Hormonbestimmung im peripheren Blut

Analysiert wurden pro Tier zwei Plasmaproben (Abbildung 48). Die Entnahmezeit-punkte entsprachen ungefähr dem Zeitpunkt der Behandlung (Blutprobe A) und dem der Probengewinnung (Blutprobe B). Progesteron (Tabelle 39) und Gesamtöstrogen (Tabelle 40) wurden quantitativ bestimmt.

BMP15

CyclinB1 CDK1

c-Mos

ZAR1

PCNA

MAPK1

GDF9

Abbildung 48: Progesteron- und Gesamtöstrogengehalte pro Tier im peripheren Blut zu den Zeitpunkten A (Behandlung) und B (Probengewinnung)

Gemittelt über die gesamte Tiergruppe, ergab sich zum Zeitpunkt der Behandlung (Zeitpunkt A) unter Anwendung des Wilcoxon signed rank Tests ein signifikant höhe-rer Gesamtöstrogengehalt im peripheren Blut als zum Zeitpunkt der Probengewin-nung (Zeitpunkt B) (Abbildung 49). Dementsprechend ist das Gesamtöstrogen – Progesteron – Verhältnis (Tabelle 41) zum späteren Zeitpunkt signifikant niedriger als zum früheren Zeitpunkt (Abbildung 50).

Abbildung 49: Gesamtöstrogengehalt im Blut zu den Zeitpunkten A (Behandlung) und B (Pro-bengewinnung), n = 7, * p = 0,02

Abbildung 50: Gesamtöstrogen – Progesteron – Verhältnis zum Zeitpunkt A (Behandlung) und B (Probengewinnung), n = 7, * p = 0,05

Tabelle 39: Kennzahlen des Progesterongehaltes im peripheren Blut zu den Zeitpunkten A (Behandlung) und B (Probengewinnung), ng/ml, n = 7

Min Med Max MW ±SD

Zeitpunkt A (Behandlung) 0,7 2,2 3,1 1,9 0,7

Zeitpunkt B (Probengewinnung) 1,0 1,7 3,2 1,9 0,7

Min: Minimum, Med: Median, Max: Maximum, MW: Mittelwert, ±SD: Standardabweichung

Tabelle 40: Kennzahlen des Gesamtöstrogengehaltes im peripheren Blut zu den Zeitpunk-ten A (Behandlung) und B (Probengewinnung), ng/ml, n = 7

Min Med Max MW ±SD

Zeitpunkt A (Behandlung) 19,8 49,8 59,5 48,7 14,9

Zeitpunkt B (Probengewinnung) 12,2 25,5 35,4 24,7 7,3

Min: Minimum, Med: Median, Max: Maximum, MW: Mittelwert, ±SD: Standardabweichung

Tabelle 41: Gesamtöstrogen – / Progesteron – Verhältnis pro Tier zu den Zeitpunkten A

* Angegeben ist der Quotient Gesamtöstrogen (pg/ml) / Progesteron (ng/ml)

5 Diskussion

Die erfolgreiche Anwendung der künstlichen Besamung zeigt, dass die Anwesenheit größerer Volumina Seminalplasma für eine Trächtigkeit nicht zwingend erforderlich ist. Dennoch gibt es Hinweise, dass die Chancen einer erfolgreichen Befruchtung und eines ungestörten Trächtigkeitsverlaufs durch Seminalplasma verbessert werden können (ROBERTSON 2005). Überwiegend wird in der Literatur die Ansicht vertre-ten, dass die intrauterine Applikation von Ejakulaten oder deren Bestandteilen in den Uterus – durch Bedeckung oder künstliche Besamung – eine lokale, inflammatori-sche Reaktion provoziert (ROBERTSON 2007). Diese Annahme beruht in erster Li-nie auf dem Nachweis massiver Leukozyteninfiltration post inseminationem (BISCHOF et al. 1994, O´LEARY et al. 2004). In den vergangenen Jahren wurde in verschiedenen Ansätzen die Hypothese gefestigt, dass die Effekte auch die Ovar-funktion betreffen (O`LEARY et al. 2006). Ein Indiz dafür ist beispielsweise die Vor-verlegung der Ovulation beim Schwein (WABERSKI et al. 1995).

