3 MATERIAL UND METHODEN
3.3 M ETHODEN
3.3.3 Chirurgische Maßnahmen
3.3.3.4 Methode IV
Die Methode der Lymphgewinnung bei Tier 12 bis Tier 17 entspricht Methode III. Es wurden zusätzlich Blutproben aus Uterusvene, Ovararterie und Ohrvene entnommen. Auch Gewebeproben von Uterus und uterinem Teil der uterotubalen Verbindung wurden gewonnen. Bei 3 Tieren erfolgte zuerst die Applikation von Samen, bei 3 Tieren zuerst die Applikation von physiologischer Kochsalzlösung.
Der Operationsablauf unterlag folgendem Zeitplan (siehe auch Schema 1):
Sofort nach transmuraler Applikation von Samen bzw. physiologischer Kochsalzlösung in das Lumen eines Uterushorns wurde im ligierten Bereich subserös Evans Blue injiziert. 15 min später begann am entsprechenden Uterushorn die Präparation eines prominenten Lymphgefäßes. Weitere 45 min später (60 min nach Applikation von Samen bzw.
physiologischer Kochsalzlösung) wurde mit der Gewinnung und dem Auffangen von Lymphe in 2 ml EDTA- Röhrchen begonnen und die Gewinnung für 45 min (bis 105 min nach Applikation von Samen
bzw. physiologischer Kochsalzlösung) fortgesetzt. Alle 15 min wurde das Auffanggefäß gewechselt. Nach Beenden der Lymphgewinnung wurden am entsprechenden Uterushorn Blutproben von Uterusvene und Ovararterie gewonnen (105 min nach Behandlung).
Gleichzeitig erfolgte die Entnahme von peripherem Blut aus der Ohrvene. 90 min nach transmuraler Applikation von Samen bzw. Kochsalzlösung in ein Uterushorn erfolgte die Applikation von Kochsalzlösung bzw. Samen in das contralaterale Uterushorn. Der weitere Ablauf der Probengewinnung entsprach dem für das erste Uterushorn geschilderten. Nach Beenden der Blut- und Lymphgewinnung wurden die Lymphknoten entfernt sowie Gewebeproben von Uterus und uterotubaler Verbindung entnommen (durchschnittlich 210 min bzw. 130 min für die Lymphknoten und 240 min bzw. 140 min für die Gewebeproben nach transmuraler Applikation von Samen bzw. physiologischer Kochsalzlösung).
Da es im Ablauf der Operation zu unterschiedlichen Zeitintervallen für das Intervall zwischen trnamuraler Applikation und Probenentnahme für die Gewebeproben und Lymphknoten kam, wurde bei 3 Tieren zuerst Samen und bei 3 Tieren zuerst physiologische Kochsalzlösung appliziert.
Zeitpunkt Erstes Uterushorn Zweites Uterushorn 0 min Samenapplikation und Injektion von
Evans Blue Lösung 15 min Beginn der Präparation
60 min Beginn der Lymphgewinnung 75 min 1. Wechsel des Probenröhrchens für
die Lymphe
90 min 2. Wechsel des Probenröhrchens für die Lymphe
Kochsalzapplikation und Injektion von Evans Blue Lösung
105 min Ende der Lymphgewinnung und Gewinnung von Blutproben
Beginn der Präparation
150 min Beginn der Lymphgewinnung
165 min 1. Wechsel des Probenröhrchens für die
Lymp he
180 min 2. Wechsel des Probenröhrchens für die
Lymphe 195 min Gewinnung von Gewebeproben und
Lymphknoten
Ende der Lymphgewinnung und Gewinnung von Blutproben,
Gewinnung von Gewebeproben und Lymphknoten
Schema 1: Zeitlicher Ablauf der Probengewinnung mit Methode IV
3.3.4 Entnahme, Fixierung und Vorbereitung der Gewebeproben zur Färbung
Für immunhistochemische Untersuchungen wurden aus jedem Uterushorn etwa 10 cm von der Uterushornspitze entfernt und aus dem Bereich des uterinen Teils der uterotubalen Verbindung je zwei endometriale Gewebeproben von etwa 1 cm3 Größe entnommen. Jeweils eine Gewebeprobe wurde direkt nach der Entnahme in 4%iges Formalin verbracht, die andere wurde in OCT® eingebettet und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die gefrorenen Proben wurden bei -80°C gelagert. Die entstandenen Uterusöffnungen wurden durch eine einstülpende Naht verschlossen.
