Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin, dem Institut für Pathologie und der Arbeitsgruppe Immunologie der
Tierärztlichen Hochschule Hannover
Etablierung eines In-vivo-Modells zur Charakterisierung der Immunreaktion des Uterus von Jungsauen nach
Insemination
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Anke Döhring
aus Lüneburg
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. D. Waberski
Prof. Dr. M. Hewicker- Trautwein PD Dr. H.-J. Schuberth
1. Gutachterin: Prof. Dr. D. Waberski
2. Gutachter: Prof. Dr. H. Bollwein
Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2004
Diese Arbeit wurde gefördert von der Dr. Dr. h.c. Karl Eib l Stiftung, der Deutschen Forschungsgemeinschaft und dem Zentralverband der Deutschen Schweineproduktion.
Teilergebnisse dieser Arbeit wurden auf der 37. Jahrestagung über Physiologie und
Pathologie und 29. Veterinär- Humanmedizinischen Gemeinschaftstagung unter dem Titel
„Establishment of an in vivo model for characterisation of leukocyte immigration into the uterus of gilts after insemination“ (A. DÖHRING, F. ARDON, N. RITTER, H.J. SCHUBERTH, H. ZERBE, M. HEWICKER- TRAUTWEIN, D. WABERSKI, R.H.F. HUNTER) präsentiert.
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG ... 9
2 LITERATUR ... 10
2.1 HISTOLOGISCHE MORPHOLOGIE DES ENDOMETRIUMS... 10
2.1.1 Veränderungen im porcinen Endometrium während des Zyklus ... 10
2.2 LEUKOZYTEN IM PORCINEN UTERUS... 12
2.3 IMMUNREAKTION DES PORCINEN UTERUS NACH INSEMINATION... 15
2.4 MORPHOLOGIE DER UTEROTUBALEN VERBINDUNG DES SCHWEINS... 16
2.5 LYMPHGEFÄßSYSTEM... 18
2.5.1 Lymphgefäßsystem des porcinen Uterus... 20
2.5.2 Technik der Lymphgewinnung ... 22
2.5.3 Zellen in der Lymphe... 24
2.5.4 Lymphfluss... 26
3 MATERIAL UND METHODEN ... 27
3.1 GERÄTE... 27
3.2 MATERIALIEN... 28
3.2.1 Klinikbedarf... 28
3.2.2 Laborbedarf... 29
3.2.3 Medikamente und Reagenzien ... 29
3.2.4 Puffer und Lösungen ... 30
3.2.5 Antikörper für die Immunhistochemie... 32
3.2.6 Antikörper für die indirekte Membranimmunfluoreszenz ... 32
3.2.7 Versuchstiere ... 33
3.3 METHODEN... 33
3.3.1 Brunstkontrolle... 33
3.3.2 Samengewinnung... 34
3.3.3 Chirurgische Maßnahmen... 34
3.3.3.1 Methode I... 35
3.3.3.2 Methode II ... 35
3.3.3.3 Methode III ... 37
3.3.3.4 Methode IV ... 37
3.3.4 Entnahme, Fixierung und Vorbereitung der Gewebeproben zur ... 40
Färbung... 40
3.3.5 Immunhistochemische Färbungen an Kryostatschnitten ... 40
3.3.5.1 Nachweis von MHCII Oberflächenantigen ... 41
3.3.5.2 Nachweis von CD4 Oberflächenantigen ... 42
3.3.6 Nachweis von Mastzellen ... 43
3.3.6.1 Tryptasenachweis von Mastzellen ... 43
3.3.6.2 Toluidinblaufärbung... 45
3.3.7 Quantitative Auswertung... 45
3.3.8 Durchflusszytometrische Leukozytendifferenzierung aus Blut und... 46
Lymphknoten ... 46
3.3.9 Zellzahlbestimmung der Lymphe... 46
3.3.10 Statistische Auswertung... 46
4 ERGEBNISSE ... 47
4.1 GEWINNUNG UTERINER LYMPHE... 47
4.1.1 Lymphfluss... 48
4.1.2 Zellzahlen in der Lymphe ... 49
4.2 IMMUNPHÄNOTYPISCHE EIGENSCHAFTEN VON LEUKOZYTEN AUS UTERUSVENE, OVARARTERIE UND PERIPHEREM BLUT... 51
4.3 IMMUNPHÄNOTYPISCHE EIGENSCHAFTEN VON LEUKOZYTEN AUS DEN LNN. UTERINI... 53
4.4 ERGEBNISSE DER IMMUNHISTOCHEMISCHEN UNTERSUCHUNGEN... 55
4.4.1 Immunhistochemischer Nachweis von MHCII Oberflächenantigen ... 56
4.4.2 Immunhistochemischer Nachweis von CD4 Oberflächenantigen ... 58
4.5 NACHWEIS VON MASTZELLEN IM ENDOMETRIUM... 60
5 DISKUSSION ... 61
5.1 ETABLIERUNG DES TIERMODELLS ZUR CHARAKTERISIERUNG DER IMMUNREAKTION DES PORCINEN UTERUS NACH INSEMINATION... 61
5.2 GEWINNUNG VON LYMPHE DES PORCINEN UTERUS... 62
5.3 DIFFERENZIERUNG DER LEUKOZYTENPOPULATION DES LOKALEN UTERINEN BLUTGEFÄßSYSTEMS UND DER UTERINEN LYMPHKNOTEN... 64
5.4 IMMUNHISTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN UND MASTZELLNACHWEIS... 66
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 72
7 SUMMARY... 74
8 LITERATURVERZEICHNIS ... 76
Abkürzungen
ABC Avidin- Biotin- Peroxidase- Komplex Abb. Abbildung
BSA Bovines Serumalbumin
CD Cluster of Differentiation (Bezeichnung zellulärer Differenzierungsantigene)
cm Zentimeter
DAB 3,3`- Diaminobenzidintetrahydrochlorid dest. destillata
EDTA Ethylendiamintetraacetat Fa. Firma
GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor (Granulozyten Makrophagen Wachstumsfaktor)
h Stunde(n)
Ig Immunglobulin
K Kontrolle
mAk monoklonaler Antikörper
MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) min Minute(n)
MW Mittelwert
NK- Zellen natürliche Killerzellen p Irrtumswahrscheinlichkeit
PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
® eingetragenes Warenzeichen S inseminiert
SD standard deviation (Standardabweichung) UTJ uterotubal junction (uterotubale Verbindung) Tab. Tabelle
1 Einleitung
Nach Insemination kommt es zu einer lokalen inflammatorischen Reaktion mit Immigration von Leukozyten in das Lumen und das Gewebe des Uterus (LOVELL u. GETTY 1968;
PURSEL et al. 1978; ROZEBOOM et al. 1998, 1999). Das Ausmaß und die Bedeutung dieser lokalen Immunantwort sind erst ansatzweise verstanden.
Bisherige Untersuchungen der zellulären Immunreaktion nach Insemination wurden beim Schwein anhand von Spülungen, histologischen und immunhistochemischen Färbungen von Gewebeproben des Endometriums sowie Untersuchungen der uterinen Lymphknoten
durchgeführt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein Tiermodell zu entwickeln, das eine Untersuchung der Immunantwort im lokalen Blut- und Lymphgefäßsystem sowie im endometrialen Gewebe ermöglicht. Eine besondere Aufmerksamkeit sollte dabei der uterotubalen Verbindung gewidmet werden. Diese anatomische Struktur wurde bisher vor allem auf ihre Funktion als Spermienreservoir untersucht (DU MESNIL DU BUISSON u.
DAUZIER 1955; RIGBY 1966; HUNTER 1981; MBURU 1996). Um unspezifische Reaktionen und interindividuelle Schwankungen einzugrenzen sollte das Tiermodell einen Vergleich innerhalb eines Tieres ermöglichen. Da das Schwein einen Uterus bicornis besitzt, erfolgte die Applikation von Ebersamen in ein Uterushorn und einer Kontrolllösung in das contralaterale Horn. Ein spezieller Aspekt galt der Gewinnung uteriner Lymphe. Der porcine Uterus besitzt ein Lymphgefäßsystem, das teilweise in enger Verbindung mit dem lokalen Blutgefäßsystem steht (DOBROSZYNSKA 1999, 2002; GAWROSKA et al. 1992, 1997).
Die Bedeutung des uterinen Lymphgefäßsystems bei lokalen Immunreaktionen sollte näher untersucht werden.
Die vorliegende Arbeit soll Teilaspekte der zellulären Immunreaktion des Uterus nach Insemination näher erklären und Ansatzpunkte für weitere Untersuchungen geben.
2 Literatur
2.1 Histologische Morphologie des Endometriums
Die Wand des Uterus setzt sich aus Perimetrium, Myometrium und Endometrium zusammen.
Das Perimetrium besteht aus Serosa und Subserosa, das Myometrium aus glatten Muskelfaserbündeln und einem Stratum vasculosum (LIEBICH 1993).
Das Endometrium ist die innere Auskleidung des Uterus. Es setzt sich aus einem einschichtigen Epithel und einer Lamina propria zusammen (LIEBICH 1993). Lumenseitig ist das Endometrium geschlechtsreifer Schweine gefaltet (LEISER et al. 1988). Das Oberflächenepithel des porcinen Endometriums ist iso- bis hochprismatisch. Je nach Zyklusstand handelt es sich um ein Epithelium simplex columnare oder ein Epithelium pseudostratificatum columnare (LIEBICH 1993; LEISER et al. 1988). Zilientragende Zellen treten im Bereich der Drüsenmündungen auf (LEISER et al. 1988; PERRY u. CROMBIE 1982; STROBAND 1986).
Die Lamina propria besteht aus einem spinozellulären Bindegewebe, in das die tubulär verzweigten Uterindrüsen eingebettet sind (LIEBICH 1993). Im tiefen endometrialen Stroma des Endometriums finden KAEOKET et al. (2002a) mehr Drüsenanschnitte als im oberflächlichen Stroma. Alle Bestandteile des Endometriuns unterliegen zyklischen Veränderungen (LIEBICH 1993).
