig assoziiert mit abszedierenden Entzündungen der Atemwege und der Haut, gekennzeichnet. Neben ihrer Immundefizienz leiden die Patienten unter Osteoporose sowie einer erosiven Gingivitis und Peridontitis (Yakisan et al. 1997; Carlsson et al. 2004; Carlsson et al. 2006).
Neben der immunologischen Symptomatik zeigen einige der bisher beschriebenen Kostmann- Syndrom-Patienten zusätzlich neurologische Auffälligkeiten in Form von Krampfanfällen, teilweise begleitet von einer mentalen und psychomotorischen Entwicklungverzögerung (Rezaei et al. 2007; Germeshausen et al. 2008).
Charakteristisch ist zudem der Knochenmarksbefund mit einem typischen Reifungsstopp im (Pro-)Myelozyten-Stadium der Granulopoese (Abb. 1).
Abb. 1: Repräsentativer Knochenmarksausstrich eines Kostmann-Patienten und zum Vergleich ein Normalbefund: Auffällig ist der Mangel an reifen Neutrophilen Granulozyten (Abb. aus Klein et al. 2007).
Basierend auf einer genetischen Verknüpfungsanalyse von drei betroffenen kurdischen Familien identifizierten Klein et al. im Dezember 2006, 50 Jahre nach der Erstbeschreibung durch Rolf Kostmann, eine rekurrente homozygote Keimzell-Mutation im Gen des mitochondrialen Proteins HAX1 als Ursache des Kostmann-Syndroms. Bei allen untersuchten Patienten führt eine homozygote Mutation zu einem vorzeitigen Stop-Codon und zum Abbruch der Transkription. Daher wird HAX1 in Zellen von Kostmann-Patienten nicht exprimiert. Der Mangel an HAX1 führt in Neutrophilen Granulozyten von betroffenen Patienten zu gesteigerter Apoptose und erklärt somit den Phänotyp einer schweren, angeborenen Neutropenie (Klein et al. 2007).
Einleitung
Initiale Symptome:
Frühes Auftreten bakterieller Infektionen der Haut und der Schleimhäute - in der Neonatalperiode: Nabelinfektionen und Paronchyie - später: Hautabszesse und schwere aphtöse Läsionen
Rezidivierende bakterielle Infektionen der Ohren und der Atemwege
Schwere systemische Infektionen
Überwiegend Staphylokokken und Streptokokken im kulturellen Nachweis
Gedeihstörung
Krampfanfälle (nicht obligatorisch) Längerfristige Symptomatik:
Peridontitis
Spleno- und Hepatomegalie
Osteoporose
Myelodysplastisches Syndrom/Akut myeloische Leukämie
Mentale und psychomotorische Entwicklungsverzögerung (nicht obligatorisch) Laborbefunde:
ANC < 0,5 x 109/l, häufig unter 0,2 x 109/l
Häufig eine milde Anämie und Thrombozytose
Häufig erhöhte Anzahl an Monozyten und eosinophilen Granulozyten
Erhöhte IgG-Spiegel
Im Knochenmarksausstrich: Reifungsstopp im (Pro-)Myelozyten-Stadium der Granulopoese mit Mangel an reifen Granulozyten
Tab. 1: Kostmann Syndrom: Klinisches Bild und Laborbefunde (modifiziert nach Carlsson et al. 2006).
1.3 SCN und Apoptose
Die klassische Form der mitochondrial lokalisierten Neutropenie, das Kostmann Syndrom, ist bedingt durch Mutationen im Gen des mitochondrialen Proteins HAX1. Der zugrundeliegende Pathomechanismus ist eine gesteigerte Apoptose der myeloischen Zellen bei betroffenen Patienten (Carlsson G et al. 2004; Cario et al. 2005; Klein et al. 2007).
Damit erweitert sich das Feld hämatologischer Erkrankungen, bei denen das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Apoptose zugunsten eines gesteigerten Zelluntergangs verschoben ist. Zu diesen Erkrankungen zählen neben der Zyklischen Neutropenie (Aprikyan et al. 2001) und der Myelokathexis (Aprikyan et al. 2000) auch das myelodysplastische Syndrom (MDS) (Raza et al. 1995; Hellström-Lindberg et al. 1997).
1.3.1 Apoptose - der programmierte Zelltod
Der Begriff Apoptose basiert auf den griechischen Begriffen für „herab” und „fallen” und beschreibt damit, in Anlehnung an herabfallendes Herbstlaub, den physiologischen Zelltod (Jeremias et al. 2001).
Inzwischen ist bekannt, dass Apoptose einen genetisch exakt determinierten und im Verlauf der Evolution hochkonservierten Vorgang darstellt. Daher spricht man auch vom programmierten Zelltod.
Apoptose ist essentiell für die Entwicklung und Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase in eukaryotischen Zellen. Fehlregulationen in diesem Gleichgewicht aus proliferativen und apoptotischen Signalen bilden die Grundlage zahlreicher Erkrankungen wie Immundefekten, malignen Erkrankungen sowie Autoimmunerkrankungen (Thompsen, 1995).
Lichtmikroskopisch lässt sich bei apoptotischen Zellen eine typische Morphologie nachweisen, in der sich der Vorgang der Apoptose von der Nekrose als zweiter Form des Zelltods abgrenzt. Dabei kommt es zunächst zu einer Kondensation des Chromatins und des Zytoplasmas und anschließender Fragmentierung der Zelle mit charakteristischen Einschnürungen, den sogenannten apoptotic-bodies. Diese membranumhüllten Vesikel enthalten Chromatin und Zytoplasmabestandteile und werden von den umgebenden Zellen und Makrophagen aufgenommen.
Im Gegensatz zur Nekrose bleibt bei der Apoptose die Zellmembran überwiegend intakt und es werden keine Zellbestandteile in den Interzellularraum abgeben. Auf diese Weise wird eine mögliche Entzündungsreaktion im betroffenen Gewebe umgangen (Opferman et al. 2003).
Innerhalb des Apoptosevorgangs lassen sich zwei Auslösemechanismen, ein extrinsischer und ein intrinsischer Signalweg, unterscheiden, die beide in der Aktivierung der Caspasen, einer
Einleitung
Gruppe von Cystein-Aspartat-Proteasen, münden und damit letztlich zur charakteristischen Zellfragmentierung führen (Youle et al. 2008).
Der extrinsische Signalweg, auch als death-receptor vermittelter Signalweg bezeichnet, wird getriggert durch die Bindung verschiedener Moleküle der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)- Rezeptor-Familie, z.B. Fas oder TNF-Rezeptor 1 (TNFR1), welche auch als death receptors bezeichnet werden. Fas oder TNFR1 können über das Membranprotein FADD (Fas- associated death domain) die intrazellulär lokalisierte Caspase-8 aktivieren. Die Protease Caspase-8 wiederum aktiviert verschiedene Effektorcaspasen, wie beispielsweise Caspase-3, - 6 oder -7.
Der intrinsische Signalweg, auch als mitochondrialer Signalweg bezeichnet, wird durch eine Vielzahl an Auslösern, wie z. B. virale Infektionen, DNA-Schäden oder den Entzug von Wachstumsfaktoren, getriggert. Dabei wird der intrinsische Signalweg kontrolliert von der B- cell-lymphoma-2 (BCL-2)-Proteinfamilie, einer Gruppe pro- und antiapoptotischer Moleküle, welche aufgrund ihrer zentralen Rolle auch als „Wächter“ der mitochondrialen Apoptose (Yan et al. 2005) bezeichnet werden. Funktionell lässt sich die BCL-2-Familie in 3 Untergruppen unterteilen.
Namensgebend für die gesamte Proteinfamilie ist BCL-2, welches neben BCL-XL, BCL-W, MCL1 und BCL-B zur antiapoptotischen Unterguppe der BCL-2-Familie gehört. Das BCL-2- Gen wurde erstmals in Zusammenhang mit der Genese follikulärer B-Zell-Lymphome beschrieben (Vaux et al. 1988). Aufgrund einer chromosomalen Translokation zwischen den Chromosomen 14 und 18 kommt es in den betroffenen B-Lymphozyten zur Überexpression von BCL-2. Die t(14;18) Translokation führt auf diese Weise zu einer gesteigerten apoptotischen Resistenz der mutierten B-Zellen. Die Entdeckung eines möglichen antiapoptotischen Einflusses durch BCL-2 begründete ein neues Paradigma für die maligne Transformation eukaryotischer Zellen.
Als zweite Untergruppe lassen sich die proapoptotischen Moleküle BAX, BAK und BOK abgrenzen.
