Interaktion zwischen Selektion auf
Leistungseffizienz und Adaptationsvermögen an eine reduzierte Calcium-Konzentration im Futter
bei Legehennen
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Mara Bues Bad Oldesloe
Hannover 2019
Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. habil. Mirja Wilkens
Institut für Physiologie und Zellbiologie Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: PD Dr. habil. Mirja Wilkens
Institut für Physiologie und Zellbiologie Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Gutachter: Junprof. Dr. Christian Visscher Institut für Tierernährung
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 02.05.2019
Mit freundlicher Unterstützung durch die H. Wilhelm Schaumann Stiftung
Meiner Familie
Poster, European Poultry Conference 2018, 17. bis 21. September 2018, Dubrovnik Egg production and egg shell quality of phylogenetically divergent chicken lines during dietary calcium depletion
M Bues, S Jansen, C Habig, A Weigend, I Halle, G Breves, S Weigend, M Wilkens
Poster, 73. Jahrestagung 2019, 13. bis 15. März 2019, Göttingen
Alteration of Ca transporting structures in small intestine and egg shell gland of phylogenetically divergent chicken lines after dietary calcium depletion M Bues, S Jansen, C Habig, A Weigend, I Halle, G Breves, S Weigend, M Wilkens
Ein übergreifendes Manuskript, das die Daten dieser und einer weiteren Dissertation beinhaltet, wird eingereicht:
Journal: BMC Physiology
Comparison of Calcium homeostatic parameters in brown-layers and white- layers with differing performance levels challenged by a Calcium-restricted diet S Jansen, M Bues, R Sharifi, C Habig, I Halle, S Petow, A Weigend, M Wilkens, S Weigend
INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Die Ca-Homöostase beim Legehuhn ... 3
2.1.1 Ca-Transport im Blut ... 4
2.1.2 Vitamin D ... 5
2.1.3 PTH ... 8
2.1.4 Calcitonin ... 10
2.2 Transzellulärer Ca-Transport ... 13
2.2.1 TRPV6 im Darm und in der Eischalendrüse ... 14
2.2.2 Calbindin D28k im Darm und in der Eischalendrüse ... 17
2.2.2.1 Regulation in der Niere und im Darm ... 18
2.2.2.2 Regulation im Darm in Abhängigkeit von dem Reproduktionsstatus ... 18
2.2.2.3 Regulation in der Eischalendrüse ... 19
2.2.2.4 Ca2+-abhängige Regulation im Darm ... 21
2.2.2.5 Weitere Funktionen von Calbindin ... 22
2.2.3 PMCA im Darm und in der Eischalendrüse ... 22
2.2.4 NCX im Darm ... 24
2.2.5 Transcaltachia ... 25
2.3 Parazellulärer Ca-Transport ... 28
2.4 Regulation der Pi-Homöostase beim Legehuhn ... 31
2.5 Eischalenkalzifizierung ... 32
2.6 Funktion des Knochengewebes bei Legehennen ... 33
2.7 Unterschiede zwischen Braun- und Weißlegern ... 36
2.8 Unterschiede zwischen Hoch- und Minderleistungslinien ... 37
2.9 Resource Allocation Theory ... 39
3 Material und Methoden ...41
3.1 Versuchsdesign ... 41
3.2 Material ... 44
3.2.1 Haltung und Fütterung ... 44
3.2.2 Blutproben ... 45
3.2.3 Eier ... 45
3.2.4 Tötung und Gewebeentnahme ... 45
3.2.4.1 Instestinaltrakt ... 46
3.2.4.2 Eischalendrüse ... 47
3.2.4.3 Niere ... 47
3.3 Methoden ... 48
3.3.1 Blutprobenanalyse ... 48
3.3.1.1 Ca2+ im Vollblut ... 48
3.3.1.2 Cat im Plasma ... 48
3.3.1.3 Pi im Plasma ... 50
3.3.1.4 25-OHD3 im Plasma ... 51
3.3.1.5 Gesamtprotein im Plasma ... 52
3.3.2 Eierschalenanalyse ... 53
3.3.3 PCR ... 54
3.3.3.1 RNA-Isolierung und cDNA-Synthese ... 56
3.3.3.2 Nachweis der RNA-Expression durch qRT PCR ... 58
3.3.4 Western Blot Analysen ... 60
3.3.4.1 Rohmembran-Präparation ... 61
3.3.4.2 Cytosol-Präparation ... 62
3.3.4.3 Elektrophorese ... 63
3.3.4.4 Blotting ... 66
3.3.4.5 Blockierung ... 67
3.3.4.6 Antikörperinkubation und Proteindetektion ... 67
3.4 Statistik ... 70
4 Ergebnisse ...71
4.1 Plasmaparameter ... 71
4.1.1 25-OHD3 im Plasma ... 71
4.1.2 Cat und Ca2+ im Plasma ... 72
4.1.3 Gesamtprotein im Plasma ... 76
4.1.4 Pi im Plasma ... 76
4.2 Ca2+-transportierende Strukturen ... 78
4.2.1 Duodenum ... 78
4.2.1.1 TRPV6 ... 78
4.2.1.2 CaBPD28k und PMCA ... 79
4.2.2 Ileum ... 81
4.2.3 Eischalendrüse ... 83
4.3 Renaler Vitamin D-Metabolismus ... 85
4.4 Legerate ... 87
4.5 Parameter der Eischalenqualität ... 90
4.5.1 Erste Ca-Restriktionsphase ... 93
4.5.2 Zweite Ca-Restriktionsphase ... 95
4.5.3 Dritte Ca-Restriktionsphase ... 97
5 Diskussion ...99
5.1 Beurteilung der eingesetzten Untersuchungsmethoden ... 99
5.1.1 Versuchstiere, Fütterung und Legerate ... 99
5.1.2 Plasmaparameter ... 102
5.1.2.1 25-OHD3 ... 102
5.1.2.2 Cat und Ca2+ ... 103
5.1.2.3 Gesamtprotein ... 104
5.1.2.4 Pi ... 104
5.1.3 Gewebeproben ... 105
5.1.3.1 Intestinaltrakt und Eischalendrüse ... 106
5.1.3.2 CaBPD28k und PMCA ... 106
5.1.3.3 Niere ... 106
5.1.4 Eischalenqualität ... 107
5.2 Vitamin D-Metabolismus ... 109
5.3 Cat, Ca2+, Eischalenqualität und Legerate ... 112
5.3.1 Futteraufnahme und Ca-Bedarf ... 116
5.4 Gesamtprotein im Plasma und Eigewicht ... 118
5.5 Intestinale Ca2+-Absorption ... 121
5.6 Ca2+-Sekretion in die ESG und Eischalenqualität ... 124
5.7 Pi im Plasma und Knochengesundheit ... 126
5.8 Ressourcen-Verteilung und Tierschutz ... 128
5.8.1 „Qualzucht“ ... 131
5.9 Schlussfolgerung ... 133
5.10 Ausblick ... 135
6 Zusammenfassung ...137
7 Summary ...140
8 Literaturverzeichnis ...143
9 Anhang ...168
10 Danksagung ...180
SCHRIFTUMSVERZEICHNIS
abh. abhängig
A. dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)
ANOVA Varianzanalyse
APS Ammoniumperoxodisulfat ATPase Adenosintriphosphatase
BE Blutentnahmezeitpunkt
bp Basenpaare
bzw. beziehungsweise
ca. circa
Ca Calcium
Cat Gesamt-Calcium
Ca2+ ionisiertes Calcium CaBPD28k Calbindin D28k
CaCNA1A/D calcium voltage-gated channel subunit alpha 1 A/D CaSR Ca2+-sensing receptor
cDNA komplementäre DNA
Cl Chlorid
cm Zentimeter
CMF caveolae-enriched membrane fraction
CYP Cytochrom P450
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay ESG egg shell gland (Eischalendrüse)
Fa. Firma
FLHS fatty liver haemorrhagic liver syndrome FLI Friedrich-Loeffler-Institut
FSH Follikelstimulierendes Hormon
g Gramm
g Kraft pro Masse (Vielfaches der Erdschwerebeschleunigung) GfE Gesellschaft für Ernährungsphysiologie
g/l Gramm pro Liter
GnRH Gonadotropin-Releasing-Hormon HCO3- Bicarbonat
HRP horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase) I.E. Internationale Einheit
kDa Kilodalton (Protein-Molekulargewicht)
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
KO knock-out
LH Luteinisierendes Hormon
LSM least significant means
LW Lebenswoche
M Molar (Mol pro Liter)
max. maximal
mg Milligramm
min Minuten
MJ Megajoule
mmol/l Millimol pro Liter
mRNA messenger RNA
MS Microsoft
N Normal (Konzentration mal Wertigkeit)
Na Natrium
Na+ ionisiertes Natrium
NCX Na+/Ca2+-Austauscher
nm Nanometer
P Phosphor
Pi anorganisches Phosphat
PCR polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion)
PKC Proteinkinase C
PMCA Plasmamembranständige Ca2+-ATPase
PTH Parathormon
RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) rpm rounds per minute
qRT PCR quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction
s Sekunden
s. siehe
SDS sodium dodecyl sulfate (Natriumdodecylsulfat)
SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) SEM standard error of the mean (Standardfehler)
Std. Stunde
TEMED Tetramethylethylendiamin TCA Trichloressigsäure
TierSchG Tierschutzgesetz
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan TRPV5/6 transient receptor potential channel,
vanilloid-subfamily-member 5/6
V Volumen
VDBP Vitamin D-bindendes Protein VDR Vitamin D Rezeptor
VDRE Vitamin D responsive element x̅ arithmetisches Mittel
z.B. zum Beispiel
Zn2+ ionisiertes Zink
1,25(OH)2D3 Calcitriol (1,25-Dihyydroxycholecalciferol) 25-OHD3 Calcidiol (25-Hydroxycholecalciferol)
µ Mikro
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 1:
Relativer PTH-Plasma-Spiegel im Verlaufe eines Ovulationszyklus aus VAN DE VELDE et al. (1984) ... 10 Abbildung 2:
Modell der Ca2+-Absorption im Intestinaltrakt der Legehennen aus STAHL (2013) ... 13 Abbildung 3:
Modell über den Mechanismus, wie 1,25(OH)2D3 über CaT1 (= TRPV6) und Calbindin D9k den Ca2+-Einstrom reguliert, aus PENG et al. (2003) ... 15
Abbildung 4: ...