Verschiedene Autoren äußerten unterschiedliche Ideen bezüglich des zugrunde lie-genden Mechanismus: CLAUS (1990) beschrieb eine durch Östrogene des Seminal-plasmas gesteigerte Prostaglandinsynthese im Uterusepithel. Diese Prostaglandine könnten via Counter current Transfer zum Ovar transportiert werden und sich dort in der Follikelflüssigkeit anreichern. O`LEARY et al. (2006) hingegen halten es für ur-sächlich, dass nach Seminalplasmakontakt des Uterus im Ovargewebe vierfach mehr Leukozyten (vorrangig aktivierte Makrophagen und dendritische Zellen) nach-gewiesen werden konnten als bei unbesamten Kontrolltieren. Sowohl der Prostag-landinanstieg im Follikel, als auch der Leukozyteninflux ins Ovar gelten als wichtige ovulationsbeteiligte Ereignisse (BRÄNNSTRÖM u. NORMAN 1993, HUNTER u.

POYSER 1985).

Bisherige Studien, die die Immunreaktion des Uterus auf die Besamung als klassisch inflammatorisch identifizierten, stützen sich weitgehend auf zelluläre Nachweise. Da-bei steht der Influx von Lymphozyten, polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten

Um Effekte auf molekularer Ebene nachzuvollziehen, wurden in der vorliegenden Studie Genexpressionsstudien in verschiedenen Zielzellen durchgeführt. Der Arbeit liegt die Hypothese zugrunde, dass intrauterin appliziertes Seminalplasma das Tran-skriptionsmuster ausgesuchter immun- und follikelreifungsassoziierter Gene im weib-lichen Genitaltrakt beeinflusst. Im Gegensatz zu einer Parallelstudie, die die Effekt nach Kurzzeitexposition (zwei Stunden) beschreibt (BÖLLING 2012), wurde in der vorliegenden Arbeit die Seminalplasmawirkung 17 Stunden nach Applikation unter-sucht.

Zur Überprüfung dieser Hypothese fand ein In – vivo – Tiermodell Anwendung, bei dem unter chirurgischer Intervention gepooltes, porcines Seminalplasma in ein Ute-rushorn appliziert wurde. Das kontralaterale UteUte-rushorn stand nach Applikation von PBS als Kontrollseite zur Verfügung. Mit diesem In – vivo – Modell konnten tierindivi-duelle Einflussfaktoren minimiert und somit die Zahl der Versuchstiere begrenzt wer-den. Hervorzuheben ist die Verwendung spontan östrischer Jungsauen. Auf zyklus-synchronisierende oder ovulationsinduzierende Hormongaben wurde verzichtet, um möglichst physiologische Versuchsbedingungen zu schaffen. Frühere Arbeiten wei-sen darauf hin, dass eine exogene Zyklusstimulation den ovulationsinduzierenden Effekt von Seminalplasma überlagert: Mit hCG behandelte Jungsauen zeigten keine Ovulationsvorverlegung nach transzervikaler Seminalplasmaapplikation (SOEDE et al. 1998).

Das einzige durch Seminalplasma regulierte Transkript war 17 h nach der Applikation PTGS2 im Epithel des Uterus. Nach Seminalplasmakontakt war die PTGS2 – Ex-pression signifikant niedriger als im Epithel der Kontrollseite.

