Untersuchungen zu Calcium-mobilisierenden Adenin-Nucleotiden in humanen T-Lymphocyten

Volltext

(1)Aus dem Institut für Biochemie und Molekularbiologie I des Zentrums für Experimentelle Medizin des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf. Untersuchungen zu Calcium-mobilisierenden Adenin-Nucleotiden in humanen T-Lymphocyten zur Erlangung des akademischen Grades des. Doktors der Naturwissenschaften. am. Fachbereich Chemie der. Universität Hamburg vorgelegt von. Andreas Gasser aus Krefeld/Nordrhein-Westfalen. 2005.

(2) Eidesstattliche Versicherung. Hiermit erkläre ich an Eides statt, daß ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe verfaßt, keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt und die den benutzten Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe.. Hamburg, den 20. Oktober 2005.

(3) Diese Arbeit wurde in der Zeit vom 01. September 2001 bis zum 31. August 2005 unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. A. H. Guse am Zentrum für Experimentelle Medizin, Institut für Biochemie und Molekularbiologie I: Zelluläre Signaltransduktion, Universität Hamburg, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, durchgeführt.. 1. Gutachter: Prof. Dr. Chris Meier (Universität Hamburg, Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften, Fachbereich Chemie) 2. Gutachter: Prof. Dr. Andreas H. Guse (Universität Hamburg, Fakultät für Medizin). Datum der mündlichen Prüfung: 09. Dezember 2005.

(4) Inhaltsverzeichnis. i. Inhaltsverzeichnis. 1. Einleitung. 1. 1.1. Funktion von T-Lymphocyten im Immunsystem . . . . . . . . . . . . . . . . .. 1. 1.2. Aktivierung von T-Lymphocyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 2. 1.3. Calcium und die Signaltransduktion von T-Lymphocyten . . . . . . . . . . .. 4. 1.3.1. Durch Botenstoffe vermittelte Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 6. 1.3.1.1. myo-Inositol-1,4,5-trisphosphat . . . . . . . . . . . . . . . . .. 7. 1.3.1.2. Cyclische Adenosin-Diphosphoribose . . . . . . . . . . . . . .. 8. 1.3.1.3. Nicotinsäure-Adenindinucleotid-2’-Phosphat . . . . . . . . .. 10. 1.3.2. Einstrom von Calcium aus dem Extrazellulär-Raum . . . . . . . . . .. 12. 1.3.2.1. Speicher-vermittelter Calcium-Einstrom . . . . . . . . . . . .. 13. 1.3.2.2. Speicher-unabhängiger Calcium-Einstrom . . . . . . . . . . .. 14. 1.3.3. Effektorsysteme von Calcium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 14. 1.4. Ionenkanäle der TRP-Familie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 16. 1.4.1. Die Superfamilie der TRP-Ionenkanäle . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 16. 1.4.2. Der Ionenkanal TRPM2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 18. 1.4.2.1. Aktivierung und Regulation von TRPM2 . . . . . . . . . . .. 20. 1.4.2.2. Physiologische Rolle von TRPM2 . . . . . . . . . . . . . . .. 22. 2. Problemstellung. 24. 3. Material und Methoden. 26. 3.1. Geräte und Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 26. 3.2. Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 27. 3.3. Medien, Chemikalien und Reagenzien-Kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 28. 3.4. Puffer und Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 30. 3.5. Kultivierung von T-Lymphocyten der Linien Jurkat und BW5147. . . . . . .. 31. 3.6. Derivatisierung von NAADP mit Chloroacetaldehyd . . . . . . . . . . . . . .. 31. 3.7. Extraktion von Nucleotiden aus T-Lymphocyten . . . . . . . . . . . . . . . .. 32. 3.7.1. NAADP-Extraktion aus Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 32. 3.7.2. Festphasenextraktion zur Aufreinigung der NAADP-Extrakte . . . . .. 33. 3.7.3. ADPR-Extraktion aus Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 33. 3.7.4. Festphasenextraktion zur Aufreinigung von ADPR . . . . . . . . . . .. 34.

(5) Inhaltsverzeichnis. ii. 3.8. HPLC-Techniken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 34. 3.8.1. Analytik von Etheno-NAADP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 34. 3.8.1.1. Gradienten-Elution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 34. 3.8.1.2. Isokratische Elution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 35. 3.8.2. Analytik von ADPR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 36. 3.8.3. Analytik der Umsetzung von NAADP durch ADP-Ribosylcyclase . . .. 37. 3.9. Zyklischer Enzym-Assay zur Quantifizierung von NAADP . . . . . . . . . . .. 38. 3.9.1. Reinigung der verwendeten Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 38. 3.9.2. NADase-Verdau und Umsetzung von NAADP zu NADP . . . . . . . .. 38. 3.9.3. Amplifikations-Reaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 39. 3.10. RT-PCR von TRPM2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 39. 3.10.1. Analyse der Expression von TRPM2 durch RT-PCR . . . . . . . . . .. 39. 3.10.2. Klonierung und Sequenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 41. 3.11. Calcium-Messungen in T-Lymphocyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 42. 3.11.1. Messung der intrazellulären Calcium-Konzentration in Gegenwart von extrazellulärem Calcium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 42. 3.11.2. Direkte Quantifizierung des Calcium-Einstroms . . . . . . . . . . . . .. 43. 3.11.3. Indirekte Quantifizierung des Calcium-Einstroms . . . . . . . . . . . .. 43. 3.12. Zellzahl-Bestimmung bei Behandlung von T-Zellen mit Concanavalin A . . .. 44. 4. Ergebnisse. 45. 4.1. Entwicklung eines analytischen Systems zur Quantifizierung intrazellulärer NAADP-Konzentrationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 45. 4.1.1. HPLC-basierte Analytik von NAADP . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 45. 4.1.1.1. Derivatisierung von NAADP mit Chloroacetaldehyd . . . . .. 46. 4.1.1.2. Optimierung der Derivatisierungsbedingungen . . . . . . . .. 49. 4.1.2. Entwicklung eines gekoppelten Enzym-Assays zur Quantifizierung geringer NAADP-Mengen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 52. 4.1.2.1. Prinzip des NAADP-Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 52. 4.1.2.2. Etablierung der Amplifikations- und Indikator-Reaktion . . .. 53. 4.1.2.3. Umsetzung von NAADP zu NADP . . . . . . . . . . . . . .. 54. 4.1.2.4. Enzymatischer Abbau von NADP durch eine NAD-Glycohydrolase aus Neurospora crassa . . . . . . . . . . . . . . . . .. 55. 4.1.2.5. Untersuchungen zum Einfluß anderer Substanzen auf den Enzym-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 58. 4.1.2.6. Extraktion von NAADP aus T-Lymphocyten . . . . . . . . .. 59. 4.2. Untersuchungen zur Funktion des Ionenkanals TRPM2 und seines Agonisten ADPR bei der Erzeugung von Calcium-Signalen in T-Lymphocyten . . . . . .. 61. 4.2.1. Bestimmung intrazellulärer ADPR-Konzentrationen durch HPLC . . .. 61.

(6) Inhaltsverzeichnis. iii. 4.2.1.1. Entwicklung eines HPLC-Verfahrens zur Quantifizierung von ADPR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 62. 4.2.1.2. Extraktion von ADPR aus T-Lymphocyten . . . . . . . . . .. 63. 4.2.1.3. Festphasenextraktion zur Aufreinigung der Zellextrakte . . .. 65. 4.2.1.4. Untersuchungen zum Abbau von NAD und ADPR während der Zellextraktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 68. 4.2.2. Änderung der zellulären ADPR-Konzentration bei Stimulation von TLymphocyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 69. 4.2.3. Analyse der Expression von TRPM2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 71. 4.2.4. Differenzierung unterschiedlicher Calcium-Einstrom-Wege durch Inhibition mit Gadolinium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 74. 4.2.5. Inhibition der ADPR-Bildung durch Cibacron Blue 3GA . . . . . . . .. 76. 4.2.6. Pharmakologische Charakterisierung der am ConA-vermittelten Calcium-Einstrom beteiligten Signalsysteme . . . . . . . . . . . . . . . . .. 79. 4.2.7. Physiologische Relevanz des ADPR/TRPM2-Systems bei der Apoptose von T-Lymphocyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5. Diskussion der Ergebnisse. 81 83. 5.1. Analytik von NAADP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 83. 5.1.1. HPLC-basierte Analytik von NAADP . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 84. 5.1.2. Quantifizierung von NAADP mit einem Enzym-Assay . . . . . . . . .. 85. 5.1.3. Bestimmung intrazellulärer NAADP-Konzentrationen . . . . . . . . .. 88. 5.2. Funktion von ADPR als Calcium-mobilisierender Botenstoff in T-Zellen . . .. 91. 5.2.1. Quantifizierung intrazellulärer ADPR-Konzentrationen durch HPLC .. 92. 5.2.2. ConA-induzierte Bildung von ADPR . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 96. 5.2.3. Expression von TRPM2 in T-Lymphocyten . . . . . . . . . . . . . . .. 97. 5.2.4. Pharmakologische Charakterisierung der am ConA-vermittelten Calcium-Einstrom beteiligten Signalsysteme . . . . . . . . . . . . . . . . .. 99. 5.2.5. Physiologische Relevanz der ADPR/TRPM2-Systems . . . . . . . . . 102 5.2.6. Regulation des Calcium-Einstroms durch das ADPR/TRPM2-System. 104. 6. Zusammenfassung. 108. 7. Abstract. 110. 8. Danksagung. 112. 9. Literaturverzeichnis. 113. A. Anhänge. I. A.1. Veröffentlichungen und Kongreßbeiträge . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. I. A.2. Gefahrenhinweise und Sicherheitsratschläge für besonders gefährliche Stoffe .. III.

(7) Abkürzungen. iv. Abkürzungen [Ca2+ ]. Konzentration zweiwertiger Calciumionen. [Ca2+ ]i. Konzentration zweiwertiger Calciumionen im Cytosol einer Zelle. 1,N 6 -ε. 1,N 6 -Etheno. 2’-P-ADPR. 2’-Phospho-Adenosin-Diphosphoribose. Abb.. Abbildung. ADP. Adenosindiphosphat. ADPR. Adenosin-Diphosphoribose. ADPRC. ADP-Ribosylcyclase. AMP. Adenosinmonophosphat. APC. Antigen-präsentierende Zelle. ATP. Adenosintriphosphat. A. U.. arbitrary units. bp. Basenpaar. BSA. bovine serum albumin. Ca/CaM. Ca2+ -Calmodulin-Komplex. CAA. Chloroacetaldehyd. CaM. Calmodulin. CaMK. Ca/CaM-abhängige Proteinkinasen. cADPR. zyklische Adenosin-Diphosphoribose. cAMP. 3’,5’-zyklisches Adenosinmonophosphat. CD. cluster of differentiation. cDNA. komplementäre DNA. cGMP. 3’,5’-zyklisches Guanosinmonophosphat. ConA. Concanavalin A. CRAC. Ca2+ -release activated channel. DAG. sn-Diacylglycerol. DMF. N,N-Dimethylformamid. DMSO. Dimethylsulfoxid. DNA. Desoxyribonukleinsäure. dNTP. Desoxyribonukleotidtriphosphat. EDTA. Ethylendiamintetraacetat. EC50. Konzentration mit halbmaximalem Effekt. ER. Endoplasmatisches Retikulum.

