Charakterisierung ausgewählter Genexpressionsmuster im porcinen Uterus und Ovar nach unilateraler, intrauteriner Infusion von Seminalplasma

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Charakterisierung ausgewählter Genexpressionsmuster im porcinen Uterus und Ovar

nach unilateraler, intrauteriner Infusion von Seminalplasma

INAUGURAL - DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Jana Katarin Nitz

Meppen

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und Ambulatorische Klinik

Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken

Prof. Dr. Ron Hunter

Klinik für kleine Klauentiere, forensische Medizin und Ambulatorische Klinik

Univ. – Prof. Dr. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut

Apl. – Prof. Dr. Hans – Joachim Schuberth Arbeitsgruppe Immunologie

Univ. – Prof. Dr. Christine Wrenzycki Klinik für Rinder

1. Gutachterin: Apl. – Prof. Dr. Dagmar Waberski 2. Gutachter: Univ. – Prof. Dr. Burkhard Meinecke

Tag der mündlichen Prüfung: 13.05.2013

Eine Arbeit aus dem Virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin Niedersachsen

(3)

Meiner Familie

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(5)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 15

2 Literaturübersicht 16

2.1 Kommunikationsformen im weiblichen Genitale 16

2.1.1 Counter Current Transfer zwischen Uterus und Ovar 16

2.1.2 Gap Junctions innerhalb des Follikels 20

2.2 Ovulationsinduzierende Effekte des Seminalplasmas 23

2.2.1 Systemisch vermittelte Effekte 23

2.2.2 Lokal vermittelte Effekte 28

3 Material und Methode 33

3.1 3.2

Versuchsschema

Herstellung des Seminalplasma – Pools

33 34

3.3 Tiermodell 34

3.3.1 3.3.2

Versuchstiere Brunstkontrolle

34 35

3.3.4 Behandlung und Probengewinnung 36

3.4 Vorbereitung der Proben zur Konservierung 40

3.4.1 Isolation von Granulosa-, Kumuluszellen und Oozyten 40

3.4.2 Kryokonservierung des Uterus und der UTV 42

3.5 Laser Microdissection zur Isolation uteriner Epithelzellen 42

3.5.1 Prinzip der Laser Microdissection 42

3.5.2 Vorbereitung der Kryoschnitte 43

3.5.3 Durchführung der Laser Microdissection 45

3.6 Molekularbiologische Untersuchung der Epithel-, Granulosa- und

Kumuluszellen 47

3.6.1 RNA – Extraktion 47

(6)

3.6.4 Plasmiderzeugung für die Herstellung von Standardreihen 50

3.6.5 Prinzip der RT – qPCR 51

3.6.6 Primeroptimierung 52

3.6.7 Durchführung der RT – qPCR 53

3.6.8 Berechnung der absoluten Kopienzahl 55

3.7 Molekularbiologische Untersuchung der Oozyten 56

3.7.1 mRNA – Extraktion mittels Dynabeads^® 56

3.7.2 cDNA – Synthese durch Reverse Transkription 57

3.7.3 Durchführung der RT – qPCR 58

3.8 Hormonanalyse in Blutproben 60

3.8.1 Blutprobenentnahme und –aufbereitung 60

3.8.2 Progesteron – Bestimmung 61

3.8.3 Gesamtöstrogen – Bestimmung 61

3.9 Statistische Auswertung 62

4 Ergebnisse 65

4.1 Quantitative und qualitative Bewertung des Probenmaterials 65

4.2 Nachweisbarkeit der Zieltranskripte 67

4.3 Vergleich der Expressionsstärken der Versuchs- und Kontrollseite 69

4.3.1 mRNA – Expression im Epithel des Uterus 69

4.3.1.1 mRNA – Expression von PTGS2 69

4.3.1.2 mRNA – Expression von TNFA 71

4.3.1.3 mRNA – Expression von TNFAIP6 72

4.3.1.4 mRNA – Expression von UBB 73

4.3.2 mRNA – Expression im Epithel des uterinen Anteils der UTV 74

4.3.2.2 mRNA – Expression von TNFA 75

4.3.3 mRNA – Expression in Granulosazellen 78

(7)

4.3.3.2 mRNA – Expression von IL6 80

4.3.3.3 mRNA – Expression von PPARG1 81

4.3.3.4 mRNA – Expression von PTX3 82

4.3.4 mRNA – Expression in Kumuluszellen 85

4.3.4.2 mRNA – Expression von PTX3 86

4.4 Vergleich der Expressionsstärken im Epithel des Uterus und der UTV

89

4.4.1 Vergleich innerhalb der Versuchs- bzw. Kontrollseite 89 4.4.2 Seitenübergreifender Vergleich der Differenzen zwischen Uterus

und UTV

91

4.5 Korrelationen der mRNA – Expressionsstärken 91

4.5.1 Korrelationen innerhalb einer Zellart 91

4.5.2 Korrelationen zwischen Uterus und UTV 95

4.5.3 Korrelationen zwischen Uterus und Granulosazellen 96 4.5.4 Korrelationen zwischen Uterus und Kumuluszellen 98 4.5.5 Korrelationen zwischen UTV und Granulosazellen 100

4.6 mRNA – Expression in Oozyten 102

4.6.1 Vergleich der Expressionsstärken der Versuchs- und Kontrollseite 102 4.6.2 Korrelationen der mRNA – Expressionsstärken 105 4.6.2.1 Korrelationen zwischen Oozyten und Granulosazellen 105

4.6.2.2 Korrelationen innerhalb der Oozyten 109

4.7 Hormonbestimmung im peripheren Blut 111

5 Diskussion 115

(8)

7 Summary 127

8 Literaturverzeichnis 131

9 Abbildungsverzeichnis 150

10 Tabellenverzeichnis 156

11 Anhang 161

11.1 Tabellen 161

11.2 Geräte 170

11.3 Klinikbedarf 172

11.4 Laborbedarf 173

11.5 Medikamente und Reagenzien 175

11.6 Rezepte 178

11.7 Primersequenzen 179

(9)

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

A. Arteria

Aq. dest. Aqua destillata

ß – NGF beta Nerve Growth Factor

BDNF Brain – Derived Neurotrophic Factor BMP15 Bone Morphogenic Factor 15

BSA Bovines Serumalbumin

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

ca. circa

cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat CDK1 Cyclin – Dependent Kinase 1

cDNA complementary Desoxyribonucleicacid cGMP cyclisches Guanosinmonophosphat

cm Zentimeter

Ct Cycle threshold

Cx Connexin

Da Dalton

DEPC Diethylpyrocarbonat

Dif Differenz

DNA Desoxyribonucleicacid, Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat DTT Dithiothreitol

E. coli Escherichia coli

Eges Gesamtöstrogen

eCG equines Choriongonadotropin EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

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EtOH Ethanol et al. et alii

fg Femtogramm

g Gramm

G Gauge

GDF9 Growth Differentiation Factor 9 gDNA genomic Desoxyribonucleicacid GnRH Gonadotropin Releasing Hormon GOI Gene Of Interest

h hour

hCG humanes Choriongonadotropin

HE Hämatoxylin Eosin

H2O Wasser

IE Internationale Einheiten

IL6 Interleukin 6

i. m. intramuskulär

i. v. intravenös

K Kontrollseite

kDa Kilodalton

kg Kilogramm

KGW Körpergewicht

l Liter

LH Luteinisierendes Hormon

LMD Laser Microdissection

MAPK1 Mitogen Activated Protein Kinase 1

max. maximal

Max Maximum

Med Median

mg Milligramm

µg Mikrogramm

MHC Major Histocompatibility Complex

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MHz Megahertz

min Minute

min. mindestens

Min. Minimum

Mio. Million

ml Milliliter

mm Millimeter

µm Mikrometer

mmol Millimol

µmol Mikromol

MPC Magnetic Particle Counter mRNA messenger Ribonucleicacid

MW Mittelwert

n Probandenzahl

ng Nanogramm

nmol Nanomol

Nr. Nummer

NT-3/-4/5 Neurotrophin-3 / -4/5 o. g. oben genannt

OIF Ovulation Inducing Factor

OP Operation

OVV Ovulationsvorverlegung

P4 Progesteron

p probability (Irrtumswahrscheinlichkeit)

p. os per os

PBS Phosphate Buffered Saline

PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen PCR Polymerase Chain Reaction PEN Polyethylennaphthalat

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PGE2 Prostaglandin E2

PGFM Prostaglandin F2α Metaboliten p. ov. post ovulationem

PPARG1 Peroxisome Proliferator – Activated Receptor Gamma 1 PTGS2 Prostaglandin Endoperoxide Synthase 2

PTX3 Pentraxin 3

PVA Polyvinylalkohol

r Korrelationskoeffizient

R. Ramus

R² Bestimmtheitsmaß

RNA Ribonucleicacid, Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

rpm rounds per minute

RQI RNA Quality Indicator

RT Reverse Transkriptase

RT – qPCR Quantitative Echtzeit PCR nach Reverser Transkriptase

sec Sekunden

s. siehe

s. u. siehe unten

SD Standard Deviation (Standardabweichung)

SP Seminalplasma

TCM Tissue Culture Medium TNFA Tumor Necrosis Factor Alpha

TNFAIP6 Tumor Necrosis Factor Alpha – Induced Protein 6

u. und

u. A. unter Anderem

UBB Ubiquitin

UTV Uterotubale Verbindung

UV Ultraviolett

V Versuchsseite

V. Vena

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vol% Volumenprozent

x g gravitational acceleration, Erdbeschleunigung z. B. zum Beispiel

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1 Einleitung

Die Sekrete der akzessorischen Geschlechtsdrüsen, Nebenhoden und kleinen Harn- röhrendrüsen werden in ihrer Gesamtheit als Seminalplasma bezeichnet und ma- chen 90 % des Ejakulates aus. Dieser spermienfreie Anteil enthält prinzipiell Ionen, anorganische Bestandteile, kleine organische Moleküle (z. B. Lipide, Phospholipide), Hormone (Steroide, Prostaglandine), Proteine und Enzyme. Schon lange ist bekannt, dass die Funktionen des Seminalplasmas weit über die augenscheinlichen Aufgaben wie Spermientransport, – ernährung und – schutz hinausgehen. In der Interaktion mit dem weiblichen Genitaltrakt entfalten sich ausgeprägte regulatorische Funktionen (WABERSKI 2007). Lokale immunmodulatorische Prozesse werden initiiert, um über verschiedene Mechanismen den Befruchtungserfolg sicherzustellen (ROBERTSON et al. 2005). Dabei werden Signale über lokale Gegenstrombahnen zwischen lym- phatischem System, Uterusvene und Utero – Ovararterie bis zum Ovar vermittelt (EINER – JENSEN u. HUNTER 2005). Ein sichtbares Indiz für lokale Effekte des In- seminates ist die Vorverlegung der Ovulation (WABERSKI et al. 1995, 1997). Das zeitliche Zusammentreffen von Eizelle und Spermien wird somit optimiert und die Be- fruchtungschance gesteigert.

Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser lokalen Effekte sind bisher weitgehend unklar. Die Ergebnisse diverser Arbeitsgruppen zeigen jedoch deutlich den immun- modulatorischen Effekt des Seminalplasmas auf den Uterus.

In der vorliegenden Studie sollte deshalb die Hypothese geprüft werden, dass intrauterin appliziertes Seminalplasma die Expression immun – und follikelreifungsas- soziierter Transkripte im Genitaltrakt östrischer Sauen reguliert. Die Effekte wurden 17 Stunden nach Behandlung unter Anwendung eines In – vivo – Tiermodells mit spontan östrischen Jungsauen untersucht.

(16)

2 Literaturübersicht

2.1 Kommunikationsformen im weiblichen Genitale

2.1.1 Counter current Transfer zwischen Uterus und Ovar

Das Prinzip des Counter current Transfers ist als fundamentaler Mechanismus in der Regulation physiologischer Prozesse seit Jahren bekannt (KRZYMOWSKI et al.

1990). Es handelt sich hierbei um einen Transport von Energie in Form von Wärme oder Substanzen von einer Lösung in eine andere. Die Lösungen fließen im Gegen- stromprinzip durch eng benachbarte Röhren, die für die Lösung selbst undurchlässig sind. Der Transport erfolgt passiv, semispezifisch und ohne Zuhilfenahme eines spezifischen Transportsystems (EINER – JENSEN u. HUNTER 2005).

Im Körper des Menschen sowie der Säugetiere findet das Counter current System die bedeutendste Anwendung im Bereich des Gehirns sowie innerhalb des Repro- duktionstraktes.

Als hitzeempfindliches Organ benötigt das Gehirn einen zuverlässiges und effektives Kühlungssystem. Durch die enge Nachbarschaft der nasalen Venen zu den Na- sen(neben)höhlen einerseits und der gehirnversorgenden A. carotis anderseits kann das durch Atemluft abgekühlte venöse Blut die Temperatur des arteriellen Blutes re- duzieren (BAKER 1979).

Am Ovar des Kaninchens führt der Austausch von Wärme durch Counter current dazu, dass kleine Follikel kühler sind als große (GRINSTED et al. 1980). Der gleiche Temperaturgradient wurde beim Schwein nachgewiesen (HUNTER et al. 2000).

Neben der Temperaturanpassung spielt der Counter current eine wichtige Rolle be- züglich endokriner Regulationen. Hierzu zählen beispielsweise die Kommunikation zwischen Hoden und Nebenhoden sowie zwischen Uterus und Ovar (EINER – JENSEN u. HUNTER 2005). In einer Zeichnung aus dem 17. Jahrhundert wurde die enge Verbindung arterieller und venöser Gefäße am Uterus dargestellt (DE GRAAF 1672). Die funktionelle Bedeutung dieser räumlichen Nähe wurde jedoch erst in den 1970er klar, als GINTHER et al. (1974) an Schafen eine verlängerte Lutealphase

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heutige Verständnis der vaskulären Anatomie im weiblichen Reproduktionssystem und ihrer Bedeutung (EINER – JENSEN u. HUNTER 2005).

Neben der unmittelbaren Nachbarschaft weisen diverse anatomische Auffälligkeiten auf eine funktionelle Besonderheit der Blutgefäßversorgung am Uterus hin: Die Wand der Arterie ist in der Nähe der Vene dünner (BENDZ et al. 1977), endotheliale Mikrovilli resultieren in einer Oberflächenvergrößerung (ZEZULA – SZPYRA u.

GRZEGORZEWSKI 2000) und beim Schwein ragen mehrere, millimetergroße Tu- berkuli ins Lumen der Arterie (DOBOSZYNSKA 1986). KRZYMOWSKI et al. veröf- fentlichten detaillierte Beschreibungen der Gefäßsituation bei der Sau: Ein venöses Netzwerk legt sich um die arteriellen Äste. Es bedeckt mehr als 50 % deren Oberflä- che, ist nur lose verbunden und lässt sich leicht entfernen (KRZYMOWSKI et al.

1981, 1990).

Bislang erfolgte der Nachweis eines Counter current Systems für folgende Substan- zen: Progesteron (WALSH et al. 1979, Schaf; KRZYMOWSKI et al. 1982 b, Schwein;

STEFANCZYK – KRZYMOWSKA et al. 2002, Schwein), Prostagladine (MC CRACKEN 1972, PGF2α Schaf; KOTWICA et al. 1980, PGF2α Schwein; STE- FANCZYK – KRZYMOWSKA et al. 2005, PGE2 Schwein), Estradiol (KRZYMOWSKI et al. 1982 b, Schwein; STEFANCZYK – KRZYMOWSKA et al. 2002, Schwein), Tes- tosteron (KRZYMOWSKI et al. 1981, 1982 b, Schwein), Relaxin und Thyroxin (SCHRAMM et al. 1986 b, Schaf) und Oxytocin (SCHRAMM et al. 1986 a, Schaf).

Für das Pferd liegen keine Untersuchungen vor, da laut DEL CAMPO und GINTHER (1973) kein Kontakt zwischen Ovararterie und -vene und somit keine Möglichkeit zum Counter current Transfer besteht.

Ein Transport von Substanzen ist immer auch an den Transport von Wärme gekop- pelt und umgekehrt (EINER – JENSEN u. HUNTER 2005). Transportiert werden frei vorliegende Moleküle bis 3000 Da, ausgenommen Bovines Serumalbumin, Erythro- zyten und andere Blutzellen (SCHRAMM et al. 1986 b, EINER – JENSEN u.

HUNTER 2005, MC CRACKEN et al. 1984, KRZYMOWSKI et al. 1982 b). Lipophile Moleküle werden aufgrund ihrer schnellen Membranpassage effektiver transferiert

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schnell transportiert (Minuten bis Sekunden). Warum ausgerechnet PGF2α mit einer Verzögerung von 20 min einen Spezialfall bildet, bleibt unerklärt (MC CRACKEN et al. 1972, Schaf). EINER – JENSEN u. HUNTER (2005) geben als Annäherungswerte für die Effektivität des Counter current Transfers im weiblichen Reproduktionstrakt 100 % für Wärme, 10 % für Gase und 1 % für größere Substanzen an. Vorausset- zung für den Transfer ist, dass das Molekül in seiner freien Form vorliegt. Der erfolg- reiche Transfer erhöht die totale Hormonkonzentration vermutlich nur um 10 – 50 %, was aber unter Unterständen einen mehrfachen Anstieg der freien Anteile bedeutet, die mit den zugehörigen Rezeptoren interagieren können (EINER – JENSEN u.

HUNTER 2005).

Beispiele der physiologischen Wichtigkeit sind die Regulation der Luteolyse sowie Effekte die unilateral zwischen Uterus, Salpinx und Ovar vermittelt werden (EINER – JENSEN 1990). Die Tatsache, dass bei monoovulatorischen Spezies die Ovulation wechselseitig erfolgt, wird von EINER – JENSEN (1990) auf den Counter current Transfer zurückgegeführt. Die durch den lokalen Progesterontransfer vermutlich stark erhöhte Progesteronkonzentration in der Arterie des Corpus luteum tragenden Ovars könnte das Wachstum neuer Follikel hemmen.

Abgesehen vom Austausch zwischen venösem und arteriellem Blut – dem wohl am besten beschriebenen Counter current System – findet der Transport auch zwischen Lymphgefäßen sowie peritonealer Flüssigkeit und Arterien statt (EINER – JENSEN u. HUNTER 2005). Sowohl Kollektoren als auch Präkollektoren uteriner Lymphe sind bei der Sau von einem Netzwerk aus Mikrogefäßen bedeckt (GAWRONSKA et al.

1997). Kleine Poren, die in Lymphgefäßen der Sau ausbildet sind, ändern abhängig vom Zyklusstadium der Sau ihre Größe (DOBOSZYNSKA et al. 1999). Dass die In- jektion von PGF2α in ein lokales Lymphgefäß zu einem deutlich erhöhten PGF2α – Gehalt in der Ovararterie führt, belegt den lokalen Austausch zwischen Lymphgefäß

und Arterie (HEAP et al. 1985, Schaf). Zum gleichen Ergebnis kamen STEFANCZYK – KRZYMOWSKA et al. (2002) unter In – vitro – und In – vivo – Be-

dingungen beim Schwein unter Verwendung von Progesteron und Oestradiol. In einer späteren Studie belegten STEFANCZYK – KRZYMOWSKA et al. (2005), dass

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Weiterführend veranschaulichen KRZYMOWSKI et al. (1990), dass Lymphflüssigkeit mit hoher Steroidkonzentration durch oberflächliche Lymphgefäße fließt, die sich in der Muskelschicht des Mesovariums um arterielle, steroidarme Blutgefäße windet.

