3 Material und Methode
3.5 Laser Microdissection zur Isolation uteriner Epithelzellen
Die Laser Microdissection der Uterus – und UTV – Proben wurde im Anatomischen Institut sowie der AG Histologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchge-führt.
3.5.1 Prinzip der Laser Microdissection
Die Laser Microdissection (LMD) beschreibt eine in den 1990ern entwickelte Metho-de zur Gewinnung von Metho-definierten Zellen unter mikroskopischer Kontrolle. Das LMD – System umfasst eine Mikroskop- und eine Lasereinheit sowie einen PC mit zugehöriger Software. Die histologischen Schnitte, die auf spezielle, Polyethylen-naphthalat (PEN) – beschichtete Objektträger aufgezogen sind, werden um 180° ge-dreht auf einem automatisch bewegten Objekttisch befestigt. Das mikroskopische Bild wird auf einen Computerbildschirm übertragen. Auf diesem Touchscreen können die gewünschten Zellen markiert und der Laservorgang gestartet werden. Der
UV-durch die Folie mit dem anheftenem Schnitt (Abbildung 6). Der Schwerkraft folgend fallen die ausgelaserten Zellen / Areale (Dissektate) in ein darunter befestigtes Reak-tionsgefäß. So erhält man eine hochreine Probe für weiterführende Analysen.
Färbe- und Vorgehensprotokolle für die LMD wurden in Anlehnung an bereits veröf-fentlichte Protokolle (FINK u. BOHLE 2005) modifiziert und in ausführlichen Vorver-suchen für das vorliegende Gewebe etabliert.
3.5.2 Vorbereitung der Kryoschnitte
In der vorliegenden Arbeit wurde die LMD genutzt, um luminale Epithelzellen aus dem Uterus sowie dem uterinen Anteil der UTV zu isolieren. Verwendet wurden die kryokonservierten Gewebestücke von Uterus und UTV, die innerhalb von sechs Mo-naten nach Probengewinnung gelasert wurden.
Vor der Anfertigung der histologischen Schnitte wurde der Kryostat (Leica Kryostat CM 3000) mit 80 % EtOH gereinigt. Außerdem erhielten die PEN-beschichteten Ob-jektträger (Membrane Slide 1.0 Polyehtylennaphthalat, Zeiss, Göttingen) eine 30 minütige UV – Bestrahlung zur Verringerung der elektrostatischen Aufladung. An-schließend wurden sie auf Eis gekühlt. Die o. g. Gewebeblöcke wurden bei einer Kammertemperatur von -25 °C und einer Objekttemperatur von -20 °C so auf der Halterung fixiert, dass der Querschnitt dem Bediener des Kryostaten zugewandt war (Abbildung 5). Die UTV wurde an ihrer dem Eileiter zugewandten Seite fixiert, sodass der Anschnitt am uterinen Anteil erfolgte. Die Schnittdicke betrug 8 µm. Es wurden je nach Größe der Gewebeprobe drei bis zehn Schnitte auf einen Objektträger gezo-gen. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt (Tabelle 2). Das Proto-koll wurde auf der Grundlage des ProtoProto-kolls von FINK und BOHLE 2005 in unveröf-fentlichten Vorversuchen etabliert. Jeder Träger wurde unmittelbar nach Aufziehen der Schnitte gefärbt und gelasert.
Abbildung 5: Kryokonserviertes Uterushorn (Querschnitt), das zur Anfertigung der histologi-schen Schnitte in der Kryostatenkammer befestigt wurde. Die zentrale Aufhel-lungslinie stellt den Epithelsaum dar.
Tabelle 2: Färbeprotokoll für die LMD, mod. nach FINK und BOHLE 2005
Reagenz Zeit
100 % EtOH 30 sec
Häm 30 sec
DEPC – Tab water Eosin DEPC – Tab water 70 % EtOH 95 % EtOH 100 % EtOH
20 sec, schwenkend 1 x dippen 20 sec, schwenkend 15 sec 15 sec 15 sec
Am Tag vor der LMD wurde für die Herstellung des DEPC – Tab waters 1 ml DEPC in 1000 ml Leitungswasser pipettiert und mittels Magnetrührer mindestens 15 min verrührt. Die Lösung wurde über Nacht unter dem Abzug bei nur lose aufgelegtem Deckel inkubiert. Am folgenden Tag wurde die Lösung bei 121 °C für 20 min autokla-viert und mit 1 g NaHCO3 versetzt. Die Zugabe des NaHCO3 veränderte den pH-Wert ins basische, um die Bläuung der Häm-Färbung zu intensivieren. Das so zubereitete DEPC – Tab water wurde max. drei Tage bei RT aufbewahrt.