(8) Abkürzungen. v. ERK. extracellular-signal regulated kinase. g. Vielfaches der Erdbeschleunigung. G6P-DH. Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase. GAP. GTPase aktivierendes Protein. HEPES. 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure. HPLC. Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie. IC50. Konzentration mit halbmaximalem inhibitorischem Effekt. ICRAC. Calcium release activated Calcium current. IκB. Inhibitor von NFκB. IL. Interleukin. InsP3. myo-Inositol-1,4,5-trisphosphat. InsP3 -R. myo-Inositol-1,4,5-trisphosphat-Rezeptor. IPTG. Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid. ITAM. immunoreceptor tyrosine-based activation motif. LAT. linker of activation in T cells. LB. Nährmedium nach Luria-Bertani. MAPK. mitogen activated protein kinase. MAPKK. MAPK-Kinase. MAPKKK. MAPKK-Kinase. MCS. multiple cloning site. MHC. major histocompatibility complex. MOPS. 3-Morpholinopropansulfonsäure. mRNA. messenger-RNA. NAADP. Nicotinsäure-Adenin-Dinukleotid-2’-Phosphat. NAD(P). Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid(-2’-Phosphat). NADase. NAD-Glycohydrolase. NF-ATc. nuclear factor of activated T cells, cytoplasmatic component. NF-ATn. nuclear factor of activated T cells, nuclear component. NFκB. nukleärer Faktor κB. NO. Stickstoffmonooxid. PARP. Poly(ADP-Ribose)-Polymerase. PARG. Poly(ADP-Ribose)-Glycohydrolase. PCA. Perchlorsäure. PCR. Polymerase Chain Reaction. PH. Plekstrin-Homologie-Domäne. PHA. Phyto-Hämagglutinin. PKC. Proteinkinase C. PLC. Phospholipase C. PIP2. Phosphatidyl-Inositol-4,5-bisphosphat. PIP3. Phosphatidyl-Inositol-3,4,5-trisphosphat.

(9) Abkürzungen. vi. RACE. rapid amplification of cDNA ends. RNA. Ribonukleinsäure. RP-HPLC. Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie. Upm. Umdrehungen pro Minute. RT. Reverse Transkription. RT-PCR. Reverse Transkription mit anschließender PCR. Ry. Ryanodin. RyR. Ryanodin-Rezeptor(en). SD. standard derivation. SERCA. sarcoplasmatic/endoplasmatic reticulum Ca2+ -ATPase. SEM. standard error of mean. SFM. Serum-freies Medium. SH2. Src-Homologie-Domäne 2. SLP-76. SH2 domain leukocyte protein of 76 kD. SOC. store operated channel(s). SOCE. store operated Ca2+ entry. TAE. Tris-Acetat-EDTA-Puffer. TBAHP. Tetrabutylammonium-Hydrogenphosphat. TCA. Trichloressigsäure. TCR. T-Zell-Rezeptor. TFA. Trifluoressigsäure. TH -Zellen. T-Helfer-Zellen. Tris. Tris(hydroxymethyl)-aminomethan. TRP. transient receptor potential. TRPC. canonical transient receptor potential. TRPM. melastatin-related transient receptor potential. TRPV. vanilloid receptor-related transient receptor potential. U. unit. X-Gal. 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid. ZAP-70. ζ-assoziiertes Protein mit 70 kD.

(10) 1. Einleitung. 1. 1. Einleitung 1.1. Funktion von T-Lymphocyten im Immunsystem Alle multizellulären Organismen müssen sich im Laufe ihres Lebens gegen Krankheitserreger wie Bakterien, Viren und parasitäre Ein- und Vielzeller zur Wehr setzen. Daher hat sich im Verlauf der Evolution ein Immunsystem gebildet, bei dem es sich um ein komplexes Netzwerk aus Zellen und Biomolekülen handelt, das zwischen „eigen“ und „fremd“ sowie „harmlos“ und „gefährlich“ unterscheiden kann. Auf diese Weise erkennt das Immunsystem eingedrungene Pathogene und maligne transformierte körpereigene Zellen und zerstört diese (Janeway et al., 2001). Das Immunsystem besteht aus zwei großen Bereichen: Der angeborenen Immunität und dem spezifischen, adaptiven Immunsystem. Die angeborene Immunität, die Antigene an konservierten Eigenschaften erkennt, besteht aus den Granulocyten, den Makrophagen und dem alternativen Weg des Komplementsystems. Dieser Teil des Immunsystems besitzt kein Gedächtnis, d. h. die Immunreaktion erfolgt bei wiederholter Infektion durch den gleichen Erreger in gleichbleibender Stärke und führt zu keiner anhaltenden Immunität. Die Phagocyten des angeborenen Immunsystems stellen trotzdem eine wichtige erste Verteidigungslinie gegen viele pathogene Mikroorganismen dar und sind besonders für die Abwehr bakterieller Infektionen essentiell (Janeway et al., 2001). Das angeborene Immunsystem kann nur solche Pathogene erkennen, die konservierte Eigenschaften aufweisen. Daher hat die adaptive Immunantwort, die auf den Lymphocyten, einer Subpopulation der Leukocyten, basiert, eine herausragende Bedeutung. Diese Zellen können durch Antigen-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche körperfremde Strukturen erkennen. Die Gene, die für diese Rezeptoren codieren, werden im Verlauf der Entwicklung der Lymphocyten in einem komplexen, als somatische Rekombination bezeichneten Prozeß so aus Genfragmenten rearrangiert, daß jede lymphocytäre Zelle ihre eigene Spezifität erhält. Diese legt fest, durch welches Antigen die Zelle aktiviert werden kann. Im Verlauf der individuellen Entwicklung der Lymphocyten werden im Thymus während der sogenannten klonalen Deletion die Zellen durch Apoptose getötet, die für körpereigene Strukturen spezifisch sind. Auf diesem Prozeß beruht die Toleranz der verbleibenden Zellpopulation gegen körpereigene Antigene. Eine Immunantwort kommt zustande durch die klonale Selektion und Expansion der für das Antigen spezifischen Zellen. Dazu müssen die Zellen durch Erkennung ihres Antigens aktiviert werden. Ein Teil des entstandenen Zellklons bleibt nach Ende der Immunreaktion als Gedächtniszellen zurück und kann bei wiederholter Infektion mit dem gleichen Patho-.

(11) 1. Einleitung. 2. gen schnell reaktiviert werden. Auf diese Weise wird eine mitunter lebenslang anhaltende Immunität erreicht (Janeway et al., 2001). Adaptive Immunreaktionen zeichnen sich durch die Aktivierung von zwei miteinander verbundenen Wegen aus: B-Lymphocyten synthetisieren nach ihrer klonalen Expansion lösliche und membrangebundene Antikörper und bilden so die Grundlage der humoralen Immunität, die gegen Pathogene im Extrazellulärraum gerichtet ist. T-Lymhocyten stellen dagegen die zelluläre Immunität dar, die sich gegen intrazelluläre Pathogene sowie transformierte Zellen richtet. Es gibt zwei große Subpopulationen der T-Lymphocyten: Cytotoxische TLymphocyten, die durch das Oberflächenantigen CD8 gekennzeichnet sind, töten infizierte und transformierte Zellen. T-Helfer-(TH )-Zellen, die das Oberflächenantigen CD4 aufweisen, aktivieren Makrophagen und B-Lymphocyten. CD4-positive T-Zellen können aufgrund der von ihnen gebildeten Cytokine weiter in die Subpopulationen der TH 1- und TH 2-Zellen differenziert werden (Janeway et al., 2001).. 1.2. Aktivierung von T-Lymphocyten Zur Aktivierung von T-Lymphocyten ist eine zeitlich und räumlich koordinierte Abfolge von Signalprozessen notwendig, an deren Ende die klonale Expansion der Zelle steht (Berridge, 1997). Dabei kommt es zur Aktivierung des auf der Oberfläche der Zellen vorhandenen TZell-Rezeptor-Komplexes (TCR-Komplex), der aus dem TCR selbst sowie den assoziierten CD3-Molekülen besteht. Der TCR wird aus je einer α- und β-Kette gebildet, deren Gene bei der somatischen Rekombination während der T-Zell-Entwicklung rekombiniert werden. Daher hat jeder TCR eine eigene Spezifität, die die Erkennung genau eines Antigens im Kontext mit einem Protein des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes (MHC) ermöglicht. Das Antigen wird auf der Oberfläche antigen-präsentierender Zellen (APCs) als prozessiertes Peptidfragment, gebunden an ein MHC-Molekül, präsentiert. MHC-Proteine der Klasse I befinden sich auf allen kernhaltigen Zellen, solche der Klasse II nur auf sogenannten professionell antigen-präsentierenden Zellen, d. h. Makrophagen, B-Lymphocyten und dendritischen Zellen. Der TCR selbst hat nur einen kleinen cytoplasmatischen Anteil, weshalb die assoziierten Proteine des CD3-Komplexes essentiell für die Signaltransduktion durch den TCR sind. Nach Ligation des TCR durch den Komplex aus antigenem Peptid und MHC-Molekül kommt es schnell zu multiplen Tyrosin-Phosphorylierungen innerhalb konservierter Motive (ITAMs) der CD3-Proteine. Die Phosphorylierung der ITAM-Motive erfolgt durch Tyrosin-Kinasen der Src-Familie, wobei in T-Zellen insbesondere die Proteine p59fyn und p56lck beteiligt sind. Diese sind durch Myristoyl-Reste an die Plasmamembran gebunden und mit den als Co-Rezeptoren wirksamen Oberflächenantigen CD4 und CD8 assoziiert. Diese binden bei Wechselwirkung des TCR mit dem Peptid-MHC-Komplex an den invarianten Teil des MHCProteins, so daß die Src-Kinasen in die räumliche Nähe des TCR-CD3-Komplexes gelangen und die ITAM-Motive phosphorylieren können. Die Src-Kinasen aktivieren sich zuvor durch.

