I MMUNHISTOCHEMISCHE U NTERSUCHUNGEN UND M ASTZELLNACHWEIS

Die morphometrische Auswertung der immunhistochemischen Färbungen ergab keine signifikanten Unterschiede für die Anzahl und Verteilung CD4 positiver Zellen, für MHCII positive Zellen waren signifikante Unterschiede nachweisbar. Zum einen waren für die Gesamtsumme im Endometrium im inseminiertem Uterushorn signifikant mehr MHCII positive Zellen nachweisbar als im Kontrollhorn. Im inseminierten uterinen Teil der uterotubalen Verbindung waren im Oberflächenepithel sowie in der Gesamtsumme signifikant mehr MHCII positive Zellen nachweisbar als im mit Kochsalzlösung behandelten uterinen Teil der uterotubalen Verbindung. Bei immunhistochemischen Untersuchungen am Endometrium von Sauen ermitteln KAEOKET et al. (2002b, 2003b) die Anzahl MHCII positiver Zellen in verschiedenen Zyklusphasen sowie nach präovulatorischer Insemination bei Sauen. Diese Werte werden jedoch nicht miteinander verglichen. Es zeigen sich bei östrischen Tieren ohne Insemination im Oberflächen- und Drüsenepithel jedoch höhere, im oberflächlichen und tiefen Stroma niedrigere Werte für MHCII positive Zellen als fünf bis sechs Stunden nach Insemination, ohne dass dies statistisch abgesichert ist. Dieser Gegensatz zu den eigenen Ergebnissen ist möglicherweise in der Verwendung von Jungsauen statt Sauen

wie in den Versuchen von KAEOKET et al. (2002b, c) begründet. BISCHOF et al. (1994b) beobachten im Endometrium von Jungsauen zwei bis vier Tage nach Insemination mit Seminalplasma eine Zunahme von MHCII positiven Zellen in der Umgebung der uterinen Drüsen sowie eine Zunahme der Färbeintensität im Vergleich zu nicht inseminierten östrischen Tieren. Die Anzahl CD4 positiver Zellen nimmt in diesem Zeitraum signifikant ab.

Obwohl KAEOKET et al. (2002b) keinen zyklusabhängigen Einfluss auf die Anzahl MHC Klasse II positiver Zellen im porcinen Endometrium finden, steigt bei anderen Uterusbesamern wie Pferd (FRAYNE u. STOKES 1994) und Ratte (HEAD u. GAEDE 1986;

ZHENG et al. 1988) die Anzahl MHCII positiver Zellen im Östrus an, während dieser Anstieg bei Scheidenbesamern wie Mensch (BULMER et al. 1988) und Schaf (LEE et al.

1988) nicht zu beobachten ist.

MHCII Oberflächenmoleküle werden von dendritischen Zellen und Makrophagen sowie von Lymphozyten und Endothelzellen exprimiert. Im lichtmikroskopischen Bild konnte eine Differenzierung von dendritischen Zellen und Makrophagen, die als häufigste MHCII positive Zellen zu beobachten waren, nicht eindeutig vorgenommen werden. Bei diesen Zellen handelt es sich um antigenpräsentierenden Zellen. Sie sind für die Aktivierung von CD4 positiven T- Zellen verantwortlich. Makrophagen sind zusätzlich zur Phagozytose befähigt und spielen durch Ausschüttung von Cytokinen bei Entzündungsreaktionen eine wichtige Rolle. Bei der Maus kommt es nach der Paarung zu einer verstärkten Produktion von Granulozyten- Makrophagen- Wachstumsfaktor (GM-CSF) in uterinen Epithelzellen (ROBERTSON u.

SEAMARK 1994). Dieses Cytokin führt zu einer Aktivierung von Makrophagen und zu einer verstärkten Bildung von Granulozyten und Makrophagen.

Die inflammatorische Reaktion des Uterus nach Insemination hat verschiedene Bedeutungen.

Zum einen dient sie der Eliminierung von Spermien und antigenen Komponenten, die bei der Insemination in den Uterus gelangen können (PURSEL et al. 1978; RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1990; ENGELHARDT et al. 1997; MATTHIJS et al. 2000). Diese Vorgänge dienen der Vorbereitung des Uterus auf den Konzeptus. Die Stimulation lokaler Immunantworten mittels intrauteriner Applikation von toten Spermien vor der Paarung (MURRAY et al. 1983, 1986) oder Zusatz von Bullenleukozyten zum Inseminat (AMLID 1981) kann fruchbarkeitsfördernde Effekte haben. Andere Studien, in denen dem Inseminat verschiedene antigene Komponenten zugefügt wurden (BLICHFELDT 1984;

RAMSOONDAR u. CHRISTOPHERSON 1998), konnten solche Effekte nicht bestätigen.