Zum Ansetzten des 70 % / 95 % Ethanol wurde DEPC – Aq. dest. verwendet. Die Herstellung erfolgte nach oben beschriebenem Verfahren, jedoch wurde statt Lei-tungswasser Aq. dest. verwendet und auf die Zugabe von NaHCO3 verzichtet.
3.5.3 Durchführung der Laser Microdissection
Bei der Laser Microdissection haben die Einflussfaktoren Zeit und Temperatur den größten Einfluss auf die Qualität der später extrahierten RNA (unveröffentlichte Vor-versuche). Das Laser Microdissection System (Leica LMD 7000, Software Leica LMD n. v. 6.6.3.) war daher in einem klimatisierten Raum aufgestellt, in dem die Raum-temperatur konstant bei 19 °C ± 2 °C gehalten wurde.
Innerhalb eines Zeitfensters von 20 min wurde in der 10er Vergrößerung so viel Epithel wie möglich, max. jedoch 2,5 Mio. µm² gelasert. Die Dissektate fielen unmit-telbar in ein steriles, RNase und DNase freies Eppendorfgefäß (Abbildung 7) und wurden unmittelbar auf Trockeneis eingefroren. Bis zur RNA – Extraktion wurden die Dissektate max. sieben Tage bei -80 °C gelagert.
Während des Lasern wurden folgende Aspekte protokolliert: Lokalisation, Beschaf-fenheit des Gewebeblocks, Zeit zwischen Färben und Einfrieren, Qualität der Schnit-te (Morphologie und Färbung), Dissektatfläche (µm²)).
Abbildung 6: Uterusquerschnitt mit zentralem Epithelsaum, HE – Färbung, 5x Vergrößerung Links: Vor Durchführung der LMD, Rechts: Nach Durchführung der LMD
Abbildung 7: Dissektat eines Laservorgangs (2,5 Mio µm²) im Deckel eines Eppendorf – Gefäßes
3.6 Molekularbiologische Untersuchung der Epithel-, Granulosa- und . Kumu luszellen
Die molekularbiologische Aufbereitung und Analyse der Epithel-, Granulosa- und Kumuluszellen wurde in der AG Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hanno-ver durchgeführt.
3.6.1 RNA – Extraktion
Zur Extraktion der RNA aus den Dissektaten der Laser Mircodissection (Epithel des Uterus und der UTV) sowie aus den Kumuluszellen und Granulosazellen wurde das RNeasys® Plus Micro – Kit der Firma Qiagen verwendet. Alle Arbeitsschritte erfolgten nach Angaben des Herstellers und bei Raumtemperatur.
Die bei -80 °C gelagerten Proben wurden dafür aufgetaut und mittels 30 sekündigem Vortexen in 350 µl Puffer RLT Plus lysiert. Vor Verwendung wurden dem Puffer RLT Plus 10µl Mercaptoethanol pro 1 ml zugegeben. Das Lysat wurde auf eine gDNA Eliminator Säule gegeben und 30 sec bei 10000 x g zentrifugiert. Damit erfolgte die Aussortierung der genomischen DNA – Fragmente, die auf der Filtermembran hän-gen blieben. Dem Durchfluss wurde ein äquivalentes Volumen 70 % EtOH zugege-ben und durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren gemischt. Das so entstandene Ly-sat wurde auf eine MinElute Säule pipettiert und 15 sec bei 10000 x g zentrifugiert.
Bei diesem Zentrifugationsschritt blieben RNA – Moleküle an der Filtermembran haf-ten, während Proteine und Salze eluiert und verworfen wurden. Es folgten zwei Waschschritte mit den Puffern RW1 (700 µl) und RPE (500 µl) mit einer jeweiligen Zentrifugation von 15 sec bei 10000 x g und anschließendem Verwerfen des Durch-flusses. Für den dritten Waschschritt wurden 500 µl 80 % EtOH auf die Säule gege-ben und 2 min bei 10000 x g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde mitsamt dem Auf-fanggefäß verworfen. Nachdem die Säule in einem neuen sterilen Eppendorfgefäß platziert wurde, folgte eine trockene Zentrifugation für 5 min bei 14000 x g. Dieser Schritt stellte eine vollständige Befreiung der Filtermembran von ethanolhaltigen Rückständen sicher.