(12) 1. Einleitung. 3. gegenseitige Autophosphorylierung in trans (Bolen, 1995). Die Aktivität der Src-Kinasen wird außerdem durch die Proteinphosphatase CD45 positiv (Okumura und Thomas, 1995) und durch die Kinase Csk negativ (Rudd et al., 1994) reguliert. Nach erfolgter Phosphorylierung innerhalb der ITAM-Motive kommt es zur Rekrutierung Phospho-Tyrosin-bindender Proteine mit SH2-(Src Homologie 2)-Domänen zur Membran. Dabei handelt es sich um Tyrosin-Kinasen der Syk-Familie, in T-Zellen um das ZAP-70Protein. Die Src-Kinasen aktivieren ZAP-70 durch Phosphorylierung, woraufhin dieses sich primär selbst phosphoryliert, so daß weitere Signalproteine zur Plasmamembran rekrutiert werden (z. B. FAK-related PTK, ras-GAP, Abl, Vav oder Cbl (Chan und Shaw, 1996)). ZAP-70 phosphoryliert auch die beiden Adapterproteine SLP-76 und LAT. Bei LAT handelt es sich um ein Transmembranprotein mit multiplen Tyrosin-Resten, nach deren Phosphorylierung Bindungstellen für weitere Proteine entstehen. Dadurch kommt es zur Rekrutierung des Grb2/SOS-Komplexes, der regulatorischen p85-Untereinheit der PI3-Kinase sowie der Phospholipase C-γ (PLC-γ) zur Membran. Durch diese Vorgänge werden mehrere Signalwege in Gang gesetzt, die im folgenden kurz dargestellt werden: 1. Ca2+ -Ionen werden aus intrazellulären Speichern freigesetzt. Dies geschieht einerseits durch Aktivierung von PLC-γ, die die beiden sekundären Botenstoffe sn-Diacylglycerol (DAG) und myo-Inositol-1,4,5-trisphosphat (InsP3 ) erzeugt. Andererseits wird eine ADP-Ribosylcyclase aktiviert, die den Botenstoff zyklische Adenosin-Diphosphoribose (cADPR) produziert. Sowohl InsP3 als auch cADPR lösen eine Ca2+ -Freisetzung aus. 2. Der Grb2/SOS-Komplex aktiviert das membrangebundene kleine G-Protein p21 ras , indem der Austausch von GDP durch GTP erleichtert wird. Die GTP-Form von p21 ras aktiviert eine Kaskade aus MAP-Kinase-Kinase-Kinase (MAPKKK), MAP-KinaseKinase (MAPKK) und MAP-Kinase (MAPK), an deren Ende die Phosphorylierung und funktionelle Aktivierung des Transkriptionsfaktors Elk-1 steht. 3. Die Rekrutierung der regulatorischen p85-Untereinheit der PI3-Kinase führt zur Aktivierung der katalytischen p110-Untereinheit des Enzyms. Dadurch wird das Substrat PIP2 zu Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat phosphoryliert, an das Proteine mit einer Plekstrin-Homologie-(PH)-Domäne binden können. Zu diesen Proteinen gehört die Serin/Threonin-Kinase Akt, die nach der Rekrutierung zur Membran durch die Kinasen PDK1 und PDK2 aktiviert wird (Downward, 1998). Von Akt führen weitere Signalwege zum Bad-Protein, der Glycogen-Synthase-Kinase3-β und zur Proteinkinase p70S6K (Übersicht in Wagener (1999)). Während der negativen Selektion im Thymus können nicht alle potentiell selbst-reaktiven T-Zellen eliminiert werden, weil antigene Peptide nicht präsentiert werden, die nur in spezialisierten Geweben außerhalb des Thymus hergestellt werden. Daher ist es für die Wahrung der Selbst-Toleranz notwendig, daß T-Zellen grundsätzlich nur durch zwei gleichzeitige Signale aktiviert werden können: Zusätzlich zur Stimulation des TCR-Komplexes durch das.

(13) 1. Einleitung. 4. Antigen im Kontext mit dem MHC-Protein ist ein zweites Signal notwendig, das nur von professionellen APCs bereitgestellt wird. Der wichtigste bekannte Co-Rezeptor auf T-Zellen ist das Oberfächenantigen CD28, dessen Liganden, die Glycoproteine B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86), ausschließlich auf professionellen APCs vorhanden sind. Die Bindung der Liganden an CD28 führt zu einer Stabilisierung der mRNAs von Cytokinen und steigert die Aktivität von Transkriptionsfaktoren (Berridge, 1997). Eine Integration der diversen an der T-Zell-Aktivierung beteiligten Signalwege erfolgt durch die Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren. Daran sind insbesondere die Transkriptionsfaktoren NF-AT, AP-1, CREB und NFκB beteiligt, die gemeinsam mit weiteren Proteinen an Gen-Promotoren binden und so die Genexpression regulieren. Schlüsselgene für die klonale Expansion von T-Lymphocyten sind das IL-2-Gen sowie das Gen der α-Kette des IL-2-Rezeptors, durch deren Genprodukte eine autokrine Signalschleife gebildet wird, die für die klonale Expansion notwendig ist (Janeway et al., 2001). Die Vorgänge und Signalwege, die an der Aktivierung naiver T-Zellen beteiligt sind, sind in Abb. 1.1 (Seite 5) schematisch zusammengefaßt.. 1.3. Calcium und die Signaltransduktion von T-Lymphocyten Zur Aktivierung von T-Zellen durch Antigen-Kontakt oder durch Stimuli, die den TCR quervernetzen, ist die Erhöhung der intrazellulären freien Ca2+ -Konzentration ([Ca2+ ]i ) eine notwendige Voraussetzung (Guse, 1998; Lewis, 2001). Eine Untersuchung von Ca2+ -Signalen in intakten Zellen wurde erst möglich durch die Entwicklung membranpermeabler Ca 2+ sensitiver Fluoreszenzfarbstoffe wie Fura-2/AM (Fura-2-pentakis-(acetoxymethyl)-ester), die in der Zelle durch Esterasen enzymatisch hydrolysiert werden und so den aktiven Fluoreszenzfarbstoff freisetzen, der nicht mehr durch die Membran aus der Zelle hinaus diffundieren kann (Williams et al., 1985). Durch Stimulation von T-Zell-Populationen (z. B. bei der Messung von [Ca2+ ]i in einer Zellsuspension) mit Lektinen, Antikörpern gegen den TCR-Komplex (z. B. OKT3, der gegen den CD3-Komplex gerichtet ist) oder APCs kommt es zu einem biphasischen Ca 2+ -Signal. Dabei tritt ein initialer Anstieg von [Ca2+ ]i von einem Basalwert von etwa 100 nM zu einem Peak von 300 nM bis 1 µM innerhalb der ersten Minute nach Stimulation auf. Diesem kurzzeitigen Peak folgt ein Abfall auf ein konstantes Plateau in Bereich von 150 − 300 nM, das für mehrere Stunden andauern kann (Premack und Gardner, 1992). Das schnelle, initiale Ca2+ -Signal kann nicht durch Chelatisierung extrazellulären Calciums, durch pharmakologische Blockade der Ca2+ -Kanäle in der Plasmamembran oder durch Depolarisation der Zellen inhibiert werden. Dies deutet darauf hin, daß der initiale Peak des Ca2+ -Signals durch Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern erzeugt wird. Die zweite, langanhaltende Plateau-Phase des Signals wird durch die genannten Faktoren vermindert und konnte daher dem Einstrom von Ca2+ aus dem extrazellulären Raum zugeordnet werden (Premack und Gardner, 1992; Guse, 1998)..

(14) ö÷ ø. å. âá äã. . . . . . . }. st. }. zy |{ . . vw. u. . . . . . Ö Ô. kl. ij. m. omn. h. pq r. x. ×Ø Ù. VY. M. E. X. Z. ]\ _. ]\^. [\. ¸. Ä. ÂÃ. . ¬. ª«. [\. KD. 4. ,. 2+. x. z. vy. 4. 23. M. KL. Á. ¸¿. x. vw. a`. X. VW. *+ ,. J. FG IH. U. QR TS. À. CD E. ¾. 1. ¦. -. 0/. ¢ £ ¤¥ ¨. V. · ·. ·. K. Q. KL. . ¸¹ ¸¹ Å º¸ Å ¸. (). AB. =>?@ <. &'. $% #. ¡ ¢ . ¡. ² ´µ³ ². . §. º » ¼½ ¸. ©. §. u. rq ts. . . Y. WX. ¸¿. . . [. \Y. ζ. . ôõ. Î ÑÓÔÕ Ò ÏÐ. É. È. Ä. ÃÄ Â ÆÇ Å. Á. κ Ë. ÌÍ. Ë. ¾¿À. »¼½. ¶µ. ²³´. °±. ¯®. ¢¦. ¤¥. Y_. ζ. ~. ó. ñò í ë. íî. ëì. κ. ì. ½. Ê. ¹º. ¸·. ¬ « . ª©. §¨. £¢. a`. Z. α ε. ïð é. è. κ éê. ÜÝ ßàÞ. æç. ÜÝ. ÚÛ. ÚÛ. ¦. \Y. ]^. ³¶. U. ST. R. . . S. QR. OP. . ±². ¯°. . ®. MN V. KL KL. . . . .

(15) . }. b. . 789. NOP. 56. g. ef. d. c. b `a . . . ~. } {| . HIJ.

(16) . . γ @A. >?. G. EF. B. ;<. CD. . 10. =. C. . :;. . . ¡. . 9:. . . . . . . . 8. 76. 45 3. 2. . . . . . . . . ef. cd. . b. . ÿ ýþ . ). '(. . . . #. !". &. $%. . . αR . . . ÿ ýþ . ,-. *+. α β γ !". . ÿ ýþ . . . /. *.. ). '(. 3γ δ ε. &. $%. '(. . . . ü. û ùú . . . . . . pl. o mn. lk j. ij. gh. 1. Einleitung. β. ζη. α β α. Abbildung 1.1: Schematische Darstellung der Signaltransduktionskaskaden während der T-Zell-Aktivierung. Aus Fliegert (1999), verändert nach Berridge (1997). Legende siehe nächste Seite.. 5.