Aus den schockgefrorenen Proben wurden Kryostatschnitte von 5 bis 6 µm Dicke angefertigt und auf Superfrost® -Objektträger verbracht. Die angefertigten Schnitte wurden bei Raumtemperatur mindestens 30 min getrocknet und bis zur Durchführung der immunhistochemischen Färbung bei -30°C gelagert.
Aus den formalinfixierten Proben wurden nach Einbettung in Paraffin Schnitte von etwa 1 bis 3 µm Dicke angefertigt.
3.3.5 Immunhistochemische Färbungen an Kryostatschnitten
Für die immunhistochemischen Färbungen wurde die Avidin- Biotin- Peroxidase- Komplex (ABC)- Methode angewendet. Dabei wird nach Zugabe des spezifischen primären Antikörpers ein mit Biotin konjugierter sekundärer Antikörper aufgetragen. Dieser bindet an den Primärantikörper. Nachfolgend wird ein Peroxidase- konjugierter Avidin- Biotin- Komplex zugegeben. Freie Bindungsstellen des Avidin- Moleküls ermöglichen die Bindung an das Biotin des sekundären Antikörpers. Mittels eines geeigneten Chromogens wird die Peroxidase, und damit das gesuchte Antigen, sichtbar gemacht. Um eine unspezifische Färbung durch endogene Peroxidaseaktivität zu verhindern, wird diese durch Zugabe von Wasserstoffperoxyd vor dem Auftragen des Primärantikörpers umgesetzt.
3.3.5.1 Nachweis von MHCII Oberflächenantigen
Die immunhistochemische Färbung wurde nach folgendem Protokoll (modifiziert nach BOENISCH 1989) durchgeführt:
1. Trocknen der Schnitte bei Raumtemperatur für 30 min 2. Fixierung in gekühltem Aceton für 5 min
3. Trocknen der Schnitte bei Raumtemperatur für 20 min 4. Dreimaliges Spülen in PBS (siehe 3.2.4.) für jeweils 5 min
5. Hemmung der endogenen Peroxidase in 70%igem Ethanol mit 0,5%
Wasserstoffperoxyd für 30 min
6. Dreimaliges Spülen in PBS (siehe 3.2.4.) für jeweils 5 min
7. Verbringen der Schnitte in Coverplates® und mit 1:5 verdünntem Ziegenserum in PBS für 20 min inkubieren
8. Dreimaliges Spülen mit PBS
9. Mit 1:150 in PBS mit 1% BSA verdünntem primären Antikörper (monoklonaler anti- MHCII Antikörper H42A) überschichten und über Nacht bei 4°C inkubieren
10. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS mit 0,05% Tween
11. Inkubieren mit 1:200 verdünntem sekundärem Antikörper GAM- b (bio tiniliertes Ziegen- anti- Maus- Serum) mit 10% Schweineserum für 30 min
12. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS mit 0,05% Tween
13. Inkubieren der Schnitte mit ABC- Gebrauchslösung (siehe 3.2.4.) für 30 min 14. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS
15. Enzymhistoche mische Reaktion: Verbringen der Schnitte in DAB- Gebrauchslösung (siehe 3.2.4.) für 5 min
16. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS für je 5 min
17. Verbringen der Schnitte in fließendes Leitungswasser für 10 min 18. Gegenfärben in Hämalaun nach Mayer für 5 min
19. 15 min Bläuen in fließendem Leitungswasser 20. Dehydrieren der Schnitte:
a. Ethanol 50% 2 min
b. Ethanol 70% 2 min c. Ethanol 96% 2 min d. Isopropanol 5 min e. Rotihistol® 1 5 min f. Rotihistol® 2 5 min g. Rotihistol® 3 5 min
21. Eindecken der Schnitte mit Roti Histokit®
3.3.5.2 Nachweis von CD4 Oberflächenantigen
Da der verwendete monoklonale Antikörper (s.3.2.5.) nach Vorbehandlung der Schnitte mit Alkohol keine Reaktivität zeigte, wurde ein vom MHCII Nachweis abweiche ndes Protokoll angewendet:
1. Trocknen der Schnitte bei Raumtemperatur für 30 min 2. Dreimaliges Spülen in PBS (s. 3.2.4.) für jeweils 5 min
3. Verbringen der Schnitte in Coverplates® und mit 1:5 verdünntem Ziegenserum in PBS für 20 min inkubieren
4. Dreimaliges Spülen mit PBS
5. Mit 1:150 in PBS mit 1% BSA verdünntem primären Antikörper (monoklonaler anti- CD4 Antikörper 74-12-4) überschichten und über Nacht bei 4°C inkubieren
6. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS mit 0,05% Tween
7. Hemmung der endogenen Peroxidase durch Verbringen der Schnitte in 70%iges Ethanol mit 0,5% Wasserstoffperoxyd für 30 min
8. Dreimaliges Spülen mit PBS für jeweils 5 min 9. Verbringen der Schnitte in Coverplates®
10. Inkubieren mit 1:200 verdünntem sekundärem Antikörper GAM-b (biotiniliertes Ziegen- anti- Maus- Serum) mit 10% Schweineserum für 30 min
11. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS mit 0,05% Tween
12. Inkubieren der Schnitte mit ABC- Gebrauchslösung (siehe 3.2.4.) für 30 min
13. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS
14. Enzymhistochemische Reaktion: Verbringen der Schnitte in DAB- Gebrauchslösung (siehe 3.2.4.) für 5 min
15. Spülen der Schnitte mit PBS für jeweils 5 min
16. Verbringen der Schnitte in fließendes Leitungswasser für 10 min 17. Gegenfärben in Hämalaun nach Mayer für 5 min
18. 15 min Bläuen in fließendem Leitungswasser 19. Dehydrieren der Schnitte:
a. Ethanol 50% 2 min b. Ethanol 70% 2 min c. Ethanol 96% 2 min d. Isopropanol 5 min e. Rotihistol® 1 5 min f. Rotihistol® 2 5 min g. Rotihistol® 3 5 min
20. Eindecken der Schnitte mit Roti Histokit®
3.3.6 Nachweis von Mastzellen
Mastzellen wurden mit Toluidinblaufärbung und immunhistochemischem Tryptasenachweis dargestellt. Vorversuche an Kryostatschnitten führten zu keinem positiven Mastzellnachweis.
Aus diesem Grund wurden alle Färbungen an Paraffinschnitten aus formalinfixiertem Material durchgeführt.
3.3.6.1 Tryptasenachweis von Mastzellen
Der immunhistochemische Nachweis von Mastzelltryptase wurde nach folgendem Protokoll (modifiziert nach BOENISCH 1989) durchgeführ t:
1. Deparaffinieren und Rehydrieren der Schnitte: jeweils 5 min in Rotihistol® 1 bis 3, 5 min Isopropanol, 3 min 96% Ethanol
2. Hemmung der endogenen Peroxidase in 70%igem Ethanol mit 0,5%
Wasserstoffperoxyd für 30 min
3. Dreimaliges Spülen mit PBS für je 5 min
4. Demaskierung der Antigene: 15 min Pronase E (s. 3.2.4.), 15 min Trypsin (s.3.2.4.) 5. Dreimaliges Spülen in PBS (siehe 3.2.4.) für jeweils 5 min
6. Verbringen der Schnitte in Coverplates® und mit 1:5 verdünntem Ziegenserum in PBS für 20 min inkubieren, um die unspezifische Hintergrundfärbung zu unterdrücken 7. Aufbringen des primären Antikörpers (monoklonaler Anti- Tryptase- Antikörper
AA1), 1: 50 verdünnt in PBS mit 1% BSA, über Nacht bei 4°C inkubieren 8. Dreimaliges Spülen in PBS mit 0,05% Tween
9. Inkubieren mit 1:200 verdünntem sekundärem Antikörper GAM- b (biotiniliertes Ziegen- anti- Maus- Serum) mit 10% Schweineserum für 30 min
10. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS mit 0,05% Tween
11. Inkubieren der Schnitte mit ABC- Gebrauchslösung (siehe 3.2.4.) für 30 min 12. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS
13. Enzymhistochemische Reaktion: Verbringen der Schnitte in DAB- Gebrauchslösung (siehe 3.2.4.) für 5 min
14. Spülen der Schnitte mit PBS für je 5 min
15. Verbringen der Schnitte in fließendes Leitungswasser für 10 min 16. Gegenfärben in Hämalaun nach Mayer für 5 min
17. 15 min Bläuen in fließendem Leitungswasser 18. Dehydrieren der Schnitte:
a. Ethanol 50% 2 min b. Ethanol 70% 2 min c. Ethanol 96% 2 min d. Isopropanol 5 min e. Rotihistol® 1 5 min f. Rotihistol® 2 5 min g. Rotihistol® 3 5 min
19. Eindecken der Schnitte mit Roti Histokit®
3.3.6.2 Toluidinblaufärbung
Die Toluidinblaufärbung erfolgte nach folgendem Protokoll (modifiziert nach BÖCK 1989):
1. Deparaffinieren und Rehydrieren der Schnitte: jeweils 5 min in Rotihistol® 1 bis 3, 5 min Isopropanol, 3 min 96% Ethanol, 3 min 70% Ethanol, 3 min 50 % Ethanol, 5 min Aqua dest.