2.1.1 Veränderungen im porcinen Endometrium während des Zyklus
Nach SPENCER et al. (1993) kommt es durch Östrogeneinfluss zu Hypertrophie und Hyperplasie des Endometriums. Im Östrus stellt sich das Oberflächenepithel des Endometriums als hochprismatisches mehrreihiges Epithel dar (KAEOKET et al. 2002a;
LEISER et al.1988). KAEOKET et al. (2002a) messen die maximale Höhe des Epithels bei
Altsauen im Östrus (Tag 1), während LEISER et al. (1988) ein Maximum im Postöstrus (Tag 2-4) feststellen. STROBAND et al. (1986) finden keine signifikanten Unterschiede der Epithelhöhe während des Zyklus bei Jungsauen. Die Zellkerne des Oberflächenepithels liegen nach LEISER et al. (1988) basal, STROBAND et al. (1986) finden dagegen die Zellkerne auf unterschiedlicher Höhe der Epithelzellen. Mitosen können gehäuft beobachtet werden (KAEOKET et al. 2002a; LEISER et al. 1988). Im Oberflächenepithel weisen KAEOKET et al. (2002a) Leukozyten nach.
Das endometriale Stroma zeigt im Östrus eine starke Ödematisierung und Infiltration von Leukozyten (KAEOKET et al. 2002a; LEISER et al. 1988). KEYS und KING (1988) weisen bei Anstieg der peripheren Östrogenkonzentration eine erhöhte vaskuläre Permeabilität nach.
KAEOKET et al. (2002a) finden die höchste Anzahl an Kapillaren unter dem Oberflächenepithel des Endometriums im Östrus. Auch eine Zunahme der Anzahl der Fibroblasten im endometrialen Stroma kann beobachtet werden.
Die uterinen Drüsen sind unter Östrogeneinfluss gestreckt (LIEBICH 1993). Im Drüsenepithel können KAEOKET et al. (2002a) im Östrus geringe, STROBAND et al. (1986) können keine sekretorische Aktivität im Drüsenepithel feststellen.
Im Postöstrus (Tag 2-4) erreicht nach LEISER et al. (1988) das hochprismatische mehrreihige Oberflächenepithel seine maximale Höhe. Die Zellkerne liegen basal, die Mitoseaktivität ist noch erhöht. Leukozyten sind im Oberflächenepithel und im Stroma nachzuweisen (KAEOKET et al. 2002a; BISCHOF et al. 1994a).
Das Stroma des Endometriums zeigt im Postöstrus noch eine deutliche Ödematisierung und eine erhöhte Anzahl Fibroblasten (KAEOKET et al. 2002a; LEISER et al. 1988). LEISER et al. (1988) beobachten eine starke Reduktion von neutrophilen und eosinophilen Granulozyten, Plasmazellen und Makrophagen, nicht aber Lymphozyten bis zum Tag 3 des Zyklus.
STROBAND et al. (1986) weisen ab Tag 6 sezernierende Drüsenzellen nach. Die Mitoseaktivität der Drüsenepithelzellen nimmt stark zu (LEISER et al. 1988).
Im Interöstrus (Tag 5-17) wandelt sich das ein- bis zweireihige hochprismatische Oberflächenepithel zu einem einschichtigen isoprismatischen Epithel, das gegen Ende des Interöstrus wieder ein- bis zweireihig hochprismatisch wird (LEISER et al.1988). Im
mittleren Interöstrus (Tag 10-12) finden BISCHOF et al. (1994a) nur noch vereinzelt Lymphozyten im Oberflächenepithel.
Die Ödematisierung des Stromas nimmt nach dem Östrus ab, ist bis zum mittleren Interöstrus verschwunden und nimmt zum späten Interöstrus wieder zu (KAEOKET et al. 2002a;
LEISER et al.1988). BISCHOF et al. (1994a) beobachten eine Anreicherung von MHCII („Major Histocompatibility Complex Class II“) positiven Zellen im Stroma. Untersuchungen von KAEOKET et al. (2002a) und LEISER et al. (1988) zeigen subepithelial eine Zunahme eosinophiler Granulozyten in diesem Zyklusstadium.
Die uterinen Drüsen zeigen im mittleren Interöstrus einen stark geschlängelten Verlauf (LEISER et al.1988; LIEBICH 1993). Ein Maximum an Drüsenanschnitten sowie an sekretorischen Vesikeln in den Drüsenepithelzellen kann im mittleren Interöstrus beobachtet werden (KAEOKET et al. 2002a).
Im Proöstrus (Tag 18-21) stellt sich das Oberflächenepithel mehrreihig hochprismatisch dar.
Intraepitheliale Lymphozyten finden sich vereinzelt (BISCHOF et al. 1994a).
Das endometriale Stroma zeichnet sich durch ein deutliches Ödem aus (KAEOKET et al.
2002a; LEISER et al.1988). Ein massiver Einstrom neutrophiler Granulozyten wird von BISCHOF et al. (1994a) und KAEOKET et al. (2002a), nicht jedoch von LEISER et al.
(1988) beobachtet.
Die uterinen Drüsen verlaufen gestreckt (LEISER et al.1988; LIEBICH 1993). Die sekretorische Aktivität der Drüsenepithelzellen ist gering (KAEOKET et al. 2002a; LEISER et al.1988).
2.2 Leukozyten im porcinen Uterus
Immunantworten können als erworben bzw. adaptiv und angeboren bzw. nichtadaptiv klassifiziert werden. Die angeborene Immunität benötigt keinen vorangegangenen Kontakt mit einem Antigen und führt zu unmittelbarer Immunantwort innerhalb von 0-4 Stunden. Als Effektorzellen spielen Makrophagen, dendritische Zellen, neutrophile Granulozyten und natürliche Killerzellen (NK- Zellen) eine entscheidende Rolle.
Die adaptive Immunantwort benötigt vorausgegangenen Antigenkontakt und entwickelt sich über mehrere Tage. Wichtige Zellen hierfür sind T- und B-Lymphozyten sowie antigenpräsentierende Zellen wie Makrophagen und dendritische Zellen (ENGELHARDT et al.1997; JANEWAY u. TRAVERS 1997).
Der Uterus ist, vor allem während der Paarung, antigenen Substanzen ausgesetzt. Ein immunologisches System ist Voraussetzung für einen wirksamen Schutz vor Infektionen. Die leukozytäre Präsenz zeigt dabei Modifikationen im Verlauf des Zyklus (BISCHOF et al.
1994a; KAEOKET et al. 2002a). Diese Veränderungen werden endokrin gesteuert; vor allem Östrogene und Progesteron sind dabei von Bedeutung. DE WINTER et al. (1994) können bei Jungsauen eine zyklusabhängige Anfälligkeit gegenüber intrauteriner Applikation von Bakterien nachweisen. Alle im Interöstrus mit E. coli inokulierten Tiere entwickelten eine Endometritis mit vaginalem Ausfluss, während nur ein im Östrus inokuliertes Tier geringgradigen vaginalen Ausfluss zeigte.
Leukozyten können anhand ihrer CD- („cluster of differentiation“) Oberflächenantigene in Subpopulationen eingeteilt werden. Beim Schwein erfolgt neben der Bezeichnung CD auch eine SWC („swine workshop cluster“) Bezeichnung, die bei Oberflächenantigenen verwendet wird, die keine humane CD- Entsprechung aufweisen (LUNNY 1993).
Lymphozyten sind in allen Zyklusstadien im porcinen Uterus vertreten. Sie finden sich im Oberflächenepithel, im Stroma sowie im Drüsenepithel des Endometriums (BISCHOF et al.
1994a; KAEOKET et al. 2002a).
Porcine T- Lymphozyten weisen im Vergleich zu anderen Spezies besondere Charakteristika auf. So gibt es einen hohen Anteil an T- Zellen, die sowohl CD4 als auch CD8 Oberflächenantigene aufweisen. Das Verhältnis von einfach CD4 zu einfach CD8 positiven Zellen ist niedriger als bei anderen Spezies. CD8 positive Zellen koexprimieren bevorzugt MHCII Moleküle (LUNNY u. PESCOVITZ 1987). Die Bedeutung dieser Besonderheiten ist noch unklar.
Immunhistochemische Untersuchungen von BISCHOF et al. (1994a) und KAEOKET et al.
(2002b) weisen CD2 positive Zellen als häufigste Lymphozyten in allen Zyklus stadien nach.
CD2 wird von T- Lymphozyten und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) exprimiert.
SAALMÜLLER et al. (1998) differenzieren weiter nach Koexpression von CD4 und CD8 Oberflächenmolekülen in CD2+CD4+CD8+, CD2+CD4+CD8-, CD2+CD4-CD8+ und CD2+CD4-CD8-. T- Helferzellen und inflammatorische T- Zellen exprimieren CD4, zytotoxische T-Zellen und NK- Zellen exprimieren CD8 (ENGELHARDT et al.1997).
KAEOKET et al. (2002b) finden im Oberflächen- und Drüsenepithel des porcinen Endometriums eine größere Anzahl CD8 positiver als CD4 positiver Zellen, während im oberflächlichen und tiefen Stroma ein umgekehrtes Verhältnis beobachtet wird. Im Östrus und frühen Postöstrus ist die Anzahl CD2 und CD4 positiver Zellen im Oberflächen- und Drüsenepithel am höchsten, während im tiefen Stroma die Anzahl CD4 positiver Zellen im frühen Postöstrus am höchsten ist (KAEOKET et al. 2002b).
Neben kleinen Lymphozyten sind große granulierte Lymphozyten im Endometrium innerhalb des Oberflächenepithels und subepithelial zu beobachten (BISCHOF et al. 1994a; KING 1988). Morphologisch ähnliche Zellen wurden auch im Dünndarm des Schweins beobachtet (WILSON 1986). Auch im humanen (KING u. LOKE 1991) und im ovinen (LEE et al. 1992) trächtigen und nicht trächtigen Uterus sowie im Uterus von Nagern (STEWART 1991) während der Trächtigkeit konnten solche Zellen identifiziert werden.