(17) 1. Einleitung. 6. Legende zu Abb. 1.1: Die Darstellung der T-Zell-Aktivierung beginnt links oben mit der Ligation des TCR durch ein MHC II-gebundenes Antigen-Fragment und endet unten rechts mit Apoptose oder Proliferation der Zelle. Während der Aktivierung werden Informationen durch Signalwege weitergeleitet, die aus Rezeptoren, Vorläufern, Transducern, Signal-Kassetten und cytoplasmatischen und nukleären Effektoren bestehen. Um die Übersicht zu erleichtern, sind funktionell zusammengehörige Komponenten zu Gruppen zusammengefaßt und in Kästen dargestellt. Entnommen aus Fliegert (1999), verändert nach Berridge (1997). Abkürzungen: CAML, Ca2+ -Signal modulierter Cyclophilin-Ligand; CAK, Cdk-aktivierende Kinase; CAP, Ceramidaktivierte Proteinkinase; CSK, C-terminale Src-Kinase; FRAP, FKBP12-Rapamycin assoziiertes Protein; FRK, Fos-regulierende Kinase; GAP, GTPase aktivierendes Protein; gKCa, Ca 2+ -aktivierter Kaliumkanal; GRB-2, Wachstumsfaktor-Rezeptor gebundenes Protein 2; ICE, Interleukin 1b-converting enzyme; IκB, Inhibitor von NFκB; IL-2R, Interleukin-2 Rezeptor; JAK, Janus-Kinase; JNK, c-Jun N-terminale Kinase; MAPK, Mitogen-aktivierte Proteinkinase; MEK, MAPK/ERK-Kinase; mSOS, Säugerhomologes von Son of Sevenless; NFκB, Nukleärer Faktor κB; p70rsk, 70 kD ribosomale S6-Kinase; p85rsk, 85 kD ribosomale S6-Kinase; PITP, Phosphatidylinositol Transferprotein; PI, Phosphatidylinositol; PIP, Phosphatidylinositol-4-phosphat; PI3K, Phosphatidylinositol 3-Kinase; PI4K, Phosphatidylinositol 4-Kinase; PIP5K, Phosphatidylinositol-4phosphat 5-Kinase; PKB, Proteinkinase B; PKC, Proteinkinase C; PMCA, Plasmamembran Ca 2+ -ATPase; PS, Phosphatidylserin; Rb, Retinoblastoma-Protein; SHC, SH2-enthaltendes Protein; SHP; SH2-enthaltende Proteintyrosin-Phosphatase; SIP, SH2-enthaltende Inositolpolyphosphat 5-Phosphatase; SM, Sphingomyelin; SMase, Sphingomyelinase; STAT, Signaltransducer and activator of transcription; TNF, Tumornekrosefaktor; TNFR, Tumornekrosefaktor-Rezeptor; Ub, Ubiquitin.. Besonders interessant ist, daß bei der Untersuchung von Ca2+ -Signalen in Einzelzellen eine große Heterogenität gefunden wurde (Wacholtz und Lipsky, 1993; Wulfing et al., 1997; Guse, 1998): Einige Zellen zeigen ein ähnliches Signal wie das in Suspensionsmessungen gefundene, während andere Ca2+ -Oszillationen unterschiedlicher Frequenz erzeugen, nur einen einzelnen Peak ohne anschließendes Plateau aufweisen oder gar nicht reagieren. Erst bei simultaner Messung vieler Einzelzellen ergibt sich das für eine Zellpopulation beschriebene biphasische Signal. Folglich kann das Ca2+ -Signal nicht nur die Zustände „ein“ oder „aus“ annehmen, sondern enthält mehr Informationen. Durch Untersuchungen an primären, naiven T-Zellen, T-Zell-Klonen, T-Zell-Hybridomen und transformieren T-Zell-Linien wurde abgeleitet, daß Art und Stärke des Ca2+ -Signals unter anderem vom Typ und Differenzierungszustand der Zelle, ihrem Stadium im Zellzyklus sowie von der APC und vom präsentierten Antigen abhängen (Übersicht in Lewis (2001)). Das Ca2+ -Signal ist daher ein wesentlicher Teil der Informationen, die der Zelle in einem bestimmten immunologischen Kontext durch den TCR und die Co-Rezeptoren vermittelt werden, und löst Aktivierung, Anergie oder Apoptose der Zelle aus (Berridge et al., 1998).. 1.3.1. Durch Botenstoffe vermittelte Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern In Jurkat-T-Lymphocyten, die häufig als Modellsystem für die Signalwege in T-Lymphocyten dienten (Abraham und Weiss, 2004), sind durch pharmakologische Eigenschaften mindestens vier verschiedene intrazelluläre Ca2+ -Speicher differenzierbar (schematische Darstellung in.

(18) 1. Einleitung. 7. T-Lymphocyt Pool I Ca ER. Ins(1,4,5)P3. IP3-R 2+. Pool II 2+ Ca. Pool III 2+ Ca. Ca SERCA Tg. cADPR 2’-P-cADPR. RyR. Ca Pool IV 2+ Ca. 2+. 2+. Cf, Ry. Abbildung 1.2: Ca2+ -Speicher in T-Lymphocyten; verändert nach Guse et al. (1997). Die Speicher I und II gehören zum Kompartiment des ER, da sie gegenüber Thapsigargin (Tg) sensitiv sind. Speicher I ist durch InsP3 (Abschnitt 1.3.1.1) entleerbar. Speicher III ist sensitiv gegen die Pharmaka Ryanodin (Ry) und Coffein (Cf), sowie gegen die sekundären Botenstoffe cADPR (Abschnitt 1.3.1.2) und 2’-Phospho-cADPR. Agonisten sind grün dargestellt, Inhibitoren rot und sekundäre Botenstoffe blau.. Abb. 1.2): Ca2+ -Freisetzung aus Speicher I kann durch den sekundären Botenstoff InsP3 ausgelöst werden (siehe Abschnitt 1.3.1.1). Die Speicher I und II sind sensitiv für Thapsigargin. Dabei handelt es sich um einen spezifischen Inhibitor (Übersicht in Treiman et al. (1998)) von Ca2+ -ATPasen des SERCA-Typs, die in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) lokalisiert sind und zur Wiederaufnahme von Ca2+ aus dem Cytosol in die Speicher des ER dienen. In Gegenwart von Thapsigargin kommt es zu einer passiven Depletion der Speicher, da ständig ein Leckstrom durch die Ca2+ -Kanäle ins Cytosol auftritt. Die Speicher I und II werden zum ER-System gerechnet, da sie durch Thapsigargin entleerbar sind. Speicher III gehört hingegen nicht zum ER-Kompartiment und wurde ursprünglich durch seine Sensitivität für Coffein charakterisiert. Außerdem ist dieser Speicher durch den sekundären Botenstoff cADPR (siehe Abschnitt 1.3.1.2) sowie durch weitere Agonisten von Ryanodin-Rezeptoren (RyR) entleerbar. Daher ist davon auszugehen, daß Speicher III eine oder mehrere Isoformen des RyR besitzt. Das in Speicher IV vorhandene Ca 2+ kann im Gegensatz zu den anderen Speichern ausschließlich passiv durch das Ca2+ -Ionophor Ionomycin freigesetzt werden (Guse et al., 1993, 1997). 1.3.1.1. myo-Inositol-1,4,5-trisphosphat InsP3 ist der am besten charakterisierte Botenstoff, der an der Ca2+ -Freisetzung aus intrazellulären Speichern beteiligt ist. Durch Aktivierung von PLC-γ kommt es zur Spaltung.

(19) 1. Einleitung. 8 . . . . . . . . . . . Abbildung 1.3: Struktur des Ca2+ -mobilisierenden Botenstoffes InsP3 .. des Membran-Phospholipids Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2 ) in DAG und InsP3 (Abb. 1.3). InsP3 gelangt durch Diffusion durch das Cytosol zu seinem Rezeptor (InsP3 -R) in der ERMembran, wodurch die Freisetzung von Ca2+ aus dem ER ausgelöst wird. Dieser Mechanismus wurde zuerst in permeabilisierten Drüsenzellen des endokrinen Pankreas beschrieben (Streb et al., 1983), aber inzwischen für viele andere Zellsysteme bestätigt, darunter auch T-Lymhocyten (Imboden und Stobo, 1985). Da mehrere InsP3 -Moleküle an den tetrameren Rezeptor binden und dieser positiv durch Ca2+ reguliert wird, handelt es sich bei der Ca2+ -Freisetzung um einen hochgradig kooperativen Prozeß (Schrenzel et al., 1995). Alle drei Isoformen des InsP3 -R werden in Jurkat-Zellen exprimiert und bilden Homo- und Heterotetramere (Meldolesi und Pozzan, 1998). Die drei Isoformen unterscheiden sich bezüglich ihrer Sensitivität gegen InsP3 und ihrer Regulation durch Ca2+ (Lewis, 2001). Das InsP3 -Signal wird durch Metabolisierung des Botenstoffes rasch beendet: Die InsP 3 3-Kinase wird durch Ca2+ /Calmodulin-Komplexe (siehe Abschnitt 1.3.3) aktiviert und setzt InsP3 zu myo-Inositol-1,3,4,5-tetrakisphosphat um. Eine Beteiligung dieses Moleküls am langanhaltenden Ca2+ -Signal durch Aktivierung von Ca2+ -Kanälen in der Plasmamembran wurde postuliert (Lückhoff und Clapham, 1992), ist in T-Lymhocyten aber umstritten (da Silva et al., 1994). InsP3 wird außerdem durch eine 5-Phosphatase zu inaktivem myoInositol-1,4-bisphosphat abgebaut. 1.3.1.2. Cyclische Adenosin-Diphosphoribose Durch Lee et al. (1989) wurde cyclische Adenosin-Diphosphoribose (cADPR, Abb. 1.4, Seite 9) als weiterer Ca2+ -mobilisierender Botenstoff beschrieben und die biologische Wirkung durch Galione et al. (1991) in intakten Seeigel-Eiern bestätigt. Seitdem wurde eine Ca2+ freisetzende Wirkung von cADPR in einer Reihe weitere Zell-Systeme gezeigt, u. a. dem Einzeller Euglena gracilis, Pflanzenzellen, Säugetierzellen und humanen Zell-Linien (Übersichten in Lee (2004) und Guse (2004)). cADPR wird durch Enzyme, die als ADP-Ribosylcyclasen (ADPRC) bezeichnet werden, unter Abspaltung von Nicotinamid aus NAD gebildet (Übersicht in Schuber und Lund.

(20) 1. Einleitung. 9 OH. OH. O. NH. N. O O. P. N. OH. O O. P. N N. O O. OH. OH. OH. Abbildung 1.4: Struktur des Ca2+ -mobilisierenden Botenstoffes cADPR.. (2004)). Für einen sekundären Botenstoff ist außer einer intrazellulären Aktivität zur Erzeugung und Weiterleitung eines Signals (im Falle von cADPR durch die Ca2+ -Freisetzung) eine durch externe oder interne Stimuli ausgelöste Bildung und eine anschließende Metabolisierung zu fordern. Für mehrere Zellsysteme wurde eine Kopplung zwischen extrazellulärer Stimulation und intrazellulärer cADPR-Bildung bereits nachgewiesen (Übersicht in Guse (2004)): Die Stimulation von Muskelzellen aus dem Darm mit dem Hormon Cholecystokinin führte zu einer Erhöhung der intrazellulären ADPRC-Aktivität (Cancela, 2001). Auch in neuronalen NG108-15-Zellen wurde bei Stimulation purinerger Rezeptoren mit Carbachol eine Erhöhung der ADPRC-Enzymaktivität gefunden (Higashida et al., 1997). Ähnliche Ergebnisse wurden bei β-adrenerger Stimulation von Herzmuskel-Zellen erhalten (Higashida et al., 1999), wobei eine Kopplung durch cyclisches AMP und Proteinkinase A gezeigt wurde (Xie et al., 2005). Eine Erhöhung der intrazellulären cADPR-Konzentration wurde in PC12-Zellen nach Stimulation mit NO durch einen cGMP- und Proteinkinase G-abhängigen Signalweg gefunden (Clementi et al., 1996). Eine Zunahme der cADPR-Konzentration konnte auch in β-Pankreas-Zellen bei Stimulation mit Glucose (Takasawa et al., 1993), in neonatalen Herzmuskelzellen bei Stimulation mit Angiotensin II (Higashida et al., 2000) sowie in T-Lymphocyten bei Stimulation mit dem CD3-Antikörper OKT3 (Guse et al., 1999) gezeigt werden. In Jurkat T-Zellen wurde eine Kopplung der intrazellulären ADPRC an die Aktivierung des TCR durch Proteinkinasen nachgewiesen (Guse et al., 1999). Bedeutung der cADPR-vermittelten. Ca2+ -Freisetzung. Die. kann pharmakologisch durch spezi-. fische cADPR-Antagonisten oder -Agonisten untersucht werden (Übersicht zur StrukturWirkungsbeziehung von cADPR in Guse (2005)). Der Mechanismus der Ca2+ -freisetzenden Wirkung von cADPR ist noch nicht vollständig geklärt. In den meisten untersuchten Zellsystemen deuten pharmakologische Daten auf eine Beteiligung der RyR hin, da Ca2+ und Coffein eine Sensitivierung für den Effekt bewirken, während RyR-Antagonisten wie Ruthenium Rot, Procain oder Mg2+ die cADPR-abhängige Freisetzung inhibieren (Übersicht in Lee (1997)). Auch RyR zeigen wie InsP3 -R eine Sensiti-.