Auch bei der Ovulationsinduktion durch Seminalplasma beim Schwein ist die Beteiligung lokaler immunologischer Signaltransduktion zwischen Uterus, uterotubaler Verbindung und Ovar vorstellbar (WABERSKI et al. 2000). Die Bedeutung der in der vorliegenden Arbeit ermittelten Zunahme von MHCII positiven Zellen im Endometrium nach Samenapplikation in diesen Zusammenhängen bedarf weiterer Klärung. Dabei wäre eine Differenzierung von dendritischen Zellen und Makrophagen wünschenswert.

Es stellte sich die Frage, ob der Ebersamen oder eventuelle bakterielle Kontamination desselben die Immunreaktion auslösen. Als Kontrolle wurde sterile physiologische Kochsalzlösung verwendet. Ebersamen enthält unvermeidlich Bakterien, die bei der Gewinnung in das Ejakulat gelangen (WALZ et al. 1968; PANDEY u. SINGH 1997;

ALTHOUSE et al. 2000). ROZEBOOM et al. (1998) finden nach instrumenteller Insemination mit verdünntem Ebersamen oder nur Verdünner bei Spülung des Uterus vergleichbare Bakterienzahlen. Die Anzahl neutrophiler Granulozyten in der Spülflüssigkeit ist jedoch zwölf Stunden nach Samenapplikation signifikant höher als nach Verdünnerapplikation. Erhöhte Werte für Leukozyten sind auch im Endometrium achtzehn Stunden nach Samenapplikation im Vergleich zu Verdünnerapplikation zu beobachten (ENGELHARDT et al. 1997). Vier bis sechs Stunden nach Applikation von verdünntem Samen oder Verdünner sind keine Unterschiede zwischen Behandlung mit Samen und Verdünner zu beobachten (ROZEBOOM et al. 1998; MATTHIJS et al. 2003).

ARMSTRONG et al. (2000) beobachten 36 Stunden nach Applikation von Seminalplasma im Vergleich zu PBS eine Zunahme der Gesamtzahl an Leukozyten sowie MHCII positiven Zellen im porcinen Endometrium. Anhand dieser Studien scheint die mögliche Beteiligung bakterieller Kontamination des Inseminats an der Immunreaktion des Uterus gering zu sein.

In den eigenen Untersuchungen ließen sich nach Insemination im uterinen Teil der

uterotubalen Verbindung signifikant mehr MHCII positive Zellen im Drüsenepithel und der Gesamtsumme als in dem besamten Uterushorn nachweisen. Elektronenmikroskopische Untersuchungen der uterotubalen Verbindung des Schweins zeigen hier keine auffälligen

Veränderungen der Leukozyten in der Mukosa nach Insemination. Im Epithel und im Lumen der uterotubalen Verbindung sind, im Gegensatz zum Uterus nahe der uterotubalen

Verbindung, keine Leukozyten nachzuweisen (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1990).

HUNTER et al. (1987) finden auf dem luminalen Oberflächenepithel des uterinen Teils der uterotubalen Verbindung bei fast allen untersuchten Jungsauen nach Besamung Leukozyten.

Im tubalen Anteil der uterotubalen Verbindung können dagegen nur in der Tiefe der

terminalen Falten vereinzelt Leukozyten beobachtet werden. Der tubale Teil der uterotubalen Verbindung ist in Zusammenhang mit der Funktion als Spermienreservoir weitreichend untersucht (RIGBY 1966; RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1990; WU et al. 1996; MBURU et al. 1997). Immunhistochemische Untersuchungen wurden jedoch nicht durchgeführt. Die nach Insemination im uterinen Teil der uterotubalen Verbindung beobachtete Zunahme an MHCII positiven Zellen im Vergleich zum Uterus lässt auf eine besondere Funktion dieser Struktur bei der inflammatorischen Reaktion des Uterus nach Insemination schließen. Die Lymphgefäße der uterotubalen Verbindung des Schweins bilden gemeinsam mit

Lymphgefäßen des Ovars in der Nähe des Ligamentum ovarii proprium ein komplexes

Netzwerk, den so genannten paraovariellen lymphatischen Plexus (GAWROSKA et al. 1997).

Dieser Plexus ist von einem dichten Geflecht von Blutgefäßen umgeben, die in Verbindung mit Uterus, Ovar und Ovidukt stehen. Die anatomischen Gegebenheiten ermöglichen einen lokalen Transfer von Molekülen zwischen Uterus, Ovar und Ovidukt über Blut- und

Lymphgefäßsystem (KOTWICA 1980; KOTWICA et al. 1981; KRZYMOWSKI et al. 1982, 1986, 1990; MAGNESS u. FORD 1982, 1983). Diese Untersuchungen lassen im

Zusammenhang mit den eigenen Untersuchungsergebnissen einen Einfluss von

Immunreaktionen der uterotubalen Verbindung auf Uterus, Ovar und Ovidukt möglich erscheinen. Die exakte Bedeutung der Veränderungen der Leukozytenpopulationen nach Insemination konnte in dieser Arbeit nicht geklärt werden. Nähere Untersuchungen über eventuelle Veränderungen nicht nur der Leukozytenpopulationen sondern auch von

Proteinfraktionen und Cytokinen in Blut- und Lymphgefäßsystem speziell der uterotubalen Verbindung wären wünschenswert.