Für die Eluierung der RNA aus der Filtermembran wurden 14 µl RNAse freies Was-ser mittig auf die Membran pipettiert. Nach einminütiger Zentrifugation bei 14000 x g wurde der RNA – haltige Durchfluss (12 µl) umgehend auf Eis gekühlt.
3.6.2 Qualitative und quantitative Messung der RNA
Um die Qualität und Menge der extrahierten RNA zu überprüfen wurde das Experi-on™ Automated Electrophoresis System® der Firma Biorad eingesetzt. Hierbei han-delt es sich um eine Lab – on – a – Chip – Technologie, deren Prinzip auf der Gel-elektrophorese beruht. Die Proben werden in die Mikrokanäle des Chips eingespritzt und elektrophoretisch aufgetrennt. Die Übersetzung in Banden und Peaks (Elekt-ropherogramme) erfolgt dann über die Detektion des eingelagerten Farbstoffs.
Zur Vorbereitung des Standard Sense Chips wurden alle Reagenzien von 4 °C auf Raumtemperatur gebracht; der bei -80 °C gelagerte Standard (Ladder) wurde auf Eis aufgetaut. Für die obligatorische Reinigung der Elektroden wurde der Cleaning Chip erst mit 800 µl Experion Electrode Cleaner befüllt und für zwei Minuten in die Electrophorese Station gesetzt. Die mechanische Reinigung erfolgte mit fusselfreien Stieltupfern (Swabs®, basan GmbH). Anschließend wurde ein mit 800 µl RNAse frei-em Wasser befüllter Cleaning Chip eingesetzt und für 5 min in der Station belassen.
Dieser Waschschritt wurde mit ausgetauschtem RNAse freiem Wasser wiederholt.
Danach wurde der Deckel der Station ca. 60 sec offen gelassen um die vollständige Trocknung der Elektroden zu erreichen. Je 2 µl der Proben – RNA sowie des zum Kit gehörigen Standards wurden unmittelbar vor der Messung für 2 min bei 70 °C degra-diert und für 5 min auf Eis gekühlt. Währenddessen erfolgte das Vorbereiten (Pri-ming) des Chips. Zur Aufreinigung wurden 600 µl Gel in einen Kit – zugehörigen Fil-ter gegeben und 10 min bei 1500 x g zentrifugiert. 65 µl des gefilFil-terten Gels sowie 1 µl Färbelösung wurden zusammenpipettiert, gevortext und für 10 min bei 13000 g zentrifugiert. 9 µl des gefärbten Gels wurden unter Vermeidung von Luftblasenbil-dung in das dafür vorgesehene Well GS eines Standard Sense Eukaryotic Total RNA Chip pipettiert. Der Chip wurde mit dem zugehörigen Programm B1 durch Einlegen in die Priming Station vorbereitet. Anschließend wurden die entsprechenden
Proben-vertiefungen (Wells) wie folgt beladen und anschließend auf der Vortex Station durchmischt:
∗ 9 µl gefärbtes Gel in das zweite Well GS
∗ 9 µl gefiltertes Gel ins Well G
∗ 5 µl Loading Puffer in die Probenwells 1-12 sowie ins Well L
∗ 1 µl denaturierter Standard ins Well L
∗ Je 1µl denaturierte Proben – RNA in die Probenwells 1-12
Der Messlauf in der Electrophorese Station musste maximal 5 min nach dem Bela-den des Chips gestartet werBela-den.
Am Ende eines Laufs gibt die Software neben den Gelen und Elektropherogrammen für jede Probe den RNA-Gehalt (ng/µl) und einen Qualitätsindex aus (RQI, RNA Qua-lity Indicator). Dabei erfolgt die Einteilung in Qualitätsstufen laut Hersteller in schlecht (RQI 0 - 3,9), akzeptabel (RQI 4,0 - 6,9) und gut (RQI 7,0 - 10).