Entlang des Konzentrationsgradienten erfolgt also eine Steriodabgabe an das arterielle Blut. Folglich ist das venöse Blut, das diesen Bereich verlässt, auch reich an Ste- rioden. In einem zweiten Schritt werden die Steroide dann in Äste der Ovararterie transferiert, die von o. g. venösen Netzwerken bedeckt sind. Zum Versorgungsgebiet der so hormonangereicherten Ovararterie gehören neben dem Ovar auch das ipsila- terale Ovidukt und die Uterushornspitze (KRZYMOWSKI et al. 1990).

Bei dieser „Two – Step – Theorie“ (HEAP et al. 1985, KRZYMOWSKI et al. 1990, STEFANCZYK – KRZYMOWSKI et al. 2002) weisen KRZYMOWSKI et al. (1990) auch dem Gekröse (Mesovarium, Mesosalpinx, Mesometrium) mit seinen Nerven, Lymph- und Blutgefäßen eine regulative Bedeutung zu. EINER – JENSEN u.

HUNTER (2005) bestätigen, dass die Deponierung markierter Hormone ins para- metriale Bindegewebe die Konzentration derselben in der Ovararterie erhöht.

Der medizinische Nutzen der Aufklärung des Counter current Transfers könnte laut EINER – JENSEN (1990) in der Anwendung für Arzneimittelapplikationen liegen.

Intrauterin deponierte therapeutische Substanzen könnten durch lokale Verteilungs- mechanismen bedeutsam höhere Konzentrationen in Uterus, Ovar und Ovidukt bei vergleichsweise niedrigen Werten im peripheren Blut erreichen. Weiterführend schlussfolgert der Autor, dass in der Gebärmutterkrebstherapie die Akkumulation in regionalen Lymphknoten ein positiver Nebeneffekt durch Eindämmung der Metasta- sierung sein könnte.

Abschließend resümieren EINER – JENSEN u. HUNTER (2005), dass der diskutierte Counter current Transfer im weiblichen Reproduktionstrakt ein semi – lokales System der Hormonregulation darstellt. Aufgrund seiner Einordnung zwischen systemischer und parakriner Signalgebung ohne ein Feedback System im traditionellen Sinne zu sein, bezeichnen die Autoren diesen dritten Weg der humoralen Kommunikation als

„Organ Feedback Regulation“. Bestimmte Zelltypen eines Organs sezernieren Bo-

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ständigen zirkulären Einflüsse das Ausmaß der Regulation experimentell kaum er- fasst werden kann.

2.1.2 Gap Junctions innerhalb des Follikels

Die weibliche Fertilität wird weitgehend bestimmt durch die Qualität der Oozyten, die gemessen wird an ihrer Fähigkeit zur Meiose, zur Befruchtung und zur Umwandlung in einen gesunden Embryo (KIDDER u. VANDERHYDEN 2010). Um diese Kompe- tenzen zu erlangen und erhalten, sind eine Reihe feinkoordinierter Abläufe innerhalb eines Follikels notwendig (PALMA et al. 2012). Signifikanteste Kontrollstelle der Ei- zell- und damit Follikelentwicklung ist die Kommunikation der Eizelle mit den sie um- gebenden Granulosazellen (PALMA et al. 2012).

Dabei sind sowohl parakrine als auch direkt von Zelle zu Zelle vermittelte Signale es- sentiell für die Oogenese (KIDDER u. VANDERHYDEN 2010). Parakrin sezernierte Botenstoffe können über Endozytose unter Zuhilfenahme von sekretorischen Vesi- keln oder Mikrotubuli oder über transzonale Projektionen in die Zielzelle gelangen.

Der direkte Stoffaustausch zwischen zwei benachbarten Zellen ist über sogenannte Gap Junctions (Zellbrücken) möglich (reviewed in PALMA et al. 2012).

KIDDER und MHAWI (2002) berichten von Genexpressionsstudien an diversen Tier- arten, die die Bedeutung der Gap Junctions in der Follikelentwicklung und somit der weiblichen Fertilität implizieren.

Schon zu Beginn des Follikelwachstum sind Gap Junctions zwischen Eizelle und Granulosazellen sowie zwischen den Granulosazellen untereinander ausgebildet (SIMON et al. 1997, JUNEJA et al. 1999). Im Laufe der Follikelreifung expandiert das Ausmaß der Kopplung (MITCHELL u. BURGHARDT 1986). Diese enge Kommunika- tion wird von diversen Autoren als funktionelles bzw. elektrophysiologisches Synzyti- um bezeichnet (KIDDER u. VANDERHYDEN 2010, PALMA et al. 2012).

Kumuluszellen sind ein spezifischer Subtyp der Granulosazellen und bilden lange zytoplasmatische Ausläufer, die die Zona pellucida penetrieren. Dadurch können sie Gap Junctions mit der Oozytenmembran bilden (MOOR et al. 1988). Schon die Diffe- renzierung von Granulosazellen in eizellbenachbarte Kumuluszellen wird nicht pa-

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Junctions ermöglichen den Granulosa- bzw. Kumuluszellen einen Beitrag zu metabo- lischen Prozessen innerhalb der Eizelle zu leisten, der einige zum Keimzellwachstum notwendige Moleküle fehlen (MOOR et al. 1988). So beeinflussen sie u. a. das Ei- zellwachstum, den Meiose – Fortschritt und die globale Transkriptionsaktivität des Eizellgenoms (reviewed in KIDDER u. VANDERHYDEN 2010).

Der definitive Nachweis für eine Schlüsselrolle der Gap Junctions in der Organoge- nese wurde durch Konnexin Gene – Targeting Experimente erbracht, die unter anderem zu Entwicklungsanomalien führten. Weiterhin sind mittlerweile in der Humanme- dizin diverse kongenitale Abnormalitäten bekannt, die auf Konnexin – Mutation zu- rückzuführen sind (reviewed in KIDDER u. MHAWI 2002).

Die fundamentale Einheit einer Gap Junction ist das Konnexon, eine zylindrische Or- ganelle, die einen Hemikanal in der Plasmamembran formt. Gebildet wird das Kon- nexon durch ein Hexamer aus Proteinuntereinheiten, die Konnexine genannt werden.

Die Basisstruktur aller Konnexine ist identisch: Vier membranübergreifende Domä- nen, zwei extrazelluläre Schleifen, eine zytoplasmatische Schleife und zytoplasmatische C- und N-Termini (KIDDER u. MHAWI 2002). Zwei Konnexone, jeweils zu einer Zelle gehörend, die sich end – to – end aneinander docken, bilden eine Gap Junction zwischen den beiden Zellen (KIDDER u. VANDERHYDEN 2010). Benannt sind Kon- nexine nach ihrem Molekulargewicht (PALMA et al. 2012). Die Zusammensetzung der Konnexine bestimmt, für welche Moleküle die Gap Junction durchlässig ist. Ent- scheidend sind dabei die Größe des Moleküls sowie dessen Ladung (KIDDER u.

VANDERHYDEN 2010). Die maximal transportierte Molekülgröße beträgt 1 kDa. Au- ßerdem werden Ionen und elektrische Impulse übertragen (PALMER et al. 2012).

KIDDER und VANDERHYDEN (2010) fassen tabellarisch vorliegende Arbeiten zu- sammen, in denen von der Passage von Na⁺, Cl^-, cAMP, cGMP, Ribonukleosiden, Aminosäuren, Glukose, Cholin und Inositol durch Gap Junctions berichtet wird.

Aus Konnexinen gebildete Hemikanäle, die an ihrem extrazellulären Ende an keinen anderen Hemikanal docken, können Moleküle zur parakrinen Wirkung in den intrazel- lulären Spalt entlassen (KIDDER u. VANDERHYDEN 2010).

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Dabei ist jedoch unsicher, ob jedes dieser Konnexine eine essentielle Rolle für die Fertilität spielt (KIDDER u. MHAWI 2002). So wird beispielsweise Cx32 keine bedeutende Aufgabe in der Follikulogenese zugeschrieben, da Cx32 – Knock – out – Mäu- se fertil sind (NELLES et al. 1996). Nach Ansicht von KIDDER u. VANDERHYDEN (2010) handelt es sich lediglich bei Cx37 und Cx43 um für die Follikulo- und Ooge- nese elementar wichtige Konnexine.

SIMON et al. (1997) und CARABATSOS et al. (2000) haben durch Forschung an Konnexin – Knock – out – Mäusen tiefere Einblicke in die Rolle der Konnexine im Rahmen der Ovar- und Follikelentwicklung ermöglicht.

Sie postulieren u. a., dass Cx37 das einzige von der Oozyte selbst stammende Kon- nexin ist. Ablation des Cx37 durch Gene – Targeting führt zur Entfernung aller Kon- nexine von der Eizelloberfläche. Die Tiere sind lebensfähig und zeigen eine offen- sichtlich normale Follikelentwicklung bis ins späte präantrale Stadium. Die Entwick- lung eines Graafschen Follikels sowie eine durch Gonadotropine ausgelöste Ovulati- on bleiben allerdings aus. Die Oozyte erreicht keine volle meiotische Kompetenz und nur 74 % ihrer eigentlichen Größe. Die Autoren vermuten, dass der betroffene Folli- kel sich mit gelbkörperähnlichen Strukturen füllt.

Die Gap Junctions zwischen einzelnen Granulosazellen sind vielzählig, groß und ba- sieren auf Cx43 (NORRIS et al. 2008). Da die Ablation von Cx43 jedoch die Eizell – Granulosa – Kopplung nicht zerstören konnte, ist davon auszugehen dass seine Be- deutung an dieser Stelle zu vernachlässigen ist (VEITCH et al. 2004). Aus Cx43 gebildete Gap Junctions sind weniger selektiv als solche aus Cx37. Ein Konnexin switch, bei dem oozytenständige Gap Junctions aus Cx43 anstelle von Cx37 zu- sammengesetzt wurden, führte zu fertilen Mäusen mit normaler Oogenese (LI et al.