Plasmazellen, die IgG, IgM und IgA produzieren, sind im porcinen Endometrium nur vereinzelt anzutreffen. Im Östrus kommt es zu einem Anstieg der Anzahl dieser Zellen (HUSSEIN et al. 1983).
Neutrophile Granulozyten treten im präpuberalen porcinen Uterus gehäuft auf (BISCHOF et al. 1994a). Bei geschlechtsreifen Sauen ist vor allem im Proöstrus und Östrus sowie nach Insemination eine starke Infiltration neutrophiler Granulozyten zu beobachten. Diese Zellen sind als Ansammlungen subepithelial sowie um Blutgefäße herum anzutreffen. Nur vereinzelt finden sie sich auch im Oberflächenepithel. (BISCHOF et al. 1994a, 1994b; ENGELHARDT et al. 1997; KAEOKET et al. 2002a, 2003a, 2003c).
Zu den MHC Klasse II exprimierenden Zellen gehören neben antigenpräsentierenden Zellen wie dendritischen Zellen und Makrophagen auch Lymphozyten und Endothelzellen (LUNNY u. PESCOVITZ 1987; SAALMÜLLER et al. 1991). KAEOKET et al. (2002b) finden keinen zyklusabhängigen Einfluss auf die Anzahl MHC Klasse II positiver Zellen im porcinen Endometrium. Im Endometrium der Stute (FRAYNE u. STROKES 1994) und Ratte (HEAD u. GAEDE 1986; ZHENG et al. 1988) steigt die Anzahl MHCII positiver Zellen im Östrus an, während dieser Anstieg bei Mensch (BULMER et al. 1988) und Schaf (LEE et al. 1988) nicht zu beobachten ist.
Mastzellen können im porcinen Endometrium von KAEOKET et al. (2002a) nur in geringer Anzahl mittels Toluidinblaufärbung nachgewiesen werden. Obwohl kein signifikanter Einfluss des Zyklus besteht, ist im Östrus die größte Anzahl Mastzellen nachzuweisen. Im bovinen Endometrium finden LIKAR und LIKAR (1964) nach Anstieg im Proöstrus im späten Proöstrus und im frühen Östrus die meisten Mastzellen. Nach dem Östrus kommt es zu einem plötzlichen Abfall der Mastzellzahl. Bei Hamstern wird eine Reduzierung der Mastzellzahl kurz vor der Ovulation, gefolgt von einem Anstieg nach der Ovulation, nachgewiesen (BRANDON u. EVANS 1983).
2.3 Immunreaktion des porcinen Uterus nach Insemination
Nach transzervikalem Absetzen des Ejakulats kommt es beim Schwein zu einem schnellen Einstrom von neutrophilen Granulozyten in das Endometrium und das Lumen des Uterus (LOVELL u. GETTY 1968; PURSEL et al. 1978; ROZEBOOM et al. 1998, 1999). Diese Immunreaktion kann auch durch Seminalplasma hervorgerufen werden (BISCHOF et al.
1994b; ROZEBOOM et al. 1999; ARMSTRONG et al. 2000), obwohl in vitro eine Hemmung der Chemotaxis neutrophiler Granulozyten durch Seminalplasma nachgewiesen werden kann (ROZEBOOM et al. 2001a, b).
Nach Bedeckung von Jungsauen mit einem vasektomierten Eber beobachten BISCHOF et al.
(1994b) einen Anstieg MHC Klasse II positiver Zellen in der Umgebung der uterinen Drüsen.
Die Anzahl an Makrophagen steigt 5-6 h nach Insemination im Vergleich zu unbesamten östrischen Sauen im Oberflächenepithel und im Stroma des Endometriums nur geringgradig an (KAEOKET et. al. 2003a). Eine verstärkte Infiltration von Makrophagen nach Insemination mit Seminalplasma wird von HADJISAVAS et al. (1994) beschrieben.
Untersuchungen an Lymphozyten im porcinen Endometrium nach Insemination (KAEOKET et al. 2003b; WHYTE u. BINNS 1994) bzw. Seminalplasmaapplikation (BISCHOF et al.
1994b) zeigen CD2 positive Zellen als häufigste Subpopulation. Im Vergleich zum Endometrium von östrischen unbesamten Tieren können KAEOKET et al. (2003b) zahlenmäßig erhöhte Werte für CD2, CD4 und CD8 positive Zellen bei Sauen bis zu elf Tagen nach Insemination nachweisen. Im Gegensatz dazu finden BISCHOF et al. (1994b, 1995) nach Natursprung bei der Jungsau niedrigere Werte für diese Zellen im Vergleich zu unbesamten Tieren am zweiten bis vierten Tag nach dem Östrus. Wie auch im Östrus bei unbseamten Tieren finden KAEOKET et al. (2003b) im Oberflächen- und Drüsenepithel des Endometriums eine größere Anzahl CD8 als CD4 positiver Zellen, während im oberflächlichen und tiefen Stroma ein umgekehrtes Verhältnis zu beobachten ist.
Einen Einfluss der Insemination auf Mastzellen im Endometrium konnten KAEOKET et al.
(2003a) nicht nachweisen. Im Endometrium der Stute kann ein signifikanter Anstieg der Mastzellzahl nach Insemination festgestellt werden (SCHULZ 1997).
2.4 Morphologie der uterotubalen Verbindung des Schweins
Die uterotubale Verbindung (UTJ) des Schweins kontrolliert den Spermientransport aus dem Uterus in den Eileiter (HAFEZ 1975). Zum einen dient sie als Barriere, um das Eindringen von Spermien in den Eileiter zu reduzieren und Polyspermie zu verhindern (HUNTER u.
LEGLISE 1971; HUNTER 1973; FLECHON u. HUNTER 1981). Zum anderen hat sie die Funktion eines Spermienreservoirs (DU MESNIL DU BUISSON u. DAUZIER 1955; RIGBY 1966; HUNTER 1981; MBURU et al. 1996).
Ergebnisse von histologischen und ultrastrukturellen Untersuchungen der uterotubalen Verbindung des Schweins liegen hauptsächlich von östrischen inseminierten Tieren vor. WU et al. (1996) beobachten in einer elektronenmikroskopischen Untersuchung kaum sichtbare Veränderungen während des Zyklus. Eine Unterscheidung zwischen uterinem Anteil und tubalem Anteil der uterotubalen Verbindung wird von HUNTER et al. (1987) vorgenommen.
Die uterotubale Verbindung des Schweins besitzt Schleimhautausstülpungen in das uterine Lumen (HOOK u. HAFEZ 1968). In den ersten Millimetern finden sich charakteristische Divertikel in der Schleimhaut, die sich als Abzweigungen vom sehr engen Lumen darstellen (RIGBY 1965). Die fingerförmigen Ausstülpungen des uterinen Anteils der uterotubalen Verbindung, die im Östrus ödematös sind, ragen als Fortsetzung von Längsfalten des Isthmus des Eileiters in den Uterus vor. Sie bilden eine Art Klappe, die das Eindringen von Spermien und Seminalplasma in den Eileiter beschränkt. Im tubalen Anteil der uterotubalen Verbindung bilden die Ausstülpungen eine Verbindung mit den ödematösen terminalen Falten des Isthmus des Eileiters (HUNTER et al. 1987). Nach dem Östrus verschwindet die ödematöse Schwellung vollständig (FLECHON u. HUNTER 1981). Die Krypten der Falten der uterotubalen Verbindung sind präovulatorisch eng geschlossen, peri- und postovulatorisch öffnen sie sich mehr (MBURU et al. 1997).
Das Oberflächenepithel der uterotubalen Verbindung besteht aus sekretorischen und zilientragenden Zellen (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1990; WU et al. 1996). Die sekretorischen Zellen sind der häufigste Zelltyp der uterotubalen Verbindung (FLECHON u.
HUNTER 1981; RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1990). Sie machen im Östrus nahe dem Eileiter 50 Prozent und nahe dem Uterus 70 Prozent der Epithelzellen aus (RODRIGUEZ- MARTINEZ et al. 1990). Auch in der Lutealphase sind nur maximal 25 Prozent der Epithelzellen zilientragend (HOOK u. HAFEZ 1968). Die sekretorischen Zellen sind hochprismatisch, bilden lumenseitig Mikrovilli und besitzen einen länglichen Kern. Eine hohe sekretorische Aktivität kann beobachtet werden. Bei den zilientragenden Zellen handelt es sich um hochprismatische Zellen mit Mikrovilli und länglichem Kern mit auffälligem Nucleolus (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1990). Sie sind in der uterotubalen Verbindung nur wenig vertreten (WU et al. 1996; MBURU et al. 1997).
Das subepitheliale Stroma besteht hauptsächlich aus Fibroblasten und Kollagenfasern (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1990). Uterusnah sind Drüsenanschnitte zu beobachten.
Die Schleimhautvorwölbungen in den Uterus setzten sich als Divertikel in das Stroma der uterotubalen Verbindung fort (HOOK u. HAFEZ 1968). Das Stroma zeigt im Östrus ein Ödem und eine unterschiedliche Anzahl immigrierender Zellen nahe den subepithelialen Kapillaren. Neutrophile Granulozyten werden nur in geringer Anzahl im Stroma beobachtet und überqueren nicht die Basalmembran (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1990).
Nach HUNTER et al. (1987) können im uterinen Anteil der uterotubalen Verbindung Leukozyten auf dem Oberflächenepithel beobachtet werden, im tubalen Anteil sind Leukozyten nur vereinzelt in der Tiefe der terminalen Falten anzutreffen. HOOK und HAFEZ (1968) finden im Epithel nahe der Basalmembran wenige lymphoblast- ähnliche Zellen.
RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. (1990) beschreiben kleine runde und dendritische Zellen an der Basis des Oberflächenepithels, die jedoch nicht die Basalmembran übertreten. Die Kerne der runden Zellen variieren zwischen rund und bohnenförmig, daher werden sie als Lymphozyten und Monozyten eingestuft. Im Epithel und im Lumen werden keine neutrophilen Granulozyten beobachtet.
