3 Material und Methode
11.5 Medikamente und Reagenzien
1 Kb Plus DNA Ladder (10787-026) Invitrogen, Karlsruhe 5x First-Strand-Buffer Invitrogen, Karlsruhe
Agarose (15510-027) Life Technologies, Darmstadt Ampicillin (A-9518) Sigma-Aldrich, Steinheim
Atropinum sulfuricum (Atropinsulfat, 1 %) Eifelfango, Bad Neuenahr-Ahrweiler Borsäurepulver (P-8136) Sigma-Aldrich, Steinheim
Bovines Serum Albumin Frakt. V (A-9647) Sigma-Aldrich, Steinheim Bovines Serum Albumin, FAF (A-7030) Sigma-Aldrich, Steinheim Braunol 2000, Povidon-Jod Braun AG, Melsungen CaCl2 x H20 (C-7902) Sigma-Aldrich, Steinheim Deoxynucleotide Triphosphates (dNTPs) Invitrogen, Karlsruhe DEPC (Diethyl-Pyrocarbonat, 40718) Sigma-Aldrich, Steinheim
D-Glukose (16301) Sigma-Aldrich, Steinheim
Dithiothriol (DTT, 0,1 M) Invitrogen, Karlsruhe dnTPs (NU-0010-50) für Eizellanalyse Eurogentec, Köln
Dulbecco PBS-Pulver (D-5773) Sigma Aldrich, Steinheim Dynabeads® mRNA DIRECT™ Micro Kit
(61021) Invitrogen, Karlsruhe
E.coli Bakterien zur Plasmidklonierung non-
K-12 Wildtyp, W-Stamm ATCC No. 9637 S.A. Waksman EDTA (Ethylendiamine-Tetraacetic Acid;
27270) Sigma Aldrich, Steinheim
Eosin (HAT 110232) Sigma Aldrich, Steinheim
Ethanol 641, absolut, vergällt CG Chemikalien, Laatzen
Ethanol vollständig vergällt SAV Liquid Production, Flintsbach Experion mRNA StdSense (700-7103) BioRad Laboratories, München Gel Star® Nucleic Acid Stain (50535) Lonza, Rockland, Maine, USA Gentamycinsulfat (G-3632) Sigma-Aldrich, Steinheim
®
Hind III Restriktionsenzym aus Haemophilus
influenzae (15207-012) Invitrogen, Karlsruhe
Hostamox® LA Intervet, Unterschleißheim
IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) Invitrogen, Karlsruhe
Isofluran CP® CP Pharma GmbH, Burgdorf
Kaninchen-Globin-mRNA (R1253) Sigma Aldricg, Steinheim LB (Lennox L-broth) Base (00705241) Invitrogen, Karlsruhe LB (Lennox L-broth) Agar (00705091) Invitrogen, Karlsruhe Mastermix (RT-SY2X-06+WOUFL) für
Eizellanalyse Eurogentec
Medizinisches Lachgas in der Druckflasche,
Wirkstoff: Distickstoffmonoxid (1kg Gas Linde Gas Therapeutics GmbH & CO, enthält 980g Distickstoffmonoxid) Unterschleißheim
Metacam® Boehringer Ingelheim, Deutschland
MgCl2 (18067-017) für Eizellanalyse Invitrogen, Karlsruhe mRNA Globin (R1253-20UG) Sigma Aldrich, Steinheim MuLV RT (N8080018) für Eizellanalyse Applied Biosystems, Darmstadt Natriumcitratlösung 3,13 % MediPac, Rheinbreitbach
NaOH (1.09137.1000) Merck
NaOH Nr. 6771.1 Carl Roth, Karlsruhe
Natriumhydrogencarbonat (31437) Sigma Aldrich, Steinheim Natrium-Pyruvat (P-3662) Sigma Aldrich, Steinheim Oligo (dt)12-18 Primer (18418-012) Invitrogen, Karlsruhe PBS-Pulver (D-5773) Sigma Aldrich, Steinheim PCR-Puffer (18067-017) für Eizellanalyse Invitrogen, Karlsruhe Penicillin G (PENK) Sigma Aldrich, Steinheim Primer (N8080127) für Eizellanalyse Applied Biosystems, Darmstadt
Primer forward Eurofins MWG
Primer revers Eurofins MWG
PVA (P-8136) Sigma Aldrich, Steinheim
QIAprep® Spin Miniprep Kit (27104) QIAGEN GmbH, Hilden
QIAquick® PCR Purification Kit (28104) QIAGEN GmbH, Hilden RNAse-Inihibitor (N8080119) für
Eizellanalyse Invitrogen, Karlsruhe
RNaseOUT™ Ribonuclease Inhibitor
(10777-019) Invitrogen, Karlsruhe
RNeasy® Plus Micro Kit (74034) QIAGEN GmbH, Hilden
Sauerstoff, verdichtet in der Druckflasche Linde Gas Therapeutics GmbH & Co, Unterschleißheim
ScaI Restriktionsenzym aus Streptomyces
caespitosus (15436-017) Invitrogen, Karlsruhe
Stereofundin® Infusionslösung Braun Melsungen AG, Melsungen Streptomycinsulfat (S-6501) Sigma Aldrich, Steinheim
Stresnil™ Janssen animal health, Neuss
SuperscriptTM II Reverse Transkriptase
(18064-014) Invitrogen, Karlsruhe
SuperscriptTM III Reverse Transkriptase Invitrogen, Karlsruhe
SYBR® Green PCR Master Mix (4309155) Applied Biosystems, Darmstadt
TCM 199 (M2520) Sigma Aldrich, Steinheim
TOPO TA Cloning® Kit (K 450641) Invitrogen, Karlsruhe
Tris (T-8524) Sigma Aldrich, Steinheim
Ursotamin®, Ketaminhydrochlorid (10 %) Serumwerk Bernburg AG, Bernburg X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-
galactopyranosid) (15520-034) Invitrogen, Karlsruhe
11.6 Rezepte
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gebrauchslösung
Bestell-Nr. 1l 2l
PBS-Pulver Sigma D-5773 9,65g 19,3g
Stocklösung 10ml 20ml
Aqua bidest Ad 1l Ad 2l
PBS-Stocklösung
Bestell-Nr. 500ml
Natrium-Pyruvat Sigma P-3662 1,80g
Streptomycinsulfat Sigma S-6501 2,50g
D-Glukose Sigma 16301 50,00g
CaCl2 x H20 Sigma C-7902 6,65g
Penicillin G Sigma PENK 3,00g
Aqua bidest Ad 500ml
PBS-Complete
Bestell-Nr.