2. 30 min Färben in 0,1% Toluidinblaulösung bei 30°C im Wärmeschrank 3. 5 min Spülen in Aqua dest.
4. 15 min Spülen in fließendem Leitungswasser 5. Eindecken mit Glyceringelatine
3.3.7 Quantitative Auswertung
Für die Auswertung wurden nur Schnitte, die lichtmikroskopisch keine Artefakte aufwiesen, verwendet. Es erfolgte bei der lichtmikroskopischen Untersuchung eine Einteilung des Endometriums in Oberflächenepithel, oberflächliches und tiefes Stroma sowie Epithel der uterinen Drüsen. Zur Quantifizierung positiver Zellen wurden mit einem Lichtmikroskop bei 400-facher Vergrößerung (10er Okular, 40er Objektiv) 14 Gesichtsfelder ausgezählt. 7 Gesichtfelder wurden nahe des Oberflächenepithels für die Beurteilung von Oberflächenepithel und oberflächlichem Stroma sowie 7 Gesichtsfelder im Bereich der uterinen Drüsen für die Beurteilung von tiefem Stroma und Drüsenepithel zufällig ausgewählt. Für die Auswertung der Mastzellfärbung wurden 10 epithelnahe Gesichtsfelder ausgezählt, da im tiefen Stroma keine Mastzellen nachweisbar waren.
3.3.8 Durchflusszytometrische Leukozytendifferenzierung aus Blut und Lymphknoten
Die Leukozytend ifferenzierung erfolgte mittels indirekter Membranfluoreszenz und durchflusszytometrischer Analyse. Dabei wurde zuerst ein primärer Antikörper, der gegen bestimmte Oberflächenantigene (s. 3.2.6) gerichtet ist, eingesetzt. Der nachfolgend verwendete Antikörper ist fluorochromkonjugiert und bindet an den primären Antikörper.
Im Durchflusszytometer wurden die Fluoreszenzintensität der markierten Zellen und der prozentuale Anteil Fluoreszenz- positiver Zellen ermittelt. Die mittleren Fluoreszenzintensitäten wurden als Prozente der Expressionsdichte definiert. Diese Untersuchungen wurden freundlicherweise von Frau Nadine Ritter aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.
3.3.9 Zellzahlbestimmung der Lymphe
Die Untersuchung der gewonnenen Lymphproben übernahm freundlicherweise Frau Nadine Ritter aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Nach Bestimmung des Volumens wurde die Lymphe mittels einer Zählkammer nach Thoma auf die Gesamtzahl von Zellen sowie die Anzahl kernhaltiger Zellen untersucht.
3.3.10 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mittels des Statistikprogramms SAS®. Bei Normalverteilung (Shapiro- Wilks- Test) wurde der gepaarte T- Test durchgeführt. Für nicht normalverteilte Werte wurde der Wilcoxon signed rank Test verwendet. Als signifikant galten Werte mit p= 0,05.