Eine dritte Unterguppe bilden die Bcl-2-homologue-3 (BH3)-only Proteine BAD, BIK, BID, HRK, BIM, BMF, Noxa und Puma, benannt nach ihrer funktionell relevanten BH3- Proteindomäne. Die BH3-only-Proteine haben innerhalb der BCL-2-Familie über ihre Interaktion mit den antiapoptotischen Molekülen, wie BCL-2 und BCL-XL, regulatorische Funktion.
Die Moleküle der BCL-2-Familie regulieren innerhalb der intrinsischen Signalkaskade die Stabilität der äusseren Mitochondrienmembran (Outer mitochondrial membrane, OMM). Die
proapoptotischen Moleküle BAX und BAK induzieren die Permeabilisation der OMM. Die Destabilisierung der OMM markiert den „point of no return“, in dessen Folge es zur Freisetzung zahlreicher apoptogener Moleküle, wie Cytochrom C, Smac/Diablo, der Serin- Protease HtrA2/OMI (High-temperature-regulated A2), AIF (Apoptosis-inducing factor), Endonuklease G (Endo G) sowie einer trunkierten Form von OPA1 (Optic atrophy 1), aus dem Intermembranraum kommt (Newmeyer et al. 2003; Green et al. 2004; Arnoult et al.
2005; Ekert et al. 2005). Die antiapoptotischen Moleküle BCL-2 und BCL-XL sind in der Lage BAK und BAX zu binden, dessen Funktion zu antagonisieren und auf diese Weise die OMM zu stabilisieren.
Von den BH3-Molekülen ist bekannt, dass sie einerseits direkt mit BAK und BAX interagieren, andererseits über einen inhibitorischen Einfluss auf BCL-2 oder BCL-XL indirekt die Funktion der proapoptotischen Proteine beeinflussen können (Willis et al. 2007;
Youle et al. 2008). Die Freisetzung der Moleküle aus dem Intermembranraum führt zur Aktivierung der Caspasen. Im Zuge dessen bildet Cytochrom C zusammen mit APAF1 (Apoptotic peptidase activiating–factor-1) eine hexamere Struktur, das Apoptosom. Das Apoptosom induziert Veränderungen in der Proteinkonformation der Procaspase-9 und führt so zu dessen Aktivierung. Die Caspase-9 ist in ihrer aktivierten Form in der Lage Effektorcaspasen, wie Capsase 3 zu aktivieren (Wang 2001; Shi 2006).
In diesem Schritt, der Aktivierung der Caspase-3, vereinen sich der extrinsische und der intrinsische Signalweg. Beide führen somit zu den typischen morphologischen Veränderungen, wie der DNA-Fragmentierung, der Chromatinkondensation und der Bildung der apoptotic-bodies.
Die Aktivierung der Caspasen-3 wird zusätzlich beeinflusst von einer Vielzahl von Molekülen, wie Smac/DIABLO, HtrA2/Omi und IAP (Inhibitor-of-apoptosis-protein). Dabei hat IAP über eine Interaktion mit der Caspase-3 inhibitorischen Einfluss auf dessen Aktivierung. Die aus dem Intermembranraum freigesetzten Moleküle HtrA2/Omi und Smac/DIABLO wirken im Gegensatz dazu über ihren inhibitorischen Einfluss auf IAP proapoptotisch. (Hengartner et al. 2000)
Zwischen dem intrinsischen und dem extrinsischen System existiert in einem früheren Abschnitt der Signalkaskade eine weitere Schnittstelle, hergestellt durch das Molekül BID.
BID gehört ebenfalls zu den proapoptotischen Molekülen der BCL-2-Familie. Nach Aktivierung der Caspase-8 innerhalb der extrinsischen Signalkaskade führt die proteolytische Spaltung von BID zu dessen Translokation an das Mitochondrium. Dort wirkt die trunkierte Form, tBID, analog zu BAX und BAK destabilisierend auf die OMM und greift auf diese
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Weise in den mitochondrien-abhängigen, intrinsischen Signalweg ein. (Hengartner et al.
2000; Youle et al. 2008)
1.3.2 HAX1
HCLS1 associated protein X1 (HAX1; GeneID 10456) ist lokalisiert auf dem kurzen Arm von Chromosom 1 und besteht aus 7 Exons und 6 Introns. Nach der Transkription sind 2 Varianten beschrieben, welche sich strukturell und funktionell unterscheiden. Dabei unterscheidet sich Trankriptionsvariante b von Variante a durch ein verkürztes Exon 2, basierend auf einer alternativen splice-site, jedoch ohne Auswirkungen auf das Leseraster. Die resultierenden Isoformen a (Protein accession NP_006109.2; NM_006118.3) und b (Protein accession NP 001018238.1; NM 001018837.1) unterscheiden sich zudem in ihrem Expressionsmuster. Während Isoform a ubiquitär exprimiert wird, ist Isoform b in relativ hoher Menge in Hirnzellen nachzuweisen. Die Lokalisation der Mutationen korreliert somit, entsprechend ihrer Auswirkung auf die Isoform b, mit zusätzlich zur Immundefizienz auftretender neurologischer Symptomatik. Die Mehrzahl der Kostmann-Patienten (23 von bisher beschriebenen 29 Patienten) weisen Mutationen auf, die nur die längere Isoform a betreffen und zeigen dementsprechend keine neurologischen Auffälligkeiten (Germeshausen et al. 2008).
Isoform a hat eine Länge von 2978bp. Nach dem Spleissvorgang hat die mRNA eine Länge von 840bp. Die mRNA der Isoform a wird zu einem 279 Aminosäuren (AS) großen Protein mit einem Molekulargewicht von 35kDa translatiert.
In der Zelle ist HAX1 überwiegend an den Mitochondrien lokalisiert (Suzuki et al. 1997) und hat, neben seiner antiapoptotischen Funktion, eine Bedeutung bei der B-Zell-vermittelten Signaltransduktion und dem Aufbau des Aktin-Zytoskeletts (Gallagher et al. 2000; Radhika et al. 2004). Darüber hinaus sind Interaktionen zwischen HAX1 und weiteren intrazellulären Proteinen, wie beispielsweise den Gallensäure-Transporter-Proteinen MDR1, MDR2 und BSEP (Ortiz et al. 2004) und Phospholamban aus Herzmuskelzellen (Vafiadaki et al. 2007) beschrieben.
Innerhalb des HAX1-Proteins lassen sich vom N- zum C-terminalen Ende vier funktionell relevante Proteindomänen, die Bcl-2 homologen Domänen 1 und 2 (BH1 , BH2), die Prolin-, Glutaminsäure-, Serin- und Threonin-reiche Domäne (PEST) und die HIV1 viral protein R binding domain (VPRBD) unterscheiden, die im folgenden Abschnitt beschrieben werden.
Abb. 2: Schematische Übersicht über die HAX1-Domänen. Position der Domänen in AS angegeben.
Bcl-2 homologe Domäne 1 und 2 (BH1 , BH2)
Vergleichende strukturelle Analysen von HAX1 mit Molekülen der Bcl-2-Familie haben eine Homologie hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz ergeben (Suzuki et al. 1997).
So besitzen alle Moleküle der BCL-2-Familie abhängig von ihrer pro- oder antiapoptotischen Funktion charakteristische Kombinationen bestimmter Motive innerhalb ihrer Aminosäuresequenz, die sogenannten Bcl-2 homologen (BH) Domänen.
Die meisten antiapoptotischen Proteine, wie BCL-2, BCL-XL und BCL-W besitzen dabei alle vier BH-Domänen (BH1-4) während proapoptotische Moleküle abhängig von ihrer Funktion entweder die BH-Domänen 1-3, wie etwa bei BAK und BAX oder wie BID und BIM nur eine BH3- Domäne aufweisen (Gross et al. 1999).
Essentiell für die Regulation der mitochondrialen Apoptose ist die Interaktion dieser pro- und antiapoptotischen Proteine. Dabei bilden die Domänen BH1, BH2 und BH3 innerhalb der antiapoptotischen Moleküle eine hydrophobe, cavitäre Struktur, welche die Bindungsstelle für die BH3-Domäne der proapoptotischen Proteine bildet (Opfermann et al. 2003).
Innerhalb der Aminosäuresequenz von HAX1 lassen sich Ähnlichkeiten zu den BH1- und BH2-Dömanen der BCL-2 Familie feststellen. Besonders diese beiden Domänen sind im Verlauf der Evolution erhaltene Motive, welche in einer Vielzahl mehrzelliger Organismen (Metazoa) nachgewiesen werden können (Dunn et al. 2006).
In seiner Struktur ist HAX1 besonders mit Bfl-1/A1, einem mit 175 Aminosäuren sehr kurzen Mitglied der Bcl-2 Familie, vergleichbar. Bfl-1/A1 verfügt ebenfalls nur über eine BH1- und eine BH2-Dömane (Zhang et al. 2000; Dunn et al. 2006).