Die Ergebnisse des Mastzellnachweises zeigen, dass diese Zellen im porcinen Endometrium nur in sehr geringer Zahl vorliegen. Auch KAEOKET et al. (2002a) können nach

Toluidinblaufärbung nur wenige Mastzellen nachweisen. Mastzellen aus der Mukosa des Darms können beim Schwein nach Fixierung in Carnoyscher Lösung oder Basic Lead Acetat mit Toluidinblau angefärbt werden, nach Formalinfixierung jedoch wenig bis nicht (PABST u. BEIL 1989; XU et al. 1993). Aufgrund dieser Formalinsensibilität, die auch von anderen Spezies bekannt ist, wurde ein immunhistochemischer Tryptasenachweis durchgeführt. Ein histochemischer Tryptasenachweis ist für Mastzellen aus dem Darm des Schweins auch nach Formalinfixierung möglich (XU et al. 1993). Der immunhistochemische Nachweis von Tryptase in Mastzellen im Uterus von Rind (KÜTHER et al. 1998) und Hund (KUBE et al.

1998) wird durch die Fixierung beeinflusst. In der vorliegenden Arbeit gab es keine

Unterschiede zwischen der Mastzellzahl im porcinen Endometrium nach Toluidinblaufärbung und immunhistochemischem Tryptasenachweis. Die geringe Anzahl der nachgewiesenen Mastzellen lässt eine Beeinflussung der Ergebnisse durch die Formalinfixierung durchaus möglich erscheinen.

5.5 Schlussfolgerungen und Ausblick

Ein Tiermodell zur Untersuchung lokaler Immunreaktionen des Endometriums, der uterinen Lymphknoten und des lokalen Blutgefäßsystems nach Insemination bei der Jungsau wurde entwickelt.

Lymphe konnte innerhalb der relativ kurzen Sammeldauer nur mit Anteilen an Erythrozyten unbekannter Herkunft ge wonnen werden. Da bei einer nicht auszuschließenden Blutkontamination auch Leukozyten aus dem Blut in die Lymphproben gelangen, wurde eine Differenzierung der Leukozytenpopulation in der gewonnenen Lymphe für nicht aussagekräftig erachtet. Dennoch sind weitere Arbeiten im Bereich der Gewinnung uteriner Lymphe beim Schwein wünschenswert, da bei der Signaltransduktion zwischen Uterus, Ovar und Ovidukt dem Lymphgefäßsytem eine wichtige Rolle zugeschrieben wird. Modifikationen des Tiermodells, z. B. in Form von Lymphgewinnung über mehrere Tage, könnten möglicherweise klären, ob nach mehreren Tagen der Anteil an Erythrozyten ein konstantes

Niveau erreicht oder sogar gegen Null geht und so weitere Untersuchungen von Lymphproben ermöglichen.

Die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen mittels monoklonaler Antikörper gegen MHCII Oberflächenmoleküle, die einen signifikanten Anstieg MHCII positiver Zellen nach Insemination ergaben, weisen auf eine Rolle antigenpräsentierender Zellen bei der uterinen Immunantwort auf Insemination hin. Um diese Rolle näher zu beleuchten, wäre eine Differenzierung dieser Zellen in Makrophagen und dendritische Zellen hilfreich. Dies könnte beispielsweise mittels Elektronenmikroskopie geschehen.

Die immunhistochemisch nachgewiesene Zunahme MHCII positiver Zellen im uterinen Teil der uterotubalen Verbindung im Vergleich zum Uterus nach Insemination deutet eine besondere Funktion dieser Struktur bei der lokalen postinseminatorischen Immunreaktion an.

Inwiefern sich diese Immunreaktion auf benachbarte Organe wie Uterus, Ovidukt und Ovar auswirkt, bedarf weiterer Untersuchungen. Da aufgrund der anatomischen Verhältnisse eine enge Verbindung zwischen Blut- und Lymphgefäßsystem von uterotubaler Verbindung und Uterus, Ovidukt und Ovar besteht, sollte dem Gefäßsystem der uterotubalen Verbindung besondere Aufmerksamkeit gewidmet werden. Dabei wären Untersuchungen nicht nur der Leukozytenpopulationen sondern auch von Proteinfraktionen und Cytokinen in Blut- und Lymphgefäßsystem speziell der uterotubalen Verbindung hilfreich.