(21) 1. Einleitung. 10. vierung durch Ca2+ , so daß die Ca2+ -Freisetzung durch cADPR eine positive Rückkopplung aufweist. In T-Lymphocyten konnte eine Verminderung des langanhaltenden Ca 2+ -Signals bei Repression der RyR-Expression gezeigt werden (Schwarzmann et al., 2002). Dabei ist noch unklar, ob die Wirkung von cADPR auf RyR direkt oder indirekt unter Beteiligung cADPR-bindender Proteine erfolgt. 1.3.1.3. Nicotinsäure-Adenindinucleotid-2’-Phosphat Die Ca2+ -freisetzende Wirkung einer Kontamination in kommerziell erhältlichem NADP auf Homogenate aus Seeigeleiern wurde erstmals durch Clapper et al. (1987) beschrieben. Erst Jahre später wurde Nicotinsäure-Adenindinucleotid-2’-Phosphat (NAADP, Abb. 1.5) als wirksame Komponente identifiziert (Lee und Aarhus, 1995). Chemisch unterscheidet sich NAADP von NADP nur durch den Austausch der Nicotinamid-Gruppe gegen Nicotinsäure. Durch Lee und Aarhus (1997) wurde im Seeigelei-System gezeigt, daß drei strukturelle Merkmale für die Ca2+ -freisetzende Wirkung von NAADP notwendig sind: (i) Die negative Ladung der Nicotinsäure-Gruppe, (ii) die Phosphat-Gruppe an der 2’-Position der Ribose und (iii) die Amino-Gruppe des Adenin-Systems. Da Veränderungen in den genannten Gruppen die Ca2+ -freisetzende Wirkung stark verminderten, wurde eine spezifische Bindung von NAADP an einen Rezeptor postuliert. Inzwischen wurde eine durch NAADP ausgelöste Ca2+ -Freisetzung in mehreren Zell-Typen gezeigt, darunter Drüsenzellen des endokrinen Pankreas, Zellen des ZNS und humane TLymphocyten (Übersicht in Guse (2002); Galione und Ruas (2005); Yamasaki et al. (2005a)). Obwohl über die durch NAADP vermittelte Ca2+ -Freisetzung bisher weit weniger bekannt ist als über das InsP3 - oder cADPR-System, zeichnen sich bereits deutliche funktionelle Unterschiede zu den anderen Botenstoffen ab: NAADP löst eine Ca2+ -Freisetzung schon bei weitaus niedrigeren Konzentrationen als InsP3 oder cADPR aus, da in einigen ZellSystemen ein Ca2+ -mobilisierender Effekt ab Konzentrationen von 10−100 nM nachgewiesen werden konnte (Guse, 2002). Die Dosis-Wirkungskurve von NAADP verläuft in SäugerNH2 COOH N N. N CH2 HO. OH. O. O. O. P. P. O OH. O OH. CH2. N N. O. O OH. O HO. P. OH. O. Abbildung 1.5: Struktur des Ca2+ -mobilisierenden Botenstoffes NAADP..

(22) 1. Einleitung. 11. Zellen glockenförmig (Lee und Aarhus, 1995; Cancela et al., 1999; Berg et al., 2000), so daß hohe NAADP-Konzentrationen teils einen geringeren Ca2+ -freisetzenden Effekt zeigen als niedrigere. Weitere wichtige Eigenschaften des NAADP-Systems sind seine Selbst-Desensitivierung und -Inaktivierung: NAADP-Konzentrationen unterhalb des Schwellenwerts für die Ca 2+ mobilisierende Wirkung können in Seeigeleiern die weitere Ca2+ -Freisetzung komplett und irreversibel blockieren (Aarhus et al., 1996). Desweiteren kann das NAADP-System durch hohe NAADP-Konzentrationen (im mikromolaren Bereich) ohne Freisetzung von Ca 2+ desensitiviert werden (Aarhus et al., 1996). In T-Lymphocyten konnte durch MikroinjektionsExperimente gezeigt werden, daß hohe, selbst-inaktivierende NAADP-Konzentrationen auch zur Inaktivierung sowohl des InsP3 - als auch des cADPR-Systems führten. Darüber hinaus trat nach einer solchen Inaktivierung auch bei Stimulation des TCR/CD3-Komplexes kein Ca2+ -Signal mehr auf, weshalb das NAADP-System zur Erzeugung eines physiologischen Ca2+ -Signals durch TCR-Stimulation anscheinend essentiell ist (Berg et al., 2000). Welcher Rezeptor die Ca2+ -freisetzende Wirkung von NAAPD vermittelt, ist bis heute umstritten. In Seeigeleiern wurde ein pharmakologisch von InsP3 -R und RyR zu differenzierender Ca2+ -Kanal beschrieben (Genazzani et al., 1997). Daraus wurde gefolgert, daß dort drei unabhängige Ca2+ -freisetzende Systeme vorhanden sind, die gegenseitig nicht desensitivierbar sind (Lee und Aarhus, 1995) und vermutlich durch drei unterschiedliche Rezeptoren vermittelt werden (Churchill und Galione, 2000). Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Mikrosomen aus Gehirn-Zellen (Bak et al., 1999) und Herzgewebe (Bak et al., 2001) sowie in arteriellen Glattmuskel-Zellen (Boittin et al., 2002) gefunden. Dem widersprechende Ergebnisse stammen hingegen aus der Rekonstitution von RyR in künstlichen Lipidmembranen: Nach Mojzisova et al. (2001) wird der RyR Typ II und nach Hohenegger et al. (2002) der RyR Typ I durch NAADP aktiviert. Auch in T-Lymphocyten wird eine Wirkung von NAADP auf den RyR vermutet, weil durch den RyR-Inhibitor Ruthenium Rot sowohl globale (Langhorst et al., 2004) als auch subzelluläre (Dammermann und Guse, 2005) Ca2+ -Signale inhibiert werden konnten. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Repression der RyR-Expression erhalten (Langhorst et al., 2004; Dammermann und Guse, 2005). Dies deutet daraufhin, daß NAADP seine Ca2+ -freisetzende Wirkung in T-Zellen direkt oder indirekt durch den RyR ausübt, und Ca2+ aus dem gleichen zellulären Speicher wie cADPR freisetzt. Auch für einen Thapsigargin-sensitiven Speicher in der Kernhülle konnte eine durch den RyR vermittelte Freisetzung von Ca2+ durch NAADP gezeigt werden (Gerasimenko et al., 2003), ebenso wie bei der durch Insulin ausgelösten Ca2+ -Freisetzung in MIN6-Zellen (Mitchell et al., 2003). Durch Churchill et al. (2002) wurde dagegen eine Beteiligung eines lysosomalen Zellkompartiments an der NAADP-vermittelten Ca2+ -Freisetzung beschrieben. Gleiche Ergebnisse wurden in β-Zellen des Pankreas erhalten (Masgrau et al., 2003). Daher ergeben sich mehrere mögliche Modelle zur Erklärung der NAADP-Effekte (Übersicht in Galione und Petersen (2005)): Nach dem „Ein Speicher“-Modell wirkt NAADP auf den RyR und löst so Ca2+ -Freisetzung aus intrazellulären Speichern aus. Nach dem „Zwei Speicher“-Modell.

(23) 1. Einleitung. 12. wirkt NAADP durch Ca2+ -Freisetzung aus lysosomalen Speichern, die einen vom RyR verschiedenen NAADP-Rezeptor besitzen. Durch den Anstieg von [Ca2+ ]i wird sekundär die Ca2+ -Freisetzung aus den RyR- und InsP3 -R-abhängigen Speichern durch die positive Modulation dieser Rezeptoren durch Ca2+ gesteigert. Die enzymatische Bildung von NAADP aus NADP ist durch ADPRCs möglich, wobei unphysiologische Reaktionsbedingungen wie ein niedriger pH-Wert und hohe NicotinsäureKonzentrationen notwendig sind (Aarhus et al., 1995). In Zellextrakten aus Säugetierzellen konnte aber auch bei physiologischem pH-Wert eine NAADP-Bildung nachgewiesen werden (Chini und Dousa, 1995; Bak et al., 1999). Durch Untersuchungen an CD38−/− -Mäusen wurde gezeigt, daß das Ekto-Enzym CD38 an der Synthese von NAADP wahrscheinlich beteiligt ist (Chini et al., 2002). Der enzymatische Abbau von NAADP zu inaktivem NAAD findet vermutlich durch eine durch Ca2+ regulierte, für die 2’-Position spezifische Phosphatase statt (Berridge et al., 2002a). Es gibt bereits einige Hinweise darauf, daß NAADP neben InsP3 und cADPR eine Funktion als sekundärer Botenstoff hat (Übersicht in Rutter (2003)): Eine Ca2+ -freisetzende Wirkung wurde inzwischen in diversen Zell-Typen gezeigt, auch wenn der genaue Mechanismus (Freisetzung aus Lysosomen versus ER-Speichern) noch umstritten ist. Ein Anstieg der intrazellulären NAADP-Konzentration bei Stimulation konnte bereits in zwei Berichten gezeigt werden (Masgrau et al., 2003; Yamasaki et al., 2005b). Unklar ist hingegen noch, welche enzymatischen Wege zur Synthese und zum Abbau von NAADP in Zellen dienen und wie dieser Stoffwechsel reguliert wird. Auch die Rolle von NAADP bei der Weiterleitung komplexer Ca2+ -Signale wie Oszillationen und Wellen ist bisher erst ansatzweise charakterisiert (Churchill und Galione, 2000).. 1.3.2. Einstrom von Calcium aus dem Extrazellulär-Raum Die Ca2+ -Signale in fast allen nicht-erregbaren Zellen bestehen aus zwei Anteilen: Einer schnellen Freisetzung aus intrazellulären Speichern und einem langanhaltenden Einstrom aus dem Extrazellulärraum (Übersicht in Venkatachalam et al. (2002)). Der Ca2+ -Einstrom hat eine wichtige Funktion, weil nur dadurch die zeitliche Beschränkung der Ca2+ -Freisetzung aufgehoben werden kann. Außerdem wird durch den Ca2+ -Einstrom eine Wiederauffüllung der intrazellulären Speicher ermöglicht. Der durch Rezeptor-Aktivierung auslösbare Ca2+ -Einstrom läßt sich unterteilen in einen Speicher-vermittelten Ca2+ -Einstrom, der durch die Depletion intrazellulärer Ca2+ -Speicher ausgelöst wird, und einen von der Speicher-Entleerung unabhängigen Ca2+ -Einstrom. Der erstgenannte Prozeß ist eingehend charakterisiert, obwohl in der Literatur widersprüchliche Ergebnisse zum molekularen Mechanismus zu finden sind und bisher kein allgemein anerkanntes Modell für diesen Speicher-vermittelten Ca2+ -Einstrom formuliert werden konnte (Penner und Fleig, 2004). Über den Speicher-unabhängigen Ca2+ -Einstrom ist dagegen weit weniger bekannt: Hierzu gibt es nur Berichte in wenigen Zell-Typen, die auch nur teilweise auf andere Zellen übertragbar sind..