2.5 Lymphgefäßsystem
Das Lymphgefäßsystem ist für die Bildung und den Abtransport von Lymphe verantwortlich.
Es stellt ein dem Venensystem parallel geschaltetes Drainagesystem dar. Das Lymphgefäßsystem wird in die Abschnitte Lymphkapillaren, Präkollektoren, die zusammen auch als initiale Lymphgefäße bezeichnet werden, sowie Kollektoren und Lymphstämme eingeteilt (FÖLDI u. KUBIK 1999).
Lymphkapillaren sind blind endende Gefäße, die aus einer einfachen Endothelzellschicht bestehen. Die Endothe lzellen überlappen sich stellenweise und bilden so interzelluläre Verbindungen in Form von Klappen als Eintrittspforte in die Lymphkapillare. Eine Basalmembran ist nicht durchgängig vorhanden (FÖLDI u. KUBIK 1999; PEPPER u.
SKOBE 2003). Die Lymphkapillaren sind über Ankerfilamente mit interstitiellen elastischen und kollagenen Fasern verbunden (GERLI et al. 1990).
Die Lymphkapillaren sind funktionell Resorptionsgefäße. Durch ansteigenden interstitiellen Flüssigkeitsdruck öffnen sich die interzellulären Verbindungen und es kommt zum Eintritt von Flüssigkeit, Makromolekülen und Zellen aus dem Interstitium in das Lumen der Kapillaren. Dadurch verringert sich die Druckdifferenz zwischen Gefäßlumen und Interstitium, die interzellulären Verbindungen schließen sich wieder (IKOMI u. SCHMID- SCHÖNBEIN 1996; SCHMID-SCHÖNBEIN 1990).
Präkollektoren dienen der Lymphbildung und der Weiterleitung von Lymphe in die Kollektoren. Sie sind wie Lymphkapillaren mit interendothelialen Öffnungen ausgestattet.
Dem Endothel liegt unter der Basalmembran in einigen Abschnitten eine Bindgewebsschicht mit vereinzelten glatten Muskelzellen an. Ab den Präkollektoren besitzen die Lymphgefäße Klappen, welche einen Reflux von Lymphe verhindern. (FÖLDI u. KUBIK 1999; MAZZONI et al.1987).
Kollektoren und Lymphstämme sind aus Tunica intima, Tunica media und Tunica adventitia aufgebaut. Die Tunica intima besteht aus Endothel und Basalmembran. Die Tunica media besteht aus mehreren Schichten glatter Muskelzellen, die von kollagenen und elastischen Fasern umhüllt sind. Die Tunica adventitia besteht aus lockerem kollagenem Bindegewebe (FÖLDI u. KUBIK 1999).
Die Kollektoren gliedern sich funktionell in tropfenförmige Klappensegmente, die als Lymphangione bezeichnet werden. Durch Kontraktion der Lymphangione kommt es zum aktiven Weitertransport der Lymphe. Den Kollektoren sind Lymphknoten zwischengeschaltet.
Die Lymphstämme leiten die Lymphe über Einmündungsstellen in das venöse System dem Blutkreislauf zu (FÖLDI u. KUBIK 1999; OLSZEWSKI 1985).
2.5.1 Lymphgefäßsystem des porcinen Uterus
Bei der Untersuchung frischer Uteri von geschlachteten Jungsauen kann KRAUS (1961) Lymphgefäße im Ligamentum latum uteri durch subseröse Farbinjektion darstellen. Sie sind gegenüber benachbarten Blutgefäßen verschieblich und liegen in einer eigenen Lamelle, die KRAUS (1961) als „stratum lymphaceum“ bezeichnet.
FABIAN (1981, 1984, 1988) stellt an Schlachtorganen Lymphgefäße im Endometrium, Myometrium und Perimetrium durch Aufbringen von Patentblau-Violett und japanischer Tusche auf die Schleimhaut dar. Nach Farbapplikation auf die Schleimhaut erfolgt sofort eine Zeichnung der Lymphgefäße, die sich in Richtung Perimetrium verliert. Zwischen Endometrium und Myometrium sowie zwischen Myometrium und Perimetrium ist je ein größeres Lymphgefäß, das parallel zur Längsachse des Uterushorns verläuft, zu beobachten.
Zwischen diesen Gefäßen verlaufen Anastomosen (FABIAN 1981, 1984, 1988).
GAWRONSKA et al. (1992) stellen Lymphgefäße im Ligamentum latum uteri von Schlachtorganen durch subseröse Injektion von Latex, DOBROSZYNSKA et al. (1999) mittels Mikrofil und einem Gelatine- Tinte- Gemisch dar.
Aus dem Corpus uteri und dem vorderen Teil der Zervix stammende Präkollektoren bilden ein bis zwei lange Kollektoren, die im Ligamentum latum uteri nach cranial verlaufen und ein großes Areal ohne Lymphgefäße demarkieren. Präkollektoren aus dem caudalen Teil der Zervix bilden zwei bis drei große Lymphgefäße, die zum größten Lymphknoten im Ligamentum latum uteri der kontralateralen Seite laufen (DOBROSZYNSKA 2002).
Zahlreiche Lymphgefäße des Uterushorns bilden ein dichtes Netzwerk im Ligamentum latum uteri; weniger zahlreiche und schmalere Kollektoren, die zu einem oder mehreren uterinen Lymphknoten führen, können beobachtet werden. Lymphkollektoren des Ovars verlaufen in engem Kontakt zu uterinen Lymphkollektoren, direkte Verbindungen können jedoch nicht erfasst werden (GAWROSKA et al. 1992). Präkollektoren, die den Uterus nahe des Ovidukts verlassen, bilden in der Nähe des Ligamentum ovarii proprium ein komplexes Netzwerk, das von GAWROSKA et al. (1997) als paraovarieller lymphatischer Plexus bezeichnet wird.
Dieser Plexus ist von einem dichten Netzwerk kleiner Blutgefäße (Vasa lymphaticorum) umhüllt.
Die meisten Kollektoren vo n Uterus, Ovidukt und Ovar sind mit je einem großen, zentralen Lymphknoten im linken und rechten Ligamentum latum uteri nahe der A. uterina verbunden.
Dieser Lymphknoten ist von drei bis sieben normalen und null bis zwei hämalen kleinen Lymphknoten benachbart. Weiterhin gibt es Verbindungen zu neun bis 27 Aortenlymphknoten. Auch unter den genannten Lymphknoten bestehen Verbindungen (DOBROSZYNSKA 2002).
Präkollektoren im Ligamentum latum uteri zeichnen sich vor allem nahe dem Uterushorn durch einen kapillarähnlichen Charakter aus. Ihre Wand besteht vor allem aus Endothelzellen, glatte Muskelzellen treten nur selten auf. Die Tunica intima der Kollektoren besitzt eine Lamina elastica interna. Eine Basalmembran ist über weite Abschnitte vorhanden. Die Tunica media besteht aus einer Schicht glatter Muskelzellen. Kollagenfasern, Fibroblasten, Blutgefäße und Nerven bilden die Tunica externa (DOBROSZYNSKA et al. 1996a).
Das Lymphgefäßsystem des porcinen Uterus unterliegt zyklischen Schwankungen (DOBROSZYNSKA et al. 1996a, b, 1999; FABIAN 1981, 1984, 1988; GAWRONSKA et al.
1992). Lichtmikroskopische Untersuchungen an Endometrium, Myometrium und Perimetrium zeigen eine Erweiterung der gestreckt verlaufenden Lymphkapillaren im Östrus mit Bildung eines feinen Maschenwerks. Im Postöstrus nimmt die Lymphkapillarzeichnung ab, ein geschlängelter Verlauf ist zu beobachten. Im Interöstrus erscheinen die Kapillaren gewellt, im Präöstrus ähnelt das Bild dem des Östrus (FABIAN 1981, 1984, 1988).
GAWRONSKA et al. (1992) beobachten in der Follikelphase kürzere, engere Lymphangione im Gegensatz zu längeren Lymphangionen in der Gelbkörperphase. DOBROSZYNSKA et al.
(1996a) untersuchen licht- und elektronenmikroskopisch Präkollektoren und Kollektoren im Ligamentum latum uteri von Schweinen zu verschiedenen Zeiten des Zyklus. Dabei zeigen die Kollektoren keine zyklusabhängigen Veränderungen, während die deutlichsten Veränderungen an Präkollektoren nahe dem Uterushorn beobachtet werden. In der Follikelphase sind die Wände dieser Präkollektoren stark gefaltet und subendotheliale
Flüssigkeitssinus können beobachtet werden. Die Endothelzellen sind sehr dünn und besitzen wenige Zellorganellen. Eine Basalmembran und Ankerfilamente sind kaum zu beobachten.
Einen Tag nach der Ovulation nimmt die subendotheliale Flüssigkeit ab. Die Endothelzellen zeigen Kondensationen von Ankerfilamenten, Basalmembranfragmente sind vorhanden und die Anzahl von Zellorganellen nimmt zu. In der Follikelphase ist das Lumen der Präkollektoren deutlich mit Lymphe gefüllt, es sind keine subendothelialen Flüssigkeitsinfiltrationen zu beobachten. Ankerfilamente und Zellorganellen sind zahlreich vorhanden. In allen Zyklusphasen können offene interendotheliale Verbindungen beobachtet werden (DOBROSZINSKA et al. 1996a).
2.5.2 Technik der Lymphgewinnung
Für die Beschreibung von Lymphgewinnungstechniken ist eine grundsätzliche Einteilung der Lymphgefäße und Lymphe nötig. Periphere Lymphe drainiert aus einem Organ oder Körperteil über afferente Lymphgefäße zum regionären Lymphknoten. Zentrale Lymphe kann aus efferenten Lymphgefäßen, die einen Lymphknoten verlassen, gewonnen werden.
Intermediäre Lymphe fließt von einem Lymphknoten in einen anderen. (YOUNG et al.
1997).