4 Ergebnisse
4.1 Gewinnung uteriner Lymphe
Nach subseröser Injektion von Evans Blue wurde der Farbstoff innerhalb von Sekunden in die uterinen Lymphgefäße aufgenommen, die sich dadurch deutlich darstellten. Viele feine Lymphgefäße, die im Lig. latum uteri vom Uterushorn zum regionären Lymphknoten ziehen, waren zu erkennen (s. Abb.1). Die Gewinnung uteriner Lymphe erwies sich jedoch als äußerst schwierig (siehe 3.3.3.). Bei der Präparation kam es leicht zu Beschädigungen der Lymphgefäße, die dann kollabierten. Auch stellten sich häufig vor Beginn der Präparation relativ stark erscheinende Lymphgefäße während der Präparation als ein Bündel feinster Gefäße dar. Mit Methode I und II kam es durch das vollständige Freipräparieren eines Lymphgefäßes zu relativ starken Blutungen. In den verwendeten englumigen Kanülen koagulierte die Lymphe leicht. Durch die Verwendung eines mit Heparin gefüllten Polyethylenschlauchs mit größerem Durchmesser (Methode III und IV) konnte dieses Problem gelöst werden. Auch konnten Blutungen durch oberflächliche stumpfe Präparation eingeschränkt werden (s. Abb.2). Da es bei Methode III und IV beim Einschneiden mit einer Irisschere unvermeidlich zum Kollabieren des Lymphgefäßes kam, wurde eine Lupenbrille verwendet, um das Einführen des Polyethylenschlauchs unter visueller Kontrolle zu ermöglichen.
Mit Methode I (Tier 1 bis 3) konnten bei 2 von 3 Tieren geringe Mengen Lymphe gewonnen werden, mit Methode II (Tier 4 bis 7) bei 3 von 4 Tieren jeweils eine Lymphprobe. Methode III (Tier 8 bis 11) ermöglichte die Lymphgewinnung bei 3 von 4 Tieren, Methode IV (Tier 12 bis 17) bei 5 von 6 Tieren. Da mittels Methode III relativ gute Erfolge bei der Lymphgewinnung erzielt wurden, wurde diese durch Modifikationen des zeitlichen Ablaufs zu Methode IV, die zur Probengewinnung für weitere Analysen genutzt wurde.
4.1.1 Lymphfluss
Der Lymphfluss wurde aus dem gewonnenen Lymphvolumen und der Sammeldauer der einzelnen mittels Methode IV gewonnenen Proben berechnet. Es gab starke Schwankungen sowohl zwischen den Tieren als auch zwischen den Einzelproben innerhalb eines Tieres (s.
Abb.4). Der durchschnittliche Lymphfluss lag bei 42 µl/min bzw. 2,5 ml/h und variierte in den Einzelproben zwischen 14,3 und 83,3 µl/min bzw. 0,9 und 5,0 ml/h. Ein Einfluss der Insemination auf den Lymphfluss konnte nicht beobachtet werden.
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0
0 10 20 30 40 50 60
Sammeldauer (min)
Lymphfluss (µl/min)
Tier 12 S Tier 14 K Tier14 S Tier 15 K Tier 15 S Tier 16 K Tier 16 S
Abb. 4: Lymphfluss im Verlauf der Lymphgewinnung S: Lymphe des mit Samen behandelten Uterushorns
K: Lymphe des mit Kochsalzlösung behandelten Uterushorns
4.1.2 Zellzahlen in der Lymphe
Von 17 operierten Tieren wurde bei 13 Tieren Lymphe gewonnen. Die gewonnenen Lymphproben der ersten 7 Tiere wurden nur qualitativ auf das Vorkommen von kernlosen (Erythrozyten) und kernhaltigen (Leukozyten) Zellen untersucht. Von allen weiteren gewonnenen Lymphproben wurden neben dem Volumen auch Gesamtzellzahl und Anzahl kernhaltiger Zellen bestimmt.
Bei den Zellen in der mit Methode I gewonnene n Lymphe handelte es sich fast ausschließlich um Erythrozyten oder Zelltrümmer. Auch die mittels Methode II gewonnenen Proben enthielten große Mengen an Erythrozyten. Bei der Lymphgewinnung mit Methode III lag das Verhältnis von Gesamtzellzahl zu Anzahl kernhaltiger Zellen durchschnittlich bei 1 zu 26,4.
Mit Methode IV ermittelte Volumina und Zellzahlen sind in Tabelle 1 dargestellt.
Durchschnittlich lag hier das Verhältnis Gesamtzellzahl zu kernhaltigen Zellen bei 1 zu 25.
Bei zunehmender Dauer der Lymphgewinnung verschob sich das Verhältnis von kernhaltigen zu kernlosen Zellen durchschnittlich zugunsten der kernhaltigen Zellen. Bei zwei Tieren kam es in der zweiten Lymphprobe zu einem Anstieg des Erythrozytenanteils, der dann wieder abnehmend war (s. Abb. 5). In allen Proben waren jedoch Erythrozyten nachweisbar. Da eine Kontamination der Lymphproben mit Blut nicht ausgeschlossen werden konnte, wurde keine Differenzierung der Leukozytenpopulationen durchgeführt.