2007).

Eine ausschlaggebende Rolle spielen die Gap Junctions im Rahmen des Luteinisie- rungsprozesses. WERT und LARSEN (1990) stellten fest, dass in die Ausbildung des Cx43 – Netzwerkes während der Primordialfollikelentstehung keine Gonadotropine involviert sind. Im Gegenteil entdeckten sie, dass der Abbau von Gap Junctions durch den Anstieg von LH im Blut initiiert wird. Die dadurch reduzierte Abgabe Meio-

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se – inhibierender Faktoren von den Granulosazellen an die Eizelle führt letztendlich zur Wiederaufnahme der Meiose.

Ähnliche Beobachtungen machten SIMON et al. (1997) und CARABATSOS et al.

(2000) während ihrer Konnexin – Knock – Out – Versuche an Mäusen. Die verfrüht eintretende Luteinisierung der Follikel brachte sie zu der Vermutung, dass Cx37 – gestützte Gap Junctions notwendig sind, um die funktionelle Integrität der Granu- losazellen zu erhalten. Auch NORRIS et al. (2008) formulierten, dass die hochaktive metabolische Kopplung zwischen Granulosazellen beendet wird, sobald LH über den MAPK – Signalweg die Phosphorilierung der Cx43 initiiert (NORRIS et al. 2008).

Diese Thesen decken sich mit der frühen Entdeckung von EL – FOULY et al. (1970), dass eine Ovektomie zu sofortiger Umwandlung des Graafschen Follikels in einen Gelbkörper zur Folge hat.

Doch neben dem Gap Junction vermittelten Weg wirken auch parakrine Signale der Luteinisierung entgegen: Von der Eizelle sezernierte Botenstoffe unterdrücken die Ausbildung von LH-Rezeptoren und Progesteron (reviewed für unterschiedliche Tier- arten in KIDDER u. VANDERHYDEN 2010).

Nach Zerstörung der bis zu 1 kDa leitenden Gap Junctions bleibt ein alternativer Sig- nalweg zwischen Kumulus- und Eizelle erhalten, der jedoch eine maximale Mole- külgröße von 400 Da transportiert (SUTOVSKY et al. 1993).

Zusammenfassend stellen KIDDER und VANDERHYDEN (2010) fest, dass Gap Junctions und die daraus resultierende bidirektionale Kommunikation innerhalb eines Follikels den funktionell integrierten Follikelstatus erhält. Die Herausforderung und Priorität künftiger Forschung sehen sie – wie zuvor schon KIDDER und MHAWI (2002) – in der Identifikation transportierter Schlüsselmoleküle sowie der genauen physiologischen Rolle ebendieser im Follikel.

(24)

2.2 Ovulationsinduzierende Effekte des Seminalplasmas

2.2.1 Systemisch vermittelte Effekte

Obwohl bei Lamas und Alpakas über gelegentliche spontane Ovulationen berichtet wurde, zählen beide Spezies gemeinhin zu den Vertretern der induzierten Ovulation (ENGLAND et al. 1969).

Der ovulationsauslösende Mechanismus wurde in den vergangenen Jahren intensiv untersucht. Lange Zeit galt die Theorie von FERNANDEZ – BACA et al. (1970) als Dogma: Sie definierten den Aufsprung des Hengstes in Kombination mit der penilen Immission als notwendige Reize zur Ovulationsauslösung bei Alpakas.

Dem wurde 1985 eine Arbeit entgegengestellt, in der die Effekte einer intravaginalen Applikation von vollständigem Ejakulat, Seminalplasma, Spermien in PBS, Sekret der akzessorischen Geschlechtsdrüsen sowie Magermilch beim Trampeltier überprüft wurden. Eine weitere Versuchsgruppe wurde im Natursprung gedeckt und drei bis zehn Minuten danach einer Uterusspülung unterzogen. Keines der Tiere, die eine intravaginale Spermiensuspension oder Magermilch erhalten hatten, ovulierte. Der Natursprung mit anschließender Uterusspülung führte in einem von vier Fällen zur Ovulation. Die intravaginale Applikation von Gesamtejakulat, Seminalplasma und Sekret der akzessorischen Geschlechtsdrüsen provozierte bei 87,5 %, 75 % bzw.

100 % der behandelten Tiere eine Ovulation. Schon damals wurde mit Bezugnahme auf unveröffentlichte Daten von ähnlichen Effekten auch nach intramuskulärer Appli- kation o. g. Substanzen berichtet (CHEN et al. 1985).

Diese Grundidee wurde in umfangreichen Studien aufgenommen und konsequent weiterverfolgt. So verabreichten ADAMS at al. (2005) unter anderem PBS bzw. Se- minalplasma intramuskulär an Lama- und Alpakastuten mit Follikeln ≥ 8 mm bzw.

zwölf Tage nach Brunstsynchronisation mittels LH. Die systemische Applikation von Seminalplasma konnte bei 93 % der spontanbrünstigen sowie bei 100 % der hormo- nell stimulierten Tiere eine Ovulation auslösen. In beiden Kontrollgruppen (PBS – Applikation) blieben Ovulationen vollständig aus. Die Autoren sehen in diesem Er- gebnis den Beleg für das Vorhandensein eines ovulation – inducing factors (OIF) im

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ergaben sich deutliche Verzögerungen im Auftreten des ersten Abfalls (150 min), des ersten Anstiegs (60 min) sowie des Erreichens des Maximalswertes (120 min) nach OIF-ausgelöster Ovulation im Vergleich zu GnRH – ausgelösten Ovulationen. OIF und GnRH stimulieren demnach die LH – Freisetzung in der Hypophyse über unterschiedliche Moleküle (ADAMS et al. 2005).

Dass der OIF über einen direkten oder indirekten Effekt auf GnRH – Neurone im Hy- pothalamus wirkt, bestätigt eine Studie von SILVA et al. (2011 b). Eine wiederum an Lamastuten durchgeführte Vorbehandlung mit dem GnRH – Antagonisten Cetrorelix^® verhinderte die OIF – bzw. GnRH – ausgelöste Ovulation in der gesamten Versuchs- gruppe.

Weitergehend postulierten RATTO et al. (2005), dass der OIF die Ovulation eher systemisch als lokal beeinflusst. Dazu wurden Seminalplasma intramuskulär und intrauterin sowie intrauterin nach uteriner Kürettage (Vereinfachung der Absorption, Nachahmung postkopulatorischer Entzündungsgeschehen) appliziert.

Weiterhin konnte eine Dosisabhängigkeit der OIF – vermittelten Wirkung nachgewiesen werden (TANCO et al. 2011). Ein Hundertstel aufgereinigten OIFs der in einem durchschnittlichen Ejakulat vorhandenen Menge führte noch zum gewünschten Ef- fekt.

Untersuchungen mit Seminalplasma anderer Tierarten führten zu der Vermutung, dass sich die Bedeutung des OIF nicht auf Kameliden beschränkt. Seminalplasma von Kaninchen, die ebenfalls zu den induziert ovulierenden Tierarten gehören, löste bei Lamastuten Ovulationen aus. Im Umkehrschluss ergab sich jedoch keine signifi- kante Relevanz des Seminalplasmas zur Auslösung der Ovulation in weiblichen Ka- ninchen. Für Häsinnen scheinen taktile genitale Stimulationsmechanismen eine grö- ßere Rolle zu spielen (SILVA et al. 2011 a).

Um die Wirkung bei spontan ovulierenden Tieren zu untersuchen wurden prepubera- le Mäuse mit 5 IU eCG superstimuliert, um nachfolgend eine intraperitoneale Gabe von Lama – Seminalplasma, PBS, hCG bzw. GnRH zu erhalten. Am nachfolgenden Tag wurden die Ovidukte gespült um die Ovulationsrate zu bestimmen. PBS löste bei

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mit Seminalplasma vom Lama behandelten Gruppe ovulierten 78 % der Mäuse mit 17 bis 22 (Ø 19,2) Oozyten (BOGLE et al. 2011). Außerdem konnte in einem Bioas- say mit Lamastuten nach intramuskulärer Injektion von equinem bzw. porcinem Se- minalplasma in 29 % bzw. 18 % eine Ovulation festgestellt werden (BOGLE et al.

2011). Das entspricht in etwa dem Ergebnis einer früheren Studie, in der der spe- ziesübergreifende Effekt von Seminalplasma untersucht wurde. Dazu wurden La- mastuten mit Seminalplasma der gleichen Spezies, einer nahe verwandten Spezies (Alpaka) sowie einer nicht verwandten, zudem spontan ovulatorischen Spezies (Rind) behandelt. Obwohl Lama- sowie Alpakaseminalplasma signifikant mehr Ovu- lationen auslösen konnte als Bullenseminalplasma (100 % bzw. 26 %), ovulierten nach Behandlung mit Bullenseminalplasma immernoch signifikant mehr Stuten als nach Behandlung mit PBS (26 % bzw. 0 %, p < 0,05). Aus den Ergebnissen dieser Studien schlussfolgern die Autoren, dass Liganden und Rezeptoren des OIF in allen Säugetierspezies vorhanden sind, allerdings in unterschiedlichen Konzentrationen.

Nach der weitgehenden Abklärung physiologischer Effekte des OIF folgte die chemi- sche Eingrenzung des Moleküls. In einem ersten Versuch führten RATTO et al.