Ähnliches wiesen TAYLOR et al. (2009) in Genexpressionsstudien bei zyklussyn-chronisierten Jungsauen nach, die drei Stunden nach intrauteriner Infusion durchge-führt wurden: während eine Androhep™ – Applikation (kommerzieller Samenverdün-ner) die PTGS2 – Expression im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle signifikant erhöhte, blieb die PTGS2 – Expression nach Seminalplasma – Infusion auf dem Ni-veau der Kontrollgruppe. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der

Expressions-schaften des Androhep™ nicht ausgeschlossen werden konnten. Ausgehend von der Beobachtung, dass die PTGS2 – Expression nach Seminalplasmaapplikation dem Kontrollniveau entspricht, ist auf das Vorhandensein einer immunsuppressiven Kom-ponente im Seminalplasma zu schließen, die eine volumeninduzierte Hochregulation des Transkripts verhindert oder diese wieder auf Basisniveau herunterreguliert. Ein potentieller Volumeneffekt war zuvor schon von MATTHIJS et al. (2003) beschrieben worden. Dort wurde nachgewiesen, dass nicht die Anwesenheit von Samenverdün-ner oder Seminalplasma im Speziellen, sondern die intrauterine Instillation eiSamenverdün-ner Flüssigkeit den Influx polymorphkerniger Leukozyten auslöst. Schlussendlich ist das Auslösen eines Volumeneffekts mit den Ergebnissen der vorliegenden Studie nicht zu beurteilen, da keine unbesamte Kontrollgruppe zur Verfügung stand. Unabhängig davon konnte aber nachgewiesen werden, dass Seminalplasma die PTGS2 – Ex-pression – ausgehend vom Ausgangsniveau oder einem durch Volumeneffekte hoch-regulierten Level – hemmt.

Das untersuchte Zieltranskript PTGS2 codiert für das Enzym Prostaglandin – Endop-eroxide Synthase 2 (synonym Cyclooxygenase 2), welches ubiquitär in geringen Do-sen vorkommt. PTGS2 spielt eine Schlüsselrolle in der Umwandlung der Arachidon-säure in biologisch wirksame Prostaglandine (SIROIS et al. 2004). Endogene Stimuli wie Zytokine und Wachstumsfaktoren steigern die Synthese schnell und um ein Viel-faches. Prostaglandine wirken in physiologischen und pathophysiologischen Abläu-fen mit, beispielsweise Fieber, Schmerz, Entzündung, Thrombose und Vasodilatation (CHANDRASEKHARAN u. SIMMONS 2004). Die Beteilung von Prostaglandinen in der Regulation der Ovarfunktion wurde bereits in den 1970ern beschrieben (ARM-STRONG u. GRINWICH 1972, ORCZYK u. BEHRMAN 1972, zitiert in ARM(ARM-STRONG 1981), später auch explizit für das Schwein (AINSWORTH et al. 1979). Generell gilt PTGS2 als proinflammatorisch und wird deshalb als einer der klassischen Entzün-dungsmediatoren angesehen.

Die Hemmung der PTGS2 – Expression durch Seminalplasma 17 h nach Applikation impliziert eine immunsuppressive Wirkung auf das Uterusepithel.

ELLERNDORFF (1985) im Rosetten – Inhibitions – Test verminderte spontane Ro-settenformation zwischen Lymphozyten und Erythrozyten nachweisen, was als Be-stätigung der Immunsuppression gedeutet wird. Außerdem inhibiert porcines Semi-nalplasma laut ROZEBOOM et al. (2001) die chemotaktische Aktivität der neutrophi-len Granulozyten in vitro und verhindert somit die weitere Rekrutierung von Entzün-dungszellen. Immunsuppressive Effekte sind auch für andere Tierarten beschrieben:

TROEDSSON et al. (2001) zeigten, dass 24 h nach Besamung im equinen Uterus weniger polymorphkernige neutrophile Granulozyten nachgewiesen werden konnten, wenn die Besamungsportion Seminalplasma enthielt. Sechs und zwölf Stunden nach Applikation ergab sich kein Unterschied für Seminalplasma – haltige und – freie Por-tionen. Die Autoren schlussfolgern, dass Seminalplasma die uterine Entzündungspe-riode nach Insemination verkürzt.