3.6.3 cDNA – Synthese mittels Reverser Transkription
Die nach oben beschriebener Methode extrahierte und quantifizierte RNA wurde mit-tels der reversen Transkription in komplementäre DNA (complementary DNA; cDNA) umgeschrieben (Tabelle 3). Dafür wurden die RNA – Mengen durch Verdünnung in-nerhalb einer Zellart vereinheitlicht.
Es wurde das Enzym SuperScript™ III der Firma Invitrogen verwendet und nach Herstellerprotokoll verfahren. Während der Pipettierschritte wurden die Ansätze auf Eis gehalten, sämtliche Inkubationsschritte erfolgten im Biometra T-Gradient (Bio-metrische Analytik GmbH, Göttingen).
Das errechnete Volumen der Proben – RNA wurde mit 1 µl Random Hexamer Primern (Fermentas) sowie 1 µl 10 mM dNTP in ein Reaktionsgefäß pipettiert. Der Ansatz wurde mit RNAse freiem Wasser auf 13 µl aufgefüllt und für 5 min bei 65°C inkubiert. Dieser Schritt dient der Auflösung der Sekundärstrukturen der RNA.
Reduktionsmittel) sowie 1µl SuperScript™ III zugefügt. Beim nachfolgenden Inkuba-tionsschritt (42°C für 55 min) erfolgte die Reverse Transkription. Die Reaktion wurde durch eine Enzym-Denaturierung über 15 min bei 70°C beendet. So wurde sicherge-stellt, dass keine Enzyme der Umschreibung die nachfolgende PCR beeinflussen.
Die so synthetisierte cDNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei -20°C eingefro-ren.
Tabelle 3: Mastermix für die Reverse Transkriptase
Reagenz Volumen (µl)
Proben-RNA max. 11,0
Random Hexamer Primer 1,0
dNTPs (10 mM) 1,0
RNAse freies H2O ad 13,0
Inkubation: 5 min bei 65°C
5x First Strand Buffer 4,0
RNase OUT ™ 1,0
DTT SuperScript™ III
1,0 1,0 Inkubation: 55 min bei 42°C, 15 min bei 70°C
3.6.4 Plasmiderzeugung für die Herstellung von Standardreihen
Um eine absolute Quantifizierung der vorhandenen PCR – Produkte vornehmen zu können, war der Einsatz von externen Standardverdünnungen notwendig. Entspre-chende Verdünnungen lagen aus vergangenen Arbeiten (KRUEGER 2010) für die Primer der Transkripte PTGS2, IL6 und TNFA vor. Neue Standardreihen für die Pri-mer PPARG1, TNFAIP6, PTX3 und UBB wurden in der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover nach etabliertem Protokoll (SIPKA 2008) hergestellt. Dafür wurden folgende Kits verwendet: Invitrogen TOPO TA cloning® Kit, QIAprep® spin Miniprep Kit, QIAquick® PCR Purification Kit. Die Übertragung erfolgte in einen chemisch kompetenten E. coli Stamm (non – K – 12 Wildtyp, W – Stamm,
III zum Einsatz. Die Vollständigkeit der klonierten Sequenz wurde durch eine Se-quenzierung in einem externen Labor (SEQLAB, Göttingen) validiert.
3.6.5 Prinzip der RT – qPCR
Bei der Polymerase – Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) handelt es sich um eine molekularbiologische Methode zum Nachweis von RNA bzw. DNA.
Wird die PCR zum Nachweis eines Expressionsmuster von RNA verwendet, spricht man von Reverse Transkriptase PCR (RT – PCR), denn vor Ablauf der eigentlichen PCR muss die RNA mittels Reverser Transkriptase in DNA umgeschrieben werden.
Der Reaktionsanstz für eine PCR muss im Wesentlichen einen Vorwärts-Primer, einen Rückwärts-Primer sowie die zu bestimmende DNA enthalten. Die eigentliche PCR beginnt mit einer initialen Erhitzung des Templates auf 95 °C für 10 min. Dies dient der vollständigen Denaturierung der DNA. Nachfolgend wiederholen sich drei Schritte: die Denaturierung (Denaturation), die Primeranlagerung (Annealing) und die Amplifikation (Elongation). Diese drei Schritte bilden einen Amplifikationszyklus, der 40 – 50 mal nacheinander bei ca. 60 °C abläuft.