(2010) Zentrifugation durch einen Filter mit Passierbarkeit von Stoffen mit definierter Molekularmasse, enzymatische Verdauung (Pronase, Proteinase K), Aktivkohlebe- handlung sowie Hitzebehandlungen (12 h bei 38° C, 1 h bei 65° C) durch. Im an- schließenden Bioassay mit Lamastuten konnte gezeigt werden, dass es sich beim OIF um ein Protein – Molekül mit einer molekularen Masse ≥ 30 kDa handelt, dass gegen Hitzebehandlung und Proteinase K resistent ist, sich aber durch Pronase E inaktivieren lässt.

In einer nachfolgenden Studie präzisieren RATTO et al. (2011) ihre Aussagen. Unter Einbeziehung einer Kombination aus Hydroylapatit- und Gelfiltrationschromatogra- phie konnte für die reaktive Substanz OIF eine Molekularmasse von 14 kDa ermittlet werden. Die Widersprüchlichkeit zu ihrem vorherigen Ergebnis, nach dem der OIF eine molekulare Masse von ≥ 30 kDa aufweist, erklären sie mit der Vermutung, der OIF sei eventuell Teil eines größeren Proteinkomplexes. Sicher sind sich die Auto- ren, dass das betreffende Molekül größer sein muss als GnRH.

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In einer 2012 veröffentlichten Studie konnten RATTO et al. die Identität des OIF ab- klären. Eine mehrstufige Aufreinigung und Analyse, die neben Hydroxylapatit – Säu- lenchromatographie, SDS/PAGE und MALDI-TOF auch LC – MS/MS und Edman Abbau beinhaltete, konnten Peptidsequenzhomologien (80 – 100 %, entsprechend zwölf bis 23 Sequenzen) zwischen OIF und humanem, porcinem, bovinem und murinem ß – Nerve Growth Factor (ß – NGF) nachgewiesen werden. Im Edman Abbau ergab sich ebenfalls eine Homologie von 73 bis 86 % des OIF mit humanem, porcinem, bovinem und murinem NGF.

Untersuchungsergebnisse mittels Röntgendiffraktion, PC12 Bioassay (Phäochromozy- tomzellen) und Western Immunoblot konnten diese Übereinstimmung bestätigen.

Schlussendlich führte die systemische Applikation von 250 µg ß – NGF aus murinen Submandibulardrüsen bei sechs von neun behandelten Lamastuten zur Ovulation.

Die Autoren sehen damit den Beweis, dass der OIF im Seminalplasma ß – NGF ist, erbracht.

Der Nerve Growth Factor gehört ebenso wie der Brain – Derived Neurotrophic Factor (BDNF) und Neurotrophin – 3 und – 4/5 (NT-3, NT-4/5) zur Familie der Neurotrophi- ne. Ursprünglich liegen alle Neurotrophine als Homodimere mit einer Molekularmas- se von 26 – 27 kDa vor (KOLBECK et al. 1994). Die ursprüngliche Zuweisung, Wachstum und Überleben sensorischer und sympathischer Neurone zu unterstützen (ANGELETTI et al. 1971) wurde schon vor längerer Zeit um eine Rolle in der Repro- duktionphysiologie erweitert. So konnten unter anderem HARPER et al. (1982) das Vorhandensein von NGF im Seminalplasma von Bullen, Schafböcken und Ziegenbö- cken nachweisen. Mit dem übereinstimmend berichten LI et al. (2010) von der Anwe- senheit des NGF sowie seines spezifischen Rezeptors TrkA (Trypsin Kinase Rezep- tor A) im Bullensperma. Positive Effekte auf die Spermienqualität waren auch nach Zugabe exogenen NGFs nachweisbar. So trat unter Anwesenheit von NGF das Ab- sterben und die Apoptose der Spermien später ein. Insgesamt zeigten die Spermien eine höhere Viabilität. Daraus schlussfolgern die Autoren, dass NGF einen Einfluss auf die Spermaqualität und somit eventuell auf die Fertilität hat.

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GnRH – Gabe. Außerdem war das NGF in vitro in der Lage, Kumulusexpansion und Wiederaufnahme der Meiose in Eizellen zu provozieren.

Den direkten Zusammenhang zwischen NGF und der Reproduktionsphysiologie konnten RATTO et al. (2012) mit der Identifikation des OIF schließlich herstellen, for- dern jedoch weitere (In – vivo –) Untersuchungen zur Rolle des NGF in reproduktionsmedizinischen und neurologischen Mechanismen.

2.2.2 Lokal vermittelte Effekte

Seit langer Zeit werden dem Seminalplasma neben der Ernährungs- und Transport- funktion für Spermien außerdem modulatorische Auswirkungen auf den weiblichen Genitaltrakt zugeschrieben. Der interessanteste Effekt ist dabei die Vorverlegung der Ovulation nach Seminalplasmakontakt des Uterus.

Aus einer hannoverschen Arbeitsgruppe erschienen im Jahr 1990 mehrere Veröffent- lichungen zur Ovulationsvorverlegung bei der Sau durch Seminalplasma (WEITZE et al. 1990 a, b, c). Einige Teile dieser Studien wurden durchgeführt, bevor WEITZE et al. 1989 die transkutane Ovarkontrolle mittels Ultraschall an der stehenden Sau etab- lierten. WEITZE et al. (1990 a) bedienten sich deshalb zur Berechnung des Ovulati- onszeitpunktes vorerst der von HUNTER (1974) ermittelten embryonalen Teilungs- stadien, durch die auf den Eizellaktivierungszeitpunkt geschlossen werden kann.

In einem ersten Versuchsansatz konnten WEITZE et al. (1990 a) nachweisen, dass eine künstliche Besamung nach intrauteriner Vorbehandlung mit Seminalplasma den Anteil befruchteter Eizellen von 63 % (Vorbehandlung mit Verdünnermedium) auf 95 % verbessern kann. Ebenso wurde die Zeit zwischen der künstlichen Besamung und der Ovulation um 12,9 h verkürzt, wenn eine Vorbehandlung mit Seminalplasma erfolgt war. In einem weiteren Ansatz wurden 22 Jungsauen über drei spontane Zyk- len je 120 ml Seminalplasma, Östrogenlösung (5 µg Östradiol 17-ß, 4,5 µg Östron- sulfat, 2 µg Östron) oder PBS intrauterin appliziert. Der vierte Zyklus diente jeweils als unbehandelter Kontrollzyklus. Jede der drei Applikationen führte zu einer signifi- kanten Verkürzung des Intervalls Brunstbeginn – Ovulation im Vergleich zum Kon- trollzyklus (44,5 h ± 4,8 h). Dabei war die Verkürzung durch Seminalplasma (30,1 h ±

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7,4 h) am stärksten ausgeprägt und wiederum signifikant gegenüber der Verkürzung durch Östrogene (36,0 h ± 7,6 h) und PBS (37,6 h ± 9,6 h) (WEITZE et al. 1990 a).

Die zweite Veröffentlichung von WEITZE et al. (1990 b) vergleicht künstliche Besa- mungen unter Verwendung von je 500 Milliarden Spermien in 60 ml Seminalplasma, Östrogenlösung (5 µg Östradiol 17-ß, 4,5 µg Östronsulfat, 2 µg Östron) oder Andro- hep™ (kommerzieller Samenverdünner). 66,7 % der Sauen, die eine seminalplas- mahaltige Besamungsportion erhalten hatten, ovulierten innerhalb von 12 h nach Be- samung. Dies traf nur auf je 38,9 % der Sauen aus der Östrogen – / Androhep™ – Gruppe zu. Bei der Schlachtung innerhalb von zwei bis drei Tagen nach Östrusende konnte in der Seminalplasma – Gruppe der größte Anteil normal entwickelter Embry- onen ermittelt werden: 85,2 % im Vergleich zu 74,5 % nach Besamung mit Spermien in Östrogenlösung und 53,6 % nach Verwendung des kommerziellen Samenverdün- ners (WEITZE et al. 1990 b).

In der dritten Studie des gleichen Jahres berichten WEITZE et al. (1990 c) wiederum von einer Vorverlegung der Ovulation nach intrauteriner Seminalplasmaapplikation um 10,2 bis 14,4 h im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe. Außerdem zeigten sie, dass die Behandlung sowohl zum Zeitpunkt des Östrusbeginns, als auch 16 h später einen ovulationsvorverlegenden Effekt hat. Die Dauer der Gesamtrau- sche war bei Sauen, die Seminalplasma erhielten, signifikant kürzer als in der unbehandelten Kontrollgruppe (50,9 h bzw. 59,0 h) (WEITZE et al. 1990 c).

Weitere Projekte, deren Ergebnisse als Dissertationen vorliegen, bestätigen die ovulationsvorverlegenden Effekte des Seminalplasmas in unterschiedlichem Ausmaß (NIEMANN 1991, WILKENS 1991, WAGNER – RIETSCHEL 1991).

Bis dato wurde angenommen, dass das im Seminalplasma enthaltene Östrogen der tragende Mechanismus dieser Ovulationsbeschleunigung sei. Man vermutete eine östrogengesteuerte Prostaglandinfreisetzung, die sich mit den Prostaglandinen im Follikelinneren addierte (CLAUS et al. 1987). Diese Hypothese wurde bald erweitert, indem WEITZE et al. (1990 a, b, c) postulieren, dass neben dem Östrogen eine weitere Substanz im Seminalplasma enthalten sein muss, die die Ovulationsauslösung

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In einer umfangreichen Studie zur Eingrenzung dieser Substanz führten daraufhin WABERSKI et al. (1995) Besamungen mit unterschiedlichen Behandlungslösungen durch. In dieser Studie bildete jede Sau eine interne Referenz: Unter Anwendung des Mariensee – Modells (JUNGBLUT et al. 1991) wurde ein Uterushorn chirurgisch vom Corpus uteri getrennt. Dieses Horn hatte demzufolge keinen Kontakt zur transzervi- kal infundierten Lösung. Die ultraschallgeleitete Ovulationsbestimmung erfolgte an beiden Ovarien einzeln. So konnte der Effekt der applizierten Substanzen durch die Differenz des Ovulationszeitpunktes der Ovarien berechnet werden (Tabelle 1).