(24) 1. Einleitung. 13. 1.3.2.1. Speicher-vermittelter Calcium-Einstrom Durch eine Abnahme der Ca2+ -Menge in intrazellulären Speichern wird ein Ca2+ -Einstrom ausgelöst, der so lange bestehend bleibt, bis die Speicher wieder aufgefüllt sind (Zitt et al., 2002). Die an diesem Vorgang beteiligten Ca2+ -Kanäle in der Plasmamembran werden zusammenfassend als SOC („store operated channels“, Speicher-abhängige Kanäle) bezeichnet (Clapham, 1995) und der durch sie getragene Ca2+ -Einstrom als SOCE („store operated Ca2+ entry“, Speicher-abhängiger Ca2+ -Einstrom). Die Depletion der intrazellulären Speicher muß dabei nicht notwendigerweise durch physiologische Ca2+ -freisetzende Botenstoffe wie InsP3 oder cADPR erfolgen: Auch nach Behandlung mit dem SERCA-Inhibitor Thapsigargin, der eine passive Entleerung der Ca2+ -Speicher bewirkt, kommt es zur Aktivierung des Ca2+ -Einstroms. In bestimmten Zell-Typen, darunter Lymphocyten, konnte gezeigt werden, daß durch Speicher-Depletion ein hochgradig Ca2+ -spezifischer, nicht spannungsabhängiger, einwärts-gleichrichtender Strom aktiviert wird, der als ICRAC („Calcium release activated Calcium current“) bezeichnet wurde (Hoth und Penner, 1992; Hoth, 1995). Dieser Strom ist durch eine sehr geringe Einzelkanal-Leitfähigkeit von 24 fS und eine rasche Inhibition durch eine Erhöhung von [Ca2+ ]i gekennzeichnet (Zweifach und Lewis, 1995). ICRAC -Ströme konnten bisher aus technischen Gründen nur in einer begrenzten Anzahl unterschiedlicher Zell-Typen nachgewiesen werden. Nach Zitt et al. (2002) ist aber die Annahme gerechtfertigt, daß ICRAC in vielen, wenn nicht möglicherweise allen elektrisch nicht-erregbaren Zellen am SOCE beteiligt ist. Es gibt jedoch auch Berichte, daß die Aktivierung von I CRAC nicht notwendigerweise eine Speicher-Depletion erfordert (Krause et al., 1999), und daß durch Speicher-Depletion auch Ströme aktiviert werden können, die sich von ICRAC unterscheiden (Lückhoff und Clapham, 1994). Bisher ist noch unklar, auf welche Weise die Entleerung der intrazellulären Ca 2+ -Speicher eine Öffnung der SOC-Kanäle auslöst. Dazu gibt es nach Zitt et al. (2002) drei Modellvorstellungen: 1. Nach dem Modell des Ca2+ -Einstrom-Faktors kommt es durch die Speicher-Entleerung zur Bildung eines Botenstoffes, der zur Plasmamembran diffundiert und dort die SOCKanäle aktiviert. Dieser konnte bisher nicht genau charakterisiert werden, hat aber vermutlich eine Masse von unter 500 g/mol und enthält eine Phosphat-Gruppe (Randriamampita und Tsien, 1993; Parekh et al., 1993). 2. Nach Irvine (1990) besteht eine direkte Protein-Protein-Interaktion zwischen den Ca2+ Kanälen der intrazellulären Speicher und den SOC-Kanälen in der Plasmamembran, so daß eine Entleerung der intrazellulären Speicher durch Konformationsänderung die Aktivierung der Plasmamembran-Kanäle auslösen kann (vergleichbar zur direkten Kopplung zwischen RyR und Dihydropyridin-Rezeptor im Skelettmuskel). 3. Das Membran-Insertions-Modell sieht vor, daß SOC-Kanäle in intrazellulären Vesikeln vorliegen, die bei Entleerung der Ca2+ -Speicher mit der Plasmamembran fusionieren.

(25) 1. Einleitung. 14. und auf diese Weise einen Ca2+ -Einstrom durch die Plasmamembran auslösen (Yao et al., 1999; Patterson et al., 1999). Obwohl es sich bei SOCE um ein generelles Phänomen handelt, das in vielen Zell-Typen auftritt, werden vermutlich in unterschiedlichen Zellen-Typen verschiedene Mechanismen und Kanäle benutzt. Daher gibt es wahrscheinlich auch mehrere Prinzipien zur Kopplung des Ca2+ -Einstroms an die Depletion intrazellulärer Ca2+ -Speicher. 1.3.2.2. Speicher-unabhängiger Calcium-Einstrom Ein Ca2+ -Einstrom kann nach Stimulation von Membran-Rezeptoren auch durch Mechanismen ausgelöst werden, die nicht auf Speicher-vermitteltem Ca2+ -Einstrom beruhen. Dies kann einerseits durch Liganden-aktivierte Ca2+ -Kanäle wie P2 X-Rezeptoren geschehen, die auf extrazelluläres ATP reagieren (MacKenzie et al., 1999). Andererseits wurden Ca2+ permeable Kanäle beschrieben, deren Aktivierung nicht durch Entleerung intrazellulärer Speicher erfolgt, sondern die durch InsP3 (Kuno und Gardner, 1987), myo-Inositol-1,3,4,5tetrakisphosphat (Lückhoff und Clapham, 1992), Ca2+ (von Tscharner et al., 1986) oder Arachidonsäure (Mignen und Shuttleworth, 2000) reguliert werden. Ein weiteres Beispiel ist der Kanal TRPM2 (siehe Abschnitt 1.4.2), der für Ca2+ permeabel ist und durch AdenosinDiphosphoribose (ADPR) aktiviert wird (Perraud et al., 2001; Sano et al., 2001). Vereinzelt wurde auch eine Aktivierung von Ca2+ -Kanälen durch G-Proteine gefunden (Krautwurst et al., 1992). Alle genannten Mechanismen sind aber bisher nur in wenigen Zellsystemen bestätigt worden. Es sind daher noch umfangreiche Untersuchungen notwendig, um nachzuweisen, daß neben der weit verbreiteten Aktivierung von SOC-Kanälen durch Speicher-Entleerung weitere Mechanismen an der Erzeugung von Ca2+ -Signalen bei physiologischer Stimulation beteiligt sind.. 1.3.3. Effektorsysteme von Calcium Ohne eine langanhaltende Erhöhung von [Ca2+ ]i kann keine Aktivierung von T-Zellen stattfinden, da Ca2+ für eine verstärkte Expression von Cytokin-Genen und damit für die Proliferation essentiell ist (Acuto und Cantrell, 2000). T-Zellen verfügen über diverse intrazelluläre Effektorsysteme, die eine Erhöhung von [Ca2+ ]i registrieren und diese in zelluläre Reaktionen umsetzen können. Die wichtigsten dieser Systeme werden im folgenden kurz beschrieben. Das ubiquitär exprimierte kleine Protein Calmodulin (CaM) ist einer der wichtigsten zellulären Ca2+ -Sensoren. Jedes CaM-Protein bindet kooperativ vier Ca2+ -Ionen, wodurch es zu einer starken Konformationsänderung kommt. Nach Bindung von Ca2+ geht der Ca/CaMKomplex Wechselwirkungen mit einer Vielzahl an Proteinen ein, darunter Enzyme, Proteine des Cytoskeletts und Ionenkanäle, wodurch deren Aktivität moduliert wird. Es gibt auch Proteine, die CaM als regulatorische Untereinheit enthalten..

(26) 1. Einleitung. 15. Für die Signalweiterleitung in T-Zellen ist insbesondere die Ca/CaM-abhängige Proteinphosphatase Calcineurin wichtig, deren Substrate Phospho-Serin- und Phospho-TyrosinReste sind. Bei der T-Zell-Aktivierung dephosphoryliert Calcineurin nach seiner Aktivierung durch Ca/CaM den cytosolischen Anteil des nucleären Transkriptionsfaktors aktivierter TZellen (NF-ATc ), so daß dieser in den Kern transloziert. Dort bildet er einen Komplex mit der konstitutiv nucleären Komponente NF-ATn , und aktiviert u. a. das IL-2 Gen (Janeway et al., 2001). Weitere Effektoren des Ca2+ -Signals sind CaM-abhängige Proteinkinasen (CaMK), von denen vier unterschiedliche Isoformen bekannt sind. CaMK II wird in vielen Geweben exprimiert und wirkt auf eine Vielzahl unterschiedlicher Substratproteine. In Abwesenheit von Ca/CaM ist CaMK II katalytisch inaktiv. Der EC50 -Wert für Ca2+ beträgt bei Sättigung mit CaM 0.5 − 1 µM (Premack und Gardner, 1992). Vor der Phosphorylierung von Zielproteinen kommt es zu einer Autophosphorylierung von CaMK II. Dadurch wird das Enzym in eine Form überführt, die von der Anwesenheit von Ca2+ und CaM unabhängig ist. Diese von Ca/CaM unabhängige Aktivität bleibt bestehen, bis Protein-Phosphatasen das Enzym dephosphorylieren, und stellt auf diese Weise eine Art „molekulares Gedächtnis“ für zurückliegende Erhöhungen von [Ca2+ ]i dar (Premack und Gardner, 1992). Ca/CaM-abhängige Proteine sind außerdem an der Reorganisation des Cytoskeletts beteiligt (z. B. Leichtketten-Myosinkinase). Die dynamische Änderung des Cytoskeletts ist eine notwendige Voraussetzung, damit T-Zellen ausreichend Kontakt mit APCs aufnehmen können, um einen Bindung des TCR an den MHC-Antigen-Komplex zu ermöglichen (Acuto und Cantrell, 2000). Die Erhöhung von [Ca2+ ]i stellt in vivo ein Signal dar, das eine T-Zelle dazu veranlaßt, an einer APC zu stoppen und weitere Signale von dieser zu empfangen (Acuto und Cantrell, 2000). Dies ist der erste Schritt zur Ausbildung eines engen Kontaktes zwischen T-Zelle und APC, der als „immunologische Synapse“ bekannt ist (Shaw und Dustin, 1997). Ein weiteres Effektorsystem stellen die Proteinkinasen C (PKC) dar, von denen diverse Isoformen bekannt sind. PKC wird durch das von der PLC-γ freigesetzte DAG gemeinsam mit Ca2+ und Phosphatidylserin aus dem inneren Blatt der Plasmamembran aktiviert. In T-Zellen wird durch PKC u. a. die inhibitorische Untereinheit IκB des Transkriptionsfaktors NFκB phosphoryliert, wodurch deren proteasomaler Abbau induziert wird. Dadurch wird ein Kernlokalisierungssignal von NFκB freigelegt, so daß der Transkriptionsfaktor in den Kern transloziert und die Expression u. a. des IL-2-Gens erhöht (Janeway et al., 2001). Möglicherweise kommt es in T-Zellen zu einer Umsetzung der Ca2+ -Signale, die sich in Amplitude und Frequenz unterscheiden können, in eine Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren (Dolmetsch et al., 1998): Durch Ca2+ -Oszillationen mit hoher Frequenz (>1 in 400 sec) kam es zur Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-AT und Oct-1, während NFκB auch noch bei einer niedrigeren Frequenz von einem Ca2+ -Signal in 30 min aktiviert wurde. Daher werden anscheinend durch unterschiedliche Ca2+ -Signale verschiedene Kombinationen an Transkriptionsfaktoren aktiviert. Diese modulieren die Transkription unterschiedlicher Gene, da sich deren Promotoren unterscheiden (z. B. sind NF-AT, Oct-1 und.