Modell für die intestinale Ca-Absorption durch Transcaltachia bei
Säugetieren aus FLEET u. SCHOCH (2010) ... 27 Abbildung 5:
Modell eines parazellulären Ca2+-Flux‘ durch einen solvent drag-
Mechanismus aus KARBACH (1992)... 30 Abbildung 6:
Kreuzungsschema der kommerziellen Legehybride aus
SITZENSTOCK et al. (2013) ... 37 Abbildung 7:
Zeitstrahl des Versuchsablaufs ... 42 Abbildung 8:
Apparatur zur Feststellung der Bruchfestigkeit ... 54 Abbildung 9:
Messchieber zur Feststellung der Schalendicke ... 54 Abbildung 10:
Amplifikationskurve einer RT qPCR von CaBPD28k im Duodenum ... 55 Abbildung 11:
Amplifikationskurven in Doppelbestimmung von TRPV6 im Duodenum ... 79 Abbildung 12:
RNA- und Proteinexpression im Duodenum ... 80 Abbildung 13:
RNA- und Proteinexpression im Ileum ... 82 Abbildung 14:
RNA- und Proteinexpression in der Eischalendrüse ... 84 Abbildung 15:
RNA-Expression von CYP24A1 und VDHAP in der Niere ... 85 Abbildung 16:
Amplifikationskurven in Doppelbestimmung von CYP27C1 in der Niere ... 86
Abbildung 17:
Legerate [%] aller Linien in den drei Ca-Restriktionsphasen ... 88 Abbildung 18:
Anteil beschädigter Eischalen [%] in den drei Ca- Restriktionsphasen ... 92 Abbildung 19:
Eiqualitäts- und Eigewichtsverläufe während der ersten Ca-Restriktions phase und der ersten 10 Tage nach Futterumstellung ... 94 Abbildung 20:
Eiqualitäts- und Eigewichtsverläufe während der zweiten Ca-Restriktionsphase und der ersten 10 Tage nach Futterumstellung ... 96 Abbildung 21:
Eiqualitäts- und Eigewichtsverläufe während der dritten Ca-Restriktionsphase ... 98 Abbildung 22:
25-OHD3-Gehalt (ng/ml) der Kontrolltiere aller Linien ... 102 Abbildung 23:
Vorversuch zur Calbindin D28k-Expression in den Organen Duodenum, Ileum und Eischalendrüse zu verschiedenen Uhrzeiten ... 105 Abbildung 24:
Abhängigkeit der Bruchfestigkeit von der Schalendicke bei Weißlegern und Braunlegern in der ersten Ca-Restriktionsphase... 108 Abbildung 25:
Hypothalamus-Hypophysen-Achse ... 114 Abbildung 26:
Estradiol-Werte der vier Linien am 2. Blutentnahmezeitpunkt ... 116 Abbildung 27:
Abhängigkeit des Gesamt-Ca (A) bzw. des Eigewichts (B) von dem
Gesamtprotein-Gehalt im Plasma ... 120 Abbildung 28:
Kortikaler Knochenanteil im Tibiotarsus ... 127
TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 1:
Belegungsplan der Abteile ... 44 Tabelle 2:
Zusammensetzung der Reagenzien, welche für die Cat-Messung verwendet wurden ... 49 Tabelle 3:
Zusammensetzung der Reagenzien, welche für die Pi-Messung verwendet wurden ... 51 Tabelle 4:
PCR Primer für die Quantifikation der RNA-Expression in Darm-, ESG- und Nieren-Gewebe ... 60 Tabelle 5:
Zusammensetzung der eingesetzten Puffer für die Rohmembran-Präparation ... 62 Tabelle 6:
Zusammensetzung des Cytosolpräparationspuffers ... 63 Tabelle 7:
Puffer- und Lösungszusammensetzungen für Western Blot ... 65 Tabelle 8:
Zusammensetzung der Polyacrylamidgele für die Elektrophorese ... 66 Tabelle 9:
Antikörperinkubationsbedingungen für CaBPD28k, PMCA und Villin ... 69 Tabelle 10:
25-OHD3-Konzentrationen (ng/ml) zu den
Blutentnahmezeitpunkten 2, 4 und 6 ... 72 Tabelle 11:
Cat- und Ca2+-Konzentrationen im Plasma (mmol/l) zu den
Blutentnahmezeitpunkten 2, 4 und 6 ... 74 Tabelle 12:
Relativer Ca2+-Anteil am Cat zu den Blutentnahme- zeitpunkten 2, 4 und 6 ... 75 Tabelle 13:
Gesamtprotein-Konzentrationen im Plasma (mg/ml) zu den
Blutentnahmezeitpunkten 2, 4 und 6 ... 76
Tabelle 14:
Pi-Konzentrationen im Plasma (mmol/l) zu den Blutentnahme- zeitpunkten 2, 4 und 6 ... 77
Tabelle 15:
Nestverhalten der verschiedenen Gruppen während der gesamten
Versuchsperiode ... 89 Tabelle 16:
Empfohlene Menge an Futterzusatzstoffen (Vitamin D3 und Ca) ... 100 Tabelle 17:
Wachstumsleistung- und Legerate verschiedener Genotypen ... 117
1 1 Einleitung
Die industrielle Haltung von Legehennen in Europa geht bis in die 1930er Jahre zu- rück, hat aber erst mit Einführung der Hybridzucht in den 1950er Jahren große Fort- schritte gemacht (DAMME u. HILDEBRAND 2015). Durch die Hybridzucht entstehen hochleistende Legehennen, die in einem Jahr ca. 300 Eier legen (FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION 2003). Der Stoffwechsel der Henne steht damit vor einer großen Herausforderung, denn es müssen sowohl die Eiinhaltsstoffe als auch die Eischalenbestandteile bereitgestellt werden. Die Eischale besteht zu 98 % aus Calciumcarbonat, was einem Bedarf von 2 bis 3 g Calcium (Ca) pro Ei entspricht (BAR 2009). Da die Hennen nur während der Lichtphase Futter aufnehmen und die Eischalenkalzifizierung vorwiegend während der Dunkelphase stattfindet, wird etwa ein Drittel des benötigten Calciums durch Resorption von Knochen bereitgestellt.
Speziell beim Vogel kommt das medulläre Knochengewebe vor, das einen großen Mineralspeicher darstellt und bei physiologischer Körperfunktion fortlaufend auf- und abgebaut wird. Bei hochleistenden Legehennen kommt es aber wegen des enorm gesteigerten Ca-Bedarfs gleichzeitig zu einem Abbau von strukturellem Knochen, weshalb zum Ende der Legeperiode die Prävalenz von Brustbeinfrakturen/- deformationen bei über 35 % liegt (STRATMANN et al. 2016, CLARK et al. 2008).
Eine andere Studie konnte zeigen, dass sogar bei bis zu 98 % der Schlachtkörper Knochenbrüche zu finden sind (GREGORY u. WILKINS 1989).
Es wird vermutet, dass eine genetische Selektion für ein bestimmtes Merkmal zu ei- ner Umverteilung der Ressourcen führt, sodass die Ressourcen in diesem Fall vor- rangig für die Eierproduktion genutzt werden und nicht für die Erhaltung, woraus pa- thologische Veränderungen im Organismus entstehen können (RAUW et al. 1998).
Die Hypothese der vorliegenden Studie ist daher, dass die Zucht auf Leistungseffizi- enz mit einem Verlust der Anpassungsfähigkeit an suboptimale Haltungsbedingun- gen (hier: Ca-Zufuhr) einhergegangen ist. Die vorliegende Studie ist ein Teilprojekt eines Verbundprojekts („Adapt Huhn“) und wurde in Kooperation mit dem Institut für Nutztiergenetik und dem Institut für Tierschutz und Tierhaltung, Friedrich-Loeffler- Institut (FLI), durchgeführt. Ziel der vorliegenden Dissertation war es, festzustellen,
2
ob verschiedene Hühnerlinien unterschiedliche Fähigkeiten besitzen, sich an eine niedrige Ca-Konzentration im Futter zu adaptieren. Es wurde der Effekt einer Ca-restriktiven Fütterung an Hühnerlinien unterschiedlicher Leistungsniveaus (zwei Hoch- und zwei Minderleistungslinien) auf Parameter der Ca-Homöostase und des Ca2+-Transports im Darm und in der Eischalendrüse untersucht. Der Effekt der gene- tischen Selektion auf Leistungseffizienz wurde außerdem vor unterschiedlichem phy- logenetischem Hintergrund untersucht, sodass auch zwischen Braun- und Weißle- gern unterschieden wurde. Neben Parametern der Eischalenqualität wurden Blutana- lysen durchgeführt, sowie strukturelle Untersuchungen an Geweben der Eischalen- drüse, des Dünndarms und der Niere.