Für die Lymphgewinnung sind flexible Schläuche aus Polyethylen, Polyvinyl oder Teflon mit einem Außendurchmesser unter 2,0 mm geeignet. Da Lymphe bei der Gewinnung gerinnt, sollten die Schläuche vor Verwendung mit steril gefilterter Heparinlösung gespült werden (YOFFEY u. COURTICE 1970; YOUNG et al. 1997).
LASCELLES und MORRIS (1961) beschreiben Techniken der Lymphgewinnung beim Schaf aus Ductus thoracicus, Truncus intestinalis, Truncus hepaticus und efferenten Lymphgefäßen des Euters. Das zur Lymphgewinnung vorgesehene Gefäß wird auf einer Länge von etwa 1 bis 4 cm freipräpariert und durch Anlegen einer Ligatur gestaut. Mittels einer Schere wird das Lymphgefäß angeschnitten und ein silikonbeschichteter Polyvinylschlauch gegen die
Richtung des Lymphflusses in das eröffnete Gefäß eingeführt. Die Außendurchmesser der verwendeten Schläuche betragen 1,3- 2,2 mm.
Der Schlauch wird im umgebenden Gewebe mittels Ligaturen befestigt, nach außen geführt und an der Haut vernäht. Nach Verschluss der Operationswunde kann Lymphe aus den genannten Lymphstämmen in einer an der Haut festgenähten Polyethylenflasche über einen Zeitraum von mindestens einer Woche gewonnen werden.
Diese grundsätzliche Methode wird für die Gewinnung afferener und efferenter Lymphe aus verschiedenen Geweben des Schafs angewendet (HEATH et al. 1962; HALL u. MORRIS 1963; LINDNER et al. 1964; SMITH et al. 1970; ALDERS u. PRESS 1990; BUXTON et al.
1994), wobei der Außendurchmesser der verwendeten Schläuche je nach Größe des Lymphgefäßes zwischen 0,61 und 1,9 mm liegt.
Afferente uterine Lymphgefäße beim Schaf (ABDEL RAHIM et al. 1984; HEAP et al. 1985;
STAPLES et al. 1982) und Rind (HEIN et al. 1988) werden von den genannten Autoren durch subseröse Injektion von Evans Blue in physiologischer Kochsalzlösung sichtbar gemacht.
DHARMARAJAN et al. (1986) injizieren Patent Blau in physiologischer Kochsalzlösung in die A. ovarica, um ovarielle Lymphgefäße bei der Ratte darzustellen.
Ein möglichst großes und gut zugängliches Lymphgefäß wird vorsichtig freipräpariert.
STAPLES et al. (1982) ligieren vor der Präparation alle erkennbaren Lymphgefäße, HEAP et al. (1985) legen nach der Präparation eine Ligatur um das zu punktierende Lymphgefäß. Das präparierte Lymphgefäß wird angeschnitten und ein Polyethylen- oder Polyvinylschlauch, der schräg zugeschnitten wird, gegen die Richtung des Lymphflusses mindestens bis hinter das erste Klappenpaar vorgeschoben. Der Außendurchmesser des Schlauchs wird so groß wie möglich gewählt (ABDEL RAHIM et al. 1984) und liegt zwischen 0,61 und 1,5 mm. Der Schlauch wird mittels Ligaturen im Gefäß fixiert. Für Langzeitgewinnung von Lymphe wird der Schlauch zusätzlich im Mesometrium vernäht, nach außen geführt und an der Haut vernäht. HEIN et al. (1988) verwenden ein System von ineinander verlaufenden Schläuchen, das während der Lymphgewinnung die Applikation eines Antikoagulanz zulässt. HEAP et al.
(1982) füllen den verwendeten Schlauch vor Verwendung mit Heparinlösung und verabreichen intravenös Heparin. ABDEL RAHIM et al. (1984) spülen bei Stillstand des Lymphflusses den Schlauch mit Heparinlösung. Der Uterus wird während der Operation
möglichst wenig berührt, um den Eintritt von Erythrozyten in die Lymphe zu minimieren (HEAP et al. 1982).
MAGNESS und FORD (1982, 1983) gewinnen uterine Lymphe von Jungsauen. Ohne vorherige Farbinjektion wird ein uterines Lymphgefäß isoliert und ligiert. Ein Polyvinylkatheter mit einer Polyethylenspitze und einem Außendurchmesser von 1,65 mm (MAGNESS u. FORD 1983) bzw. einer Stahlspitze und einem Außendurchmesser von 1,22 mm (MAGNESS u. FORD 1982) wird gegen die Lymphflussrichtung in das Gefäß eingeführt und mittels Ligaturen befestigt. Für Langzeitgewinnung von Lymphe (MAGNESS u. FORD 1983) wird der Katheter durch die Flanke nach außen geführt. Bei Bedarf kann ein geringer Unterdruck erzeugt werden (MAGNESS u. FORD 1982).
Nach HALL et al. (1977) sind die afferenten mesenterialen Lymphgefäße beim Schaf so feinlumig, dass eine Kannulierung unmöglich erscheint. Stattdessen werden mesenteriale Lymphknoten entfernt; es kommt nach einigen Wochen zu einer Verbindung der vormals afferenten und efferenten Lymphgefäße. Diese Verbindung ist relativ stark und lässt sich zur Lymphgewinnung nutzen. Da afferente Lymphe nur in geringer Quantität und für einen eingeschränkten Zeitraum gewonnen werden kann, kann diese Methode zur Gewinnung
„pseudoafferenter“ Lymphe genutzt werden (YOUNG et al. 1997).
2.5.3 Zellen in der Lymphe
Die Zusammensetzung der Lymphe unterscheidet sich vor und nach Passieren eines Lymphknotens. Die Gesamtzellzahl in peripherer Lymphe zeigt deutliche Schwankungen sowohl zwischen unterschiedlichen Geweben und Tieren als auch innerhalb eines Tieres.
SMITH et al. (1970) weisen beim Schaf in efferenter Lymphe aus den Extremitäten, Niere, Ovar, Hoden und Schilddrüse durchschnittlich 200 bis 1000 Zellen/µl und in Leberlymphe 2000 bis 6000 Zellen/µl nach. Beim Schaf werden in utero- ovarieller Lymphe in der
Follikelphase durchschnittlich 200 Leukozyten/µl und in der Lutealphase 30 Leukozyten/µl gefunden (ALDERS u. PRESS 1990); beim tragenden Schaf sind es 20 bis 400 Leukozyten/µl (STAPLES et al. 1982). Für uterine und ovarielle periphere Lymphe der tragenden Kuh liegen die Werte durchschnittlich zwischen 3 und 100 Zellen/µl. In zentraler Lymphe beim Schaf sind im Vergleich zu peripherer Lymphe deutlich mehr Zellen enthalten (SMITH et al. 1970). Die Werte liegen zwischen 1000 und 26000 Zellen/µl (HEATH et al.
1962; SMITH et al. 1970).
Die Zellen in peripherer Lymphe setzen sich durchschnittlich aus etwa 80 bis 90 Prozent Lymphozyten, 10 bis 20 Prozent Monozyten und Makrophagen sowie wenigen anderen Leukozyten zusammen (HALL u. MORRIS 1963; SMITH et al. 1970; HEIN et al. 1988;
ALDERS u. PRESS 1990). STAPLES et al. (1982) weisen in peripherer utero- ovarieller Lymphe beim tragenden Schaf 95 bis 100 Prozent, SMITH et al. (1970) 90 bis 95 Prozent Lymphozyten nach. In zentraler Lymphe verschiedener Gewebe des Schafs finden HALL und MORRIS (1963) und SMITH et al. (1979) Lymphozytenanteile von 92 bis 100 Prozent.
ALDERS und PRESS (1990) weisen in peripherer utero- ovarieller Lymphe des Schafs durchschnittlich 7 Prozent eosinophile Granulozyten nach; der Anteil dieser Zellen steigt zwischen Tag 10 bis 15 des Zyklus auf über 10 Prozent an. In den ersten 5 Tagen nach Beginn der Gewinnung von peripherer ovarieller und uteriner Lymphe bei tragenden Kühen beobachten HEIN et al. (1988) neutrophile Granulozyten als dominierende Leukozytenpopulation. Auch nach Antigenstimulation kann ein Anstieg der Anzahl neutrophiler Granulozyten beobachtet werden (HALL u. MORRIS 1963).
In peripherer Lymphe des Hinterbeins beim Schaf finden HALL und MORRIS (1963) variierende Anteile Erythrozyten. Zu Beginn der Lymphgewinnung aus Ovar und Schilddrüse sind einige Erythrozyten in der peripheren Lymphe nachzuweisen. Periphere Lymphe der Niere wird bei vielen untersuchten Schafen durch den hohen Anteil an Erythrozyten rosa bis rot gefärbt (SMITH et al. 1970). In utero- ovarieller Lymphe des Schafs finden ALDERS und PRESS (1990) hohe Werte für Erythrozyten. Durchschnittlich werden in der Follikelphase 300, in der Lutealphase 60 Erythrozyten/µl nachgewiesen.
Beim Schaf sind in zentraler Lymphe verschiedener Lymphstämme nahezu keine Erythrozyten nachzuweisen. Im Ductus thoracicus dagegen können Werte zwischen 3x104 und 120x104 Erythrozyten/µl nachgewiesen werden (HEATH et al. 1962).
2.5.4 Lymphfluss
Im Ductus thoracicus werden beim Schaf Lymphflussraten von 40 bis 200 ml/h, im Ductus intestinalis von 20 bis 35 ml/h und im Ductus hepaticus von 4,4 bis 14 ml/h gemessen (HEATH et al. 1962). Periphere Lymphe des Schafs aus Extremitäten, Leber, Niere und Ovar wie auch zentrale Lymphe der Extremitäten und der Leber fließt mit einer Rate von 1 bis 10 ml/h (SMITH et al. 1970).