Sowohl JUNGE – KRAEMER (2012) als auch BÖLLING (2012) konnten jeweils zwei Stunden nach Seminalplasmaapplikation keinen Einfluss auf die PTGS2 – Expres-sion im Uterus von Jungsauen nachweisen. BÖLLING (2012) bediente sich dabei ei-nes der vorliegenden Studie nahezu identischen Tiermodells, bei dem lediglich die Zeitspanne zwischen Behandlung und Probengewinnung verändert wurde. Bei JUNGE – KRAEMER (2012) hingegen kamen in einer Microarray – Studie synchro-nisierte Jungsauen zum Einsatz, deren Uteri nach transzervikaler Besamung und an-schließender Schlachtung gewonnen wurden. Dabei wurden neben PTGS2 insge-samt 361 weitere immunassoziierte Transkripte untersucht. Wie in der vorliegenden Studie waren dabei IL6, PTX3, TNFA und PPARG1 enthalten. TNFAIP6 wurde nicht, dafür aber TNFAIP2 untersucht. Im direkten Vergleich der Kontrollgruppe mit der Seminalplasma – behandelten Gruppe wurde für keines der 362 eine differentielle Genregulation nachgewiesen.

Im Widerspruch dazu und zum Ergebnis der vorliegenden Arbeit stehen Studien von O`LEARY et al. (2004). Uterusgewebe synchronisierter Jungsauen wurden 34 h nach Seminalplasmaapplikation bzw. PBS – Kontrollinfusion diversen Genexpressionsstu-dien unterzogen. Für PTGS2, TNFA und IL6 konnte eine höhere Expressionsrate bei jenen Tieren, die Seminalplasma erhalten hatten, nachgewiesen werden. Die

Ex-Die unterschiedlichen Ergebnisse mögen auf eine zeitabhängige Dynamik der nalplasmawirkung hindeuten. Je nachdem, wie lang das Zeitintervall zwischen Semi-nalplasmakontakt und Probengewinnung gewählt wurde, scheinen sich die Effekte zu unterscheiden.

Eine alternative Erklärung für die unterschiedlichen Ergebnisse liefern Genexpres-sionsstudien an uterinen Stroma- und Epithelzellkulturen (MADEJ et al. 2011). Porci-nes Seminalplasma inhibierte die PGFM –, PGE2 – und PGF2α – Produktion in uteri-nen Epithelzellen sowohl nach drei als auch nach 24 h. Dagegen konnten in Zellkul-turen aus porcinen, uterinen Stromazellen 3,7 bis 8,6-fach höhere PGF2α – Werte festgestellt werden (MADEJ et al. 2011). Dieses Ergebnis unterstreicht die Wichtig-keit, Epithel- und Stromazellen in Genexpressionsanalysen möglichst präzise zu trennen. Die in der vorliegenden Studie angewandte Laser Microdissection ist die derzeit spezifischste Methode dafür. Unter mikroskopischer Kontrolle konnten defi-nierte Epithelzellen isoliert werden. Eine Verunreinigung der Proben durch Zellen an-liegender Gewebeschichten wurde dadurch weitgehend minimiert. Lediglich der Ein-fluss potentiell vorhandener residenter Immunzellen konnten nicht ausgeschlossen werden. Die Untersuchung dieser Zusammenhänge ist Gegenstand einer laufenden Folgearbeit.

Dass der Uterotubalen Verbindung (UTV) im Rahmen der Ovulationsvorverlegung durch Seminalplasma eine besondere Bedeutung zukommt ist bekannt: Der ovulati-onsfördernde Effekt wird nur ausgelöst, wenn das Seminalplasma Kontakt zur UTV erhält (WABERSKI et al. 1999). Außerdem ist der Leukozyteninflux mit einer deutlich höheren Anzahl MHC Klasse II positiver Zellen in der UTV besonders ausgeprägt (WABERSKI et al. 2006). In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Genexpression der UTV vergleichend zum Uterushorn untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass alle Transkripte im Uterusepithel höher exprimiert waren als im gleichseitigen Epithel der UTV. Zum gleichen Ergebnis kam auch BÖLLING (2012) in der Parallelstudie, in der die Probenentnahme zwei Stunden nach Seminalplasmaapplikation durchgeführt

regulation werden somit bestätigt, ohne dass ein direkter Seminalplasma – Einfluss nachweisbar war.