3 2 Literaturübersicht
2.1 Die Ca-Homöostase beim Legehuhn
Im Körper wird Ca für viele verschiedene Funktionen benötigt, wie z.B. für die Kno- chenstabilität, für Hormonsekretion, Blutkoagulation, Muskelkontraktion und neurona- le Stimulation (HOENDEROP u. BINDELS 2005b; SCHOEBER et al. 2007). Auch wegen der Funktion als second messenger ist Ca für die Aufrechterhaltung physiolo- gischer Körperfunktionen ein essentielles Elektrolyt, dessen Konzentration im Blut einer strengen Regulation durch entsprechende Mechanismen unterliegt. Ca kann im Darm aus der Nahrung absorbiert, im Knochen durch Abbau mobilisiert und in dem Tubulussystem der Nieren rückresorbiert werden, sodass die gesamte Regulation der Ca-Homöostase über diese drei Organe stattfindet. Bei Legehennen wird der Ca-Gehalt im Blut durch einen Ca2+-sensing receptor (CaSR), der in der Neben- schilddrüse, in der Niere, im Darm und im Gehirn nachgewiesen werden konnte (DIAZ et al. 1997), detektiert und durch hormonelle Regulation auf eine Plasma- Ca2+-Konzentration von 1,26 – 1,58 mmol/l eingestellt (KOLLING et al. 1992). In der Nebenschilddrüse führen sinkende Ca2+-Konzentrationen, wie sie während der Eischalenkalzifizierung vorkommen, zu einer Sekretion von Parathormon (PTH), wel- ches wiederum die 1,25(OH)2D3-Synthese in der Niere stimuliert. Dies ist die hormo- nell aktive Form von Vitamin D, welche den transzellulären Ca2+-Flux erhöht, wodurch im Darm vermehrt Ca2+ absorbiert und in der Niere mehr Ca2+ rückresorbiert werden kann (s. Kapitel 2.1.2). PTH erhöht auch die Anzahl und Aktivität der Osteo- klasten, wodurch der Knochenabbau stimuliert wird und die dort gespeicherten Mine- ralien (Ca2+ und Pi) freigesetzt werden (HOENDEROP et al. 2005a).
Da die Eischale aus 2 bis 3 g Ca besteht, ist der Ca-Bedarf bei eierlegenden Hennen enorm gesteigert (BAR 2009). Die Futter- und somit die Ca-Aufnahme findet nur während der Lichtphase statt, daher befindet sich nach Ausschalten des Lichts und nach einer Retentionszeit des Futters von ca. 4 Stunden kein absorbierbares Ca mehr im Magen-Darm-Trakt (BAR 2009). Die Eischale wird aber zum großen Teil während der Dunkelphase gebildet wird, daher muss das benötigte Ca durch Mobili-
4
sierung von Knochengewebe bereitgestellt werden. Knochengewebe stellt etwa 30 %, die Absorption aus dem Darm 70 % des benötigten Ca bereit (MUELLER et al.
1964; KIM et al. 2007). Die Mobilisierung von Ca erfolgt hauptsächlich aus medullä- rem Knochengewebe, welches bei weiblichen Vögeln mit Beginn der Geschlechtsrei- fe unter dem Einfluss des Sexualhormons Östrogen gebildet wird (s. Kapitel 2.6.).
Bei einer täglichen Futteraufnahme der Hochleistungshennen von max. 115 g/Tag (LIEBOLDT et al. 2015) und einem empfohlenen Ca-Gehalt des Futters von 3,6 % bis 4 % (BAR 2009), nimmt eine Henne ca. 4,2 bis 4,6 g Ca pro Tag auf. Die Netto- Absorption von aufgenommenem Ca pro Tag beträgt ca. 70 bis 75 % (BAR et al.
2002), wobei diese von der Legetätigkeit abhängig ist. An Tagen der Eibildung ist die Futteraufnahme größer ist als an unproduktiven Tagen (MORRIS u. TAYLOR 1967;
T. TAYLOR u. KIRKLEY 1967). Gleichzeitig ist die Netto-Absorption von Ca an die- sen Tagen höher und die Ausscheidung über die Niere geringer (T. TAYLOR u.
KIRKLEY 1967).
2.1.1 Ca-Transport im Blut
Ca liegt im Blut entweder frei, an Bindungsproteine gebunden oder komplexgebun- den vor. Bei weiblichen Vögeln hängt die prozentuale Verteilung vom Reproduktions- status ab. Bei heranwachsenden Vögeln liegt der Gesamtcalciumspiegel im Blut bei ca. 2,5 mmol/l, wobei ca. 60 % davon als freie, ionisierte Form vorliegen (HURWITZ 1989). Durch den Einfluss von Östrogen (URIST et al. 1958) bei aktiver Legetätigkeit erreicht der Gesamtcalcium (Cat)-Spiegel Werte von bis zu 8 mmol/l (HURWITZ 1989). Hierbei nimmt vor allem das proteingebundene Ca zu, wodurch der prozen- tuale Anteil von ionisiertem Ca kleiner wird und nur noch etwa 20 % ausmacht (LUCK u. SCANES 1979a). Während eines Ovulationszyklus stellen sich die Ca2+-und Cat-Konzentrationen im Blut als Sinuskurve dar, bei der die Maximalwerte 3 bis 6 Stunden nach der Oviposition und die Minimalwerte 3 bis 6 Stunden vor der folgenden Oviposition erreicht werden (LUCK u. SCANES 1979a; KOLLING et al.
1992; RUSCHKOWSKI u. HART 1992). Diese Schwankungen im Blut kommen durch
5
eine Ca-Sekretion in der Eischalendrüse (ESG) zustande, die für die Bildung der Eischale notwendig ist.
Die Ca-Bindungsproteine werden in der Leber gebildet und transportieren das ge- bundene Ca in das Ovar, nicht etwa in die Eischalendrüse (URIST et al. 1958).
Ca-bindende Proteine sind unter anderem Albumin und Vitellogenin, letzteres wird im Ovar für die Eigelbsynthese in Lipovitellin und Phosvitin gespalten (URIST et al.
1958; GUYER et al. 1980). Da das gebundene Ca mit dem Protein in das Eigelb ein- gelagert wird, hat die Eigelbsynthese keine Einwirkung auf die ionisierte Ca2+-Konzentration im Blut (URIST et al. 1958). Für die Eischalenkalzifizierung wird hingegen nur das ionisierte Ca in der Eischalendrüse bereitgestellt. Die Ca2+-Konzentration im Blut ist deshalb repräsentativ für den Ca-Bedarf während der Eischalenkalzifizierung und für die Bereitstellung durch intestinale Absorption und Demineralisierung des Knochens (LUCK u. SCANES 1979a).
2.1.2 Vitamin D
Der Vitamin D-Metabolismus der Vögel ähnelt nach bisherigen Studien dem der Säugetiere grundsätzlich, er wurde allerdings bei Vögeln aber noch nicht im gleichen Maße erforscht. Im Gegensatz zu den meisten Säugetieren, ist bei Vögeln die Bioak- tivität des Vitamin D3 höher als die des Vitamin D2, da die aviären Bindungsproteine (VDBP) im Plasma Vitamin D3 deutlich stärker binden als Vitamin D2 (DELUCA et al.
1988). Im Folgenden wird der Vitamin D-Metabolismus am Beispiel Säugetier erläu- tert. Bestehen bekannte Unterschiede zum Geflügel, wird darauf hingewiesen.
Vitamin D3 wird über die Nahrung aufgenommen oder in der Haut durch ultraviolette Strahlung (270 - 300 nm) in Abhängigkeit von der Hauttemperatur aus 7-Dehydroxycholesterol synthetisiert (HOLICK 1981; JONES et al. 1998; BAR 2008).
Vitamin D3 selbst ist inert und muss zwei Hydroxylierungen durchlaufen, bevor es seine zwei Hauptfunktionen ausüben kann: Stimulation der intestinalen Ca2+- und Pi-Absorption und Ca2+- und Pi-Mobilisierung aus dem Knochen (HOLICK 1981;
DELUCA u. SCHNOES 1984; HAUSSLER et al. 1998). Die Bioaktivierung des Vita-
6
min D3 wird durch verschiedene Isoformen des Enzyms Cytochroms P450 (CYP) katalysiert (OMDAHL et al. 2002). Zuerst wird Vitamin D3 in den Mikrosomen und Mitochondrien der Leber vor allem durch die Isoform CYP2R1 (CHRISTAKOS et al.