Durchschnittlich verringerte sich vor allem der Anteil an Erythrozyten in der Lymphe. Die Anzahl kernhaltiger Zellen zeigte deutliche Unterschiede zwischen den Tieren und lag dabei zwischen 20 und 600 Leukozyten/µl. Bei 3 Proben (Tier 12, S1- S4; Tier 14, K1- K4; Tier 15 S1- S4) erhöhte sich im Verlauf der Lymphgewinnung die Anzahl Leukozyten (s. Tab.1).
Tabelle 1: Volumina und Zellzahlen der gewonnenen Lymphe mit Methode IV
* Probe S kennzeichnet die gewonnene Lymphe der inseminierten Seite, Probe K die der Kontrollseite; 1-4: aufeinander folgende Lymphproben aus einem Lymphgefäß;
n.e.: nicht ermittelt
0
Abb. 5: Verhältnis Gesamtzellzahl zu Anzahl kernhaltiger Zellen im Verlauf der Lymphgewinnung
S: Lymphe des mit Samen behandelten Uterushorns
K: Lymphe des mit Kochsalzlösung behandelten Uterushorns
4.2 Immunphänotypische Eigenschaften von Leukozyten aus Uterusvene, Ovararterie und peripherem Blut
Es erfolgte ein Vergleich der immunphänotypischen Eigenschaften von Leukozyten aus dem Blut von Uterusvene, Ovararterie und Ohrvene (peripheres Blut) nach intrauteriner Applikation von Kochsalzlösung in ein Uterushorn und Samen in das contralaterale Horn. Bei gleicher Behandlung wurden die Blutproben auch untereinander verglichen.
Für CD18 positive Zellen konnte durchflusszytometrisch eine schwach oder intermediär positive Zellpopulation ermittelt werden (CD18 int.). Daneben wurden Zellen nachgewiesen,
die das CD18 Molekül stark exprimieren (CD18 high). Vergleichbares wurde für das CD8 Molekül ermittelt. Hier wurde zwischen CD8 high und der Gesamtfraktion CD8 positiver Zellen (CD8 total) differenziert.
In den Blutproben aus der Ovararterie konnten im Vergleich zum peripheren Blut aus der Ohrvene signifikant weniger CD8 high exprimierende Zellen nach Behandlung mit Samen beobachtet werden. Für CD4 war nach Kochsalzbehandlung ein signifikanter Anstieg in den Blutproben aus der Uterusvene im Vergleich zur Ohrvene zu beobachten (s. Tab. 2).
Zwischen den Behandlungen mit Samen und Kochsalzlösung konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden.
Tab. 2 : Prozentuale Reaktivität monoklonaler Antikörper mit Leukozyten aus Ovararterie, Uterusvene und peripherem Blut (Mittelwerte und Standardabweichungen)
*: Blut aus der Ohrvene wurde zeitgleich mit den Blutproben aus Ovararterie und Uterusvene auf der mit Samen (Peripheres Blut S) bzw. mit Kochsalzlösung (Peripheres Blut K) behandelten Seite entnommen.
a, b: signifikanter Unterschied zwischen Werten in einer Spalte (p=0,05);
K: Blutprobe der Kontrollseite; S: Blutprobe der inseminierten Seite
4.3 Immunphänotypische Eigenschaften von Leukozyten aus den Lnn. uterini
Nach Beenden von Lymph- und Blutgewinnung wurden die Lnn. uterini entnommen, die bei 7 von 10 Tieren auf beiden Seiten und bei 2 Tieren einseitig vorhanden waren. Bei der Entnahme der Lymphknoten kam es aufgrund des Versuchsaufbaus zu unterschiedlichen Zeitintervallen zwischen Behandlung und Probenentnahme für das inseminierte Uterushorn und das Kontrollhorn (s. 3.3.3.4.). Aus diesem Grund wurde bei 3 Tieren zuerst Samen und bei weiteren Tieren zuerst physiologische Kochsalzlösung appliziert. Ein Einfluss der unterschiedlichen Zeitintervalle auf die Untersuchungsergebnisse konnte nicht beobachtet werden (Daten nicht dargestellt). Die entnommenen Lymphknoten wurden homogenisiert und die Leukozyten durchflusszytometrisch untersucht. Dabei wurde die Expressionsdichte von CD4, CD8, CD18, MHCII-DR und MHCII-DQ Oberflächenmolekülen bestimmt.