Ebenso zeigte sich im Vergleich der behandelten mit der Kontrollseite kein Einfluss des Seminalplasmas auf die Genexpression in Kumulus- und Granulosazellen. Glei-ches gilt für die Expression der Zieltranskripte in den Oozyten. Dabei scheint die Zeitdynamik eine untergeordnete Rolle zu spielen, denn zwei Stunden nach Semi-nalplasmakontakt wurden ebenfalls keine Unterschiede nachgewiesen (BÖLLING 2012).

In Einklang mit den Ergebnissen von BÖLLING (2012) konnte TNFA in der RT – qPCR der Granulosa- und Kumuluszellen nicht nachgewiesen werden. Gleich galt für IL6 und PPARG1 in den Kumuluszellen. Unter Anwendung eines ähnlichen Tier-modells injizierte KRÜGER (2009) TNFA in die Ovararterie, konnte aber 45 min spä-ter im Ovargewebe ebenfalls die Nachweisgrenze für TNFA auf Transkriptebene nicht erreichen.

Innerhalb von zwei Stunden nach Seminalplasma – Applikation konnte BÖLLING (2012) keinen Hinweis auf im Seitenvergleich differentielle Genexpression aufzeigen.

Es ergaben sich durch Korrelationen zwischen Genexpressionsstärken innerhalb der behandelten Seite jedoch Hinweise auf regulative Funktionen des Seminalplasmas, die die Kommunikation zwischen Uterus und Ovar betreffen. Dieser Einfluss konnte in der vorliegenden Arbeit 17 h nach Seminalplasmakontakt nicht festgestellt werden.

Jedoch ließen sich zu diesem Zeitpunkt verstärkt Korrelationen innerhalb der Follikel der behandelten Seite nachweisen. Auf der Seminalplasma – Seite stand die TNFAIP6 – Expression in den Granulosazellen mit fünf von acht maturationsassozi-ierten Oozytentranskripten in engem korrelativem Zusammenhang. Seminalplasma scheint demnach die Synchronisation zwischen Granulosa- und Oozytentranskripten zu induzieren. Die Tatsache, dass es sich dabei um negative Korrelationen handelt, fügt sich dabei schlüssig in das Gesamtbild: Niedrige TNFAIP6 – Genexpressionsra-ten sind wenige Stunden vor Ovulation festgestellt worden. Diese Zusammenhänge wurden von NAGYOVA et al. (2009) untersucht. In einer kombinierten In – vivo – /

einer Verabreichung von 500 IU eCG an Tag 15 des Zyklus nach 66 Stunden die Applikation von 500 IU hCG folgte. Nach Schlachtung wurden die Granulosazellen aus Tertiärfollikeln (≥ 6 mm) isoliert und mittels RT – PCR auf ihren TNFAIP6 – Ge-halt überprüft. Schlacht- und somit Beprobungszeitpunkte waren 66 h nach eCG so-wie vier, acht, 16, 24 und 32 h nach hCG. Der TNFAIP6 – Verlauf zeigte dabei eine Kurve mit niedrigster Expression vor der hCG – Behandlung. Das Plateau der stärks-ten Expression wurde innerhalb von vier bis 16 h nach hCG erreicht. Der stetige Ab-fall der TNFAIP6 – Expression zu den Zeitpunkten 24 h und 32 h repräsentiert den Zeitraum der maximalen Kumulusexpansion. Zu diesem Zeitpunkt wäre laut Hor-monprogramm die Ovulation zu erwarten gewesen.

TNFAIP6 gilt als eines der Proteine, die essentiell für die Formation und Stabilität der Matrix im Kumulus – Oozyten – Komplex sind (FULOP et al. 2003). NAGYOVA et al.