Tabelle 1: Effekte einer intrauterinen Applikation unterschiedlicher Lösungen auf den Ovu- lationszeitpunkt, mod. nach WABERSKI et al. 1995

Infusionslösung OVV MW* (h) OVV SD** (h)

SP 10,7^a 2,4

Aktivkohlebehandeltes SP 7,3^b 1,0

Aktivkohlebehandeltes SP + 10 µg Oestradiol 10,0^a 1,8

10 µg Oestradiol in PBS 3,3^c 1,6

7,8 µg Oestronsulfat in PBS 250 µg PGF_2α in PBS

2,4^c,d 0,7^d

1,7 1,2

250 µg PGE₂ in PBS 0,7^d 1,2

PBS 0,0^d 0,0

Aktivkohlebehandeltes SP 1 – 10 kDa 5,3^e 1,6

Aktivkohlebehandeltes SP < 1 kDa

Aktivkohlebehandeltes SP 1 – 10 kDa, pronasebehandelt

0,0^d 0,0^d

0,0 0,0 OVV: Ovulationsvorverlegung SP: Seminalplasma PBS: Kontrolllösung

* Mittelwert der Differenz der Ovulationszeitpunkte rechtes Ovar – linkes Ovar

** Standardabweichung der Differenz der Ovulationszeitpunkte rechtes Ovar – linkes Ovar

a – e

Angaben mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich statistisch signifikant (p < 0,05)

Die Autoren entnehmen diesen Ergebnissen, dass eine nichtsteroidale, pronasesen- sitive Substanz mit einer Molekülmasse von 1 – 10 kDa die Schlüsselrolle bei der Ovulationsvorverlegung spielt.

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Außerdem kann mit dem Versuchsdesign belegt werden, dass es sich um einen lokalen – also unilateralen – Effekt handelt, der direkt zwischen Uterushorn und ipsila- teralem Ovar vermittelt wird. Das LH – Profil im peripheren Blut seminalplasmabe- handelter Sauen verändert sich nicht gegenüber jenen, die eine PBS – Infusion erhielten. Verkürzt wird jedoch das Intervall zwischen LH – Peak und Ovulation auf dem dem behandelten Uterushorn anliegenden Ovar (WABERSKI et al. 1997).

Aus der gleichen Arbeitsgruppe stammt eine weitere Studie, die ebenfalls auf der Grundlage des Mariensee – Modells durchgeführt wurde (HAHN 1998). Neben aktiv- kohlebehandeltem Seminalplasma mit unterschiedlichen Molekülmassen wurden u.

A. Relaxin (200 ng bzw. 2000 ng) und ein GnRH – Analogon (Buserelin, 4 µg) eingesetzt. Beide Substanzen zeigten nach intrauteriner Applikation keinen Einfluss auf den Ovulationszeitpunkt. Des Weiteren wurden Effekte der Seminalplasmaapplikati- on unmittelbar, 16 h und 24 h nach Brunstfeststellung untersucht. Das Intervall zwischen Ovulation auf dem unilateral zum behandelten Horn liegenden Ovar und der ipsilateralen Kontrollseite verkürzte sich von 8,7 h (± 2,0 h) auf 4,6 h (± 3,8 h) nach 16 h. Nach 24 h war keine Ovulationsauslösung mehr feststellbar. Die Autoren schlussfolgern, dass der Behandlungszeitpunkt eine bedeutende Rolle spielt: eine ovulationsvorverlegende Wirkung ist nur zu erwarten, wenn die Seminalplasmaappli- kation mindestens 20 h vor der spontanen Ovulation erfolgt. Je länger dabei das In- tervall Brunstfeststellung – Ovulation auf dem Kontrollovar ist, desto ausgeprägter ist der ovulationsvorverlegende Effekt. Bei einem Intervall von ≤ 20 h ist davon auszugehen, dass keine Ovulationsvorverlegung ausgelöst werden kann, wohingegen bei Intervallen von ≥ 28 h immer ein Effekt nachweisbar ist (HAHN 1998).

Für weiterführende Erkenntniss der Effekte des Seminalplasmas auf die Ovarfunktion führte eine australische Arbeitsgruppe (O`LEARY et al. 2006) Versuche an synchro- nisierten Jungsauen durch. Die Tiere wurden 34 h nach transzervikaler Behandlung mit Seminalplasma bzw. PBS geschlachtet. Dem Synchronisationsprotokoll zufolge befanden sie sich zu diesem Zeitpunkt etwa sechs Stunden prae ovulationem. Eine statistisch abgesicherte Vorverlegung der Ovulation durch Seminalplasma konnten

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Seminalplasmakontakt weiter fortgeschritten war: 97 % (± 2,4 %) der Eizellen befanden sich 36 h nach Behandlung mit Seminalplasma in der Metaphase II. Gleiches traf nur auf 84 % (± 10,4 %) der Eizellen nach Behandlung mit PBS zu.

Eine zweite Tiergruppe wurde fünf bzw. neun Tage nach der Behandlung geschlachtet. Beurteilt wurden unter anderem die Anzahl und das Gewicht der Corpora lutea.

Außerdem wurden von Tieren beider Behandlungsgruppen Hormonprofile erstellt.

Das signifikant höhere Gewicht der Corpora lutea nach Seminalplasmakontakt des Uterus resultierte in signifikant höheren Progesteronwerten im peripheren Blut an den Tagen fünf und neun nach der Behandlung. O`LEARY et al. (2006) waren damit die ersten, die die Effekte des Seminalplasmas auf das Ovar auf die Zeit nach der Ovulation ausweiteten. Sie sehen darin eine Erklärung für die zuvor beschriebene Erhöhung der Anzahl lebendiger Embryonen (O`LEARY et al. 2004), reduzierte emb- ryonale Sterblichkeit und die gleichmäßigere Embryonalentwicklung (WABERSKI et al. 1997) durch Seminalplasma. Die Isolierung dieser Substanz (WABERSKI et al.

1995) und die Ausnutzung seiner Wirkung in der angewandten Reproduktionsmedi- zin hat daher nach Ansicht der Autoren äußerste Wichtigkeit (O`LEARY et al. 2004).

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3 Material und Methode

3.1 Versuchsschema

In der vorliegenden Arbeit wurden Tierversuche am Tiermodell Schwein durchge- führt. Die Behandlung, deren Auswirkungen auf molekularbiologischer Ebene untersucht wurden, beinhaltete folgende Aspekte (Abbildung 1):

∗ 1. Laparatomie

∗ Ligatur beider Uterushörner nahe der Bifurkation

∗ Unilaterale, intracornuale Applikation von Seminalplasma (Versuchsseite)

∗ Kontralaterale, intracornuale Applikation von PBS (Kontrollseite)

∗ Inkubationszeit (17 h)

∗ 2. Laparatomie

∗ Teil – Ovariohysterektomie

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Tiermodells

Links: Behandlung, SP = Seminalplasma, PBS = Kontrolllösung Rechts: Probenentnahme, UTV = Uterotuberale Verbindung

SP PBS

Uterushorn UTV

Ovar

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3.2 Herstellung des Seminalplasma – Pools

Es wurde ein Pool aus dem Seminalplasma zehn unterschiedlicher Eber aus der Re- produktionsmedizinischen Einheit der Kliniken verwendet. Alle Eber waren zum Zeit- punkt der Samengewinnung geschlechtsreif, fertil, allgemein- und geschlechtsge- sund. Zur Separierung des Seminalplamas wurde das jeweilige Ejakulat drei Zentri- fugationsschritten (je 10 min bei 3370 x g, Megafuge 2.0R, Heraeus instruments) mit großzügigem Verwerfen des Pellets unterzogen. Das Seminalplama von zehn Ebern wurde zusammengefügt und gründlich durchmischt (15 min auf einem Heidolph MX 3001 Magnetrührer, 500 rpm). Das Seminalplasma wurde vor und nach dem Poolen mikroskopisch mehrfach auf Spermienfreiheit kontrolliert. Die Lagerung erfolgte in 100 ml Portionen bei -20 °C. Bei Bedarf wurde eine 100 ml Portion im Wasserbad bei 38 °C aufgetaut. Durch die weitere Lagerung im Wasserbad wurde sichergestellt, dass das Seminalplasma zum Zeitpunkt der Behandlung eine Temperatur von 38 °C hatte.

Für die Behandlung der Kontrollseite wurde PBS – Gebrauchslösung (Rezept s. An- hang) eingesetzt. Die Lösung wurde ebenfalls in 100 ml Portionen bei -20 °C gela- gert, bei Bedarf im Wasserbad aufgetaut und auf 38 °C erwärmt. Der pH-Wert der PBS-Gebrauchslösung wurde durch Titration von 1 molarer NaOH auf den Wert des Seminalplasmas (pH 8,2) eingestellt.

3.3 Tiermodell

Der Tierversuch sowie die unmittelbare Probenaufbereitung wurden in der Reproduk- tionsmedizinischen Einheit der Kliniken, Abteilung Schwein, der Tierärztlichen Hoch- schule Hannover durchgeführt. Die Genehmigung wurde unter der Antragsnummer 33.12-42502-04-07/1261 erteilt.

3.3.1 Versuchstiere

Bei den Versuchstieren handelte es sich um sieben klinisch gesunde Jungsauen aus einem Mastbetrieb. Bei Einstallung in die Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken betrug das Körpergewicht je ca. 80 – 100 kg. Die Transportrausche wurde

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Zweier- bis Vierergruppen auf Stroh. Nur regelmäßig zyklische Tiere ohne auffällige Befunde im Ultraschall (z. B. Flüssigkeit im Uterus, Zysten) wurden in den Versuch aufgenommen.