Der DNA – Nachweis kann qualitativ oder quantitativ erfolgen. Bei der quantitativen RT – PCR (RT-qPCR) wird zwischen konventioneller und Real-Time RT-qPCR un-terschieden.
Bei der Real – Time RT – qPCR handelt es sich um ein Verfahren, das die Amplifika-tion in „Echtzeit“, also nach jedem Zyklus quantifiziert. Dafür lagern sich fluoreszie-rende Farbstoffe (SYBR® Green) in den Doppelbindungen der DNA ein. Nur gebun-dener Farbstoff fluoresziert. Deshalb steht die Intensität der Fluoreszenz in direktem Zusammenhang mit der vorhandenen DNA – Menge. Die Fluoreszenz wird während der ablaufenden Amplifikationszyklen permanent aufgezeichnet. Zu Beginn der Re-aktion wird lediglich eine basale Fluoreszenz registriert. Nach Ablauf einer bestimm-ten Anzahl von Zyklen übersteigt die Fluoreszenz des PCR – Produkts das Basalsig-nal. Diese Zyklenzahl wird Cycle threshold (Ct) genannt und ist ein Wert zur Berech-nung der Kopienanzahl in der Probe. Der Fluoreszenz folgt danach ein exponentieller
Zu diesem Zeitpunkt wird die Reaktion durch Enzymlimitierung und ihre eigenen Produkte inhibiert.
Nach Ablauf der Amplifikationszyklen endet die Reaktion mit einer Temperaturerhö-hung auf 95 °C. Die dabei aufgezeichnete Fluoreszenz beschreibt den Zerfall der amplifizierten DNA – Stränge. Die entstehende Kurve wird Schmelzkurve genannt und darf bei selektiver Amplifikation eines einzigen Produktes nur einen Peak auf-weisen. Eine mehrgipfelige Schmelzkurve deutet darauf hin, dass die genutzen Pri-mer nicht spezifisch an das Zielgen binden.
3.6.6 Primeroptimierung
Für die Untersuchung der Zielgene wurden größtenteils bereits veröffentlichte Pri-mersequenzen benutzt. Eine Liste der Sequenzen mit Angabe der Literaturstelle be-findet sich im Anhang.
Bevor die Proben in der RT – qPCR gemessen wurden, wurde für jeden Primer die optimale Konzentration sowie die optimale Anlagerungstemperatur ausgetestet. Da-für wurden Forward- und Reverse-Primer in unterschiedlichen Verhältnissen mitei-nander kombiniert (Abbildung 8). Diese Optimierung wird vom Hersteller (Firma MWG, Ebersberg) empfohlen. Als optimale Kombination wurde jene bestimmt, die in der RT – qPCR die beste Effizienz der externen Standardkurve (= hohe Sensitivität) bei möglichst niedriger Fluoreszenz in der Negativkontrolle (= hohe Spezifität) zeigte.
Anschließend wurde die gewählte Primerkonzentration in einer konventionellen PCR mit unterschiedlichen Temperaturen (56 / 60 / 62 °C) für den Anlagerungsschritt lau-fen gelassen. Auf dem nachfolgend angefertigten Gel konnte anhand der Ausprä-gung und Form der Bande die optimale Temperatur ermittelt werden. Die Bande mit höchster Intensität (= hohe Sensitivität) und klarer Zentrierung (= hohe Spezifität) wurde ausgewählt. Alle in dieser Arbeit verwendeten Primerpaare zeigten die beste Bande bei einer Anlagerungstemperatur von 60 °C.
Abbildung 8: Primermatrix für die Ermittlung des optimalen Primerverhältnisses
3.6.7 Durchführung der RT – qPCR
Für die Durchführung der quantitativen Genexpressionsanalyse wurde das StepOnePlus® Real – Time PCR System (Applied Biosystems, Darmstadt) mit zuge-höriger Software (StepOne™ Software 2.0, Applied Biosystems, Darmstadt) genutzt.
Das Reaktionsgemisch setzte sich aus Proben-cDNA, Vorwärts-Primer, Rückwärts-Primer, SYBR® Green und RNase freiem H2O zusammen (Tabelle 4 – 7). Die genaue Zusammensetzung ist in den Tabellen 4 – 7 dargestellt. Pro Reaktionsplatte wurde ein Gen mit allen Proben einer Zellart im Doppelansatz gemessen. Zusätzlich liefen eine Standardverdünngsreihe des linearisierten Messplasmids (102-106 Kopien) so-wie die Negativkontrollen (H2O) jeweils im Doppelansatz mit.