Trotz seiner relativ kurzen Struktur bindet Bfl-1/A1 das proapoptotische Molekül BAX über eine Interaktion mit dessen BH3-Domäne (Zhang et al. 2000).
Experimente mit Bfl-1/A1, bei denen gezielt Mutationen innerhalb der BH1- und BH2- Domäne gesetzt wurden, haben gezeigt, dass beide Domänen essentiell für dessen antiapoptotische Funktion sind (D'Sa-Eipper et al. 1998). Vergleichbare Ergebnisse zeigten sich in Mutationsexperimenten mit BCL-2, dessen antiapoptotische Funktion, ebenso wie dessen Fähigkeit zur Heterodimerisation mit BAX an die BH1- und BH2-Domäne geknüpft sind (Yin et al. 1994; Hanada et al. 1995).
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Welche Rolle den beiden Domänen innerhalb von HAX1 zukommt und ob sie auch für Interaktion mit anderen Proteinen essentiell sind, ist bisher nicht bekannt.
Prolin-, Glutaminsäure-, Serin- und Threonin-reiche Domäne (PEST)
Neben den beiden BH-Domänen besitzt HAX1 zudem eine PEST-Domäne. Als PEST- Domäne bezeichnet man Abschnitte in der AS-Sequenz eines Proteins, die reich an den Aminosäuren (AS) Prolin (P), Glutaminsäure (E), Serin (S) und Threonin (T) sind (Rogers et al. 1986). Sie sind kennzeichnend für Proteine mit besonders kurzen Halbwertszeiten, wobei die PEST-Domäne als Erkennungssequenz für den Abbau im Ubiquitin-Proteasom-System fungiert (Rechsteiner et al. 1996).
Innerhalb der BCL-2-Familie besitzt MCL1 eine solche PEST-Sequenz und ist dementsprechend instabil (Zhong et al. 2005; Day et al. 2005).
Zudem konnten Derouet et al. zeigen, dass GM-CSF über einen verminderten zellulären Turnover von MCL1 Apoptose in Neutrophilen Granulozyten inhibiert (Derouet et al. 2004).
Experimente mit Mutanten des NPDC-1 (Neural proliferation and differentiation control protein-1), bei denen die carboxy-terminale PEST-Domäne entfernt wurde, haben gezeigt, dass der schnelle Abbau des Proteins an dessen PEST-Domäne gekoppelt ist (Spencer et al.
2004).
HIV1 Virales Protein R binding domain (VPRBD)
Als ein Interaktionspartner von HAX1 wurde das HIV1 Viral Protein R (VPR) identifiziert.
VPR ist von zentraler Bedeutung bei der Pathogenese der HIV-Infektion und der Entwicklung von AIDS. VPR ist beteiligt an der Integration der viralen Erbinformation in die Wirts-DNA und stimuliert weiterhin die Expression verschiedener Virus-Proteine (Le Rouzic et al. 2005).
Darüber hinaus besitzt VPR proapoptotisches Potential und ist ursächlich beteiligt am stetigen Verlust von CD4+-Lymphozyten im Verlauf der HIV-Infektion (Yedavalli et al. 2005). Dabei aktiviert VPR die Caspasen 9 und 3 (Muthumani et al. 2002) und wirkt destabilisierend auf das mitochondriale Membranpotential (MMP). Analog zu Molekülen der BCL-2-Familie interagiert VPR mit dem PTPC (Permeabilization transition pore complex) an der IMM (Jacotot et al. 2000; Jacotot et al. 2001).
Yedavalli et al. haben in ihren Experimenten gezeigt, dass VPR-induzierte Apoptose durch Überexpression von HAX1 supprimiert wird. Zudem identifizierten sie unter Verwendung verschiedener Deletionsmutanten (DM) von HAX1 den Bereich zwischen AS 118-141 als die
Neben der Interaktion mit HIV1 VPR interagiert HAX1 mit EBNA-LP (Epstein-Barr virus nuclear antigen leader protein) (Kawaguchi et al. 2000) sowie mit dem K15 Protein des Humanen Herpersvirus 8 (HHV 8) (Sharp et al. 2002).
1.3.3 HAX1 und Apoptose
Mit der Identifikation von HAX1 als essentiellem Faktor für die Homöostase myeloischer Zellen konnte der Pathomechanismus der autosomal-rezessiven Form der SCN aufgeklärt werden.
Ausgehend von der mitochondrialen Lokalisation von HAX1 untersuchten Klein et al. (2007) dessen Einfluss auf die Stabilität des Mitochondrienmembran, als zentrale Barriere innerhalb des intrinsischen Signalweges.
In den untersuchten Zellen wurde die Permeabilisierung der inneren Mitochondrienmembran (IMM), welche mit dem Verlust des mitochondrialen Membranpotential (Δψm) korreliert, im Durchflusszytometer analysiert.
Zur Darstellung des Δψm wurden die untersuchten Neutrophilen Granulozyten mit JC-1, einem dualen Indikatorsystem, gefärbt. Nach der Färbung liegt JC-1 als Polymer in den Mitochondrien vor und fluoresziert orange. Bei Verlust des Δψm verändert sich dessen Konformation und JC-1 emittiert in seiner monomeren Form grüne Fluoreszenz. Anhand des Verhältnisses aus beiden Fluoreszenzen lässt sich die Permeabilisierung der IMM durchflusszytometrisch darstellen.
Dabei triggert die Permeabilisierung der IMM die Destabilisierung der OMM mit konsekutiver Freisetzung proapoptotischer Moleküle aus dem Intermembranraum.
Mit dieser Methode konnten Klein et al. zeigen, dass die IMM bei HAX1-defizienten Granulozyten nach Inkubation mit Valinomycin (100 nM) schneller destabilisiert als in den Wildtyp (WT)-Kontrollen.
Weitere Apoptoseexperimente, basierend auf einer Färbung mit Annexin-V/Propidium Iodid, bestätigten die Ergebnisse. Nach retroviralem Transfer von HAX1 war der Phänotyp einer gesteigerten Apoptose in HAX1-defizienten Granulozyten vollständig reversibel.
Diese Ergebnisse belegen die antiapoptotische Funktion von HAX1 in myeloischen Zellen.
(Klein et al. 2007)
Erstmalig wurde eine antiapoptische Funktion von HAX1 2002 in Zusammenhang mit dem Humanen Herpesvirus 8 (HHV-8) Protein K15 postuliert. Im Hinblick auf die Homologie zwischen HAX1 und Proteinen der BCL-2-Familie (Suzuki et al. 1997) untersuchten Sharp et
Einleitung
al. das antiapoptotische Potential von HAX1 nach Co-Transfektion von HeLa-Zellen mit BAX und HAX1. In Gegenwart von HAX1 überlebten die untersuchten Zellen länger als in den Kontrollen. Dabei war das antiapoptotische Potential vergleichbar mit dem von BCL-XL nach Co-Transfektion der HeLa-Zellen mit BAX und BCL-XL (Sharp et al. 2002).
Ein weiterer Beleg für die zentrale Rolle von HAX1 bei der Regulation der Apoptose ist dessen Interaktion mit den mitochondrialen Proteasen HtrA2/Omi und PARL (Presenilin- associated, rhomboid-like) in Lymphozyten und neuronalen Zellen. HAX1 formt dabei ein Komplex mit PARL an der IMM. HtrA2 wird als inaktive Vorform synthetisiert und ins Mitochondrium transportiert. In Gegenwart von HAX1 kommt es zur proteolytischen Spaltung von HtrA2 durch PARL. In seiner aktiven Form ist HtrA2 in der Lage die Akkumulation von BAX an der OMM zu inhibieren und so der Permeabilisierung der OMM entgegenzuwirken (Chao et al. 2008).
1.4 Zielsetzung der Arbeit
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Etablierung eines in vitro-Modells zur molekularen Charakterisierung von HAX1. Basierend auf der Polymerase Chain Reaction (PCR) sollen Deletionsmutanten von HAX1 konstruiert werden, denen jeweils eine der vier HAX1 Domänen (BH1, BH2, PEST, VPRBD) fehlt.
Die vier Deletionsmutanten, BH1ΔHAX1, BH2ΔHAX1, PESTΔHAX1 und VPRBDΔHAX1 können sowohl in bakterielle als auch in retrovirale Expressionsysteme kloniert werden.
Damit liefern sie die notwendige Grundlage für eine Vielzahl an Experimenten zur weiteren funktionellen Charakterisierung von HAX1.
Basierend auf Experimenten mit den vier Deletionsmutanten lässt sich aufklären, welche Domänen innerhalb des Proteins beispielsweise essentiell für dessen antiapoptotische Funktion sind.
Weiterhin können die Mutanten in Interaktionsstudien verwendet werden, um zu zeigen, über welche Domänen HAX1 beispielsweise mit Molekülen der BCL-2 Familie interagiert.