Der Lymphfluss aus dem Ovar unterliegt zyklischen Schwankungen. LINDNER et al. (1970) messen in ovarieller Lymphe des Schafs in der Lutealphase Lymphflussraten von durchschnittlich 4,8 ml/h, in der Follikelphase nur 0,2 ml/h. ALDERS und PRESS (1990) können beim Schaf in utero- ovarieller Lymphe eine positive Korrelation zwische n Anzahl der Corpora lutea und maximalem Lymphfluss feststellen. Dabei liegt der ermittelte Lymphfluss bei 2,2 ml/h in der Follikelphase und 13,9 ml/h in der Lutealphase. Bei der tragenden Ratte (Tag 16) messen DHAMARAJAN et al. (1986) einen durchschnittlichen Lymphfluss von 0,06 ml/h. Beim tragenden Schaf (Tag 15 bis 31) fließt utero- ovarielle Lymphe mit 1,6 bis 2,7 ml/h (STAPLES et al. 1982). ABDEL RAHIM et al. (1984) können für uterine Lymphe des Schafs bei einer durchschnittlichen Flussrate von 0,8 ml/h keine zyklusabhängigen Schwankungen feststellen.
3 Material und Methoden
3.1 Geräte
Aqua dest. Aufbereitungssystem Fa. Kloos, Langenhagen Arterienklemmen Mosquito, gerade Fa. Aesculap, Tuttlingen Augenpinzette, anatomisch, gerade Fa. Aesculap, Tuttlingen
Brutschrank Fa. Haraeus, Hanau
Gewebeeinbettautomat Hypercenter II Fa. Shandon, Frankfurt Inhalationsnarkosegerät „Sula 800“ Fa. Dräger, Lübeck Irisschere, gerade, spitz Fa. Aesculap, Tuttlingen
Kryostat Fa. Microm, Heidelberg
Laborwaage, Typ L310 Fa. Satorius GmbH, Göttingen
Lupenbrille (Optivisor®) Fa. Donegan Optical Company, Lenexa, USA
Metzenbaumschere, gerade Fa. Aesculap, Tuttlingen Nadelhalter nach Mathieu Fa. Aesculap, Tuttlingen Photomikroskop “Axioskop” Fa. Zeiss, Oberkochen Pinzette, gerade, anatomisch Fa. Aesculap, Tuttlingen Pinzette, gerade, chirurgisch Fa. Aesculap, Tuttlingen
Pipetten, einstellbar Fa. Brand GmbH & Co., Wertheim
Schlittenmikrotom Fa. Microm, Heidelberg
Skalpellgriff Fa. Aesculap, Tuttlingen
Tuchklemmen nach Backhaus Fa. Aesculap, Tuttlingen Ultraschallgerät Sonoline® SI 250 Fa. Siemens, Karlsruhe Wundnadeln, rund, mit Federöhr, 1/2 Kreis
(55 und 30 mm)
Fa. Eikemeyer, Tuttlingen Wundnadeln, schneidend, mit Federöhr, 3/8
Kreis (70, 40 und 20 mm)
Fa. Eikemeyer, Tuttlingen
3.2 Materialien
3.2.1 Klinikbedarf
Samenentnahme
Eberphantom- Modell Minitüb Fa. Minitüb GmbH & Co. KG, Tiefenbach Handschuhe „True Touch“ Fa. Maxxim Medical Inc., Clearwater, USA Samenauffanggefäß Fa. Minitüb GmbH & Co. KG, Tiefenbach
„US BAG“- Samenauffangbeutel Fa. Minitüb GmbH & Co. KG, Tiefenbach
Operation
Braunülen 1,3 x 45 mm Fa. Vygon GmbH und Co. KG, Aachen EDTA- Röhrchen (2 ml, 5 ml, 10 ml) Fa. Sarstedt, Nürnbrecht
Einweg- OP- Handschuhe, steril Fa. Braun, Melsungen
Einweg- Operationsmasken Fa. Irema, Kilamllock, Irland
Einweg- Rasierer Fa. Heiland, Hamburg
Kanülen (0,45x20 mm, 0,7x40 mm, 0,9x40 mm)
Fa. Braun, Melsungen Mikrokanüle aus Perfluorocarbon mit Trokar,
(Innendurchmesser 0,2 mm, Außendurchmesser 0,4 mm, Länge 8 cm)
Fa. Fine Science Tools, Foster City, USA
Mikrokanüle aus rostfreiem Stahl,
(Innendurchmesser 0,1524mm, Außendurch- messer 0,3048 mm, Länge 90 mm)
Fa. Fine Science Tools, Foster City, USA
Nadel- Faden- Kombination Supramid, pseudomonofil, atraumatisch (0,5, 1, 2 und 3 metric)
Fa. Heiland, Hamburg
Nahtmaterial Supramid Fa. Heiland, Hamburg
Operationstücher Fa. Heiland, Hamburg
Polyethylenschläuche (Innendurchmesser 0,4 bzw. 0,8 mm, Außendurchmesser 0,58 bzw.
0,96 mm)
Fa. SIMS Partex Ltd., England
Spritzen (1 ml, 5ml, 20ml) Fa. Braun, Melsungen Trachealtuben (Durchmesser 11 mm, Länge
32 cm)
Fa. Eikemeyer, Tuttlingen
3.2.2 Laborbedarf
Coverplates® Fa. Shandon, Frankfurt
Eppendorf- Reaktionsgefäße, 1,5 ml Fa. Brand GmbH & Co., Wertheim Papierfilter Fa. Schleicher & Schuell, Dassel
Paraplast Plus® Fa. Shandon, Frankfurt
Pipettenspitzen (weiß, gelb und blau) Fa. Eppendorf, Hamburg
Superfrost®- Objektträger Fa. Menzel- Gläser, Braunschweig
3.2.3 Medikamente und Reagenzien
3,3`- Diaminobenzidintetrahydrochlorid Fa. Fluka, Buchs, Schweiz ABC- Elite- Kit Fa. Vectastain Laboratories Inc.,
Burlingame, USA
ABC- Elite Mouse Kit Fa. Vector Laboratories Inc., Burlingame, USA
Atropinum sulfuricum solutum® 1%
(Atropinsulfat 1%, 0,02-0,08 mg/kg)
Fa. WDT, Garbsen Balb/C Mäuse- Ascites Fa. BioLogo, Kronshagen Bovines Serumalbumin Fa. Serva, Heidelberg
CaCl x 2 H2O Fa. Merck, Darmstadt
Evans Blue Fa. Merck, Darmstadt
Glyceringelatine Fa. Merck, Darmstadt
Gramox® dry (Amoxicillin- Natrium, 10 mg/kg)
Fa. Vetoquinol, Oberursel
Heparin Fa. Merck, Darmstadt
Isocain® 2% Fa. Selectavet, Wayarn- Holzollig
Isoflo® (Isofluran) Fa. Essex, München
Natriumchlorid Fa. Roth, Karlsruhe
Perhydrol (Wasserstoffperoxyd 30%) Fa. Merck, Darmstadt
Pronase E Fa. Merck, Darmstadt
Roti®- Histokit Fa. Roth, Karlsruhe
Roti®- Histol Fa. Roth, Karlsruhe
Stresnil® (Azaperon 1%, 2 mg/kg i.m.) Fa. Jansen- Cilag GmbH, Neuss Surital® (Thiamylal- Natrium 4%,
2,5- 10 mg/kg i.v.)
Fa. Pharmacia & Upjohn GmbH, Erlangen
Toluidinblau Fa. Merck, Darmstadt
Trypsin Fa. Fluka, Buc hs, Schweiz
Tween 20 Fa. Serva Feinbiochemie GmbH & Co KG,
Heidelberg
Ursotamin® (Ketamin 10%, 10-15 mg/kg i.m.) Fa. WDT, Garbsen
3.2.4 Puffer und Lösungen
ABC- Gebrauchslösung 1 ml PBS
15 µl Substanz A, schütteln 15 µl Substanz B, schütteln 30 min vor Gebrauch ansetzen
DAB- Stammlösung 5 g DAB
PBS (pH- Wert 7,2) ad 2,5 l
DAB- Gebrauchslösung
50 ml DAB- Stammlösung PBS (pH- Wert 7,2) ad 200 ml filtrieren, 2 ml H2O2 (3%) zugeben
Evan`s Blue Färbelösung (steril) 0,5 g Evan`s Blue
Isotone Kochsalzlösung ad 100ml autoklavieren
Färbelösung Hämalaun nach Mayer 1 g Hämatoxylin
Aqua bidest. ad 1 l lösen;
200 mg NaJO3
50 g Kalialaun
in der Hämatoxilinlösung unter schütteln lösen; Lösung sollte blauviolett sein;
50 g Chloralhydrat
1 l Zitronensäure dazugeben; Farbton schlägt nach rotviolett um
Isotone Kochsalzlösung 0,9%
9 g NaCl
Aqua dest. ad 1000 ml
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH- Wert 7,2 40 g NaCl
4,8 g NaH2PO2 x H2O Aqua dest. ad 5 l
Pronase- E- Lösung zur Demaskierung, pH- Wert 7,4 0,1 g Pronase E
0,2 g CaCl2 x 2 H2O 200 ml PBS
Toluidinblaulösung 0,1%
0,1 g Toluidinblau 100 ml A. dest.
Trypsinlösung zur Demaskierung, pH- Wert 7,6 0,5 g Trypsin
0,04 g CaCl2 x 2 H2O 200 ml PBS
3.2.5 Antikörper für die Immunhistochemie
mAk (Maus) Isotyp Spezifität Hersteller
H42A IgG2a MHCII (porcin) Fa. VMRD, Pullman,
USA
74-12-4 IgG2a CD4 (porcin) Fa. VMRD, Pullman,
USA
AA1 IgG2a Tryptase (human)* Fa. Dako Diagnostika
GmbH, Hamburg
*: kreuzreaktiv mit porcinem MHCII
Als sekundärer Antikörper wurde ein polyklonaler Ziege-anti-Maus IgG (H&L) Antikörper, mit Biotin konjugiert (Fa. Vector Laboratories Inc., Burlingame, USA), eingesetzt.