(27) 1. Einleitung. 16. NFκB für die Expression von IL-2 nötig, während NFκB zur Expression von IL-8 ausreichend ist). Auf diese Weise können definierte Ca2+ -Signale einen bestimmten Satz an Genen transkriptionell aktivieren und damit unterschiedliche Zellfunktionen auslösen (Lewis, 2001).. 1.4. Ionenkanäle der TRP-Familie Kanäle der „transient receptor potential“-(TRP)-Familie wurden zuerst in Drosophila melanogaster beschrieben: In der Mutante trp tritt bei Belichtung des Komplexauges der Fliege im Gegensatz zum Wildtyp keine dauerhafte Depolarisation auf. Obwohl diese Mutante schon länger bekannt ist, wurde das betroffene Gen erst durch Montell und Rubin (1989) kloniert. Bei dem vom trp-Gen codierten Protein handelt es sich um einen für Ca 2+ permeablen Ionenkanal, der durch Licht aktiviert wird (Hardie und Minke, 1992). Da in den trp-Fliegen der Ca2+ -Einstrom nach Belichtung und damit die Hell-Adaptation ausbleibt, werden sie durch intensives Licht geblendet. Die Superfamilie der TRP-Kanäle, die in Säugetieren mehr als 20 Mitglieder umfaßt, definiert sich durch ihre Homologie zum Trp-Kanal in Drosphila. Anders als innerhalb anderer Ionenkanal-Familien sind die Liganden und die Kanal-Selektivitäten unterschiedlich (Clapham, 2003).. 1.4.1. Die Superfamilie der TRP-Ionenkanäle TRP-Ionenkanäle bilden eine Superfamilie, deren Kanäle für Ca2+ und/oder monovalente Kationen permeabel sind.. Alle TRP-Kanäle bestehen aus Untereinheiten, die sechs. membrandurchspannende hydrophobe Bereiche und cytosolische N- und C-Termini besitzen; dieses Strukturprinzip haben TRP-Kanäle mit spannungsabhängigen Kalium-Kanälen und Cyclo-Nucleotid-gesteuerten Kanälen gemeinsam (Clapham et al., 2001), weshalb TRPKanäle vermutlich ebenfalls tetramere Komplexe bilden, was auch experimentell bestätigt wurde (Kedei et al., 2001). Viele TRP-Kanäle werden ubiquitär exprimiert, weshalb in den meisten Zell-Typen mehrere TRP-Kanäle vorhanden sind. Außerdem gibt es meist mehrere Spleiß-Varianten der Kanäle. Die TRP-Superfamilie wird in sechs Unterfamilien eingeteilt. Davon bilden die drei Familien der klassischen TRP-Kanäle (TRPC), der Melastatin-verwandten TRP-Kanäle (TRPM) und der Vanilloid-Rezeptor-verwandten TRP-Kanäle (TRPV) die größten (Abb. 1.6, Seite 17). Außerdem gibt es noch die Familien der Mucolipine (TRPML), der Polycystine (TRPP) und die TRPA-Gruppe, die nur das ANKTM1-Protein umfaßt (Übersicht in Clapham (2003)). Die bisher bekannten Funktionen von TRP-Kanälen sind vielfältig (Clapham, 2003). Alle nehmen Reize auf einer zellulären Ebene wahr: In Hefe-Zellen beispielsweise dient ein TRP-Kanal zur Detektion von Hyperosmolarität und Nematoden verwenden TRP-Kanäle zur Chemosensorik. Mäuse nehmen mit dem TRPC2-Kanal Pheromone wahr, während bei Menschen TRP-Kanäle zur Wahrnehmung von Geschmackseindrücken (sauer, bitter und umami) sowie von Wärme, Hitze und Kälte dienen..

(28) 1. Einleitung. 17. Abbildung 1.6: Phylogenetische Verwandtschaft der drei Hauptgruppen der Superfamilie der TRP-Kanäle, verändert nach Clapham et al. (2001). Die evolutionäre Verwandtschaft wird durch den Abstand der Verzweigungspunkte symbolisiert.. Die TRPC-Familie weist die höchste Homologie zum Trp-Kanal aus Drosophila auf. Einige ihrer Mitglieder werden durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und durch RezeptorTyrosin-Kinasen aktiviert und üben daher wahrscheinlich Funktionen als Rezeptor-gesteuerte Kanäle aus. Möglicherweise handelt es sich bei einigen TRPC-Kanälen um speicherregulierte Ca2+ -Kanäle (SOC, siehe Abschnitt 1.3.2.1, Montell (2001)). Solch eine Funktion ist jedoch umstritten und möglicherweise auch durch die Überexpression der Kanäle bedingt (Lievremont et al., 2004). TRPV-Kanäle dienen allgemein als zelluläre Sensoren. Das am besten charakterisierte Bespiel ist der Kanal TRPV1, der durch eine Substanz aus Chili-Schoten aktiviert wird, aber in vivo wahrscheinlich auch zur Detektion von Hitze dient (Caterina et al., 1997). Von den drei großen Gruppen der TRP-Superfamilie ist über die TRPM-Familie bisher am wenigsten bekannt. Trotzdem wurden bereits Funktionen dieser Kanäle in diversen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen festgestellt (Übersicht in Kraft und Harteneck (2005)). Die Besonderheit von TRPM-Kanälen besteht darin, daß einige (TRPM2, TRPM6 und TRPM7) sowohl eine Kanal- als auch eine intrazelluläre Enzym-Aktivität besitzen. Bei diesen TRP-Kanälen handelt es sich um die einzigen bekannten Beispiele solcher Proteine, die auch als „Chanzymes“ (für „channel enzymes“) bezeichnet werden (Scharenberg, 2005)..

(29) 1. Einleitung. 18. 1.4.2. Der Ionenkanal TRPM2 Der TRPM2-Kanal besteht N-terminal aus einem nicht-selektiven Ionenkanal und C-terminal aus einer enzymatisch aktiven Untereinheit (schematisch dargestellt in Abb. 1.7). Wie alle anderen TRP-Ionenkanäle bildet auch TRPM2 Tetramere, wobei unklar ist, ob unter physiologischen Bedingungen Homo- oder Heterotetramere mit anderen TRPM-Kanälen vorliegen (Scharenberg, 2005). Das TRPM2-Protein besteht aus 1503 Aminosäuren und hat eine vorhergesagte Masse von 171 kDa (Perraud et al., 2003a). Im N-terminalen Bereich von TRPM2 befindet sich eine TRPM-Homologie-Region, die in allen acht TRPM-Kanälen vorhanden, deren Funktion jedoch unbekannt ist. Daran schließen sich sechs Transmembranhelices an, wobei die Aminosäuren der Schleife zwischen den Helices fünf und sechs die Kanal-Pore des TetramerKomplexes bilden. Weiter C-terminal befindet sich ein wegen seiner vorhergesagten Struktur als „coiled coil region“ bezeichneter Bereich unbekannter Funktion, auf den die cytosolische. Na +. Ca2+. Extrazellulärraum Plasmamembran. TM TM TM TM TM 1 2 3 4 5. Cytosol. TM 6. CCR. NUDT9-H. TRPMHomologie-Region. ADPR. C. N Abbildung 1.7: Schematischer Aufbau des Ionenkanals TRPM2 (verändert nach Meinke (2005)). TRPM2 enthält wie alle TRP-Kanäle sechs Transmembranhelices (TM 1−6), wobei zwischen TM 5 und TM 6 eine Schleife liegt, die die Kationen-permeable Pore bildet. Im cytosolischen Nterminalen Bereich befindet sich die TRPM-Homologie-Region, die allen Mitgliedern der TRPMFamilie gemeinsam ist, über deren Funktion aber nichts Genaues bekannt ist. Im cytosolischen Cterminalen Teil folgt auf TM 6 ein Bereich unbekannter Funktion, für den eine „coiled coil“-Struktur vorausgesagt wurde (CCR) und die NUDT9-Homologie-Region (NUDT9-H). An diese auch als „Nudix box“ bezeichnete Domäne bindet ADPR und löst dadurch eine Öffnung des Kanals aus, so daß Ca 2+ und Na+ -Ionen ins Cytosol strömen können..

(30) 1. Einleitung. 19. NUDT9-Homologie-Region folgt (Perraud et al., 2003a). Diese weist eine hohe Homologie zu der mitochondrialen Adenosin-Diphosphoribose-Pyrophosphatase (ADPRase) NUDT9 auf (Perraud et al., 2003b). Eine Bindung von Adenosin-Diphosphoribose (ADPR) an diesen auch als „Nudix box“ bezeichneten Bereich von TRPM2 löst, vermutlich durch eine Konformationsänderung, die Öffnung des Kanals aus (Perraud et al., 2001). Die NUDT9Homologie-Region von TRPM2 hat im Vergleich zum mitochondrialen Enzym nur eine sehr geringe enzymatische Aktivität (Perraud et al., 2001), die darüber hinaus zur Aktivierung des Kanals nicht notwendig ist (Perraud et al., 2005). Mutationen innerhalb der NUDT9Homologie-Region können die Aktivierbarkeit von TRPM2 durch ADPR komplett aufheben (Kühn und Lückhoff, 2004). Eine Expression von TRPM2 tritt im ZNS, dort besonders in Microglia-Zellen (Kraft et al., 2004), in Immunzellen und diversen anderen Geweben wie Knochenmark, Milz, Herz, Leber, Lunge, Pankreas und Prostata auf (Perraud et al., 2001; Sano et al., 2001; Hara et al., 2002). Neben der Vollängen-Form von TRPM2 (TRPM2-LF) sind fünf weitere Isoformen beschrieben worden, die in unterschiedlichen Zell-Typen exprimiert werden (schematische Darstellung in Abb. 1.8). Protein 1. TRPM-Homologie-Region. TM-Domänen. CCR. Pore. NUDT9-H ADPR-B. 1503. Kat.Dom.. mRNA 1. ORF. 6220. TRPM2-LF. 1. ORF. 6118. TRPM2-∆ ∆C 1. Exon 27 fehlt. ORF. 6160. TRPM2-∆N Exon 11 fehlt teilweise. TRPM2-∆N ∆C. 1. ORF. 6058. Exon 11 fehlt teilweise 1. ORF. Exon 27 fehlt 6223. TRPM2-SF Stopp-Codon am Beginn von Exon 17 1. ORF. 5227. TRPM2-SSF Transkript von Promotor in Intron 4 beginnt mit Exon 5S SF. Abbildung 1.8: Schematische Darstellung der sechs bekannten Isoformen des Ionenkanals TRPM2, entnommen aus Meinke (2005). In grau sind die Strukturen der mRNAs dargestellt, wobei die unterschiedlich gefärbten Abschnitte die Exons repräsentieren. Darüber sind die offenen Leserahmen dargestellt, deren Farben mit denen der Protein-Regionen in der schematischen Darstellung des Proteins (ganz oben) übereinstimmen. Die TRPM-Homologie-Region ist in hellem Orange dargestellt, die Transmembranhelices sowie die „coiled coil region“ in dunklem Orange, und die NUDT9-Homologie-Region in gelb. Erläuterung siehe Text..