2016) in 25-OHD3 umgewandelt, welches biologisch inaktiv ist (DELUCA 2004;
PROSSER u. JONES 2004; DUSSO et al. 2005; BAR 2008). Eine zweite Metaboli- sierung findet in den Mitochondrien der Niere statt, wo das Enzym 1-α-Hydroxylase (CYP27B1) die Bildung der hormonellen Form 1,25-(OH)2D3 katalysiert (PROSSER u. JONES 2004). Bei Hühnern konnte CYP27B1 nicht nachgewiesen werden, es wird daher angenommen, dass CYP27C1 das katalysierende Enzym ist (CHUN et al.
2014).
1,25(OH)2D3 ist die biologisch aktivste Form von Vitamin D3. Die Wirkung wird über den nukleären Vitamin D Rezeptor (VDR) vermittelt, der bei Vögeln bereits in Darm, Niere, Knochen, Nebenschilddrüse und Eischalendrüse identifiziert werden konnte (COTY 1980; SOARES et al. 1995). Durch die Rezeptorbindung bildet sich ein Kom- plex, der mit einem Retinoid-X-Rezeptor heterodimerisiert (KIMMEL-JEHAN et al.
1997; OMDAHL et al. 2002; DELUCA 2004; CHRISTAKOS et al. 2016). An den Ge- nen, die durch 1,25(OH)2D3 reguliert werden, befinden sich Vitamin D-responsive elements (VDREs), an die der Komplex binden kann (DELUCA 2004). Dadurch wird eine RNA-Synthese stimuliert, die für verschiedene Proteine kodiert. Dazu zählen u.a. Calbindin D28k, PMCA, TRPV5 und TRPV6, die am transzellulären Ca2+-Transport beteiligt sind (SIEBERT et al. 1982; CAI et al. 1993; BOUILLON et al.
2003). Dieser genomische Effekt von 1,25(OH)2D3 über den VDR tritt nach einer Zeit von 3 bis 24 Stunden verhältnismäßig langsam ein (BAR 2008). In der Literatur wur- de auch bereits ein unidirektionaler, nicht-genomischer durch 1,25(OH)2D3 vermittel- ter Mechanismus beschrieben, der zu einem schnell-induzierten Ca2+-Flux durch die Zelle führen kann (s. Kapitel 2.2.5). Hierbei handelt es sich um einen vesikulären Ca-Transportmechanismus (Transcaltachia) im Duodenum von Hühnern (NORMAN et al. 1997). Aufgrund der schnellen Wirkungsweise (NORMAN 2006) ist es wahr- scheinlich, dass 1,25(OH)2D3 vor allem während der Eischalenbildung den nicht- genomischen Weg stimuliert.
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Der basale Plasma-1,25(OH)2D3-Spiegel ist bei älteren Hennen mit etablierter Lege- tätigkeit signifikant höher als bei jungen Hennen (SEDRANI 1984; SOARES et al.
1988). Die Plasma-1,25(OH)2D3-Konzentrationen unterliegen bei Legehennen einer circadianen Rhythmik, die mit dem Ovulationszyklus assoziiert ist. Aufgrund des er- höhten Ca-Bedarfs zur Zeit der Kalzifizierung, ist der Plasma-1,25(OH)2D3-Spiegel kurz vor und während der Eischalenbildung am höchsten, die niedrigsten Werte sind in den ersten Stunden nach der Ovulation zu beobachten (ABE et al. 1979;
CASTILLO et al. 1979). Die Höhe der Plasmakonzentration ist mit dem Ca2+-Transport in der Eischalendrüse korreliert, sodass Legehennen mit einer höhe- ren Konzentration eine signifikant bessere Schalenqualität aufzeigen (SOARES et al.
1988). Eine Ca-Restriktion im Futter führt zu einem Anstieg der basalen Konzentrati- on um ca. 30 %, das Maximum während der Eischalenkalzifizierung kann um bis zu 80 % zunehmen (RUSCHKOWSKI u. HART 1992). Die mRNA-Expression des VDRs unterliegt im Darm keiner deutlichen Schwankung, in der Eischalendrüse ist sie aber bei Vorhandensein eines Eis erhöht (IEDA et al. 1995).
Die 25-Hydroxylierung in der Leber unterliegt keiner strengen Regulierung (JONES et al. 1998), sodass der 25-OHD3-Gehalt proportional zu der Vitamin D-Aufnahme ansteigt, daher ist der Plasma-Spiegel von 25-OHD3 ein guter Indikator für den Vita- min D3-Status (HOLICK 1981; BAR 2008). Die Bildung von 1,25-(OH)2D3 unterliegt hingegen einer feinen Regulierung durch den Plasma-Ca2+-Gehalt und PTH (SOARES et al. 1995; BAR 2008). Sinkt der Plasma-Ca2+-Spiegel, z.B. durch alimen- täre Ca-Restriktion, wird aus der Nebenschilddrüse PTH ausgeschüttet, welches die 1-α-Hydroxylase in der Niere stimuliert, wodurch 1,25(OH)2D3 synthetisiert wird (SOARES et al. 1995; HAUSSLER et al. 1998; JONES et al. 1998). Auch bei einem fütterungsinduzierten Vitamin D-Mangel sind vermutlich PTH und Ca2+ die Regulato- ren, die zu einem nachgewiesenen Anstieg von 1,25(OH)2D3 im Plasma führen (SEDRANI 1984). Zudem reguliert 1,25(OH)2D3 sich selbst, da es durch einen Feed- back-Mechanismus zu einer verringerten PTH-Freisetzung und einer Hemmung der 1-α-Hydroxylase führt, während gleichzeitig die 24-Hydroxylase stimuliert wird, die zu einer Inaktivierung des Hormons führt (BRUMBAUGH et al. 1975; HAUSSLER et al.
1998).
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Zusätzlich kann bei Legehennen von einer Regulierung der Synthese durch Prolaktin (SPANOS et al. 1976) und Sexualhormone ausgegangen werden. Während der Ge- schlechtsreife wird die Bildung von 1,25(OH)2D3 durch die Kombination von Östroge- nen und Androgenen stimuliert (NYS et al. 1984b); bei Beginn Legetätigkeit nimmt die Aktivität der 1-α-Hydroxylase in der Niere weiter zu (MONTECUCCOLI et al.
1977; CASTILLO et al. 1979).
Eine Inaktivierung der Vitamin D-Derivate wird über die 24-Hydroxylase (CYP24A1) vermittelt, die auch in der Niere exprimiert wird (JONES et al. 1998; BAR 2008, 2009). Maßgeblich für die Aktivität der verschiedenen Enzyme ist der Ca-Status des Tieres. Bei einer Hypercalcämie wird die 24-Hydroxylase hochreguliert, welche 25-OHD3 zu 24,25-(OH)2D3 und 1,25-(OH)2D3 zu 1,24,25-(OH)2D3 hydroxyliert, wäh- rend die 1-α-Hydroxylase (CYP27B1 oder CYP27C1) gehemmt wird (SOARES et al.
1995; JONES et al. 1998; CHUN et al. 2014), bei einer Hypocalcämie verhalten sich die Enzyme CYP24A1 und CYP27B1 reziprok.
Bei älteren Hennen nimmt die renale 1-α-Hydroxylierungs-Aktivität ab (JOYNER et al. 1987). Somit zeigen ältere Hennen eine schlechtere Anpassungsfähigkeit an eine Ca-Restriktion, wodurch vermehrt Eier schlechter Qualität produziert werden im Ver- gleich zu jungen Hennen (BAR u. HURWITZ 1987).
2.1.3 PTH
Die Nebenschilddrüsen spielen bei dem Erhalt der extrazellulären Ca2+-Konzentration eine wesentliche Rolle, da sie durch den Ca2+-sensing receptor (CaSR) kleinste Abweichungen vom physiologischen Blut-Ca-Spiegel erkennen (HOENDEROP et al. 2005a). Liegt eine Hypocalcämie vor, wird aus den Neben- schilddrüsen PTH sezerniert, welches eine Resorption von Knochengewebe durch Osteoklasten bewirkt, außerdem eine Rückresorption von Ca2+ in den Tubuli der Nie- ren und eine Stimulierung der 1-α-Hydroxylase, wodurch 1,25(OH)2D3 gebildet und die Ca2+-Absorption aus dem Darm gesteigert wird (SOARES et al. 1995;
HOENDEROP et al. 2005a). In Studien mit parathyreoidektomierten Ratten
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(HOENDEROP u. BINDELS 2005b) und Vögeln (DACKE et al. 1993) führte die nied- rige PTH-Konzentration im Serum zu einer Hypocalcämie, die sich durch eine PTH-Supplementierung normalisierte. PTH inhibiert außerdem die 24-Hydroxylase, sodass 1,25(OH)2D3 nicht inaktiviert wird (TANAKA et al. 1975). Somit gelten PTH und 1,25(OH)2D3 als die zwei Hauptregulatoren der Ca-Homöostase. Neben dem indirekten Effekt auf den Darm von Hühnern durch 1,25(OH)2D3, gibt es auch Hin- weise auf einen direkten Effekt von PTH auf die Enterozyten, da hier bereits PTH-Rezeptoren nachgewiesen werden konnten (PINHEIRO et al. 2012).