2 Methoden
2.1 Molekularbiologische Methoden
Die Zusammensetzung der verwendeten Puffer ist unter 3.3 aufgeführt.
2.1.1 Überlappende PCR/Combination-PCR
Zur Generierung der vier Deletionsdomänen basierend auf PCR wurden für jede Domäne spezifische, HAX1-interne Primer entworfen.
Dabei bindet der interne Forward-Primer (Abb.3, Pfeil 2) „hinter“ und der interne Reverse- Primer (Abb. 3, Pfeil 2) „vor“ der entsprechenden Domäne. Zusätzlich wurden dem Reverse- Primer weitere 10 Nukleotide angehängt, die zu dem Abschnitt „hinter“ der Domäne komplementär sind. Weiterhin wurden externe Primer (Abb.3, Pfeile A + B) entworfen, mit denen an dass 5´-Ende jedes Mutanten eine NcoI- und an das 3´-Ende eine Eco-RI- Restriktionsschnittstelle angehängt wird.
Abb. 3: PCR-Strategie zur Generierung einer HAX1-Domain-Deletion: Schematisch ist eine HAX1-cDNA- Sequenz dargestellt (obere Abbildung) in deren 5`-Bereich die BH1-Domaine lokalisiert ist.
Zunächst wurde in zwei getrennten PCR-Reaktionen basierend auf humaner HAX1 cDNA (Gene ID 10456) jeweils ein interner mit dem korrespondierenden externen Primer kombiniert, so dass in einer PCR das Fragment vor und in einer weiteren hinter der entsprechenden Domäne amplifiziert wurde. Die verwendeten Primer-Kombination für die beiden initialen PCRs sind im Ergebnisteil in Tabelle 9 aufgelistet.
In einem zweiten Schritt wurden die amplifizierten Fragmente kombiniert, wobei die beiden initialen Fragmente in einem kurzen Abschnitt zueinander komplementär sind.
BH1
5´ 3´
A
1 B 2
PCR 1: Primer A + Primer 1
PCR 2: Primer B + Primer 2 PCR 3: Primer A + Primer B B
A
Methoden
In einer sogenannten Combination-PCR wurde unter Verwendung beider externer Primer ein HAX1-Fragment amplifiziert, in dem nur die entsprechende Domäne entfernt wurde.
Basierend auf dieser Strategie wurden in der BH1∆HAX1-, BH2∆HAX1-, PEST∆HAX1- und einen VPRBD∆HAX1-Mutanten hergestellt. Die Sequenzen der verwendeten Primer sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die Zusammensetzung für die verschiedenen PCR ist in Tabelle 3 dargestellt. Die PCR wurde mit dem Mastercycler (Eppendorf, Wesseling Berzdorf) und unter den in Tabelle 4 angegebenen Konditionen durchgeführt.
Externe Primer:
NcoI forward CCA TGG CTA TGA GCC TCT TT EcoRI reverse GAA TTC AAC CGG GAC CGG AAC Interne Primer:
BH1 forward CCC CCT GAG GAA TTT GGG TTC G
BH1 reverse CAA ATT CCT CAG GGG GTT CCT CAT CAT CAT C BH2 forward AGC ATC TTC AGC GAT ATG GGG
BH2 reverse TGA AGA TGC TTA TCC CTC CTC CTG G PEST forward AGA CTA CGG GAG GGA CAG AC
PEST reverse CTC CCG TAG TCT ATG GGA AGG CAA GG VPRBD forward GGG GGG GTC TTG GAG AGT G
VPRBD reverse TCT CCA AGA CCC CCC CCT CAC CAG GTG TC
Tab. 2: Sequenzen der verwendeten Primer: die Basensequenz der Primer ist in 5´ 3´-Orientierung angegeben.
50-100 ng DNA
1x PCR-Puffer (Roche Diagnostics, Mannheim) 0,2mM dNTPs (Roche Diagnostics, Mannheim) 0,5 µM Forward-Primer
0,5 µM Reverse-Primer
0,5% DMSO (Sigma, Deisenhofen)
0,6 U Taq Polymerase,High fidelity (Roche Diagnostics, Mannheim) dH20
10 µl Endvolumen
Tab. 3: Zusammensetzung des PCR-Ansatzes
Initiale Denaturierung 95°C 10min
30 Zyklen:
Denaturierung 95°C 10min
Annealing 55°C 30sec
Elongation 72°C 1min
Abschliessende Synthese 72°C 10min
Tab. 4: PCR-Konditionen
2.1.2 Gelelektrophorese
Nach der PCR wurden die generierten DNA-Fragmente in einem Agarosegel entsprechend ihrer Größe elektrophoretisch aufgetrennt.
Dabei wird dem Gel in einer Gelkammer ein elektrisches Feld angelegt. Aufgrund ihrer Polarität, bedingt durch die negativ geladenen Phosphatgruppen, wandern die DNA-Proben zur Anode. Bei der Passage des Gels werden die Fragmente entsprechend der Größe aufgetrennt. Abhängig von der Größe der erwarteten Fragmente lassen sich Gele mit 0,7-1,5%
Agarose-Anteil (Biozym, hess. Oldendorf) herstellen. Die Gele werden dabei mit 0,05%
Ethidiumbromid (AppliChem, Darmstadt) versetzt. Ethidiumbromid ist ein roter Phenatridin- Farbstoff, der nach Interkalation mit DNA unter UV-Licht sichtbar wird. Als Laufpuffer wird 1x TBE-Puffer (Tris-Borat-EDTA) verwendet. Die Proben werden mit 1x Laufpuffer versetzt und die Größe der Fragmente unter UV-Licht anhand einer DNA-Leiter (100 bp-Leiter, PEQLAB; 1 kb-Leiter, New England Biolabs, Ipswich, USA) bestimmt. Die Elektrophorese wird bei einer Spannung von 13V/cm durchgeführt. Nach Beurteilung der Proben unter UV- Licht lassen sich die gewünschten Proben mit einem Skalpell aus dem Gel heraustrennen.
Unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (QIAGEN, Hilden) werden die DNA- Proben anschließend aufgereinigt und die Konzentration für die weitere Verwendung photometrisch bestimmt.
2.1.3 Ligation
Nach Generierung eines DNA-Fragmentes in der PCR oder einem Restriktionsverdau lässt sich das Fragment für die weitere Verwendung in einen Vektor ligieren. Dabei sind verschiedene Vektorsysteme zu unterscheiden.
Methoden
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die drei Vektorsysteme pGEM-T (Promega, Madison, USA), pET24d (Novagen®, EMD, Madison, USA) und pMMP-IRES-CD24 (konstruiert von G. Köhne, AG Klein) verwendet. Der pMMP-IRES-CD24-Vektor bildet das retrovirale backbone für das, bei der Klonierung verwendete, Konstrukt pMMP-HAX1-FLAG-IRES- CD24 (konstruiert von R.Rittner, AG Klein). Eine Übersicht über die verwendeten Vektorsysteme findet sich in Tabelle 5.
Größe Antibiotika-Resistenz Funktion
pGEM-T 3000 bp Ampicillin Klonierungsvektor
pET24d 5310 bp Kanamycin Prokaryotischer
Expressionvektor, C-terminales His-Tag pMMP-IRES-
CD24
7136 bp Ampicillin Retrovirales backbone, murines CD24
Tab. 5: Übersicht über die verwendeten Vektorsysteme
Im Anschluss an die PCR wurden die verschiedenen Deletionsmutanten im Verhältnis 3:1 in den Klonierungsvektor pGEM-T ligiert. Nach Sequenzkontrolle wurde VPRΔHAX1 in pET24d ligiert. Im Rahmen der entwickelten Klonierungstrategie zur Herstellung eines retroviralen Expressionssystems wurde eine Ligation mit drei Fragmenten durchgeführt, bei der die Fragmente in absteigender Größe im Verhältnis 1:3:7 dem Ansatz zugefügt wurden.
Das Vektor-backbone wurde vor der Ligation mit Antarctic Phosphatase (New England Biolabs, Ipswich, USA) dephosphoryliert.
Bei den Ligationen wurde den Fragmenten T4-DNA-Ligase (1:10, New England Biolabs, Ipswich, USA) und 10x Ligationspuffer (1:10) in einem Endvolumen von 10µl hinzugefügt.
Die Kalkulation der notwendigen DNA-Menge erfolgte nach folgender Formel:
Die Ligationsansätze wurde entweder über 1 h bei Raumtemperatur (RT) oder 12 h bei 4°C inkubiert.
2.1.4 Transformation
Für die Transformation wurden chemisch kompentene XL10-Gold Escherichia coli-Bakterien verwendet. Die bei -80°C gelagerten Bakterien wurden zunächst auf Eis aufgetaut.