3.3.2 Brunstkontrolle

Zur genauen Zyklusbestimmung wurde ab Tag 16 p. ov. mit der Brunstkontrolle be- gonnen. Das Intervall der Untersuchungen betrug vier bis sechs Stunden. Die Sauen wurden in das Eberabteil mit Sicht- und Nasenkontakt zu acht geschlechtsreifen Ebern getrieben. Dort wurden der Flankengriff, die Stütz- und die Reitprobe durchge- führt. Die Ausprägung der Rötung und Schwellung der Vulva sowie des Interesses am Eber wurden dokumentiert (- bis +++). Anschließend wurde im Untersuchungs- stand eine transadominale Ultraschalluntersuchung (5-MHz-Sektorschallkopf, Sono- line SI-400, Siemens) von der rechten Inguinalgegend durchgeführt. Dabei wurden die Darstellbarkeit von Follikeln sowie die Größe eines repräsentativen Follikels no- tiert. Als Oestrusbeginn wurde der mittlere Zeitpunkt zwischen der letzten negativen und ersten positiven Reitprobe definiert. Die Behandlung in Form von Seminalplas- maapplikation erfolgte maximal sechs Stunden nach errechnetem Brunstbeginn (Ab- bildung 2).

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Untersuchungs- und Behandlungsintervalle Letzter

negativer Reittest

Erster positiver

Reittest

2. OP

„Probengewinnung“

2. Blutprobe 1. OP

„Behandlung“

1. Blutprobe Errechneter

Brunstbeginn

17 h 3 – 6 h

4 – 6 h

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3.3.4 Behandlung und Probengewinnung

Die Sauen wurden ca. zwölf Stunden vor der OP nüchtern ohne Stroh bei freiem Wasserzugang gehalten. Vor Einleitung der Narkose wurde eine klinische Allge- meinuntersuchung durchgeführt. Nur klinisch gesunde Tiere wurden in die Studie aufgenommen.

Die Narkoseeinleitung erfolgte mittels Atropin – Prämedikation (Atropin sulfuricum^® sol. 1 vol%, Eifelfango, Bad Neuenahr; 0,02 mg/kg KGW i.m.) und einer Ketamin – / Azaperon – Kombination (Stresnil^®, Janssen-Cilag GmbH; 2,0 mg/kg KGW i.m., Ur- sotamin^® Serumwerk Bernburg AG; 20 mg / kg KGW i.m.). Nach Niedergehen des Tieres wurde ein Ohrvenenverweilkatether (18 Gauge) gelegt, mit Natriumcitrat ge- spült und fixiert. In allen Fällen war zum Erreichen des Toleranzstadiums eine intra- venöse Nachdosierung des Ketamin (Ursotamin^®) notwendig. Das Tier wurde auf den OP – Tisch verbracht und in Brust – Bauchlage endotracheal intubiert (Tubus- größe 9 bis 12 mm, Länge 32 cm). Zur Erhaltung der Narkose wurde das Tier an ein Inhalationsnarkosegerät (Sulla 909 V Dräger AG, Lübeck) bei Spontanatmung ange- schlossen. Während der ersten Minuten wurden 5 l Lachgas / Sauerstoff (Linde Gas Therapeutics GmbH & Co., Unterschleißheim) im Verhältnis 60:40 pro Minute zur Verfügung gestellt. Anschließend wurde der Gasdurchfluss auf 1,5 – 2 l / min bei gleichen Anteilen Lachgas und Sauerstoff reduziert. Tierindividuell wurden in der An- flutungsphase ca. 3 %, während der Narkoseerhaltung 0,8 – 1,5 % Isofluran (CP Pharma, Burgdorf) beigemischt. Alle Tiere erhielten während der Dauer der OP über den Ohrvenenverweilkatether eine Elektrolytinfusion (Albrecht GmbH, Aulendorf).

Während der gesamten OP wurden mithilfe eines Narkosemonitors (Eagle 1000, Marquette Hellige) folgende Parameter überwacht und protokolliert: Herzfrequenz, EKG, Pulsoximetrie, Atemfrequenz, Atemzugvolumen, Kapnographie, Temperatur intranasal.

Nach erfolgreicher Intubation wurde das narkotisierte Tier in Rückenlage auf dem OP – Tisch fixiert. Nach Reinigung, Rasur, Entfettung (70 % EtOH), Jodierung und steriler Abdeckung des Inguinalbereichs erfolgte ein medianer Hautschnitt (ca.

10 cm) und die Öffnung der Bauchhöhle auf Höhe des letzten Zitzenpaares. Faszien

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Uterus sowie beide Ovarien wurden vorsichtig vorgelagert. Anzahl und Größe der Tertiärfollikel wurden protokolliert. Das Infundibulum wurde hierfür nicht verlagert.

Nach Reponierung der Ovarien in die Bauchhöhle wurde das linke Uterushorn corpusnah dreifach ligiert. Hierfür wurden ein resorbierbarer Faden (Surgicryl^® PGA EP 6, SMI AG, Hünningen, Belgien) sowie eine atraumatische Nadel verwendet. Unter Schonung der sichtbaren Blutgefäße wurde die Nadel mit Faden von medial nach lateral uterusnah durch das Gekröse geführt, der Faden wurde vorerst unverknotet abgelegt. Kranial des ersten, im Abstand von ca. 2 cm wurde ein zweiter Faden gleichermaßen abgelegt. Nach Anlegen des dritten Fadens im gleichen Abstand nach gleicher Vorgehensweise wurde der erste Faden angezogen und mit chirurgi- schen Knoten dreifach verknotet. Der Anzug der Ligatur erfolgte so fest wie möglich unter Zuhilfenahme eines Nadelhalters. Anschließend wurde das rechte Uterushorn ebenso corpusnah dreifach ligiert. Es folgte die langsame Infusion von 100 ml Semi- nalplasma (38 °C) ins linke Horn kranial der Ligatur. Der ligierte Teil des Uterus wurde locker zwischen den Fingern fixiert und eine sterile Kanüle (18 G) durch die Ute- ruswand ins Lumen geführt (Abbildung 3). Dort wurde die freie Beweglichkeit der Ka- nüle im Lumen vorsichtig überprüft. Eine unsterile Assistenz injizierte über eine Po- lyethylen – Spritzverlängerung langsam und ohne Druck das Seminalplasma. Beim Auftreten von spontanen Kontraktionswellen des Myometriums wurde die Injektion unterbrochen und nach Entspannung des Uterus fortgesetzt. Die Applikation der gesamten 100 ml erfolgte über eine Zeitspanne von ca. 2 min. Nach beschriebener Me- thode erfolgte danach die langsame Infusion von 100 ml PBS-Gebrauchslösung (38 °C) ins rechte Horn kranial der Ligatur.

Uterus und Ovarien wurden anschließend wieder zurück in die Bauchhöhle verlagert.

Das Bauchfell wurde fortlaufend mit einer Kürschnernaht vernäht (Vitafil^® White Po- lyester EP6, SMI AG, Hünningen, Belgien). Die Faszien und Muskulatur (Surgicryl^® PGA EP 6, SMI AG, Hünningen, Belgien) wurden ebenso wie die Haut (Vitafil^® White Polyester EP6, SMI AG, Hünningen, Belgien) mit Einzelheften verschlossen und mit einer Wundauflage aus sterilen Kompressen und Sprühkleber bedeckt.

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Abbildung 3: Infusion des Seminalplasmas in das ligierte Uterushorn

Zum Ausspülen des Isoflurans aus der Lunge wurde das Tier vorübergehend mit rei- nem Sauerstoff beatmet und anschließend von der Inhalationsnarkose getrennt. Zum Aufwachen wurde es in eine Strohbox mit Wärmelampe verbracht, dort erfolgte mit Einsetzen des Schluckreflexes die Extubation. Um die zweite Narkose schneller und schonender intravenös einleiten zu können, wurde an dem Ohrvenenverweilkatether eine Spritzverlängerung fixiert.

Die Tiere verblieben in einer strohgestreuten Einzelbox unter Rotlicht und erhielten einmalig Amoxicillin (Hostamox^® Intervet Unterschleißheim; 15 mg/kg KGW i. m.) sowie zwei Injektionen Butorphanol (Alvegesic^® CP Pharma, Burgdorf; initial 0,05 mg/kg KGW i.v.; nach ca. 5 h 1 mg/kg KGW i.m.).

Die zur Probengewinnung notwendige Teil – Ovariohysterektomie wurde, beginnend mit der Versuchsseite, in einer zweiten Operation möglichst exakt 17 Stunden nach Infusion des Seminalplasmas durchgeführt. Nach intramuskulärer Injektion von Atro-

® ®

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gen i. v. über den Ohrvenenkatether erfolgen. Im weiteren Verlauf glich die OP – Vorbereitung der Einleitung der ersten OP.

Nach Eröffnen der Bauchhöhle wurden Uterus und Ovarien vorgelagert. Danach erfolgte die Ovarektomie. Mittels einer Arterienklemme wurde das Ovar der Versuchs- seite locker fixiert und mit einer Skalpellklinge zügig abgesetzt. Der verbleibende Stumpf wurde mehrfach ligiert (Spool Suture PGA violett EP 6). Das Ovar wurde unmittelbar in PBS-Complete Lösung (RT) befördert und ins Labor gebracht, wo die weitere Präparation erfolgte. Ebenso wurde das Ovar der Kontrollseite abgesetzt.

Anschließend wurden in das Gefäßnetz im Geköse des Uterushorns der Versuchs- seite – unter besonderer Beachtung der A. uterina mit ihrem R. uterinus sowie des R.

uterinus der A. ovarica – mehrere versetzte Ligaturen (Spool Suture PGA violett EP 6) gesetzt, jedoch noch nicht angezogen. Erst nach Anlegen der letzten Ligatur wurden sie kaudal beginnend zugezogen. Das Mesometrium wurde organnah gefenstert.