Vergleichbar mit 1,25(OH)2D3 unterliegt auch die PTH-Konzentration einer circadia- nen Schwankung in Assoziation mit dem Eibildungszyklus (s. Abbildung 1). Erhöhte Konzentrationen konnten während der Eischalenkalzifizierung bei gleichzeitig abge- fallenen Serum-Ca-Spiegeln nachgewiesen werden und niedrigste Werte waren mit Beenden der Kalzifizierung zu beobachten (VAN DE VELDE et al. 1984; SINGH et al. 1986). Eine Ca-Restriktion im Futter führt über den gesamten Ovulationszyklus zu einer Verdopplung der PTH-Konzentration (SINGH et al. 1986; YANG et al. 2013).
Im Knochen führt PTH zu einer schnellen Freisetzung von Ca2+ und Pi aus der Kno- chenmatrix durch Erhöhung der Osteoklasten-Anzahl und -Aktivität (PICOTTO et al.
1997; HOENDEROP et al. 2005a). So nehmen die Trabekeldicke und der Mineral- gehalt des medullären Knochens bei erhöhten PTH-Konzentrationen nachweislich ab (KERSCHNITZKI et al. 2014). Während physiologische Konzentrationserhöhungen vorwiegend das medulläre Knochengewebe ansprechen, bleibt der medulläre Anteil bei einer Ca-restriktiven Diät nahezu unverändert, dagegen nimmt der kortikale Anteil im Verlauf der Legezeit ab (TAYLOR u. MOORE 1954; TAYLOR u. BELANGER 1969; ZALLONE u. MUELLER 1969). TAYLOR (1970) vermutet, dass die unter- schiedlichen Resonanzen der Knochengewebe von der Höhe der PTH-Konzentration abhängt: Eine geringe Erhöhung während der Eischalenkalzifizierung hat vor allem einem Effekt auf das medulläre Knochengewebe und nur zu einem geringen Anteil auf das kortikale.
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Ein Ca-Defizit führt hingegen zu einer deutlich gesteigerten PTH-Sekretion, aus der eine höhere Resonanz des kortikalen Knochengewebes resultiert, während die ma- ximal mögliche Resonanz des medullären bereits erreicht worden ist. Während einer Eischalenkalzifizierung kommt es aufgrund erhöhter Knochenresorption zu anstei- genden Konzentrationen von Pi im Plasma (MILES et al. 1984). Erhöhte PTH-Konzentrationen wirken sich deshalb unterschiedlich auf die Mineralstoff- Ausscheidung in der Niere aus: während die renale Rückresorption von Ca2+ zu- nimmt, wird Pi vermehrt ausgeschieden durch tubuläre Exkretion (PRASHAD u.
EDWARDS 1973; WIDEMAN 1987).
2.1.4 Calcitonin
Calcitonin ist ein Peptidhormon, das bei Vögeln aus den Ultimobranchialkörpern se- zerniert wird (COPP et al. 1967) und durch eine Regulation der Knochenresorption
Abbildung 1: Relativer PTH-Plasma-Spiegel im Verlaufe eines Ovulationszyklus aus VAN DE VELDE et al. (1984)
Gemessen wurde über einen Zeitraum von 20 Stunden. Etwa 6 Stunden nach der Ovulation beginnt das frühe Stadium der Eischalenkalzifizierung, 22 Stunden nach der Ovulation ist die Eischalenkalzifizierung beendet. N-Zahlen variieren zwischen den Zeitpunkten (zwischen 1 bis 8).
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an der Ca-Homöostase beteiligt ist. Konzentrationsschwankungen von Calcitonin verändern die Aktivität von Osteoklasten, wobei hohe Konzentrationen die Knochen- resorption inhibieren (CHAMBERS u. MAGNUS 1982; DE VERNEJOUL et al. 1988;
HOFF et al. 2002). Eine Calcitonin-Sekretion wird über CaSR vermittelt (FELSENFELD u. LEVINE 2015) und entsteht als Reaktion auf eine Hypercalcämie;
somit stellt es einen Gegenpart zu PTH dar, welches bei Hypocalcämie aus der Ne- benschilddrüse sezerniert wird (HAROLD COPP et al. 1962). Interessanterweise füh- ren aber zumindest bei der Ratte beide Hormone zu einer gesteigerten renalen Syn- these von 1,25(OH)2D3 (MURAYAMA et al. 1999), welches durch einen Feedback- mechanismus wiederum die Calcitonin- und PTH-Synthese hemmt (NAVEH-MANY u. SILVER 1988). SHINKI et al. (1999) konnten einen Abfall der VDR-mRNA durch Calcitonin nachweisen und nehmen an, dass Calcitonin für die Aufrechterhaltung einer physiologischen 1,25(OH)2D3-Konzentration in normocalcämischen Tieren ver- antwortlich ist. Die Entdeckung und Benennung des Calcitonins erfolgte in den 1960er Jahren durch verschiedene Studien an Säugetieren und es wurde damals schon als hypocalcämischer Faktor identifiziert (SANDERSON et al. 1960; COPP u.
CAMERON 1961; COPP et al. 1962).
BAIMBRIDGE u. TAYLOR (1980) führten eine Studie an Hühner-Embryonen durch und kamen zu der Schlussfolgerung, dass Calcitonin im Embryo eine Hypercalcämie verhindern soll, die durch Ca-Verschiebungen aus der Eischale zum Embryo zustan- de kommen könnte. Von NAKAYAMA et al. (2011b) wurde eine Wirkung von Calcito- nin auf den Hypophysenvorderlappen beschrieben, wodurch die ACTH-Sekretion und schließlich die Corticosteron-Sekretion aus der Nebennierenrinde stimuliert wer- den. Daneben konnten NAKAGAWA-MIZUYACHI et al. (2009) eine Rezeptor- Linganden-Interaktion in den adrenokortikalen Zellen detektieren, weshalb auch ein direkter Effekt von Calcitonin auf die Nebennierenrinde angenommen werden kann.
Es wurde ein direkter Zusammenhang zwischen ovarieller und adrenaler Aktivität bei geschlechtsreifen Vögeln entdeckt (BAJPAYEE u. BROWN 1972), sodass erhöhte Corticosteron-Werte für die Aufrechterhaltung der Legetätigkeit wichtig sein könnten (KOHNE u. JONES 1976). Die Calcitonin-Aktivität auf den Hypophysenvorderlappen nimmt 3 Stunden vor der Oviposition durch die Wirkung von 17-ß-Estradiol und Pro-
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gesteron, welche die Bindungsaffiniät des Calcitonin-Rezeptors erhöhen, zu (NAKAYAMA et al. 2011a). Zur gleichen Zeit sind auch erhöhte Corticosteron-Werte im Blut zu messen (NAKAYAMA et al. 2011a). Da jedoch bei ultimobranchialekto- mierten, legenden Hühnern keine signifikanten Veränderungen in der Ca- Homöostase zu beobachten sind (SPEERS et al. 1970) und Mäuse ohne Calcitonin- Gen physiologische Elektrolyt- und Hormonkonzentrationen aufweisen (HOFF et al.
2002), konnte die Bedeutung des komplexen Wirkungsmechanismus noch nicht voll- ständig erfasst werden.
13 2.2 Transzellulärer Ca-Transport
Der Ca-Transport über ein Epithel (z.B. Darm oder Eischalendrüse) kann trans- oder parazellulär stattfinden. Der parazelluläre Transport erfolgt passiv durch tight junc- tions, welche im Interzellularraum für eine enge Verbindung der Epithelzellen ver- antwortlich sind, und ist von einem elektrochemischen Gradienten abhängig (s. Kapi- tel 2.3). Somit wird Ca2+ direkt zwischen zwei Kompartimenten ausgetauscht, wäh- rend Ca2+ bei dem transzellulären Weg über mindestens zwei Zellmembranen trans- portiert wird (HOENDEROP et al. 2005a). Hierbei tritt Ca2+ über Ionenkanäle ein, wird intrazellulär an Calbindine gebunden und so durch die Zelle transportiert, bis es auf der gegenseitigen Membran durch Ionenpumpen und Ionenaustauscher aktiv ausgeschleust wird. Dieser aktive Transport ist auch gegen einen transepithelialen Gradienten möglich. Die Mechanismen sind in Abbildung 2 schematisch dargestellt.
Abbildung 2: Modell der Ca2+-Absorption im Intestinaltrakt der Legehennen aus STAHL (2013) CaBPD28k = Calbindin D28k, NXC = Na+/Ca2+-Austauscher, PMCA = Plasmamembranständige Ca2+-ATPase, TRPV6 = transient receptor potential channel vanilloid-subfamily-member 6
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Neben diesen Vorgängen kann Ca2+ auch via Transcaltachia durch die Zelle trans- portiert werden (s. Kapitel 2.2.5). Dies ist ein schneller vesikulärer Transportprozess, bei dem Ca2+ durch Endo- und Exozytose die Zellmembranen passiert. Es ist be- kannt, dass die duodenale Ca2+-Absorption durch die Wirkung von 1,25(OH)2D3 zu Beginn der Eiproduktion ansteigt und dass diese durch eine alimentäre Ca-Restriktion noch weiter gesteigert werden kann (HURWITZ et al. 1973; BAR et al.
1984). Eine Ca-Restriktion und eine damit einhergehende erhöhte 1,25(OH)2D3- Synthese hat jedoch keinen direkten Effekt auf den Ca2+-Transport in der Eischalen- drüse (BAR et al. 1978), sodass vermutlich unterschiedliche Regulationsmechanis- men den epithelialen Ca2+-Transport in den beiden Organen bestimmen.