3.2.6 Antikörper für die indirekte Membranimmunfluoreszenz
mAk (Maus) Isotyp Spezifität Zitat
74-12-4 IgG2b CD4 (porcin) Lunney et al. (1994)
76-2-11 IgG2a CD8a (porcin) Lunney et al. (1994)
MUC76a IgG2a CD18 (porcin) Lunney et al. (1994)
K 274.3G8 IgG1 MHCII- DQ (porcin) Lunney et al. (1994) MSA3 IgG2a MHCII- DR (porcin) Lunney et al. (1994)
3.2.7 Versuchstiere
Für die chirurgischen Maßnahmen zur Probengewinnung wurden gesunde Hybridjungsauen im Alter von acht bis neun Monaten im Versuchstierstall des Instituts für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover eingestellt. Die Haltung erfolgte in Zweier- bis Vierergruppen ohne direkten Eberkontakt. Während des Versuchsablaufs wurden die Tiere zweimal täglich vor einen Sucheber getrieben.
Der für die Versuche benötigte Samen wurde von sechs gesunden Hybridebern des Instituts für Reproduktionsmedizin gewonnen. Diese Eber dienten gleichzeitig als Sucheber.
3.3 Methoden
3.3.1 Brunstkontrolle
Die Bunstkontrolle erfolgte zweimal täglich im Abstand von 12 Stunden. Die Tiere wurden vor die Box eines Suc hebers getrieben. Dort wurden Farbe und Ödematisierung der Vulva und Eberduldung beurteilt sowie die Stütz- und Reitprobe durchgeführt. Die Brunstkontrolle wurde bei Duldung des Menschen in Anwesenheit des Ebers als positiv beurteilt. Der Beginn der Brunst wurde aus dem Mittel zwischen letzter negativer und erster positiver Brunstkontrolle berechnet.
Zusätzlich wurden nach Feststellung von Brunstsymptomen die Ovarien mittels transkutaner Sonographie auf Follikel untersucht. Es wurde ein Ultraschallgerät Sonoline® SI 250 mit einem 5- MHz- Schallkopf verwendet.
3.3.2 Samengewinnung
Die Samengewinnung erfolgte manuell am Phantom. Dabei wurde ein vorgewärmtes Samenauffanggefäß mit Samenauffangbeutel verwendet.
Das Ejakulat wurde unmittelbar nach der Entna hme makroskopisch untersucht. Dabei wurden Farbe, Konsistenz und Geruch beurteilt.
3.3.3 Chirurgische Maßnahmen
Chirurgische Eingriffe bei Tieren im Östrus wurden innerhalb der ersten 24 h nach Brunstfeststellung durchgeführt. Die Tiere wurden mindestens 12 h vor Operationsbeginn einzeln aufgestallt und erhielten Nahrungskarenz bei freiem Trinkwasserzugang.
Die chirurgischen Maßnahmen wurden unter Allgemeinanästhesie durchgeführt. Als Prämedikation wurden Atropinsulfat (Atropinum sulfuricum solutum® 1%, 0,02-0,08 mg/kg, i.m.) sowie Azaperon (Stresnil® 1%, 2 mg/kg i.m.) verabreicht. Die Narkoseeinleitung erfolgte durch Ketamin (Ursotamin® 10%, 10-15 mg/kg i.m.). Die Vertiefung der Narkose wurde durch Thimylal- Natrium (Surital® 4%, 2,5- 10 mg/kg i.v.) erreicht. Darauf folgten endotracheale Intubation und Inhalationsnarkose mit einem Gemisch aus Sauerstoff (0,8 l/min), Lachgas (0,4 l/min) und Isofluran (1,5- 3,5 Vol%).
Die Tiere wurden mit dem Kopf nach unten in leichter Schräglage fixiert. Die Bauchhöhle wurde kaudal des Nabels in der Linea alba durch einen Medianschnitt von etwa 15 cm Länge eröffnet und der Uterus vorgelagert.
Nach Anlegen von Ligaturen 20 cm distal der uterotubalen Verbindung wurde in ein Uterushorn im ligierten Bereich 20 ml frischer, unverdünnter Ebersamen, in das contralaterale Uterushorn wurde die gleiche Menge sterile physiologische Kochsalzlösung appliziert. Der verwendete Ebersamen wurde unmittelbar vor Beginn der Operation gewonnen. Durch subseröse Injektion von 1 bis 3 ml steriler Evans Blue Lösung an 6 bis 10 Lokalisationen im ligierten Bereich des Uterushorns erfolgte eine Blaufärbung uteriner Lymphgefäße. Der vorgelagerte Uterus wurde regelmäßig mit körperwarmer physiologischer Kochsalzlösung übergossen, um ein Austrocknen und Abkühlen des Organs zu vermeiden. Das jeweils nicht zur Probengewinnung genutzte Uterushorn wurde in die Bauchhöhle zurückgelagert.
Die verschiedenen Methoden der Lymphgewinnung werden unter 3.3.3.1 bis 3.3.3.4 geschildert.
Nach Beenden der Probenentnahme und Zurücklagern des Uterus in die Bauchhöhle wurde die Bauchwand in 3 Schichten genäht. Peritoneum und Fascia transversalis wurden, wie auch die Muskulatur in der Linea alba, mittels einer fortlaufenden Naht verschlossen. Der Verschluss der Haut erfolgte mit Einzelheften. Die Tiere erhielten eine intravenöse antibiotische Versorgung (Gramox® Dry, Amoxicillin- Natrium, 10 mg/kg). Für 2 Tage nach Beenden der chirurgischen Maßnahmen wurden die Tiere einzeln aufgestallt.
3.3.3.1 Methode I
Nach Darstellung der Lymphgefäße durch Evans Blue erfolgte bei Tier 1 bis Tier 3 die Punktion verschiedener uterusnaher Lymphgefäße (siehe Abb. 1) mittels einer Mikrokanüle aus rostfreiem Stahl (Innendurchmesser 0,1524 mm, Außendurchmesser 0,3048 mm, Länge 9 cm). Gewonnene Lymphe wurde in Eppendorfgefäßen aufgefangen.
3.3.3.2 Methode II
Nach Darstellung der Lymphgefäße durch Evans Blue (siehe Abb. 1) wurde bei Tier 4 und Tier 5 ein möglichst prominentes Lymphgefäß im Ligamentum latum uteri (siehe Abb. 1, 2) vollständ ig freipräpariert und distal des Präparationsbereichs mit einer Ligatur gestaut. Vor Beginn der Punktion des präparierten Lymphgefäßes mittels einer Mikrokanüle aus Perfluorocarbon mit Trokar (Innendurchmesser 0,2 mm, Außendurchmesser 0,4 mm, Länge 8 cm) wurde eine Ligatur locker um das Lymphgefäß gelegt. Mit dieser Ligatur wurde nach erfolgreicher Punktion die Mikrokanüle fixiert. Vor der Benutzung erfolgte eine Füllung der Kanüle mit steril gefilterter Heparinlösung (150 U/ml). Gewonnene Lymphe wurde in Eppendorfgefäßen aufgefangen.
Abb. 1: Darstellung der uterinen Lymphgefäße nach Injektion von Evans Blue
Abb. 2: Stumpfe Präparation eines gestauten Lymphgefäßes
Abb. 3: Lymphgewinnung
1
2
3
4
1 2
1
2
Pfeile: Injektionsstellen subserös am Uterushorn mit abführenden
uterusnahen Lymphgefäßen;
1: blau gefärbte Lymphgefäße im Lig.
latum uteri;
2: Eileiter
1: Durch Evans Blue blau gefärbtes, gestautes Lymphgefäß;
2: Ligatur
1: Uterushorn;
2: Eileiter;
3: EDTA- Auffanggefäß;
4: Polyethylenschlauch
Bei Tier 6 und Tier 7 wurden ohne vorherige Applikation von Evans Blue Ligaturen direkt neben einem möglichst starken Ast der A. uterina gesetzt. Diese sollten zu einem Staueffekt arteriennaher Lymphgefäße führen (FORD 2002). Da sich dieser Staueffekt nicht einstellte, wurde die gleiche Methode wie bei Tier 4 und Tier 5 angewendet.
3.3.3.3 Methode III
Nach Darstellung der Lymphgefäße durch Evans Blue wurde bei Tier 8 bis Tier 11 ein möglichst prominentes Lymp hgefäß nahe des Ln. uterinus im Ligamentum latum uteri nur oberflächlich stumpf freipräpariert und distal der Punktionsstelle ligiert (s. Abb.2). Das präparierte Lymphgefäß wurde unter Verwendung einer Lupenbrille mit einer geraden spitzen Irisschere angeschnitten und ein Schlauch aus Polyethylen (Innendurchmesser 0,4 bzw. 0,8 mm, Außendurchmesser 0,58 bzw. 0,96 mm) eingeführt. Die Fixierung des Schlauches erfolgte entsprechend Methode II. Der Schlauch wurde vor der Benutzung mit steril gefilterter Heparinlösung (150 U/ml) gefüllt. Je nach Stärke des Lymphgefäßes wurde ein Schlauch mit Außendurchmesser 0,58 mm bzw. 0,96 mm gewählt. Gewonnene Lymphe wurde in EDTA- Röhrchen (2 ml) aufgefangen. Die Röhrchen wurden mit Parafilm verschlossen, um den Eintritt von Blut zu verhindern.
Wenn die uterinen Lymphknoten auffindbar waren, wurden diese entnommen.
3.3.3.4 Methode IV
Die Methode der Lymphgewinnung bei Tier 12 bis Tier 17 entspricht Methode III. Es wurden zusätzlich Blutproben aus Uterusvene, Ovararterie und Ohrvene entnommen. Auch Gewebeproben von Uterus und uterinem Teil der uterotubalen Verbindung wurden gewonnen. Bei 3 Tieren erfolgte zuerst die Applikation von Samen, bei 3 Tieren zuerst die Applikation von physiologischer Kochsalzlösung.