Mit einer Metzenbaumschere wurde zuerst der Eileiter, dann der Uterus kranial der Ligaturen durchtrennt. Dabei wurde der Uterus mit einer Darmklemme verschlossen.

Die kranialen 40 cm des Hornes wurden entnommen und zur weiteren Bearbeitung an die OP – Assistenz übergeben (s. u.). Der verbleibende Stumpf wurde einstülpend vernäht (Spool Suture PGA violett EP 6) und die dreifache Ligatur aus der ersten La- paratomie entfernt. Anschließend wurden die kranialen 40 cm des Uterushornes der Kontrollseite nach gleicher Vorgehensweise entnommen.

Nach gründlicher Kontrolle auf Abwesenheit jeglicher Blutungen wurden die Uterus- hornstümpfe zurück in die Bauchhöhle verlagert. Der Verschluss der Bauchhöhle sowie die Aufwachphase verliefen wie im Rahmen der ersten Operation beschrieben.

Die Sauen wurden post operationem regelmäßigen klinischen Allgemeinuntersu- chungen unterzogen (stündliche Kontrollen bis zur Wiederherstellung des Stehver- mögens, danach min. vier Untersuchungen im Abstand von 24 h). Die postoperative Medikation umfasste eine dreitägige Antiphlogese (Metamizol (Vetalgin^® Intervet, Un- terschleißheim; 40 mg/kg KGW i. m.), Meloxicam (Metacam^® Boehringer Ingelheim;

0,4 mg/kg KGW i. m.)) sowie eine zehntägige Antibiose (Amoxicillin, initial

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3.4 Vorbereitung der Proben zur Konservierung

3.4.1 Isolation von Granulosa-, Kumuluszellen und Oozyten

Ziel der Punktion war es, Granulosazellen, Kumuluszellen und Oozyten separat kon- servieren zu können. Dafür erfolgte die weitere Präparation der Ovarien parallel durch zwei Personen im Labor. Zu jedem Ovar wurden Größe und Anzahl der Terti- ärfollikel bestimmt. Dann erfolgte die Punktion einzelner Follikel (Abbildung 4). Dafür wurden in einer sterilen 1ml – Spritze (Omnifix, Braun Melsungen AG, Melsungen) ca. 0,1 ml TCM Air 199 vorgelegt. Der ausgewählte Follikel (min. 6 mm) wurde mit einer 22 G – Kanüle (Sterican, Braun Melsungen, Melsungen) punktiert und vorsichtig an der Follikelinnenwand entlang geschabt. Der Follikelinhalt wurde aspiriert und in ein Nunc-Schälchen (Ø 5 cm; Nunclon-Surface, nunc Roskilde, Dänemark) mit vorgelegtem Tropfen TCM Air gegeben.

Abbildung 4: Punktion eines Graafschen Follikels

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Die so gewonnene Follikelflüssigkeit wurde stereomikroskopisch (Wild Heerbrug MOG 17, Schweiz) auf die Anwesenheit von Granulosazellen, Kumuluszellen und der Oozyte überprüft. Bei Nichtauffinden der Oozyte wurde die Follikelhülle vorsichtig mit etwas TCM Air aufgefüllt, erneut an der Follikelinnenwand entlang geschabt und die Flüssigkeit zurückgewonnen. Je nach Anzahl der verfügbaren Tertiärfollikel wurden bis zu sechs Follikel pro Ovar punktiert. Das Ovar wurde nach jeder Punktion zurück in die raumtemperierte PBS Complete Lösung verbracht. Alle anderen verwendeten Lösungen wurden auf einer Wärmeplatte auf einer Temperatur von 38 °C gehalten.

Die Oozyte wurde mit anhängendem Kumulus aus der Follikelflüssigkeit in einen neuen TCM Air – Tropfen verbracht. Das Umsetzen sowie das nachfolgende mecha- nische Denudieren erfolgten mithilfe eines Stripper Micropipettors (Drummond Microdispenser, Broomall, USA; Tips 290 bis 125 µm, Mid adlantic Diagnostics).

Aus der Follikelflüssigkeit wurden die Granulosazellschollen mittels einer Eppendorf Pipette (10 – 100µl, Eppendorf Research, Hamburg, Spitzen Nerbe plus, 10 – 200 µl, Winsen / Aller) mit konstant 50 µl TCM Air aufgenommen und in ein Safe Seal Cup (0,5 ml; Sarstedt AG & Co., Nümbrecht) verbracht. Das Cup wurde mit 350 µl PBS – Gebrauchslösung aufgefüllt und auf Eis zwischengelagert.

Nach dem gleichen Verfahren wurden die Kumuluszellen, die beim Denudieren von der Oozyte gelöst wurden, gepickt und nach Auffüllung mit PBS Gebrauchslösung auf Eis zwischengelagert.

Nach der Punktion des letzten Follikels wurden Kumulus- und Granulosazellen 10 min bei 1000 x g (3250 rpm, 85 mm Hermle Z233 M-2 Zentrifuge mit Rotor 220.87V06) zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abpipettiert. Die trockenen Zellpellets wurden bis zur weiteren Verarbeitung umgehend bei -80 °C eingefroren.

Die Oozyte wurde nach vollständigem Denudieren (Freisein der Zona pellucida von anhaftenden Kumuluszellen) durch drei Tropfen PBS mit PVA pipettiert („gewa- schen“) und in einem Safe Seal Sarstedt Cup mit 1,5 µl PBS mit PVA bei -80 °C eingefroren.

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wie eine semiquantitative Einschätzung der Kumulus- / Granulosazellen (- bis +++).

Alle verwendeten Punktate stammen aus Follikeln mit einer Mindestgröße von 6 mm.

Die maximale Zeitspanne zwischen 1. Punktion und Einfrieren der Oozyte betrug 30 Minuten.

3.4.2 Kyrokonservierung des Uterus und der UTV

Die Gewebeproben von Uterus und UTV sollten nach der Entnahme aus dem Tier möglichst schnell fixiert werden. Die weitere Verarbeitung erfolgte daher durch zwei Personen in einem dem OP – Raum unmittelbar benachbarten Raum. Fixiert wurden die längs halbierte UTV sowie ein ca. 1 cm breiter Querschnitt des Uterushorns 2 cm kaudal der UTV. Dafür wurde jedes Gewebestück locker in Parafilm gewickelt und in Alufolie verpackt. Diese wurde beschriftet und unverzüglich in flüssigen Stickstoff verbracht, in dem die Päckchen bis zur weiteren Verarbeitung verblieben. Die maximale Zeitspanne zwischen Organentnahme und Kryofixation der Gewebeprobe betrug sieben Minuten.

3.5 Laser Microdissection zur Isolation uteriner Epithelzellen

Die Laser Microdissection der Uterus – und UTV – Proben wurde im Anatomischen Institut sowie der AG Histologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchge- führt.

3.5.1 Prinzip der Laser Microdissection

Die Laser Microdissection (LMD) beschreibt eine in den 1990ern entwickelte Metho- de zur Gewinnung von definierten Zellen unter mikroskopischer Kontrolle. Das LMD – System umfasst eine Mikroskop- und eine Lasereinheit sowie einen PC mit zugehöriger Software. Die histologischen Schnitte, die auf spezielle, Polyethylen- naphthalat (PEN) – beschichtete Objektträger aufgezogen sind, werden um 180° ge- dreht auf einem automatisch bewegten Objekttisch befestigt. Das mikroskopische Bild wird auf einen Computerbildschirm übertragen. Auf diesem Touchscreen können die gewünschten Zellen markiert und der Laservorgang gestartet werden. Der UV-

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durch die Folie mit dem anheftenem Schnitt (Abbildung 6). Der Schwerkraft folgend fallen die ausgelaserten Zellen / Areale (Dissektate) in ein darunter befestigtes Reak- tionsgefäß. So erhält man eine hochreine Probe für weiterführende Analysen.

Färbe- und Vorgehensprotokolle für die LMD wurden in Anlehnung an bereits veröf- fentlichte Protokolle (FINK u. BOHLE 2005) modifiziert und in ausführlichen Vorver- suchen für das vorliegende Gewebe etabliert.

3.5.2 Vorbereitung der Kryoschnitte

In der vorliegenden Arbeit wurde die LMD genutzt, um luminale Epithelzellen aus dem Uterus sowie dem uterinen Anteil der UTV zu isolieren. Verwendet wurden die kryokonservierten Gewebestücke von Uterus und UTV, die innerhalb von sechs Mo- naten nach Probengewinnung gelasert wurden.

Vor der Anfertigung der histologischen Schnitte wurde der Kryostat (Leica Kryostat CM 3000) mit 80 % EtOH gereinigt. Außerdem erhielten die PEN-beschichteten Ob- jektträger (Membrane Slide 1.0 Polyehtylennaphthalat, Zeiss, Göttingen) eine 30 minütige UV – Bestrahlung zur Verringerung der elektrostatischen Aufladung. An- schließend wurden sie auf Eis gekühlt. Die o. g. Gewebeblöcke wurden bei einer Kammertemperatur von -25 °C und einer Objekttemperatur von -20 °C so auf der Halterung fixiert, dass der Querschnitt dem Bediener des Kryostaten zugewandt war (Abbildung 5). Die UTV wurde an ihrer dem Eileiter zugewandten Seite fixiert, sodass der Anschnitt am uterinen Anteil erfolgte. Die Schnittdicke betrug 8 µm. Es wurden je nach Größe der Gewebeprobe drei bis zehn Schnitte auf einen Objektträger gezo- gen. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt (Tabelle 2). Das Proto- koll wurde auf der Grundlage des Protokolls von FINK und BOHLE 2005 in unveröf- fentlichten Vorversuchen etabliert. Jeder Träger wurde unmittelbar nach Aufziehen der Schnitte gefärbt und gelasert.