(2008) wiesen TNFAIP6 in expandierenden Kumulus – Oozyten – Komplexen nach und konnten feststellen, dass dieses Protein als Katalysator in der Hyaluronsäureak-tivierung dient. Nach Angaben von ASSIDI et al. (2008) kann es auch als Qualitäts-marker für die Entwicklungskompetenz der Oozyte gewertet werden.

BÖLLING (2012) bestätigte in der Parallelstudie, dass ovulationsnah eine niedrige TNFAIP6 – Expressionsrate vorliegt. Die Ergebnisse ließen eine Gruppierung der Versuchstiere bezüglich der PTGS2 –, PTX3 – und TNFAIP6 – Expression zu, die im Zusammenhang mit dem Hormonprofil im peripheren Blut zum Zeitpunkt der Pro-bengewinnung stand. Die Tiere mit einem niedrigen Östrogen – / Progesteron – Ver-hältnis, das ein fortgeschrittenes Zyklusstadium in Ovulationsnähe signalisiert (NO-GUCHI et al. 2010), exprimierten auffallend viel PTGS2 und PTX3, während die TNFAIP6 – Expression teilweise unterhalb der Nachweisgrenze blieb. Tiere der an-deren Gruppe, die demnach zu einem früheren Zeitpunkt im Östrus behandelt und beprobt wurden, zeigten eine gegenläufige Expression: hohe TNFAIP6 – Expression bei vergleichsweise niedriger PTGS2 – und PTX3 – Expression. Aufgrund des spä-teren Beprobungszeitpunktes müssten die Tiere der vorliegenden Studie mit denen der ersten Gruppe aus o. g. Studie (BÖLLING 2012) vergleichbar sein. Das spiegelt

Korrelation der Oozytentranskripte mit der TNFAIP6 – Expression in den Granu-losazellen könnte also Folgendes vermutet werden: a) je niedriger die Expression von TNFAIP6 in den Granulosazellen und b) je höher die Expression von CyclinB1 / CDK1 / PCNA / GDF9 / BMP15 in der Oozyte, desto näher befindet sich das Tier am Ovulationszeitpunkt. Das Vorhandensein einer negativen Korrelation der Expres-sionsstärken von TNFAIP 6 in den Granulosazellen und der maturationsassozierten Eizelltranskripte auf der behandelten Seite impliziert eine seminalplasmainduzierte fortgeschrittene Synchronisation der Genexpression im präovulatorischen Follikel.

Inwieweit dies einer Ovulationsinduktion zuzuordnen ist, bleibt an dieser Stelle spe-kulativ.

Unabhängig vom Behandlungseffekt korreliert die Expression des PTGS2 jeweils in den Granulosa- und den Kumuluszellen mit der Expression des PTX3, sowohl inner-halb der behandelten als auch innerinner-halb der Kontrollseite. Gleiches wies auch BÖLLING (2012) in der Parallelstudie nach. Sowohl PTGS2 als auch PTX3 werden über den SMAD2 – Signalweg aktiviert und sind essentiell für die Kumulusexpansion (DIAZ et al. 2007, Maus). Das biologische Zusammenspiel dieser beiden Transkripte ist somit bekannt und konnte in diesen Studien bestätigt werden.

Bei näherer Betrachtung der Expressionsstärken in den Oozyten der Einzeltiere fällt eine sehr breite Spannweite auf. Die relativen Expressionstärken reichen beispiels-weise für GDF9 von 3,2 bis 111,7 auf der Kontrollseite. Abgesehen von ZAR1 konn-ten aber für jedes Transkript auf Einzeltierebene hohe Korrelationen zwischen der Expressionsstärke der Behandlungs- und der Kontrollseite hergestellt werden. Es ist somit davon auszugehen, dass ausgeprägte Unterschiede in den Expressionsstär-ken zwischen den Tieren bestehen; die Variabilität zwischen Oozyten desselben Tie-res scheint aber gering zu sein.

Außer ZAR1 scheinen alle Oozytentranskripte über ein Netz von Korrelationen mitei-nander verschaltet zu sein. Auffällig ist hierbei, dass deutlich mehr korrelative Zu-sammenhänge auf der mit Seminalplasma behandelten Seite bestehen als auf der

Kontrollseite. Dies mag als Hinweis für regulative Eigenschaften intrauterin applizier-ten Seminalplasmas auf Oozyapplizier-tenebene gelapplizier-ten.

Schlussfolgerung

Die Hypothese, dass intrauterin appliziertes Seminalplasma die Regulation immun- und follikelreifungsassoziierter Transkripte beeinflusst, konnte in der vorliegenden Studie bestätigt werden. Dabei steht 17 h nach Applikation die reduzierte Expression von PTGS2 im Uterusepithel im Vergleich zur Kontrollseite im Vordergrund.

Darüber hinaus geben korrelative Beziehungen Hinweise darauf, dass Seminalplas-ma die Kommunikation zwischen Granulosazellen und Oozyten sowie die Genex-pression innerhalb der Oozyte reguliert.

Tenor der gegenwärtigen Literatur ist – und darin lässt sich das Ergebnis der vorlie-genden Studie einordnen – dass die Immunantwort des Uterus auf Seminalplasma nicht länger ausschließlich als klassisch inflammatorisch angesehen werden kann.

Im Seminalplasma scheinen immunsuppressive Komponenten enthalten zu sein, de-ren Wirkung in den ersten 24 h nach Besamung dominiert. Die Einbeziehung anderer aktueller Studien lässt auf eine zeitliche Dynamik der Seminalplasmawirkung schlie-ßen.

6 Zusammenfassung

NITZ, Jana Katarin:

Charakterisierung ausgewählter Genexpressionsmuster im porcinen Uterus und Ovar nach unilateraler, intrauteriner Infusion von Seminalplasma

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Expressionsmuster ausgewählter immun- und follikelreifungsassoziierter Transkripte im Uterus und Ovar östrischer Jungsauen zu untersuchen, nachdem diese eine unilaterale intrauterine Seminalplasmainfusion erhalten hatten.

Dazu fand ein In – vivo – Tiermodell Anwendung, bei dem unter chirurgischer Inter-vention gepooltes, porcines Seminalplasma in ein ligiertes Uterushorn appliziert wur-de. Das kontralaterale Uterushorn stand nach Applikation von PBS als Kontrollseite zur Verfügung. Von sieben spontan östrischen Jungsauen wurden 17 h nach o. g.

Behandlung folgende Proben gewonnen: Uterusepithel, Epithel des uterinen Anteils der UTV, Granulosazellen, Kumuluszellen und Oozyten. Nach unterschiedlicher Auf-bereitung folgten Genexpressionsstudien mittels RT – qPCR für sechs Zielgene:

Prostaglandin – Endoperoxide Synthase 2 (PTGS2), Pentraxin 3 (PTX3), Tumor Ne-crosis Factor Alpha – Induced Protein 6 (TNFAIP6), Tumor NeNe-crosis Factor Alpha (TNFA), Interleukin 6 (IL6) und Peroxisome Proliferator – Activated Receptor Gamma 1 (PPARG1). Außerdem wurde die Expression des potentiellen Referenzgenes por-cines Ubiquitin B (UBB) gemessen. Aufgrund der nicht stabilen Expression in der vorliegenden Studie wurde UBB allerdings nicht als Referenzgen, sondern lediglich als Positivkontrolle gewertet. In den Oozyten wurden abweichend die Expressions-stärken der spezifischen Transkripte c – Mos, Bone Morphogenic Protein 15 (BMP15), Growth Differentiation Factor 9 (GDF9), CyclinB1, Cyclin – Dependent Kinase 1 (CDK1), Mitogen - Activated Protein Kinase 1 (MAPK1), Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) und Zygote Arrest Gene 1 (ZAR1) untersucht.