In jedem Transformationansatz wurden 50µl der Bakterien mit 50-200ng des Plasmids Ligationsansatzes versetzt und für 30 min auf Eis inkubiert. Dabei kommt es zur Anlagerung der Plasmide an die Bakterienmembran. Danach wurden die Bakterien im Reaktionsansatz einem Hitze-Schock über 2min bei 42°C ausgesetzt und anschließend weitere 2min auf Eis abgekühlt. Durch den Hitze-Schock wird die Bakterienmembran destabilisiert und das Plasmid von den Bakterien aufgenommen. Nach Zugabe von 200µl LB-Medium wurde der Ansatz in einem Inkubator für 1 H bei 37°C und 900 rpm inkubiert.
Anschließend wurden die transformierten Bakterien entsprechend der vektorvermittelten Resistenz auf antibiotikahaltigen LB-Agarplatten (Luria-Bertani, LB) ausgestrichen. Über die Antibiotikaresistenz werden dabei die transformierten Bakterien selektiert. Nach 12-stündiger Inkubation der Platten bei 37°C konnten die gewachsenen Bakterienkolonien für die Plasmid- Präparation weiterverarbeitet werden.
2.1.5 Präparation von Plasmid-DNA
Bei der Isolation von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen wurde nach dem Prinzip der Alkalischen Lyse verfahren (Birnboim und Doly, 1979; Ish-Horowicz und Burke, 1981). Für die Präparation wurden die Puffer P1, P2 und P3 des QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN, Hilden) verwendet.
Dabei werden von den vorbereiteten Agarplatten pro Mutant 10 transformierte Bakterienkolonien gepickt und in jeweils 5ml antibiotikahaltigem LB-Kulturmedium über 12 h bei 400rpm inkubiert. Nach der Inkubation werden die Bakterien abzentrifugiert und pro Ansatz in 100µl kaltem Resuspensionspuffer (QIAGEN P1) resuspendiert. Nach Zugabe von 200µl Lyse-Puffer (QIAGEN P2) wird das Eppendorf-Röhrchen vorsichtig gewendet und anschließend zwei Minuten auf Eis inkubiert. Die Lyse-Reaktion wird durch Zugabe von 150µl Ausfällungspuffer (QIAGEN P3) beendet, wobei die zahlreichen Bakterienbestandteile ausfallen und durch anschließende Zentrifugation vom Überstand getrennt werden. Der Überstand enthält nur noch Plasmid-DNA sowie kleinere Proteine. Die weitere Aufreinigung der Plasmid-DNA erfolgt durch Zugabe von zwei Volumenanteilen Phenol/Chloroform (Roth, Karlsruhe). Dabei ist zu beachten, dass alle Arbeiten mit Phenol/Chloroform notwendigerweise unter dem Abzug stattfinden. Nach der Zentrifugation bilden sich im Reaktionsgefäß zwei Phasen, mit der in Lösung befindlichen Plasmid-DNA in der oberen,
Methoden
Phenol/Chloroform in der unteren Phase und den verbliebenen Proteinen an der Phasengrenze. Die obere Phase wird abpipettiert und in einem anderen Gefäß weiterverarbeitet. Durch Zugabe von zwei Volumenanteilen 100% Ethanol wird die Plasmid- DNA ausgefällt und der Überstand verworfen. In einem zweiten Schritt wird das Pellet in 70% Ethanol resuspendiert. Dabei wird die DNA von wasserlöslichen Salzen bereinigt, welche beispielsweise bei einem Restriktionsverdau die Aktivität der verwendeten Enzyme beeinflussen könnten. Abschliessend wird erneut zentrifugiert und das aufgereinigte Plamid- DNA abhängig von der Größe des Pellets in 30-50µl dH2O resuspendiert.
2.1.6 Restriktionsverdau
Die Verwendung von Restriktionsendonukleasen ist eine gängige Methode bei der Charakterisierung von DNA. Gleichzeitig lassen sich mit Restriktionsenzymen sequenzkontrollierte Konstrukte aufspalten und die Fragmente für weitere Klonierungen verwenden.
Restriktionsenzym Inkubationsbedingungen Schnittstelle EcoRI 37°C/1h oder 4°C/12h, HI 5´…G▼AATTC…3´
3´…CTTAA▲G…5´
HaeII 37°C/1h oder 4°C/12h, HI, BSA
5´…RGCGC▼Y…3´
3´…Y▲CGCGR…5´
NcoI 37°C/1h oder 4°C/12h, HI 5´…C▼CATGG…3´
3´…GGTAC▲C…5´
SacII 37°C/1h oder 4°C/12h, HI 5´…CCGC▼GG…3´
3´…GG▲CGCC…5´
XhoI 37°C/1h oder 4°C/12h, HI 5´…C▼TCGAG…3´
3´…GAGCT▲C…5´
Tab. 6: Verwendete Restriktionsenzyme, Inkubationsbedingungen. BSA: Bovine Serum Albumin, HI: Heat Inactivation
Vor der Sequenzierung der vier Mutanten wurde die Ligation des PCR-Amplikons in pGEM- T mittels eines Restriktionsverdaus mit NcoI und EcoRI überprüft. Nach dem Restriktionsverdau wurden die Proben elektrophoretisch aufgetrennt und analysiert. Nur die verifizierten Klone wurden sequenziert.
Um die vier Deletionsmutanten in einen retroviralen Vektor zu klonieren zu können, wurde zwei Klonierungsstrategien (Ergebnisteil Abb. 9 und Abb. 12) entwickelt. Dafür wurde der Ausgangsvektor pMMP-HAX1-FLAG-IRES-CD24 in einem Zwei-Stufen-Verdau zunächst
mit XhoI und SacII und anschließend mit HaeII aufgespalten. Der Deletionsmutant VPRBDΔHAX1 wurde nach Ligation in pET24d in einem Zwei-Stufen-Verdau zunächst mit XhoI und danach mit HaeII aufgespalten.
Die Inkubationsbedingungen und Schnittstellen der verwendeten Restriktionsenzyme sind in Tabelle 6 aufgelistet. Die Restriktionsenzyme und Puffer wurden von New England Biolabs (Ipswich, USA) bezogen. Die Restriktionsverdaus wurden entsprechend der Anwendung mit 100ng-10µg Plasmid, 10x Puffer (1:10), 10 Units Restriktionsenzym in einem Endvolumen von 10µl oder 30µl angesetzt.
2.1.7 Sequenzierung
Die vier generierten Mutanten, BH1ΔHAX1, BH2ΔHAX1, PESTΔHAX1, VPRBDΔHAX1, wurden nach Ligation in pGEM-T unter Verwendung der M13-Universal Primer (Promega, Madison) sequenziert. Die Sequenzierungen wurden freundlicherweise von der AG Germeshausen (MHH) durchgeführt. Die Sequenz der vier Mutanten wurden ausgehend von HAX1-Sequenz (HAX1 Gene ID 10456) generiert und mit den Sequenzierungsergebnissen verglichen. Ein sequenzkontrollierter Klon jedes Mutanten wurde anschließend in einer Maxi- Präparation unter Verwendung des QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN, Hilden) vervielfältigt. Die Sequenzen der vier Deletionsmutanten sind im Anhang dargestellt.
2.2 Zellbiologische Methoden
2.2.1 Zellkultur
Im Rahmen der experimentellen Arbeit wurden Fibroblasten- und 293GPG-Zelllinien verwendet (Tab. 7). Die Zusammensetzungen der verwendeten Kulturmedien sind in 3.4 beschrieben. Die Zellkultur wurden unter sterilen Bedingungen in Sicherheitsbänken der Klasse 1 und 2 (Herasafe, Heraeus, Osterode) mit Zellkulturflaschen von Sarstedt (Nürnbrecht) durchgeführt. Die Inkubation der Zellen erfolgte in Brutschränken (Labotec C200, Göttingen; Thermo Forma, Waltham, MA, USA) mit 5% CO2 bei 37°C. Die Konfluenz und die Morphologie wurden unter einem Lichtmikroskop (Zeiss, Oberkochem) beurteilt und die Zellen bei einer Konfluenz von 90% gesplittet.
Für das Passagieren wurden die Zellen nach einer PBS-Waschvorgang mit Trypsin für 3 min bei 37°C inkubiert. Nach Ablösung der adhärenten Zellen wird der Vorgang durch Zugabe von Medium beendet und die Zellsuspension zentrifugiert (210 x g, 5 min). Nach
Methoden
Resuspension des Zellpellets wurden die Zellen in entsprechender Verdünnung in eine bereits mit Medium vorbereitete Zellkulturflasche überführt.
Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte lichtmikroskopisch. Dafür wurden die Zellen mit Trypanblau (1:10) gemischt und in einer geeichten Neubauer-Zählkammer. Dabei dient der Farbstoff Trypanblau als Hintergrund, vor dem sich die nicht angefärbten Zellen zählen lassen. Die Zellzahl pro ml wurde anschließend mit der folgenden Formel berechnet:
Fibroblasten Humane Bindegewebszellen aus Hautstanzen
von einem gesunden Spendern und von einem HAX1-defizienten Patienten. Nach Transduktion unter Verwendung von
pMMP-HAX1-FLAG-IRES-CD24,
pMMP-VPRBDΔHAX1-FLAG-IRES-CD24 und pMMP-IRES-CD24 wurden die Zellen für durchflusszytometrische Analysen und für Western Blot verwendet.
293GPG Retrovirale Verpackungszelllinie, abgeleitet
von HEK293-Zellen. Die Zellen enthalten Gene, welche für die Produktion von retroviralen Partikeln benötigt werden. Diese Gene (gag, pol, env) stammen von MLV (murine leukemia virus). Außerdem enthalten die Zellen das Hüllprotein VSV-G (vesicular stomatitis virus G). Da VSV-G für die 293GPG-Zellen toxisch ist, wurde das Gen unter einen Tetrazyklin-regulierbaren Promotor gestellt. Durch Gabe von Tetrazyklin in das Medium, kann die Produktion des Hüllproteins abgeschaltet werden. (Ory et al., 1996).
Tab. 7: Verwendete Zelllinien
2.2.2 Transfektion
Für die Herstellung retroviraler Überstände wurden 293GPG-Zellen mittels Kalzium- Phosphat-Präzipation transient transfiziert (Bacchetti und Graham, 1977). Die Pufferzusammensetzung ist unter 3.3 aufgeführt.
Die 293GPG-Zellen wurden in 175 cm2 bis zu einer Konfluenz von 60% in Tetrazyklin- haltigem DMEM kultiviert, um die Expression von VSV-G zu unterdrücken. Für die Transfektion wurden zwei Röhrchen vorbereitet. In Röhrchen A wurden zu 25µg des Plasmid 147µl 2M Calciumchlorid und Low TE-Puffer bis zu einem finalen Volumen von 1,2ml hinzugegeben und vermischt. In Röhrchen B wurden 1,2ml 2x HEPES-buffered saline (HBSS, pH= 7,2) pipettiert. Anschließend wurde das Gemisch A tropfenweise zu Gemisch B pipettiert, wobei gleichzeitig unter Verwendung einer Pipette Luftblasen im Gemisch B erzeugt werden. Dabei bindet die Plasmid-DNA an das ausgefällte Calciumphosphat. Nach 30min Inkubation bei RT wird das Gemisch tröpfenweise auf die 293GPG-Zellen gegeben und die Zellen für weitere 16 h bei 37°C inkubiert. Das an Calciumphosphat gebundene Plasmid wird dabei mittels Endozytose von den 293GPG-Zellen aufgenommen. Nach einem anschließenden PBS-Waschvorgang wird das Medium durch Tetrazyklin-freies Medium ersetzt. Mit diesem Schritt beginnt die Expression des VSV-G Hüllproteins und damit die Produktion aktiver Viruspartikel. Die weiteren Schritte wurden daher in einem S2- Sicherheitsbereich durchgeführt. In den folgenden 5 Tagen wurde das virushaltige Medium jede 12 h abpipettiert. Der gesammelte Überstand wurde filtriert (Millipore, USA), um Zelltrümmer zu entfernen und bei -80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
Für die Virustiter-Bestimmung wurden 293T-Zellen verwendet. Zunächst wurden in jedes Loch einer 6-Loch-Platte 4x105 Zellen pipettiert in und in Medium für 6 h kultiviert. Nach der Inkubation wurden das Medium verworfen und durch Virusüberstand in verschiedenen Verdünnungstufen (1:1, 1:3, 1:10, 1:30) und 8µg/ml Polybrene (Sigma, Deisenhofen) ersetzt und für 24 h bei 37°C kultiviert. Nach Austausch des virushaltigen gegen virusfreies Medium wurden die Zellen für weitere 48 h inkubiert. Anschließend wurden die CD24-Expression in den verschiedenen Verdünnungsstufen durchflusszytometrisch bestimmt. Für die Färbung wurde der FITC Anti-Maus CD24-Antikörper (BD Pharmigen) verwendet. Die Berechnung der Plaque Forming Unit (PFU) des Virus und die Multiplicity of infection (MOI) wurden nach folgenden Formeln berechnet:
Methoden
2.2.3 Transduktion
Für die durchflusszytometrische Analyse und den Western Blot wurden Fibroblasten von einem gesunden Spender und einem HAX1-defizienten Patienten mit den retroviralen Überständen von pMMP-VPRBDΔHAX1-FLAG-IRES-CD24 und den Kontrollen pMMP- IRES-CD24 und pMMP-HAX1-FLAG-IRES-CD24 transduziert. Zunächst wurden die WT- und die HAX1-defizienten Fibroblasten in je 3 Löcher einer 6-Loch-Platte pipettiert und für 12 h inkubiert. Nach Entfernung des Mediums wurden die 3 verschiedenen Virusüberstände entsprechend Abbildung 4 in Anwesenheit von 0,8ml/ml Polybrene zu den Fibroblasten hinzugefügt. Nach 24-stündiger Inkubation wurde das Medium erneuert und die Zellen für weitere 48 h im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde die Transduktioneffizienz anhand der CD24-Expression durchflusszytometrisch bestimmt. Für die Verwendung in der Western Blot Analyse wurden die Zellen anhand ihres CD24-Immunphänotyps gesortet. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (MoFloTM, Dako Cytomation) wurde freundlicherweise von M. Ballmeier (MHH) durchgeführt.
Abb. 4: Schema für die Transduktion von Fibroblasten von gesunden Spendern (ND) und HAX1-defizienten Patienten (HAX1 -/-) mit pMMP-IRES-CD24, pMMP-HAX1-FLAG-IRES-CD24, pMMP-VPRBDΔHAX1- FLAG-IRES-CD24 in einer 6-Loch-Platte.
2.3 Biochemische Methoden
2.3.1 Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie ist eine Methode mit der sich Zellen entsprechend ihrer Größe, Struktur und spezifischer Anfärbungen charakterisieren lassen. Dabei werden die Zellen in Suspension einzeln an einem Laser vorbeigeführt. Die dabei entstehenden Streulicht- und Fluoreszenzemissionen jeder Zelle lassen sich von einem Detektorsystem quantifizieren.
Dabei wird zwischen Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC), welches Auskunft über die Größe der Einzelzelle gibt, und Seitwärtsstreulich (Sideward Scatter, SSC), welches abhängig ist von der Zellgranularität, unterschieden. Basierend auf unterschiedlichen Eigenschaften im Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht lassen sich Blutzellen (Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten) voneinander differenzieren.
Spezifische Eigenschaften von Zellen lassen sich über Fluoreszenz-Markierung nachweisen.
Dabei werden die Zellen mit entsprechenden Antikörpern gefärbt. Die fluoreszenzmarkierten Antikörper absorbieren die Lichtenergie des Laserstrahls. Die Energie hebt die Elektronen auf ein höheres Energieniveau. Nach Beendigung des Laserimpulses führt der Rücksprung der Elektronen in ihr ursprüngliches Energieniveau zur Freisetzung von Energie in Form von Photonen. Diese Lichtemission lassen sich mit einem Photodetektor quantifizieren und analysieren. Über fluoreszenzmarkierte Antikörper lassen sich auch transduzierte Zellen nachweisen und sortieren.
Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit transduzierten Fibroblasten exprimieren CD24 an ihrer Oberfläche. Für die Färbung der Zellen mit einem FITC-(Fluoreszeinisothiocyanat, Exzitation: 495 nm, Emission: 520 nm) konjugierten Anti-CD24-Antikörper wurden die Zellen zunächst trypsiniert, gesammelt und mit PBS gewaschen. Nach Resuspension von 1-2 x 105 Zellen erfolgte die Färbung lichtgeschützt mit FITC Anti-Maus CD24-Antikörpern (1:600, BD Pharmigen, Heidelberg) für 30min auf Eis. Nach Inkubation und erneuter zweifacher Waschung wurden die Zellen in PBS resuspendiert. Die durchflusszytometrische Analyse der Proben wurde mit dem FACScan (Becton und Dickinson) durchgeführt und mit CellQuest (BD Bioscience, Erembodegem, Belgien) analysiert.
2.3.2 Western Blot
Mit einer Western Blot Analyse lassen sich Proteine identifizieren und quantifizieren. Die Auftrennung erfolgt elektrophoretisch auf einem SDS Polyacrylamid-Gel, gefolgt vom
Methoden
Blotting, der Übertragung der augetrennten Proteine auf eine Nitrozellulosermembran. Auf der Trägermembran lassen sich die Proteine mit spezifischen Antikörpern darstellen.
Die Zellen, deren Proteine analysiert werden sollen, werden dafür zunächst lysiert. Hierzu wird die Zellsuspension zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wird in einem Lyse-Puffer (30µl Protease Inhibitor Cocktail + 500µl hypotone Lösung) resuspendiert. Nach Zentrifugation bei 4000rpm, 4°C für 5-10min befinden sich die zytoplasmatischen Proteine im Überstand und lassen sich abpippetieren. Das Pellet wird verworfen. Für den weiteren Gebrauch muss die Probe auf Eis gekühlt oder bei -80°C für spätere Verwendung aufbewahrt werden.
Nach Zelllyse lässt sich die Konzentration des Proteinlysats photometrisch mit der Bradford- Methode (Bradford 1976) quantifizieren. Der dabei verwendete Farbstoff Coomassie Brilliantblau G-250 bildet in saurer Lösung Komplexe mit Proteine und absorbiert als Komplex Licht einer Wellenlänge von 595mm. Im Vergleich zu einer entsprechenden Verdünnungsreihe mit bekannten Konzentrationen lässt sich die Proteinkonzentration im Bereich von Mikrogramm pro Milliliter (µg/µl) bestimmen.
Sammelgel (6%) Trenngel (10%)
dH20 3,9 ml 6,15 ml
1,5 M TrisHCl (pH 8,8) --- 3,86 ml
0,5 M TrisHCl (pH 6,8) 720 µl ---
Acryl-Bisacrylamid 975 µl 5,2 ml
10% SDS 57,5 µl 155 µl
20% Ammoniumpersulfat (APS) 37,6 µl 75,2 µl
TEMED 5,75 µl 11,5 µl
Tab. 8: Zusammensetzung der verwendeten Polyacrylamid-Gele
Die Auftrennung des Proteinlysats erfolgt in einer Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Laemmli (Laemmli 1970). Dabei werden die Proteine entsprechend ihres Molekulargewichts aufgetrennt. Das verwendete Detergens SDS überdeckt dabei die Eigenladung der verschiedenen Proteine. Das verwendete Polyacrylamid-Gel unterteilt sich in ein Sammelgel (6%) und ein Trenngel (10%). Die verwendete Zusammensetzung des Sammel- und des Trenngels ist Tabelle 8 zu entnehmen. Zunächst wird dabei das Trenngel zwischen zwei fixierte Glasplatten gegossen. Für eine ebene Oberfläche am Übergang zum Sammelgel wird das Trenngel vor Polymerisation mit dH 0
überschichtet. Nach vollständiger Polymerisation des Trenngels wird der dH20-Überstand verworfen und das Sammelgel aufgeschichtet. Dabei wird ein Gelkamm eingesetzt, der die Geltaschen innerhalb des Sammelgels bildet. Das fertige Gel wird in eine Elekrophorese- Kammer (Bio-Rad, München) eingespannt und die Kammer mit Laufpuffer gefüllt. Die Proben mit jeweils 25µg Protein werden mit Laemmli-Puffer im Verhältnis 1:6 und 3% ß- Mercaptoethanol versetzt und bei 95°C über 10min inkubiert. Dabei denaturieren die Proteine und bedingt durch die reduzierenden Eigenschaften des ß-Mercaptoethanols werden die Disulfidbrücken gespalten. Vor dem Beladen des Gels werden die Proben wieder auf RT abgekühlt. Als Maßstab für die Proteingröße wird zudem eine Proteinleiter mit einem Molekulargewichtsstandard (1-220kDa, Benchmark Prestained Protein ladder, Invitrogen) aufgetragen. Zunächst wird die Elektrophorese bei 80mV für 10min durchgeführt. Nach Passage des Sammelgels kann die Spannung auf 120mV erhöht werden bis die Bromphenolblau-Makierungslinie den unteren Rand des Trenngels erreicht hat. Nach Entfernung des Sammelgels wird das Trenngel für 10 min in Transfer-Puffer überführt.
Der Transfer der aufgetrennten Proteine vom Polyarylamidgel auf eine Polyvinyliden- Difluorid-Membran (Roti®-PVDF, Roth) wird mittels Nass-Blott-Verfahren durchgeführt.
Dabei wird die PVDF-Membran zunächst für 1min in Methanol inkubiert und anschließend für 5 min in Transferpuffer äquilibriert. Nach dem Transfer des Gels auf die Membran wird beides luftblasenfrei mit Filterpapier und Schwammpads als Blotting-Sandwich in einen Rahmen gespannt. Der Transfer wird in einer Transferkammer über 1 h, 4°C und einer Spannung von 100V durchgeführt. Mittels reversibler Panceau-Färbung lässt sich der Proteintransfer überprüfen.
Der spezifische Nachweis der Proteine auf der PVDF-Membran erfolgt immunologisch. Um falsch-positive Signal zu vermeiden werden die freien Bindungsstellen durch Inkubation über 12 h bei 4°C in Blockpuffer (PBS-T, 5% Magermilchpulver) abgesättigt. Der Blockpuffer wird anschließend in 2 kurzen Waschungen mit PBS-T entfernt. Die Inkubation mit dem Primärantikörper Anti-FLAG (polyklonal, Kaninchen, Sigma) erfolgte in einer Verdünnung in Blockpuffer von 1:1000 über 2 h bei RT auf einem Schüttelinkubator (Fröbel, Lindau).
Nach Inkubation mit dem Primärantikörper wird die Membran 4 Waschvorgängen unterzogen, bei denen unspezifisch gebundene Antikörper entfernt werden. Die nachfolgende Inkubation mit dem Sekundärantikörper Anti-Kaninchen-HRP (Cell Signalling, New England Biolabs, Ipswich, USA) erfolgte für 1,5 h bei RT in einer Verdünnung von 1:6000. Dabei ist der Sekundärantikörper mit Merrettich-Peroxidase konjugiert. Nach der Inkubation im Sekundärantikörper wird die Membran erneut vierfach mit PBS-T gewaschen. Anschließend
Methoden
wird die Membran mit ECL-Lösung (Amersham, Buckinghamshire, UK) inkubiert. Dabei katalysiert die Peroxidase die Umsetzung von Luminol, welches als Substrat in der ECL- Lösung enthalten ist. Die entstehende Chemilumineszenz der Reaktion wird mit einem LAS- 3000-Gerät (Fujifilm, Tokio, Japan) detektiert.
Nach der Detektion lassen sich die gebundenen Antikörper mit Stripping-Buffer von der Membran entfernen. Dabei wird dem Puffer vor Inkubation ß-Mercaptoethanol hinzufügt und die Membran im fertigen Puffer für 15 min bei 37°C inkubiert. Der Stripping-Buffer wird anschließend durch erneute PBS-T-Waschungen entfernt.
Die GAPDH-Kontrolle wird mit einem GAPDH-Primärantikörper (monoklonal, Maus, Santa Cruz) für 2 h bei 4°C in einer Blockpuffer-Verdünnung durchgeführt. Als Sekundärantikörper wird Anti-Maus-HRP für 1,5 h bei RT in einer Verdünnung von 1:6000 verwendet.
3 Material
3.1 Chemikalien
Sofern nicht anders angegeben wurden alle Chemikalien in der handelsüblichen Form in p.A.
Qualität von den Firmen Merck (Darmstadt, Carl Roth GmbH (Karlsruhe), Sigma-Aldrich (Taufkirchen) und J.T. Baker (Deventer, Niederlande) bezogen.
Ethidiumbromid AppliChem GmbH, Darmstadt
Seakem® LE Agarose Biozym, hess. Oldendorf
DNA Leiter 1 kb [50 µg/ml] New England Biolabs, Frankfurt/Main DNA Leiter Plus 100 bp [0,5 mg/ml] PEQLAB, Erlangen
Benchmark Prestained Protein-Leiter 20- 220 kDa
Invitrogen
Trypan-Blau-Färbung 0,4% GIBCO, Invitrogen Corporation, Karlsruhe
Magermilchpulver Sucofin, Zeven
Ethanol Verband Chemiehandel, Köln
3.2 Kits
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN, Hilden QIAquick Gel Extraction Kit(250) QIAGEN, Hilden
pGEM®-T Vector System I Promega, Madison, WI, USA QIAGEN® Plasmid Maxi Kit(25) QIAGEN, Hilden
ECL Plus Western Blotting Detection System
GE Healthcare Amersham, Buckinghamshire, UK
3.3 Pufferlösungen
TBE Puffer (5×-Tris-Borate-EDTA) 0,36 M Tris-HCl (pH 8,3) 0,36 M Borsäure
EDTA-Dinatriumsalz (pH 8,0) in dH2O lösen
LB-Medium 1% (w/v) Trypton
0,5 % (w/v) Hefeextrakt 0,5 % (w/v) NaCl
Material
LB-Agarplatte 15 g Bactoagar in 1 Liter LB-Medium
DNA-Ladepuffer 0,25% Bromphenolblau
40% Sucrose in Wasser (w/v)
PBS (pH 7,2) 137 mM NaCl
8,1 mM Na2HPO4 2,7 mM KCl 1,5 mM KH2PO4
PBS-T 20 mM Tris-HCl (pH 7,5)
155 mM NaCl 0,1% Tween 20
Lösung 1 (Mini-Präp) 50 mM Glukose
25 mM TrisCl, pH 8 10 mM EDTA pH 8
Lösung 2 (Mini-Präp) 0,2 M NaOH
1% (v/v) SDS
Lösung 3 (Mini-Präp) 5 M Potassium Acetat 11,5 % (v/v) Eisessig Hypotoner Puffer für zytoplasmatische
Proteine (pH= 7,6)
20 mM HEPES 10 mM KCl, 1 mM MgCl2 20% Glycerin 0,1 % Triton-X-100
0,5 mM DTT (Dithiothreitol) 0,2 mM PIC (frisch hinzufügen) 1 mM Na-Orthovanadat
Protease inhibitor cocktail (PIC) 104 mM AEBSF (4-(2-Aminoethyl)- benzensulfonylfluorid)
0,08 mM Aprotinin 2 mM Leupeptin 4 mM Bestatin 1,5 mM Pepstatin A 1,4 mM E-64
Laufpuffer (SDS-PAGE) 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0.1% SDS
Laemmli-Puffer (SDS-PAGE) 62,5 mM TrisHCl (pH= 6,8) 10% Glycerol
1% SDS
0,01% Bromphenolblau 3% β-Mercaptomethanol Transfer Puffer (Western Blot) 192 mM Glycin
25 mM Tris Blockpuffer (Western Blot) PBS-T
5% Magermilchpulver Waschpuffer (Western) PBS, 0.1% Tween-20
Low TE-Puffer 1 mM Tris HCl (pH= 7,5)
0,05 mM EDTA (pH= 8) 2x HEPES-buffered saline (2x HBSS) 0,3 M NaCl
50 mM HEPES
1,5 mM Na2HPO4, pH= 7,2
3.4 Medien und Seren
Fibroblasten Medium DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle
Medium) 20%FCS
2 mM L-Glutamin 50 U/ml Penicillin 50 µg/ml Streptomycin GPG Medium (lichtempfindlich): DMEM
10%FCS
2 mM L-Glutamin 50 U/ml Penicillin 50 µg/ml Streptomycin 300 µg/ml G418
2,0 µg/ml Puromycin 1 µg/ ml Tetrazyklin
Material
Sammelmedium für Viren DMEM
50 ml FCS (10%) 50 U/ml Penicillin 50 µg/ml Streptomycin 2 mM L-Glutamin 1 mM HEPES
Fetales Kälberserum (FCS) GIBCO, Invitrogen Corporation, Karlsruhe Trypsin-EDTA Lösung (1x) Sigma, Taufkirchen
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose(4,5 g/l) without L- Glut
PAA Laboratories, Pasching, Österreich
L-Glutamine 200 mM (100×) GIBCO, Invitrogen Corporation, Karlsruhe
Tetrazyklin Sigma, Taufkirchen
Penicillin-Streptomycin (5000 U/ml PenG sodium, 5000 µg/ml Streptomycin sulphate in 0,85% Saline)
GIBCO, Invitrogen Corporation, Karlsruhe
Ampicillin Sigma, Taufkirchen
DMSO Sigma, Taufkirchen
HEPES Puffer 1M GIBCO, Invitrogen Corporation, Karlsruhe
Polybrene Sigma, Deisenhofen
3.5 Enzyme und Antikörper
Enzyme
Expand High Fidelity Plus Enzyme Blend Roche Diagnostics, Mannheim
T4 DNA Ligase [1 Weiss U/ml] New England Biolabs, Frankfurt/Main Restriktionsenzyme
Antarktische Phosphatase [5.000 U/ml]
Antikörper
FITC Anti-Maus CD24 Antikörper [0,5 mg/ml]
BD Pharmigen, Heidelberg
Anti-FLAG polyklonal, Kaninchen Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA GAPDH, Maus monoklonal IgG Santa Cruz, CA, USA
Ziege Anti-Kaninchen Antikörper, HRP linked IgG
Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA
Ziege Anti-Maus Antikörper, HRP linked IgG
Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA
Kompetente Bakterien:
XL10-Gold Ultracompetent Cells Stratagene, La Jolla, CA, USA
3.6 Geräte, Instrumente, Materialien
CellQuest (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)
Detektionskammer (FUJIFILM Image Reader LAS-3000, Tokio, Japan) Elektronische Präzisionswaage BP 3100S (Sartorius, Göttingen)
FACS-Gerät (FACScan; Becton, Dickinson, CA, USA)
Spritzenfilter Porengröße 0,2 µm, 25mm PET Membran (Roth, Karlsruhe) Filter Stericup/Steritop (Millipore, Billerica, MA, USA)
Gelelektrophorese-Kammer (Bio-Rad, München) Heizblock (Eppendorf, Hamburg)
Inkubator (S1: Labotec C200, Göttingen und S2: Thermo Forma, Waltham, MA, USA) Megafuge (Heraeus, Osterode)
Neubauer Zählkammer (BRAND GmbH+CoKG, Wertheim) Parafilm (BRAND GmbH+CoKG, Wertheim)
PCR Maschine (Eppendorf, Master cycler gradient, Hamburg) Photometer (Eppendorf, Hamburg)
Roti®-PVDF- Membran (Roth, Karlsruhe) Schüttelinkubator (Fröbel, Lindau)
Schüttler (CERTOMAT®HK, B.Braun Biotech international, Melsungen) Sterilwerkbänke (Hera Safe, Heraeus, Osterode)
Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) UV-Tisch (Bachofer, Reutlingen) Wasserbad (GFL 1083, Burgwedel) Werkbank (Variolab Mobilien W90) Zentrifuge (Eppendorf, Hamburg)
Material
3.7 Probenmaterial
Die verwendeten Fibroblasten stammen aus Hautbiopsien eines Patienten mit nachgewiesener HAX1-Defizienz und eines gesunden Probanden. Die Probenentnahme erfolgte nach Aufklärung und mit dem Einverständnis der Eltern.
4 Ergebnisse
Das Ziel dieser Arbeit ist die Etablierung eines stabilen in vitro-Modells mit verschiedenen HAX1-Deletionsmutanten. Die Mutanten, in denen jeweils eine der vier HAX1-Domänen deletiert wird, sind notwendige Werkzeuge, um die Bedeutung der einzelnen Domänen hinsichtlich der Funktion des gesamten Proteins untersuchen zu können.
Mittels der PCR wurden vier verschiedene Mutanten hergestellt, die sowohl in bakterielle als auch in retrovirale Vektoren kloniert werden können und somit Grundlage für verschiedene Untersuchungen, wie Strukturanalysen, Interaktionsstudien und funktionelle Untersuchungen sein können.
4.1 Deletion der HAX1-Domänen
Die Deletionsmutanten wurden in zwei PCR-Schritten generiert. Zunächst wurden in einem ersten Schritt in zwei getrennten PCRs die 3´- und 5´-Abschnitte des HAX1-Gens vor und hinter der zu deletierenden Domäne (BH1, BH2, PEST, VPRBD) amplifiziert, d.h. pro HAX1-Mutant jeweils zwei Fragmente. In jeder PCR wird dabei ein interner, Domänen- spezifischer Primer und ein externer, nicht-Domänen-spezifischer Primer verwendet. Die Fragmentlängenbestimmung der PCR-Produkte wurde mittels NEBcutter V2.0 durchgeführt (Tab. 9). Die vorberechneten Fragmentlängen wurden gelelektrophoretisch verifiziert (Abb.
5).
Tab. 9: Externe und interne Primer-Kombinationen und Produktgrößen
Externe/interne Primer-Kombination PCR-Fragmentlänge forward (F) reverse (R)
NcoI-F-extern BH1-R-intern 111 bp
NcoI-F-extern BH2-R-intern 222 bp
NcoI-F-extern PEST-R-intern 331 bp
NcoI-F-extern VPR-R-intern 375 bp
VPR-F-intern EcoRI-R-extern 422 bp
PEST-F-intern EcoRI-R-extern 494 bp
BH2-F-intern EcoRI-R-extern 574 bp
BH1-F-intern EcoRI-R-extern 673 bp
Ergebnis A)
B)