2.2.1 TRPV6 im Darm und in der Eischalendrüse
Der Ca2+-Influx in die Zelle findet entlang eines elektrochemischen Gradienten statt, da die Zelle negativ geladen ist und die Ca2+-Ionen positiv sind. Durch die niedrige intrazelluläre Ca2+-Konzentration entsteht ein 10 000-facher Konzentrationsgradient, durch den kein Energieaufwand für den Ca2+-Transport in die Zelle hinein notwendig ist (PENG et al. 2003; JONCHÈRE et al. 2012). Sowohl im Darm auf der apikalen (BOUILLON et al. 2003; PENG et al. 2003), als auch in der Eischalendrüse auf der basolateralen Membran (JONCHÈRE et al. 2012) konnte der transient receptor po- tential vanilloid channel type 6 (TRPV6) als ein Ca-Kanal beim Geflügel identifiziert werden. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass TRPV5 vorwiegend in renalem Ca2+-Transport involviert ist, wohingegen TRPV6 für die duodenale Ca-Absorption verantwortlich ist (PENG et al. 2003). Im Legedarm kommt TRPV6 auf der basolate- ralen Membran vor und wird in der Eischalendrüse, wo die Eischalenkalzifizierung stattfindet, im Vergleich zum Magnum vermehrt exprimiert (JONCHÈRE et al. 2012).
Die Regulation von TRPV6 wurde bisher nur am Säugetier in ausreichendem Maße erforscht. SCHOEBER et al. (2007) teilen die Regulationsmechanismen in zwei Ka- tegorien ein: Auf transkriptionaler und translationaler Ebene werden TRPV5 und TRPV6 durch Vitamin D, PTH und Östrogene reguliert, wohingegen die Kanalaktivität vom pH-Wert und von der Ca2+-Konzentrationen abhängig ist. Die Ca2+-abhängige
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Regulation der Aktivität wird über den ubiquitär vorkommenden Ca2+-Sensor Calmo- dulin vermittelt, welcher an die spezifische Bindungsdomäne des TRPV6 binden kann (LAMBERS et al. 2004). Bei hohen intrazellulären Konzentrationen von freiem Ca2+ wird der Ca2+-Influx auf diese Weise durch Calmodulin blockiert (VAN CROMPHAUT et al. 2001; PENG et al. 2003). Dieses negative Feedback wird größ- tenteils durch Calbindine verhindert, die sich in direkter Nachbarschaft der Kanäle befinden, Ca2+-Ionen binden und so für einen kontinuierlichen Ca2+-Einstrom sorgen (HOENDEROP et al. 2005a).
Durch eine Studie an Ratten konnte erstmals aufgezeigt werden, dass die Ca2+-Kanäle im Duodenum durch einen second messenger pathway aktiviert werden können (MASSHEIMER et al. 1994). Hierbei führt 1,25(OH)2D3 innerhalb von 1 - 10 min dosisabhängig zu einem erhöhten Ca2+-Influx.
Abbildung 3: Modell über den Mechanismus, wie 1,25(OH)2D3 über CaT1 (= TRPV6) und Calbin- din D9k den Ca2+-Einstrom reguliert, aus PENG et al. (2003)
In Abwesenheit von 1,25(OH)2D3 sind die CaT1- und Calbindin-Spiegel niedrig. Bei offenem CaT1- Kanal strömt Ca2+ ein und erhöht die intrazelluläre Ca2+-Konzentration, wodurch Calmodulin an den Kanal bindet und ihn schließt. In Anwesenheit von 1,25(OH)2D3 hält eine erhöhte Synthese von Calbindin und somit Bindung von Ca2+ die intrazelluläre, freie Ca2+-Konzentration gering. Hierdurch und durch eine erhöhte Expression von CaT1-Kanälen ist der Ca2+-Flux erhöht.
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Die Regulation der TRPV-Expression erfolgt durch Vitamin D. Einer Studie zufolge konnte eine signifikante Abnahme (> 90 %) der mRNA-Expression des TRPV6 bei VDR-KO Mäusen detektiert werden; bei Wildtypen konnte durch Injektion mit 1,25(OH)2D3 ein Anstieg der mRNA-Expression beobachtet werden (VAN CROMPHAUT et al. 2001). In der Niere von Vitamin D3-defizitären Ratten konnten sowohl die mRNA- als auch die Proteinexpression des TRPV5 durch 1,25(OH)2D3-Applikation gesteigert werden (HOENDEROP et al. 2001). Auch die TRPV6-Expression nahm im Dünndarm von Schafen durch eine Behandlung mit 1,25(OH)2D3 auf mRNA- und Proteinebene zu (WILKENS et al. 2011). Der Ca2+- Einstrom in Abhängigkeit der 1,25(OH)2D3-Konzentration ist in Abbildung 3 darge- stellt. Auch apikales H+ hat einen Einfluss auf die intrazelluläre Ca-Konzentration, da es zu einem pH-Wert Abfall führt, wodurch der Ca2+-Einstrom gehemmt wird (BINDELS et al. 1994).
Durch verschiedene Studien konnte gezeigt werden, dass auch Östrogene einen po- sitiven Effekt auf die TRPV6-Expression haben. So konnte eine Behandlung mit 17-β-Estradiol sowohl bei ovariektomierten Ratten, als auch bei 1-α-Hydroxylase KO-Mäusen die duodenale TRPV6-Expression erhöhen (VAN ABEL et al. 2003).
WEBER et al. (2001) konnten diese Ergebnisse jedoch nicht bestätigen und gehen deshalb von einer Regulation durch die extrazelluläre Ca2+-Konzentration aus. VAN ABEL et al. (2003) unterstützen diese These, denn sie führten ein Experiment mit einer Ca-reichen Diät durch und konnten eine gesteigerte TRPV6-Expression, sowie erhöhte Ca-Gehalte im Serum nachweisen.
Die Rolle von PTH für die Expression der TRPVs konnte bisher vor allem in Bezug auf TRPV5 festgestellt werden. Nach einer Parathyreoidektomie bei Ratten ging der abnehmende PTH-Spiegel im Blut mit einer Abnahme der renalen TRPV5-Konzentration und des Serum-Ca-Spiegels einher, welche beide durch PTH-Supplementierung wieder zugenommen haben (HOENDEROP u. BINDELS 2005b). YANG et al. (2013) konnten außerdem einen Zusammenhang zwischen PTH und TRPV6 in der Eischalendrüse bei Hennen feststellen: Während der Eischalen- kalzifizierung nahm sowohl die PTH-Konzentration im Plasma als auch die uterine
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TRPV6-Genexpression zu. Diese Autoren konnten zudem durch immunohistochemi- sche Studien den TRPV6 auf der apikalen Membran in der Eischalendrüse nachwei- sen, was vermuten lässt, dass dieser Kanal am aktiven Transport von Ca2+ in das Lumen der Eischalendrüse involviert ist. Im Gegensatz dazu konnten JONCHÈRE et al. (2012) keine Modulation der TRPV6-Expression durch eine stattfindende Eischa- lenkalzifizierung nachweisen. Diese Autoren vermuten außerdem, dass sich der Ka- nal auf der basolateralen - nicht auf der apikalen - Membran befindet, über die das Ca2+ von dem Blut in die Zelle strömt.
Die Ergebnisse einer Dissertation von STAHL (2013) weisen jedoch darauf hin, dass noch keine validen Methoden zur Untersuchung der TRPV6-Expression bei Hühnern existieren. Unter Verwendung der gleichen Primer wie JONCHÈRE et al. (2012) konnte keine ausreichende RNA-Expression nachgewiesen werden, um eine Aus- wertung vorzunehmen. Auch die Proteinexpression blieb bei Verwendung des glei- chen primären Antikörpers wie bei YANG et al. (2013) ergebnislos. Eine deutliche Bande, die nach Inkubation bei 100 kDa, anstatt bei den erwarteten ca. 80 kDa er- schien, erwies sich nach Sequenzierung als Hitzeschockprotein und nicht als TRPV6. Auch in einer anderen Studie konnte keine TRPV6-RNA im Darm von Hüh- nern nachgewiesen werden, dafür wurden calcium voltage-gated channel subunit alpha 1 C (CaCNA1C) und subunit alpha 1 D (CaCNA1D) hoch exprimiert (GLOUX et al. 2018). Die Autoren vermuten, dass diese Gene die Abwesenheit von TRPV6 kompensieren und für einen apikalen Ca-Einstrom sorgen.
2.2.2 Calbindin D28k im Darm und in der Eischalendrüse
Calbindine sind Proteine, die Ca2+ binden und die Ionen vermutlich durch die Epithel- zelle transportieren (Wassermann, Taylor, 1968; Bar 1973b). Durch die Proteinbin- dung bleibt zudem die intrazelluläre Konzentration von freien Ca-Ionen gering, so- dass die physiologische Funktion von second messenger-Systemen nicht beeinflusst wird. Bei Vögeln kommt hauptsächlich nur Calbindin D28k vor, im Gegensatz zu Säu- getieren, in deren Darm vorwiegend Calbindin D9k zu finden ist (HUNZIKER 1986;
WASSERMAN et al. 1991). Calbindin D28k kann bis zu vier Ca2+-Ionen binden, aber
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auch andere zweiwertige Kationen (z.B. Zn2+), durch welche die Ca2+-Bindungsfähigkeit gestört werden kann (OMAR et al. 2016). Die Transportfunk- tion kann angenommen werden, da die Konzentration von Calbindin positiv mit dem Ca2+-Transport in der Zelle korreliert (WASSERMAN u. TAYLOR 1968; BAR et al.