Im Epithel des Uterus wurde 17 h nach Seminalplasmaappikation signifikant weniger

len und -transkripte konnte kein Einfluss des Seminalplasmas auf die Expressions-stärke im Vergleich zur Kontrollseite nachgewiesen werden (p > 0,05). Die Transkrip-te PTGS2, TNFA und TNFAIP6 wurden im Epithel des UTranskrip-terus höher exprimiert als im Epithel des uterinen Anteils der UTV. Das galt sowohl für die Seminalplasma- als auch für die Kontrollseite. Alle Werte erreichten statistische Signifikanz (p < 0,05), abgesehen von TNFAIP6 auf der Versuchsseite (p = 0,08).

Für zahlreiche Genexpressionsstärken konnten korrelative Zusammenhänge festge-stellt werden.

Innerhalb der Seminalplasmaseite korrelierten folgende Werte: PTGS2 und IL6 in Granulosazellen (r = 0,76; p = 0,05), IL6 und PTX3 in Granulosazellen (r = 0,76; p = 0,05), TNFA im Uterusepithel und IL6 in Granulosazellen (r = 0,76; p = 0,05), PTGS2 im Uterusepithel und in Kumuluszellen (r = - 0,79; p = 0,04), PTGS2 im Uterusepithel und PTX3 in Kumuluszellen (r = - 0,82; p = 0,02)

Innerhalb der Kontrollseite korrelierten folgende Werte: PTGS2 im Uterusepithel und TNFAIP6 im Epithel der UTV (r = 0,79; p = 0,04), TNFAIP6 im Epithel des Uterus und der UTV (r = 0,89; p = 0,01), TNFAIP6 in Granulosazellen und TNFA im rusepithel (r = 0,89; p = 0,01), PPARG1 in Granulosazellen und TNFAIP6 im Ute-rusepithel (r = 0,86; p = 0,01), IL6 in Granulosazellen und TNFAIP6 im Epithel der UTV (r = 0,78; p = 0,04); IL6 in Granulosazellen und PTGS2 im Epithel der UTV (r = 0,85; p = 0,01).

IL6 in Granulosazellen korrelierte sowohl auf der Seminalplasmaseite (r = 0,78; p = 0,04) als auch auf der Kontrollseite (r = 0,88; p = 0,01) mit TNFA im Epithel der UTV.

Ebenso unabhängig von der Behandlung korrelierten PTGS2 und PTX3 in Granu-losazellen und Kumuluszellen (Versuchsseite r = 0,86; p = 0,01; Kontrollseite r = 0,82; p = 0,02).

Bei den relativen Expressionsstärken der Oozytentranskripte, die hohen tierindividu-ellen Schwankungen unterlagen, korrelierten die Seminalplasmaseiten zu ihren je-weiligen Kontrollseiten (r ≥ 0,79; p ≤ 0,04). Lediglich für ZAR1 konnte diese Korrelati-on nicht statistisch abgesichert werden (p > 0,05). Innerhalb der Oozytentranskripte

ausschließlich innerhalb der Kontrollseite korrelierten (r ≥ 0,79; p ≤ 0,04). Zusätzlich lagen für fünf Transkriptpaare Korrelationen auf beiden Seiten vor (r ≥ 0,79; p ≤ 0,04). CyclinB1 (r = - 0,74; p = 0,06), CDK1 (r = - 0,88; p = 0,01), PCNA (r = - 0,79; p

= 0,03), GDF9 (r = - 0,79; p = 0,03) und BMP15 (r = - 0,78; p = 0,04) waren nach Seminalplasmakontakt des ipsilateralen Uterushorns negativ zur Expressionsstärke von TNFAIP6 in den gleichseitigen Granulosazellen korreliert. Auf der Kontrollseite bestand lediglich eine Korrelation zwischen ZAR1 und IL6 in zugehörigen Granu-losazellen (r = 0,85; p = 0,01).

Blutproben, die zu zwei Zeitpunkten aus dem peripheren Blutkreislauf entnommen

Blutproben, die zu zwei Zeitpunkten aus dem peripheren Blutkreislauf entnommen

Im Dokument Charakterisierung ausgewählter Genexpressionsmuster im porcinen Uterus und Ovar nach unilateraler, intrauteriner Infusion von Seminalplasma (Seite 111-175)