(31) 1. Einleitung. 20. Durch Wehage et al. (2002) konnten in neutrophilen Granulocyten Transkripte nachgewiesen werden, in denen durch alternatives Spleißen Exon 27 oder ein Teil von Exon 11 fehlte oder beide Deletionen in Kombination auftraten. Entsprechend wurden diese Varianten als TRPM2-∆N, TRPM2-∆C und TRPM2-∆N∆C bezeichnet. Bei der Isoform TRPM2-SF („short form“) kommt es am Übergang von Exon 16 zu Exon 17 durch alternatives Spleißen zur Entstehung eines Stopp-Codons, so daß ein C-terminal trunkiertes Protein resultiert (Zhang et al., 2003). TRPM2-SF bildet keinen funktionalen Kanal, weil ein Teil der Transmembranhelices fehlt, und hat darüber hinaus eine dominantnegative Wirkung auf die Vollängen-Form TRPM2-LF (Zhang et al., 2003). Bei der von Uemura et al. (2005) beschriebenen SSF-Form handelt es sich nicht um eine Spleißvariante, sondern um eine mRNA, die durch Verwendung eines alternativen Promotors innerhalb des Introns vor Exon 5 entsteht. Diese Form wurde wegen ihrer Expression in menschlichem Striatum als TRPM2-SSF („striatum short form“) bezeichnet. Das erste Exon dieser Variante entspricht Exon 5 der anderen Isoformen, dem durch die Benutzung des alternativen Promotors noch ein kurzer Abschnitt des Introns vor Exon 5 vorangestellt ist; diese alternative Form von Exon 5 wird als Exon 5SSF bezeichnet (Uemura et al., 2005). 1.4.2.1. Aktivierung und Regulation von TRPM2 Die Identifikation des „Nudix box“-Motivs im C-Terminus von TRPM2 hat zur Untersuchung bekannter Substrate von Enzymen mit diesem Motiv auf Aktivierung von TRPM2 geführt (Perraud et al., 2001; Sano et al., 2001). Dabei wurde festgestellt, daß TRPM2 durch ADPR (Abb. 1.9) sowie möglicherweise auch durch NAD aktiviert werden kann. Außerdem wurde eine Aktivierung des Kanals durch oxidativen Streß (z. B. in Form von Wasserstoffperoxid) berichtet (Hara et al., 2002). Der von TRPM2 getragene Strom wies in Patch Clamp-Messungen ein lineares StromSpannungsverhältnis mit einem Umkehrpotential von etwa 0 mV auf. Folglich handelt es sich um einen nicht-selektiven Kationenkanal ohne gleichrichtende Wirkung (Perraud et al., NH2 N N CH2 HO. HO. OH. O. O. O. P. P. O OH. O OH. CH2. O. O OH. OH. Abbildung 1.9: Struktur des TRPM2-Agonisten ADPR.. N N.

(32) 1. Einleitung. 21. 2001; Sano et al., 2001). Die ADPR-induziert Aktivierung von TRPM2 kann durch erhöhte lokale cytosolische Ca2+ -Konzentrationen verstärkt werden (McHugh et al., 2003), so daß eine positive Rückkopplung durch den Ca2+ -Einstrom auftreten kann. Die Rolle von NAD bei der Aktivierung von TRPM2 ist hingegen umstritten (Scharenberg, 2005): Von einigen Gruppen konnte eine solche Aktivierung nachgewiesen werden (Sano et al., 2001; Hara et al., 2002), während dies in anderen Experimenten nicht bestätigt wurde (Perraud et al., 2001). Eine mögliche Erklärung hierfür ist, daß ADPR ein direktes Degradationsprodukt von NAD darstellt. Da die Aktivierung von TRPM2 durch NAD deutlich höhere Konzentrationen als die ADPR-induzierte Aktivierung erfordete und eine viel langsamere Kinetik aufwies, war die Wirkung von NAD möglicherweise auf eine Kontamination durch ADPR zurückzuführen. Außerdem kann auch nicht ausgeschlossen werden, daß es während der Messung der Ströme zu einer Hydrolyse von NAD zu ADPR in der Zelle kam. Durch Wehage et al. (2002) wurde beschrieben, daß die TRPM2-∆C-Form bei Überexpression in HEK-293-Zellen zwar durch oxidativen Streß, nicht jedoch durch ADPR aktivierbar war. Daraus folgerten die Autoren, daß oxidativer Streß direkt und nicht durch Bildung von ADPR auf den Kanal wirkt. Andererseits konnte durch Arbeiten von Perraud et al. (2005) gezeigt werden, daß bei cytosolischer Expression eines ADPR-abbauenden Enzyms keine Aktivierung von TRPM2 durch oxidativen Streß mehr ausgelöst werden konnte. Auch bei Blockade von Poly(ADPR)-Polymerasen, die möglicherweise an der Entstehung von ADPR aus NAD beteiligt sind, konnte oxidativer Streß TRPM2 nicht mehr aktivieren (Fonfria et al., 2004). Dies deutet daraufhin, daß oxidativer Streß die Bildung von freiem ADPR bewirkt, das sekundär die Aktivierung von TRPM2 vermittelt. Die Ergebnisse von Wehage et al. (2002) sind möglicherweise auch durch eine Arbeit von Kolisek et al. (2005) zu erklären, in der kürzlich eine aktivierende Wirkung von cADPR auf TRPM2 beschrieben wurde: cADPR aktivierte in Konzentrationen > 100 µM den Kanal direkt, während cADPR-Konzentrationen < 10 µM den Kanal für ADPR sensitivierten. Daher wurde postuliert, daß der Kanal außer der Bindungsstelle für ADPR in der „Nudix box“ über eine weitere, davon unabhängige Bindungsstelle für cADPR verfügt. Da oxidativer Streß nach Kumasaka et al. (1999) auch zur intrazellulären Bildung von cADPR führen kann, ist es möglich, daß in der Arbeit von Wehage et al. (2002) die TRPM2-∆C-Form bei oxidativem Streß durch cADPR statt ADPR aktiviert wurde. Nach Scharenberg (2005) ist ADPR der physiologisch entscheidende Stimulus zur Aktivierung von TRPM2. ADPR bindet dabei an eine Bindungstasche innerhalb der NUDT9Homologie-Region, und löst die Öffnung von TRPM2 aus. Dieses Modell legt nah, daß im Lauf der Evolution eine Fusion der Kanal- und Enzym-Domänen stattgefunden hat, um eine spezifische enzymatische Bindungsdömane zur Detektion eines intrazellulären Ligandens zu nutzen..

(33) 1. Einleitung. 22. 1.4.2.2. Physiologische Rolle von TRPM2 Zur physiologischen Funktion von TRPM2 liegen bisher erst wenige Berichte vor. Diese lassen aber bereits erkennen, daß der Kanal eine Funktion beim Zelltod hat, der durch oxidativen Streß ausgelöst werden kann. Durch Hara et al. (2002) konnte erstmals gezeigt werden, daß die TRPM2-Expression Zellen empfindlich gegen oxidativen Streß macht. Da bekannt ist, daß oxidativer Streß die Bildung von ADPR auslöst (Scharenberg, 2005), verläuft dieser Prozeß vermutlich über die Bildung von ADPR, das die Aktivierung von TRPM2 auslöst, möglicherweise gemeinsam mit Ca2+ (McHugh et al., 2003) und cADPR (Kolisek et al., 2005) als Co-Stimuli. Zu diesen Ergebnissen paßt auch, daß durch eine dominantnegative TRPM2-Isoform die Suszeptibilität für oxidativen Streß reduziert werden konnte (Zhang et al., 2003). Ausgehend von diesen Befunden wurde durch Ayub und Hallett (2004) die Hypothese aufgestellt, daß es in Immunzellen nach Erhöhung von [Ca2+ ]i zu einer Umsetzung von NAD zu ADPR in den Mitochondrien kommt. ADPR wird daraufhin freigesetzt, aktiviert TRPM2, und löst so einen Ca2+ -Einstrom aus dem Extrazellulärraum aus. Eine Beteiligung von Poly(ADPR)-Polymerasen an diesem Prozeß wurde von Fonfria et al. (2004) postuliert. Durch Überexpression eines ADPR-abbauenden Enzyms im Cytosol konnte gezeigt werden, daß oxidativer Streß zur Akkumulation von mitochondrialem ADPR im Cytosol führte (Perraud et al., 2005). Eine Funktion von TRPM2 bei physiolgischer Stimulation konnte aber bisher nur bei Verwendung von TNF-α (Hara et al., 2002) und dem an der Genese der Alzheimer-Erkrankung beteiligten amyloiden β-Peptid (Fonfria et al., 2005) gezeigt werden. Mit dem Modell einer Beteiligung des ADPR/TRPM2-Systems am Zelltod steht im Einklang, daß Ca2+ -Ionen auf TRPM2 als Co-Stimulus wirken: McHugh et al. (2003) postulierten ein Modell, nach dem es nach Aktivierung des Kanals zu einer positiven Rückkopplung kommt. Der von TRPM2 vermittelte Ca2+ -Einstrom erhöht die lokale Ca2+ -Konzentration, was wiederum den Kanal stärker aktiviert. Auf diese Weise würde ein Signal entstehen, das von der Zelle nicht mehr aufgehoben werden kann. Ein solches irreversibles Signal ist für Prozesse, die den Tod der Zelle auslösen sollen, biologisch sinnvoll. In T-Zellen wurde nach Stimulation des TCR/CD3-Komplexes die Bildung reaktiver Sauerstoffspecies (ROS) nachgewiesen (Devadas et al., 2002). Möglicherweise könnten auch solche Prozesse zur Aktivierung von TRPM2 in T-Lymphocyten beitragen. Es gibt mehrere Berichte, die vermuten lassen, daß die Stimulation von T-Lymphocyten zur Aktivierung von TRPM2 führt: So kam es nach Harootunian et al. (1989) bei T-ZellStimulation zu einem Na+ -Einstrom, dessen molekulare Ursache unklar blieb. Es wurde auch berichtet, daß es bei Stimulation des TCR zu einer Aktivierung mehrerer Einstrom-Wege für Ca2+ kam (Chow et al., 1993). In Drüsenzellen des Pankreas wurde ein nicht selektiver Kationen-Strom beschrieben, der durch Depletion intrazellulärer Speicher ausgelöst werden konnte und als ICRAN C („Ca2+ release activated nonselective cation current“) bezeichnet wurde (Krause et al., 1996). Ein Strom mit gleichen Eigenschaften wurde von Su et al. (2001) auch in T-Lymphocyten gefunden. Möglicherweise ist das ADPR/TRPM2-System.