0 20 40 60 80
CD18int CD18high CD4 CD8high CD8total DR DQ
Ln. S Ln. K
Abb. 6: Mittelwerte der prozentualen Reaktivität monoklonaler Antikörper mit Leukozyten aus den Lnn. uterini von 6 Tieren
Ln. S: Ln. uterinus des mit Samen behandelten Uterushorns
Ln. K: Ln. uterinus des mit Kochsalzlösung behandelten Uterushorns
Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Leukozytenpopulationen der untersuchten Lymphknoten der inseminierten Seite und der Kontrollseite. Allerdings zeigte die Auswertung für 3 von 6 Tieren zahlenmäßig höhere Werte für MHCII-DR sowie für 3 von 4 Tieren zahlenmäßig niedrigere Werte für CD4 in den Lymphknoten des mit Samen behandelten Uterushorns (s. Tab. 3 und Abb. 6).
Tabelle 3: Prozentuale Reaktivität monoklonaler Antikörper mit Leukozyten aus den Lnn. uterini
Ln. S: Ln. uterinus des mit Samen behandelten Uterushorns
Ln. K: Ln. uterinus des mit Kochsalzlösung behandelten Uterushorns
4.4 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen
Für die immunhistochemische Untersuchung der uterinen Gewebeproben stellte sich zum einen die Frage, ob es Unterschiede in der Expression von Oberflächenmolekülen zwischen inseminiertem Uterushorn und Kontrollhorn gab. Zum anderen sollten mögliche Unterschiede zwischen Uterus und uterotubaler Verbindung näher beleuchtet werden. Weiterhin wurde bei der mikroskopischen Auswertung der immunhistochemischen Schnitte das Endometrium in 4 verschiedene Abschnitte unterteilt und bewertet. Es erfolgte die Einteilung in Oberflächenepithel, oberflächliches und tiefes Stroma sowie Drüsenepithel. Alle mit in die Auswertung einbezogenen Tiere befanden sich im Östrus. Ein im Interöstus (Tag 10) operiertes Tier wurde gesondert betrachtet.
Bei der Entnahme der Gewebeproben kam es, wie auch bei den Lymphknoten, aufgrund des Versuchsaufbaus zu unterschiedlichen Zeitintervallen zwischen Behandlung und
Probenentnahme für das inseminierte Uterushorn und das Kontrollhorn (s. 3.3.3.4.). Aus diesem Grund wurde bei 3 Tieren zuerst Samen und bei weiteren Tieren zuerst physiologische Kochsalzlösung appliziert. Ein Einfluss der unterschiedlichen Zeitintervalle auf die
Untersuchungsergebnisse konnte nicht beobachtet werden (Daten nicht dargestellt).
Als positiv, also reaktiv mit dem verwendeten Antikörper, wurden Zellen gewertet, die an ihrer Oberfläche eine braune Färbung aufwiesen.
Die bei allen immunhistochemischen Färbungen mitgeführte Negativkontrolle zeigte in keinem Fall eine positive Braunfärbung. Als positive Kontrolle dienende
Lymphknotenschnitte färbten sich in jedem Fall entsprechend dem jeweiligen Antikörper.
Bei allen untersuchten Proben östrischer Tiere war eine starke Infiltration von neutrophilen Granulozyten im Endometrium zu beobachten. Diese waren vor allem im oberflächlichen Stroma unter dem Oberflächenepithel sowie in der Umgebung von Blutgefäßen anzutreffen.
4.4.1 Immunhistochemischer Nachweis von MHCII Oberflächenantigen
MHCII Oberflächenantigen wird von verschiedenen Zellen exprimiert, zum einen von antigenpräsentierenden Zellen wie dendritischen Zellen und Makrophagen, zum anderen auch von Lymphozyten und Endothelzellen.
Bei der durchgeführten immunhistochemischen Färbung zeigten alle beobachteten Endothelzellen eine positive Reaktion mit dem verwendeten monoklonalen Antikörper. Sie wurden nicht mit in die Auswertung einbezogen. Da eine eindeutige Differenzierung
Bei der durchgeführten immunhistochemischen Färbung zeigten alle beobachteten Endothelzellen eine positive Reaktion mit dem verwendeten monoklonalen Antikörper. Sie wurden nicht mit in die Auswertung einbezogen. Da eine eindeutige Differenzierung