PBS-Gebrauchslösung 500ml
Bovines Serum Albumin Frakt. V
Gentamycinsulfat Sigma G-3632 0,0015g
Natrium-Pyruvat Sigma P-3662 0,0000198g
NaHCO3 Sigma 31437 0,066g
H2O Ampuwa® Fresenius Ad 30ml
Bovines Serum Albumin, FAF
Sigma A-7030 0,03g
266 mosmol; pH 7,2; BSA nach pH-Einstellung dazugeben
11.7 Primersequenzen
Tab. 51: Vorwärts- und Rückwärtssequenzen der untersuchter Transkripte
Transkript Sequenz Länge (bp) Referenz
PTGS2 for ATG ATC TAC CCG CCT CAC AC
Acc. No: Accession-Nummer der Nukleotid-Sequenz der NCBI Gen-Datenbank
Auszüge dieser Arbeit wurden wie folgt bereits der Öffentlichkeit vorgestellt:
Vorträge
Etablierung der Laser – Microdissektion Methode zur Gewinnung porciner Ute-rusepithelzellen für molekularbiologische Studien (Tag des Virtuellen Zentrums für Reproduktionsmedizin Niedersachsen, 13.07.2011, Hannover)
Poster
Influence of intra-uterine seminal plasma infusion on gene expression of transcripts associated with local immune reactions in estrous pigs (46th Annual Conference of Physiology and Pathology of Reproduction, 27.02. – 01.03.2013, Danzig; Abstract in:
Reprod Biol 13(2): 60-61, 2013)
Danksagung
Für die vertrauensvolle Überlassung eines Projektes, das mir eine sehr lehr- und ab-wechslungsreiche Doktorandenzeit beschert hat, gilt mein erster und aufrichtiger Dank Frau Prof. Dr. Dagmar Waberski. Ich bedanke mich für die fachliche und per-sönliche Unterstützung, für eine stets offenstehende Tür, die „lange Lei-ne“, unglaublich schnelle Korrekturen und die Beharrlichkeit auf der Zielgeraden.
Ein ganz besonderer Dank gebührt außerdem Dr. Heiko Henning, von dessen Wis-sen und ständiger Unterstützung diese Arbeit und meine Nerven maßgeblich profitie-ren durften.
Vielen, vielen Dank meiner wissenschaftlich – besseren Hälfte Dr. (!) Alexandra Bölling alias Hanni. Eine bessere Zwillingsschwester hätte ich mir nicht wünschen können!
Ich danke Prof. Dr. Ron Hunter, dessen fachlichen und menschlichen Rat ich sehr schätze.
Für die stets unkomplizierte Bereitstellung der Geräte und Arbeitsplätze sowie viele anregende und konstruktive Diskussionen bedanke ich mich bei Prof. Dr. Hans – Joachim Schuberth, Prof. Dr. Ralph Brehm, Prof. Dr. Christiane Pfarrer und Prof. Dr.
Christine Wrenzycki und ihren Arbeitsgruppen.
Vielen Dank der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die Finanzierung des Pro-jekts.
Bei Sandra Wilkening bedanke ich mich für die PCR der Oozyten, insbesondere die schnelle Aufarbeitung der „Nachzügler“. Ebenso gedankt sei JProf. Dr. Marion
Ein großes Dankeschön geht an Marion Gähle, Dr. Nina Hambruch, Edita Podhajsky und Dr. Anja Sipka für die gründliche Einarbeitung, fachliche und moralische Unter-stützung und das Abwenden der einen oder anderen Katastrophe.
Vielen Dank an unser OP – Team, meine Mitdoktoranden und den Chefassistenten Thomas für zahlreiche Einsätze zu jeder Tages- und Nachtzeit sowie die Tierpfleger für die gewissenhafte Versorgung der Versuchssauen.
Tack så mycket alla på och runt Salsbro Stuteri, särskilt Zofi, LiliAnne och Timo, för en fantastisk sommar 2012.
Für die spontane und schnelle Hilfe im Kampf gegen meinen persönlichen Feind
Word und diverse „Wird schon“s stehe ich in tiefer Schuld bei Alois.
Vielen Dank!
Danke Dir, Hendrik. Du weißt wofür.
Zu guter Letzt gilt mein Dank meiner Erdungsstation im Emsland: Meinen Eltern und meiner Lieblingsschwester Julia – dafür, dass aus mir ein Sonnenkind geworden ist.