Tabelle 4: Mastermix für die quantitative PCR (PPARG1, PTX3, TNFAIP6, UBB)
Reagenz Volumen (µl) SYBR® Green 12,50
Vorwärts-Primer (5 µmol/L) 1,50
Rückwärts-Primer (5 µmol/L) 0,25
cDNA 1,00 RNAse freies H2O ad 25,00
50 300 900
300 900
Rückwärts – Primer (nmol/L)
Tabelle 5: Mastermix für die quantitative PCR (IL6)
Reagenz Volumen (µl) SYBR® Green 12,50
Vorwärts-Primer (5 µmol/L) 1,50
Rückwärts-Primer (5 µmol/L) 1,50
cDNA 1,00 RNAse freies H2O ad 25,00
Tabelle 6: Mastermix für die quantitative PCR (TNFA)
Reagenz Volumen (µl) SYBR® Green 12,50
Vorwärts-Primer (5 µmol/L) 1,50
Rückwärts-Primer (5 µmol/L) 4,50
cDNA 1,00 RNAse freies H2O ad 25,00
Tabelle 7: Mastermix für die quantitative PCR (PTGS2)
Reagenz Volumen (µl) SYBR® Green 12,50
Vorwärts-Primer (5 µmol/L) 4,50
Rückwärts-Primer (5 µmol/L) 1,50
cDNA 1,00 RNAse freies H2O ad 25,00
Das Temperturregime beinhaltete eine initiale Erhöhung der Temperatur auf 95 °C für 10 min. Dem folgten 40 biphasische Zyklen mit 95 °C für 15 sec und der bei der Primeroptimierung ermittelten Anlagerungstemperatur für 60 sec. Während dieser Amplifikationszyklen wurde die Fluoreszenz gemessen (Tabelle 8).
Tabelle 8: Temperaturzyklen für die quantitative PCR
Prozess Temperatur (°C) Zeit Denaturierung 95 15 s
Anlagerung der Primer und Elongation 60 60 s
Abschließend wurde eine Schmelzkurve erstellt, die zur Bewertung der PCR – Quali-tät hinzugezogen werden konnte. Bei einer kontinuierlichen Temperatursteigerung von 0,3 °C pro 10 sec über das Temperaturspektrum 60 bis 95 °C konnte durch per-manente Fluoreszenzaufzeichung der Zerfall der PCR – Produkte dokumentiert wer-den.
3.6.8 Berechnung der absoluten Kopienzahl
Die systemzugehörige Step One™ Software v2.0 (Applied Biosystems, Darmstadt) zeichnet zu den benannten Zeitpunkten die Fluoreszenzintensität für jeden einzelnen Ansatz auf. Dadurch wird für jeden Ansatz ein Ct – Wert bestimmt. Durch das loga-rithmische Auftragen der Ct – Werte der Standardreihe gegen die bekannte Kopien-anzahl entsteht eine Regressionsgrade. Anhand dieser Gerade wird von der Soft-ware für jeden unbekannten Ansatz (Probe) eine Kopienzahl (Copy Number) errech-net. Die Angabe einer Kopienzahl pro Menge eingesetzter RNA bezeichnet man als absolute Quantifizierung.
Als Kriterien eines auswertbaren PCR – Laufs wurden die Qualität der Schmelzkur-ve, die Effizienz sowie das Bestimmtheitsmaß (R²) überprüft. Die Schmelzkurve vali-diert die Spezifität der Amplifikation, während R² Rückschlüsse auf den linearen Zu-sammenhang zwischen Ct – Wert und Kopienzahl ziehen lässt. Die Effizienz beträgt 100 % wenn die Steigung der Regressionsgrade -3,32 beträgt. In diesem Fall, dem Optimalfall, verdoppelt sich das Produkt in jedem Zyklus. Nur bei einer eingipfligen Schmelzkurve, einer Effizienz von 100 % ± 10 % sowie einem Bestimmtheitsmaß R²
≥ 0,985 kann von einer spezifischen Amplifikation und exakten Berechnung der Ko-pienzahlen ausgegangen werden. Im Doppelansatz einer Probe wurde eine