1992). Im Darm lässt die Höhe der Calbindin-Expression deshalb auf die Absorpti- onsrate von Ca schließen (CORRADINO et al. 1968b). Bei Hühnern sind die Kon- zentrationen in den proximalen Dünnarmabschnitten höher als in den distalen, was darauf hinweist, dass die aktive Ca-Absorption in proximalen Bereichen am höchsten ist (WASSERMAN u. TAYLOR 1968; SUGIYAMA et al. 2007).
2.2.2.1 Regulation in der Niere und im Darm
In der Niere und in dem Darm werden Calbindine durch 1,25(OH)2D3 reguliert (HUNZIKER 1986; CRAVISO et al. 1987), welches durch Bindung an einen VDR im Zellkern die mRNA-Synthese stimuliert, die wiederum für das Protein kodiert (TAYLOR u. WASSERMAN 1967; BAR 2008). Zwischen der Plasmakonzentration von 1,25(OH)2D3 und intestinalem Calbindin besteht somit eine enge Korrelation (BAR u. HURWITZ 1979a; NYS et al. 1992a), die auf transkriptionaler Ebene regu- liert wird (SIEBERT et al. 1982). Die nukleäre Wirkung von 1,25(OH)2D3 konnte auch durch eine Studie mit Actinomycin D verdeutlicht werden, denn dieses Zytostatikum konnte durch Bindung an die DNA und Blockierung der RNA-Synthese die intestinale Calbindin-Synthese verhindern (CORRADINO u. WASSERMAN 1968a).
2.2.2.2 Regulation im Darm in Abhängigkeit von dem Reproduktionsstatus
Die Regulation der Calbindin-Expression unterscheidet sich bei Hennen abhängig von ihrer Reife. Die Geschlechtsreife und der Beginn der Legetätigkeit bewirken im Darm eine erhöhte mRNA- und Proteinexpression und somit Ca-Absorption (HURWITZ et al. 1973; MONTECUCCOLI et al. 1977; NYS et al. 1992a). Dies ist mit ansteigenden Konzentrationen von Sexualhormonen und Vitamin D-Metaboliten as- soziiert (MONTECUCCOLI et al. 1977; CASTILLO et al. 1979; NYS et al. 1992a).
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Dabei führt der erhöhte Östrogen-Spiegel kombiniert mit dem zirkulierenden Testos- teron zu einer Stimulation der renalen 1-α-Hydroxylase, was wiederum zu einer er- höhten 1,25(OH)2D3-Synthese führt (NYS et al. 1992a). Hierbei potenziert Testoste- ron Östrogen. Mit Östrogen alleine können keine so starken Anstiege von 1,25(OH)2D3 und somit auch von Calbindin erreicht werden (WASSERMAN u.
TAYLOR 1968; NYS et al. 1992a). Es ist jedoch noch unklar, ob es neben den Sexu- alhormonen noch andere Faktoren gibt, die zu einer 1,25(OH)2D3-Synthese führen.
Bei legenden Hennen spielt lediglich Vitamin D eine wesentliche Rolle, da in Abwe- senheit von Vitamin D kein Anstieg der Proteinexpression beobachtet werden kann, auch wenn diese Hennen mit Östrogen und Testosteron behandelt wurden (NYS et al. 1992a). Wird während einer Kalzifizierung vermehrt Ca2+ benötigt, sinken zu- nächst die Plasma-Ca-Spiegel, es kommt zu einer regulativen Erhöhung der 1,25(OH)2D3-Konzentration und die Proteinexpression steigt (NYS u. DE LAAGE 1984a). Die höchsten 1,25(OH)2D3-Konzentrationen sind direkt vor und während der Eischalenkalzifizierung nachzuweisen (CASTILLO et al. 1979). Allerdings zeigt eine aktuelle chinesische Studie, dass Östrogen auch bei Legehennen einen Effekt haben kann, da bei einem iatrogenen Östrogendefizit eine signifikante Abnahme an duo- denaler Calbindin mRNA-Expression zu beobachten ist (LI et al. 2018).
Wird die Eischalenkalzifizierung inhibiert, nehmen die Plasma- 1,25(OH)2D3-Konzentration und die Calbindin-Expression im gesamten Dünndarm signifikant ab. Bei zusätzlicher 1,25(OH)2D3-Injektion erreicht die Calbindin- Expression jedoch die Werte der Kontrolltiere (NYS u. DE LAAGE 1984a; NYS et al.
1992a). Eine Legepause führt zu einer ähnlichen Abnahme von 1,25(OH)2D3 und Calbindin (MONTECUCCOLI et al. 1977).
2.2.2.3 Regulation in der Eischalendrüse
In der Eischalendrüse führt 1,25(OH)2D3 nach Etablierung der Legetätigkeit zu kei- nen signifikanten Veränderungen (NYS et al. 1989), da weder endogenes, noch exo- genes 1,25(OH)2D3 einen Effekt auf die Calbindin-Konzentration hat (NYS et al.
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1989; BAR et al. 1990). Eine regulative Rolle kann aber laut OHIRA et al. (1998) nicht ausgeschlossen werden, da eine Injektion von 1,25(OH)2D3 in das Lumen der Eischalendrüsen zur Zeit der Kalzifizierung zu einer höheren Calbindin-Expression führt. Allerdings sind bei einer Ca-defizitären Fütterung, die zu einer gesteigerten 1,25(OH)2D3-Synthese führt, keine Veränderungen (BAR et al. 1978; NYS et al.
1989) bzw. sogar Abnahmen (BAR et al. 1984; NYS et al. 1992b) der Calbindin- Expression in der Eischalendrüse zu beobachten.
Es gibt Hinweise darauf, dass die Regulation durch den Ca2+-Flux selbst stattfindet, etwa über einen second messenger pathway (NYS et al. 1992b), und somit abhängig von der Ca2+-Konzentration im Plasma ist (WASSERMAN u. TAYLOR 1968; NYS et al. 1989; BAR et al. 1992). Pausiert die Legetätigkeit natürlicherweise, sind deutliche Abnahmen in der mRNA- und Proteinexpression zu beobachten, während 1,25(OH)2D3 unverändert bleibt (WASSERMAN u. TAYLOR 1968; BAR et al. 1978;
BAR et al. 1990a; BAR et al. 1992). Auch eine Inhibition der Eischalenkalzifizierung durch Acetazolamid (BAR et al. 1992) oder eine frühzeitige Oviposition (NYS et al.
1992b; IEDA et al. 1995) führen zu einer starken Verminderung der mRNA- Expression. Östrogen hat hier keinen Einfluss, es führt lediglich zu Beginn der Ge- schlechtsreife zu einer erhöhten Calbindin-Expression in der Eischalendrüse (NYS et al. 1992b). Zu dieser Zeit stimuliert FSH das Wachstum der Follikel, die wiederum Östrogen produzieren (BAIN et al. 2016). Dieses Hormon führt zu einem Wachstum des Legedarms und der Eischalendrüse, was mit einer steigenden Calbindin- Expression assoziiert ist (NYS et al. 1992b). Dies ist auch durch eine Injektion des Hormons bei unreifen Hennen induzierbar, was durch eine kombinierte Injektion mit Testosteron noch zu einer weiteren Steigerung führt (NYS et al. 1986c). Während die mRNA- und Proteinexpression in der Eischalendrüse während der Geschlechtsreife nur geringfügig ansteigt, findet erst ein deutlicher Anstieg mit Beginn der Legetätig- keit bzw. mit Kalzifizierung des ersten Eis statt (WASSERMAN u. TAYLOR 1968;
NYS et al. 1989; BAR et al. 1992).
Studien zufolge bleibt die Proteinexpression während eines Legezyklus weitestge- hend konstant, während die mRNA-Expression starke Schwankungen aufweist, die
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mit der Eischalenkalzifizierung assoziiert sind (NYS et al. 1989; BAR et al. 1992;
IEDA et al. 1995). Die niedrigsten Werte sind 4 Stunden post ovulationem zu finden und die höchsten während der Kalzifizierung, nämlich 12 und 18 Stunden nach der Ovulation (NYS et al. 1989, YANG et al. 2013). Diese Divergenz zwischen mRNA- und Proteinexpression bei etablierter Legetätigkeit lässt auch auf eine post- transkriptionale Regulation von Calbindin in der Eischalendrüse schließen (NYS et al.
1989). Unterschiede zwischen den Expressionen können aber auch aus verschiede- nen Halbwertzeiten resultieren, denn die des Proteins überdauert mit 1 bis 2 Tagen die der mRNA deutlich (NYS et al. 1989; BAR et al. 1992). Eine Studie von BAR et al. (1984) konnte außerdem aufzeigen, dass die Calbindin-Expression bei Hennen, die schwere Eischalen produzierten, größer ist als bei denen, die leichte produzier- ten. IEDA et al. (1995) verweisen auch auf die mechanische Stimulation durch das Ei selbst, da eine vorzeitige Eiablage zu einem verminderten Ca2+-Flux und zu einer reduzierten Genexpression führt.
Eine Regulation durch PTH ist unwahrscheinlich, da sowohl bei parathyreoidekto- mierten als auch bei nicht-parathyreoidektomierten Tieren die Calbindin-Expression in der Eischalendrüse zur Zeit der Kalzifizierung zunimmt (VAN DE VELDE et al.
1984; YANG et al. 2013).
2.2.2.4 Ca2+-abhängige Regulation im Darm
Auch im Darm wird eine zusätzliche Regulation durch die Ca2+-Konzentration ange- nommen: Wenn der Ca-Einstrom durch Blockierung der Ca2+-Kanäle verhindert wird, nimmt auch die intestinale Calbindin-Expression ab (SCHOEBER et al. 2007). Eine Ca-Restriktion im Futter führt zu niedrigeren Plasma-Ca-Spiegeln und im Gegensatz zu der Eischalendrüse zu einer höheren intestinalen Proteinexpression (BAR et al.
1979b; THEOFAN et al. 1987). Umgekehrt bedeutet dies, dass bei steigenden Ca- Gehalten des Futters und somit steigenden Plasma-Ca-Spiegeln das intestinale Calbindin und die Transportfähigkeit des Calbindins abnehmen (BAR u. HURWITZ 1979a; BAR et al. 1979b; THEOFAN et al. 1987). Dabei bleibt die mRNA-Expression im Darm in den Fütterungsgruppen unverändert, was auf einen post-transkriptionalen
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Effekt hindeutet, der durch veränderte Ca2+- und Pi-Werte im Blut hervorgerufen wer- den könnte, welche die Translation der mRNA oder die Umsatzrate des Proteins be- einflussen (THEOFAN et al. 1987; NYS et al. 1992a). Niedrige Ca-Gehalte im Futter führen somit zu einer höheren Absorptionsrate, die absolute Ca-Retention ist jedoch geringer als bei hohen Ca-Konzentrationen (SUMMERS et al. 1976).
2.2.2.5 Weitere Funktionen von Calbindin
Calbindine haben neben dem Ca2+-Transport vermutlich auch als Ca-Puffer eine Schutzfunktion für die Zelle (VAN CROMPHAUT et al. 2001; BOUILLON et al. 2003;
CHRISTAKOS et al. 2003; JONCHÈRE et al. 2012). Eine hohe cytosolische Kon- zentration von freiem Ca2+ kann zu einer zellulären Degeneration und Apoptose füh- ren (CHRISTAKOS et al. 2007). Darüber hinaus könnte Calbindin zur Stimulation der Ca2+-Ausschleusung aus der Zelle durch Bindung an die plasmamembranständige Ca2+-ATPase beitragen (BOUILLON et al. 2003). Es wird auch diskutiert, ob Calbin- din in der Niere den chemischen Gradienten für die Funktionsfähigkeit des TRPV5 aufrechterhält (LAMBERS et al. 2006).
2.2.3 PMCA im Darm und in der Eischalendrüse
Für die Ausschleusung von Ca2+ aus der Zelle heraus sind hauptsächlich zwei Transporter verantwortlich: eine plasmamembranständige Ca2+-ATPase (PMCA) und ein Na+/Ca2+-Austauscher (NCX) (BOUILLON et al. 2003; HOENDEROP et al.
2005a). Da der Transport gegen einen elektrochemischen Gradienten stattfindet (JONCHÈRE et al. 2012), ist Energieaufwand nötig, es handelt sich also um einen aktiven Transport. Die Isoformen der PMCAs (PMCA1-4) werden von vier unabhän- gigen Genen kodiert (HOENDEROP et al. 2005a). Durch splicing entstehen noch weitere Isoformen, sodass inzwischen über 30 verschiedene Isoformen entdeckt werden konnten (BOUILLON et al. 2003). Während PMCA2 und 3 gewebespezifisch sind, ist das Vorkommen von PMCA1 und 4 ubiquitär (STAUFFER et al. 1993;
BOUILLON et al. 2003). Dies deutet laut STAUFFER et al. (1993) darauf hin, dass
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PMCA1 und PMCA4 an der Erhaltung der zellulären Ca-Homöostase beteiligt sind.
Im Dünndarm von Säugetieren und Vögeln ist die PMCA1b das dominante Isomer (BOUILLON et al. 2003), in der Eischalendrüse von Vögeln wird PMCA1 nur gering- fügig exprimiert (JONCHÈRE et al. 2012).
Im Darm wird Ca2+ über die basolaterale Membran einer Zelle herausgeschleust, wohingegen in der Eischalendrüse das Ca2+ über die apikale Membran in das Lumen transportiert wird (WASSERMAN et al. 1991). In diesem Organ ist die PMCA4 vor- herrschend (JONCHÈRE et al. 2012). In einer Studie mit Enten konnte bereits nach- gewiesen werden, dass eine Abnahme der uterinen Ca2+-ATPase zu dünneren Eischalen führt (LUNDHOLM 1997). Funktionelle Untersuchungen konnten außer- dem zeigen, dass durch Hemmung der uterinen PMCA der Ca2+-Flux verringert wird (STAHL 2013). Somit kann auch in Bezug auf die Eischalendrüse angenommen werden, dass die PMCA hauptsächlich für die Ausschleusung von Ca2+ verantwort- lich ist.
Die intestinale mRNA-Expression bei Säugetieren und nicht-legenden Vögeln wird von Vitamin D reguliert und von den Faktoren, die den Vitamin D-Metabolismus be- einflussen (WASSERMAN et al. 1992; CAI et al. 1993). Durch Studien konnte nach- gewiesen werden, dass die duodenale mRNA-Expression bei Vitamin D-defizitären Hühnern abnimmt und durch eine Injektion mit 1,25(OH)2D3 erhöht werden kann (ZELINSKI et al. 1991; CAI et al. 1993). Auch die Aktivität der Ca2+-Pumpe kann durch diese Behandlung gesteigert werden (JOHNSON u. KUMAR 1994). NYS u. DE LAAGE (1984a) zeigten in ihrer Studie einen ähnlichen Effekt: Durch Fütterung einer Ca-restriktiven Diät (1,1 % Ca) und gleichzeitiger Verhinderung der Eischalenkalzifi- zierung, nahm die Aktivität der duodenalen PMCA signifikant ab. Durch zusätzliche Supplementation von 1,25(OH)2D3 konnten dann wieder die Werte wie in der Kon- trollgruppe erreicht werden. Auch eine alleinige Ca-Restriktion führt nachweislich zu einer Erhöhung der intestinalen mRNA-Expression und Aktivität der PMCA (WASSERMAN et al. 1992; CAI et al. 1993; CENTENO et al. 2004).
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Auch bei legenden Hennen konnte eine erhöhte Aktivität der jejunalen und uterinen PMCA durch Vitamin D-Supplementierung nachgewiesen werden (GRUNDER et al.
1990).
Ein anderes Studienergebnis weist jedoch darauf hin, dass die uterine PMCA durch Östrogene, nicht durch 1,25(OH)2D3 reguliert wird (QIN et al. 1993). In einer Studie mit sechs Wochen alten Hühnern konnte durch Applikation von 17-ß-Estradiol die ATPase-Aktivität in der Eischalendrüse erhöht werden, aber nicht die im Darm (QIN et al. 1993). Vergleichend zu der Calbindin-Konzentration in der Eischalendrüse kann auch in Bezug auf die PMCA eine Regulation durch den Ca2+-Flux an sich nicht aus- geschlossen werden (BAR 2008). Daneben kann auch eine gewisse Abhängigkeit der duodenalen PMCA von dem Östrogenspiegel angenommen werden, weil legen- de Hennen, die durch tägliche orale Gabe von Letrozol ein Östrogendefizit aufwie- sen, eine signifikante Abnahme der duodenalen mRNA-Expression von PMCA1b zeigten, was mit einem niedrigeren Plasma-Ca-Spiegel einherging (LI et al. 2018).
2.2.4 NCX im Darm
Der Na+/Ca2+-Austauscher (NCX) kommt an der basolateralen (Darm) oder apikalen (Eischalendrüse) Membran vor und tauscht Ca2+ und Na+ in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:3 aus (BAKER et al. 1969). Es gibt drei bekannte Isoformen, die von verschiedenen Genen kodiert werden. Der NCX1 kommt im Gewebe von Säugetie- ren ubiquitär vor, während der NCX2 und NCX3 nur im Gehirn und Skelettmuskel vorkommen (LI et al. 1994; NICOLL et al. 1996). Auch bei Vögeln konnte der NCX bereits im Intestinaltrakt (CENTENO et al. 2004), im Herzen (SHEPHERD et al.
2007) und in der Niere (LI et al. 2018) nachgewiesen werden. Da bisher noch keine spezifischen NCX-Hemmer vorhanden sind, kann die Relevanz dieses Transporters für den Ca2+-Transport nicht vollständig geklärt werden. Basierend auf verschiedenen Studienergebnissen kann aber angenommen werden, dass der NCX1 in der Niere eine wichtige Funktion übernimmt und primär für die Ca2+-Extrusion verantwortlich ist, wohingegen er im Darm nur eine kleine Rolle spielt (HOENDEROP et al. 2005a;
BAR 2009).