Der Operationsablauf unterlag folgendem Zeitplan (siehe auch Schema 1):
Sofort nach transmuraler Applikation von Samen bzw. physiologischer Kochsalzlösung in das Lumen eines Uterushorns wurde im ligierten Bereich subserös Evans Blue injiziert. 15 min später begann am entsprechenden Uterushorn die Präparation eines prominenten Lymphgefäßes. Weitere 45 min später (60 min nach Applikation von Samen bzw.
physiologischer Kochsalzlösung) wurde mit der Gewinnung und dem Auffangen von Lymphe in 2 ml EDTA- Röhrchen begonnen und die Gewinnung für 45 min (bis 105 min nach Applikation von Samen
bzw. physiologischer Kochsalzlösung) fortgesetzt. Alle 15 min wurde das Auffanggefäß gewechselt. Nach Beenden der Lymphgewinnung wurden am entsprechenden Uterushorn Blutproben von Uterusvene und Ovararterie gewonnen (105 min nach Behandlung).
Gleichzeitig erfolgte die Entnahme von peripherem Blut aus der Ohrvene. 90 min nach transmuraler Applikation von Samen bzw. Kochsalzlösung in ein Uterushorn erfolgte die Applikation von Kochsalzlösung bzw. Samen in das contralaterale Uterushorn. Der weitere Ablauf der Probengewinnung entsprach dem für das erste Uterushorn geschilderten. Nach Beenden der Blut- und Lymphgewinnung wurden die Lymphknoten entfernt sowie Gewebeproben von Uterus und uterotubaler Verbindung entnommen (durchschnittlich 210 min bzw. 130 min für die Lymphknoten und 240 min bzw. 140 min für die Gewebeproben nach transmuraler Applikation von Samen bzw. physiologischer Kochsalzlösung).
Da es im Ablauf der Operation zu unterschiedlichen Zeitintervallen für das Intervall zwischen trnamuraler Applikation und Probenentnahme für die Gewebeproben und Lymphknoten kam, wurde bei 3 Tieren zuerst Samen und bei 3 Tieren zuerst physiologische Kochsalzlösung appliziert.
Zeitpunkt Erstes Uterushorn Zweites Uterushorn 0 min Samenapplikation und Injektion von
Evans Blue Lösung 15 min Beginn der Präparation
60 min Beginn der Lymphgewinnung 75 min 1. Wechsel des Probenröhrchens für
die Lymphe
90 min 2. Wechsel des Probenröhrchens für die Lymphe
Kochsalzapplikation und Injektion von Evans Blue Lösung
105 min Ende der Lymphgewinnung und Gewinnung von Blutproben
Beginn der Präparation
150 min Beginn der Lymphgewinnung
165 min 1. Wechsel des Probenröhrchens für die
Lymp he
180 min 2. Wechsel des Probenröhrchens für die
Lymphe 195 min Gewinnung von Gewebeproben und
Lymphknoten
Ende der Lymphgewinnung und Gewinnung von Blutproben,
Gewinnung von Gewebeproben und Lymphknoten
Schema 1: Zeitlicher Ablauf der Probengewinnung mit Methode IV
3.3.4 Entnahme, Fixierung und Vorbereitung der Gewebeproben zur Färbung
Für immunhistochemische Untersuchungen wurden aus jedem Uterushorn etwa 10 cm von der Uterushornspitze entfernt und aus dem Bereich des uterinen Teils der uterotubalen Verbindung je zwei endometriale Gewebeproben von etwa 1 cm3 Größe entnommen. Jeweils eine Gewebeprobe wurde direkt nach der Entnahme in 4%iges Formalin verbracht, die andere wurde in OCT® eingebettet und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die gefrorenen Proben wurden bei -80°C gelagert. Die entstandenen Uterusöffnungen wurden durch eine einstülpende Naht verschlossen.
Aus den schockgefrorenen Proben wurden Kryostatschnitte von 5 bis 6 µm Dicke angefertigt und auf Superfrost® -Objektträger verbracht. Die angefertigten Schnitte wurden bei Raumtemperatur mindestens 30 min getrocknet und bis zur Durchführung der immunhistochemischen Färbung bei -30°C gelagert.
Aus den formalinfixierten Proben wurden nach Einbettung in Paraffin Schnitte von etwa 1 bis 3 µm Dicke angefertigt.
3.3.5 Immunhistochemische Färbungen an Kryostatschnitten
Für die immunhistochemischen Färbungen wurde die Avidin- Biotin- Peroxidase- Komplex (ABC)- Methode angewendet. Dabei wird nach Zugabe des spezifischen primären Antikörpers ein mit Biotin konjugierter sekundärer Antikörper aufgetragen. Dieser bindet an den Primärantikörper. Nachfolgend wird ein Peroxidase- konjugierter Avidin- Biotin- Komplex zugegeben. Freie Bindungsstellen des Avidin- Moleküls ermöglichen die Bindung an das Biotin des sekundären Antikörpers. Mittels eines geeigneten Chromogens wird die Peroxidase, und damit das gesuchte Antigen, sichtbar gemacht. Um eine unspezifische Färbung durch endogene Peroxidaseaktivität zu verhindern, wird diese durch Zugabe von Wasserstoffperoxyd vor dem Auftragen des Primärantikörpers umgesetzt.
3.3.5.1 Nachweis von MHCII Oberflächenantigen
Die immunhistochemische Färbung wurde nach folgendem Protokoll (modifiziert nach BOENISCH 1989) durchgeführt:
1. Trocknen der Schnitte bei Raumtemperatur für 30 min 2. Fixierung in gekühltem Aceton für 5 min
3. Trocknen der Schnitte bei Raumtemperatur für 20 min 4. Dreimaliges Spülen in PBS (siehe 3.2.4.) für jeweils 5 min
5. Hemmung der endogenen Peroxidase in 70%igem Ethanol mit 0,5%
Wasserstoffperoxyd für 30 min
6. Dreimaliges Spülen in PBS (siehe 3.2.4.) für jeweils 5 min
7. Verbringen der Schnitte in Coverplates® und mit 1:5 verdünntem Ziegenserum in PBS für 20 min inkubieren
8. Dreimaliges Spülen mit PBS
9. Mit 1:150 in PBS mit 1% BSA verdünntem primären Antikörper (monoklonaler anti- MHCII Antikörper H42A) überschichten und über Nacht bei 4°C inkubieren
10. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS mit 0,05% Tween
11. Inkubieren mit 1:200 verdünntem sekundärem Antikörper GAM- b (bio tiniliertes Ziegen- anti- Maus- Serum) mit 10% Schweineserum für 30 min
12. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS mit 0,05% Tween
13. Inkubieren der Schnitte mit ABC- Gebrauchslösung (siehe 3.2.4.) für 30 min 14. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS
15. Enzymhistoche mische Reaktion: Verbringen der Schnitte in DAB- Gebrauchslösung (siehe 3.2.4.) für 5 min
16. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS für je 5 min
17. Verbringen der Schnitte in fließendes Leitungswasser für 10 min 18. Gegenfärben in Hämalaun nach Mayer für 5 min
19. 15 min Bläuen in fließendem Leitungswasser 20. Dehydrieren der Schnitte:
a. Ethanol 50% 2 min
b. Ethanol 70% 2 min c. Ethanol 96% 2 min d. Isopropanol 5 min e. Rotihistol® 1 5 min f. Rotihistol® 2 5 min g. Rotihistol® 3 5 min
21. Eindecken der Schnitte mit Roti Histokit®
3.3.5.2 Nachweis von CD4 Oberflächenantigen
Da der verwendete monoklonale Antikörper (s.3.2.5.) nach Vorbehandlung der Schnitte mit Alkohol keine Reaktivität zeigte, wurde ein vom MHCII Nachweis abweiche ndes Protokoll angewendet:
1. Trocknen der Schnitte bei Raumtemperatur für 30 min 2. Dreimaliges Spülen in PBS (s. 3.2.4.) für jeweils 5 min
3. Verbringen der Schnitte in Coverplates® und mit 1:5 verdünntem Ziegenserum in PBS für 20 min inkubieren
4. Dreimaliges Spülen mit PBS
5. Mit 1:150 in PBS mit 1% BSA verdünntem primären Antikörper (monoklonaler anti- CD4 Antikörper 74-12-4) überschichten und über Nacht bei 4°C inkubieren
6. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS mit 0,05% Tween
7. Hemmung der endogenen Peroxidase durch Verbringen der Schnitte in 70%iges Ethanol mit 0,5% Wasserstoffperoxyd für 30 min
8. Dreimaliges Spülen mit PBS für jeweils 5 min 9. Verbringen der Schnitte in Coverplates®
10. Inkubieren mit 1:200 verdünntem sekundärem Antikörper GAM-b (biotiniliertes Ziegen- anti- Maus- Serum) mit 10% Schweineserum für 30 min
11. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS mit 0,05% Tween
12. Inkubieren der Schnitte mit ABC- Gebrauchslösung (siehe 3.2.4.) für 30 min
13. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS
14. Enzymhistochemische Reaktion: Verbringen der Schnitte in DAB- Gebrauchslösung (siehe 3.2.4.) für 5 min
15. Spülen der Schnitte mit PBS für jeweils 5 min
16. Verbringen der Schnitte in fließendes Leitungswasser für 10 min 17. Gegenfärben in Hämalaun nach Mayer für 5 min
18. 15 min Bläuen in fließendem Leitungswasser 19. Dehydrieren der Schnitte:
a. Ethanol 50% 2 min b. Ethanol 70% 2 min c. Ethanol 96% 2 min d. Isopropanol 5 min e. Rotihistol® 1 5 min f. Rotihistol® 2 5 min g. Rotihistol® 3 5 min
20. Eindecken der Schnitte mit Roti Histokit®
3.3.6 Nachweis von Mastzellen
Mastzellen wurden mit Toluidinblaufärbung und immunhistochemischem Tryptasenachweis dargestellt. Vorversuche an Kryostatschnitten führten zu keinem positiven Mastzellnachweis.
Aus diesem Grund wurden alle Färbungen an Paraffinschnitten aus formalinfixiertem Material durchgeführt.
3.3.6.1 Tryptasenachweis von Mastzellen
Der immunhistochemische Nachweis von Mastzelltryptase wurde nach folgendem Protokoll (modifiziert nach BOENISCH 1989) durchgeführ t:
