Instestinaltrakt

Der Intestinaltrakt wurde zusammen mit dem Legedarm nach Eröffnung der Bauch-höhle entnommen. Es folgte eine Präparation des Konvoluts zur Ansicht der einzel-nen Darmabschnitte. Das gesamte Duodenum und der distale Teil des Ileums wur-den abgetrennt und in eisgekühlte physiologische Kochsalzlösung gelegt. Die Darm-abschnitte wurden am Mesenterialansatz aufgeschnitten und in der physiologischen Kochsalzlösung gespült. Der Darm wurde mit der luminalen Seite nach oben auf eine gekühlte Glasplatte gelegt. Durch Abschabung mit einem Objektträger wurde die Tu-nica mucosa abpräpariert. Die präparierte TuTu-nica mucosa wurden in flüssigem Stick-stoff eingefroren und in ein Scintillationsgefäß überführt. Die Zeit zwischen Tötung und Einfrieren des Gewebes betrug max. 20 bis 30 min.

47 3.2.4.2 Eischalendrüse

Der Legedarm wurde nach Entnahme zur Übersicht ausgebreitet und es wurde do-kumentiert, ob Dotterkugeln im Ovar vorhanden waren. Die Eischalendrüse, die als sackartige Erweiterung zwischen Vagina und Eileiter erkennbar ist, wurde abgetrennt und aufgeschnitten. Es wurde dokumentiert, ob sich ein Ei in Kalzifizierung in der Eischalendrüse befand. Das Gewebe wurde in gekühlte physiologische Kochsalzlö-sung gelegt. Die weitere Vorgehensweise war identisch mit der Präparation des Darmgewebes.

3.2.4.3 Niere

Das Nierengewebe wurde nach Entfernung des Darmkonvuluts und des Legedarms in der dorsalen Bauchhöhle sichtbar. Ein etwa 1 mal 0,5 cm großer Bereich wurde mit einem scharfen Löffel entfernt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und in ein Scin-tillationsgefäß überführt. Zwischen Tötung und Gewebeentnahme lagen max. 10 min.

48 3.3 Methoden

3.3.1 Blutprobenanalyse 3.3.1.1 Ca²⁺ im Vollblut

Die Messung des ionisierten Ca-Gehalts im Vollblut wurde unverzüglich nach der Blutprobenentnahme mit dem Blutgas-Analysesystems RAPIDLab 348EX (Siemens Healthcare GmbH) durchgeführt. Während maximalen Wartezeiten von 20 min wur-den die Proben auf Eis gelagert.

3.3.1.2 Cat im Plasma

Für die Messung des Gesamtcalciums (Cat) im lithiumheparinisierten Plasma wurden Proben aus -20° C bei Raumtemperatur aufgetaut. Alle zu verwendenden Lösungen wurden vor Verwendung aus dem Kühlschrank genommen und auf Raumtemperatur gebracht. Für die spätere Berechnung der Konzentrationen wurden ein Leerwert so-wie eine Standardreihe mit bekannten Ca-Konzentrationen (0,1; 0,5; 1; 2; 3; 4;

5 mmol/l) aus einer 10 mM-Stammlösung angesetzt. Nach einer 1:2 Verdünnung der Proben und Standards mit Tris wurden 9,5 µl mit einer 8-fach Pipette in Doppelan-satz in eine Mikrotiterplatte pipettiert. In jede Vertiefung wurden erst 185 µl einer Lö-sung gegeben, die 2-Amino-2-Methylpropanol enthielt (pH 10,7). Dann kamen 185 µl einer Lösung hinzu, die o-Kresolphthalein-Komplexon mit 8-Hydroxychinolin enthielt.

Ca bildet mit o-Kresolphthalein-Komplexon in alkalischer Lösung einen violetten Komplex. Nach Inkubation für 10 min konnte mittels eines Tecanreaders (Infinite®

M200, Tecan Trading AG) und einer Magellan™ 7.1-Software (Tecan Trading AG) bei einer Wellenlänge von 570 nm die Intensität der violetten Färbung gemessen werden, welche sich direkt proportional zu der Ca-Konzentration verhält. Die Extink-tions- und Konzentrationswerte der Standardreihe bildeten eine lineare Regression, durch die aus den Extinktionswerten der Proben die Konzentrationen des Cat be-rechnet werden konnten. Wegen der vorangegangenen Verdünnung mussten die Werte mit zwei multipliziert werden. Als Kontrollproben wurden Precinorm und ein

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„Plasma-Mix“, der aus 5 Hühner-Plasma-Proben gepoolt wurde, auf jeder Platte mit-geführt, aus denen der inter-assay Variationskoeffizient bestimmt werden konnte.

Alle Reagenzien für diese Methode (Standard, Lösung 2, Lösung 3, Tris) wurden selbst hergestellt (s. Tabelle 2). Der inter-assay Variationskoeffizient betrug 6,3 % der intra-assay Variationskoeffizient 5,1 %.

Tabelle 2: Zusammensetzung der Reagenzien, welche für die Cat-Messung verwen-det wurden

0,147 g abwiegen und in 100 ml A.dest. lösen.

Lösung 2

2-Amino-2-Methylpropanol 3,5 mM

156 g

2-Amino-2-Methylpropanol (FW 89,14 g/l) abwiegen und mit ca. 300 ml A.dest. auffüllen.

50 3.3.1.3 Pi im Plasma

Die lithiumheparinisierten Plasmaproben wurden aus -20° C bei Raumtemperatur aufgetaut. Alle zu verwendenden Lösungen wurden vor Verwendung auf Raumtem-peratur gebracht. Vor der Bestimmung wurde eine Enteiweißung mit einer TCA-Lösung durchgeführt. Es wurde ein Leerwert und eine Standardreihe mit be-kannten Phosphat-Konzentrationen (0,5; 1; 1,5; 2,5; 3,5; 5; 6 mmol/l) aus einer 6mM-Stammlösung angesetzt. Nach Verdünnung der Proben und Standards mit TCA in einem Verhältnis von 1:10 wurde für 10 min mit 3000 U/min bei 4 °C (GS-15R Zentrifuge, Beckmann) zentrifugiert. Die Überstände wurden in neue Röhrchen ge-gossen und hieraus wurden 100 µl mit einer 8-fach Pipette in Doppelansatz in eine Mikrotiterplatte pipettiert. Es kamen zwei Lösungen à 100 µl hinzu, die Ammonium-vanadat mit Salpetersäure bzw. Ammoniummolybdat mit Schwefelsäure enthielten.

Das anorganische Phosphat bildet in salpetersaurer Lösung mit Molybdat und Vana-dat einen gelben Farbkomplex. Nach 10-minütiger Inkubation konnte die Farbintensi-tät nach gleichem Prinzip wie bei der Cat-Messung, aber bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen werden. Auch hier wurden Precinorm und der „Plasma-Mix“ als Kontrollproben mit aufgetragen.

Auch die Reagenzien für diese Methode (Standard, Lösung 1, Lösung 2, TCA) wur-den selbst hergestellt (s. Tabelle 3). Der inter-assay Variationskoeffizient betrug 6,2 % der intra-assay Variationskoeffizient 4,0 %.

51

Tabelle 3: Zusammensetzung der Reagenzien, welche für die Pi-Messung verwen-det wurden

Lösung 1 Ammoniumvanadat 21 mM

1,23 g Ammoniumvanadat (FW 117,0 g/l) abwiegen und in 500 ml 0,28 N HNO3

abgedunkelt lösen.

Lösung 2 Ammoniummolybdat 40 mM

24,72 g Fa. ids® verwendet, welcher für humanes Serum und Plasma entwickelt wurde. Bei diesem Assay konkurrieren das 25-OHD3 aus der Probe und Biotin-markiertes-25-OHD3 um die Antikörper, mit denen die Platte beschichtet ist. Mit Peroxidase markiertes Avidin wird hinzugegeben und es kommt zu einer Bindung des Biotins mit dem Avidin. Durch ein chromogenes Substrat (TMB) entsteht eine Farbreaktion, die rechtzeitig durch eine Stopplösung beendet wird, sodass die Farbintensität noch im zu detektierenden Bereich liegt.

Die lithiumheparinisierten Proben wurden aus -20 °C bei Raumtemperatur aufgetaut und anschließend für 5 min bei 14.000 rpm abzentrifugiert. Gleichzeitig wurden alle Reagenzien für mindestens 90 min auf Raumtemperatur gebracht. Zuerst wurden 25 µl von jedem der sieben Standards (0; 6,5; 12; 20,2; 33,2; 51,6; 96,8 ng/ml), von

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jeder Kontrolle (Sollwerte 12,8 und 52 ng/ml) und jeder Probe in ein neues Röhrchen pipettiert. In jedes Röhrchen wurde 1 ml eines Freisetzungsreagenz hinzugegeben, das Biotin-markiertes 25-OHD3 enthielt. Anschließend wurden hieraus 200 µl in die Vertiefungen der mit Antikörper beschichteten Platte in Doppelansatz gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden bei 23 °C wurden die Vertiefungen 3 mal mit 250 µl einer Waschlösung gewaschen und schließlich auf einem Tuch ausgeklopft.

Es wurde dann ein Enzymkonjugat hinzugegeben und 30 min bei 23 °C inkubiert.

Der oben genannte Waschschritt wurde wiederholt, anschließend wurde ein Tetra-methylbenzidin-Substrat in die Vertiefungen hinzugegeben. Es folgte wieder eine Inkubation bei 23 °C, nach 30 min wurde die Reaktion mit 100 µl einer Stopplösung beendet. Hierbei änderte sich die Farbe von hellblau zu gelb. Die Absorption wurde mit Hilfe eines Tecanreaders (Infinite® M200, Tecan Trading AG) und einer Magel-lan™ 7.1-Software (Tecan Trading AG) bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 650 nm gemessen. Es wurde eine 4-Parameter-Kurve aus den Exktinktionen der Standards berechnet, durch die die Konzentrationen der Pro-ben errechnet werden konnten. Der inter-assay Variationskoeffizient lag bei 10,1 %, der intra-assay Variationskoeffizient bei 5,2 %.

3.3.1.5 Gesamtprotein im Plasma

Die Messung von Gesamtprotein erfolgte kolorimetrisch nach der Methode von BRADFORD (1976). Der Farbstoff Coomassie-Brilliant-Blue G-250 bindet Proteine in saurer Lösung an ihren kationischen und unpolaren Seitenketten. Die ungebundene, kationische Form ist rot gefärbt und hat ein Absorptionsmaximum bei 470 nm. Durch die Komplexbildung entsteht eine blaue Farbe und das Absorptionsmaximum ver-schiebt sich auf eine Wellenlänge von 595 nm. Anhand der Exktinktionskoeffizienten kann die Proteinkonzentration errechnet werden.

Die lithiumheparinisierten Proben wurden am Vortag aus -20 °C aufgetaut (für die Messung von 25-OHD3) und über Nacht bei 4 °C gelagert. Es wurden Standardlö-sungen mit Konzentrationen von 40; 80; 120; 160 und 200 ng/ml angesetzt. Die

Pro-53

ben wurden 1:400 mit A. dest. verdünnt. Anschließend wurden 50 µl der Standards, Proben und des Leerwerts (A. dest.) in Dreifachansatz in eine Mikrotiterplatte pipet-tiert. Kühl gelagertes SERVA-Reagenz wurde verdünnt (6 ml + 16,5 ml A. dest.) und bis zur Verwendung bei Raumtemperatur dunkel gelagert. Hiervon wurden 200 µl mit einer 8-fach Pipette in jede Vertiefung hinzugegeben. Nach 5-minütiger Inkubation wurde mittels eines Tecanreaders (Infinite® M200, Tecan Trading AG) und einer iControl™-Software (Tecan Trading AG) bei einer Wellenlänge von 595 nm die Far-bintensität gemessen, durch welche die Proteinkonzentrationen berechnet werden konnten.

3.3.2 Eierschalenanalyse

Für die Eierschalenanalyse wurden die Eier zu Beginn gewogen (Waage PC440, Mettler Toledo). Danach wurde die Bruchfestigkeit mittels einer Apparatur gemessen, welche die für den Bruch der Eischale benötigte Kraft anzeigt (s. Abbildung 8). Im nächsten Schritt wurde das Ei entleert und die Schale mit einem Löffel ausgeschabt und für 30 s bei 800 Watt in der Mikrowelle getrocknet. Die getrocknete Eischale wurde anschließend gewogen. Im letzten Schritt wurden in der Nähe des Äquators die Eihäute entfernt und die Schalendicke anhand eines Messschiebers mit einer Genauigkeit von 0,01 mm gemessen (s. Abbildung 9). Das relative Schalengewicht wurde durch Division des absoluten Schalengewichts durch das Eigewicht ermittelt.

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3.3.3 PCR

Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ist eine Methode, mit der DNA in-vitro verviel-fältigt werden kann. Dies geschieht innerhalb von 20 – 50 Zyklen, von denen jeder aus einer Denaturierungphase, einer Primerhybridisierungphase und einer Elongati-onsphase besteht. In der ersten Phase wird die doppelsträngige DNA auf 95 °C er-hitzt, wodurch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren gelöst werden und sich die DNA in zwei einzelne Stränge aufteilt. Die zweite Phase dient der Anlagerung (Annealing) spezifischer, synthetisch erzeugter Primer an die DNA, wofür eine Temperatur von 55 – 65 °C notwendig ist. Die optimale Temperatur wird von der Basenpaarenzusammensetzung der Primer bestimmt. In der Elongations-phase (AmplifikationsElongations-phase) werden durch die Taq-Polymerase, die sich an das 3‘-Ende eines Primers anlagert, neue komplementäre DNA-Stränge aus freien dNTPs synthetisiert. Die Primer bilden jeweils den Anfang der neuen Einzelstränge und werden deshalb nicht wieder abgelöst. Die optimale Temperatur für die Wirkung der Taq-Polymerase liegt bei 72 °C. Allerdings kann man die letzten beiden Phasen

Abbildung 8: Apparatur zur Feststellung der Bruchfestigkeit

Abbildung 9: Messchieber zur Feststel-lung der Schalendicke

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auch kombiniert bei 60 °C ablaufen lassen, wodurch sich lediglich die Wirkungs-schnelligkeit der Taq-Polymerase verändert. Da im nächsten Zyklus jeweils wieder alle Doppelstränge aufgetrennt und mit freien Nukleotiden aufgefüllt werden, verläuft die Vervielfältigung der Amplifikate exponentiell.

Die qRT PCR ist die präzisiste und sensitivste Methode, mit der Nukleinsäuren quan-titativ detektiert werden können (TEVFIK DORAK 2006). Dabei ruft ein zugesetzter Fluoreszenzfarbstoff (SYBR® Green) ein deutliches Fluoreszenzsignal hervor, wenn er an doppelsträngige DNA bindet. Diese Fluoreszenzsignale, die bei einer Poly-merase-Kettenreaktion durch den Fluoreszenzfarbstoff über eine gewisse Anzahl von Zyklen gesendet werden, können kontinuierlich detektiert werden. Die Fluoreszenz

Abbildung 10: Amplifikationskurve einer RT qPCR von CaBPD28k im Duodenum

Die Kurve zeigt die Fluoreszenz in Abhängigkeit der Zyklen auf. Rote Linien = Verdünnungsstufen der Standardreihe; grüne Linien: Proben; blaue Linien = Negativkontrolle

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ist mit der Zahl der Amplifikate positiv korreliert. Eine korrekte Messung kann nur in der Phase der exponentiellen Vermehrung stattfinden, da die Reaktion mit zuneh-mender Zahl der Zyklen in den Bereich der Sättigung übergeht. Aus dem über die Zeit zunehmenden Signal des Farbstoffs lässt sich diese Phase darstellen. Es wird rechnerisch ein Threshold ermittelt, also ein Maß an Fluoreszenz, das deutlich über dem Hintergrund liegt und innerhalb der exponentiellen Phase erreicht wird. Die exakte Anzahl der zum Überschreiten dieses Wertes notwendigen Zyklen korreliert mit der Ausgangsmenge der Ziel-DNA in den jeweiligen Inkubationsansätzen. Die bekannten Ausgangsmengen der Standardreihe können gegen die entsprechenden Treshold-Werte aufgetragen werden, wodurch eine Standardkurve erzeugt werden kann. Diese ist zusammen mit den Treshold-Werten Grundlage für die Berechnung der Anzahl der Kopien der jeweiligen Proben. Typische Amplifikationskurven sind in Abbildung 10 dargestellt.

3.3.3.1 RNA-Isolierung und cDNA-Synthese

Aus den aus Duodenum, Ileum und der Niere entnommenen Gewebeproben wurde die Gesamt-RNA mittels eines RNeasy® Plus Mini Kit (Qiagen) isoliert. Für die Isola-tion aus den Geweben der ESG wurde ein RNeasy® Fibrous Tissue Mini Kit (Qi-agen) verwendet.

Das bei -80 °C gelagerte Darm- (Duodenum und Ileum) und Nierengewebe wurde zunächst in einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Mörser zerkleinert. Anschlie-ßend wurden ca. 30 mg des pulverisierten Gewebes in ein mit flüssigen Stickstoff vorgekühltes 1,5 ml Reaktionsgefäß (Eppendorf) eingewogen und mit 600 µl eines RLT-Puffers umspült. Dieser Puffer wurde im Vorfeld mit 1 % ß-Mercaptoethanol ver-setzt. Die Homogenisierung des Gemisches wurde jeweils dreimal für 3 - 5 s durch einen Ultraschall-Homogenisator vorgenommen. Bei der anschließenden Zentrifuga-tion (Biofuge® Pico, Hereaus instruments) für 3 min bei 13.000 rpm sollten die gro-ben Zellbestandteile abgetrennt werden. Der Überstand wurde zum Binden der ge-nomischen DNA in eine gDNA-Eliminationssäule überführt, welche für 30 s bei 13.000 rpm zentrifugiert wurde. Der Durchfluss wurde mit 600 µl 70 %igen Ethanols

57

versetzt und resuspendiert, bis die Lösung homogen war. Die homogene Lösung wurde anschließend in zwei Durchgängen in eine RNeasy®-Säule überführt und je-weils 15 s bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Durchfluss wurde anschließend verwor-fen, da sich die durch Ethanol ausgefällte RNA nun im auf einer Kieselgelmembran im Inneren der Säule befand. Es folgte ein Waschdurchgang mit 700 µl RW1-Puffer und eine Zentrifugation für 15 s bei 13.000 rpm. Zwei weitere Waschdurchgänge wurden mit je 500 µl eines RPE-Puffers, der im Vorfeld durch Ethanol (100 %) ver-dünnt wurde, durchgeführt. Zwischen diesen Schritten wurde für 15 s, nach dem letz-ten Waschschritt für 2 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. 30 µl RNase freies Wasser wurde mittig auf jede Säule gegeben und bei 13.000 rpm für 1 min zentrifugiert, wodurch sich die Gesamt-RNA aus der Säule löste.

Die Präparation des ESG-Gewebes entspricht in den ersten Schritten denen der RNA-Isolierung aus dem Darmgewebe, allerdings wurden nur 300 µl RLT-Puffer für die Homogenisierung eingesetzt. Nach der Homogenisierung durch Ultraschall wur-den 590 µl RNase freies Wasser und 10 µl Proteinkinase K hinzugegeben und das Gemisch wurde für 10 min bei 55 °C inkubiert, um eine effizientere Freisetzung der Nukleinsäuren zu erreichen. Nach einer Zentrifugation mit 13.000 rpm für 3 min wur-de wur-der Überstand mit 500 µl Ethanol (100 %) vermischt, um die RNA und DNA aus-zufällen. Das Gemisch wurde in zwei Durchgängen (max. 700 µl pro Durchgang) auf eine RNeasy®-Säule gegeben und anschließend bei 10.000 rpm für 15 s zentrifu-giert. Der Durchfluss wurde jeweils verworfen. Die RNA, die sich jetzt in der Säule befand, wurde mit 350 µl RW1-Puffer gewaschen und bei 10.000 rpm für 15 s zentri-fugiert. Im nächsten Schritt wurden 10 µl einer DNase Stammlösung mit 70 µl RDD-Puffer vermischt und auf die Säule gegeben, um DNA aus der Kieselgelmemb-ran zu entfernen. Nach einer Inkubation von 10 min bei Raumtemperatur wurde die Säule erst mit 350 µl RW1-Puffer, dann in zwei Durchgängen mit jeweils 500 µl RPE-Puffer gewaschen. Zwischen den Waschschritten wurde bei 10.000 rpm für 15 s zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Nach dem letzten Waschschritt wurde erst 2 min, dann noch einmal 1 min bei 10.000 rpm zentrifugiert. Als letztes wurden 30 µl RNase freies Wasser mittig auf jede Säule gegeben und bei 13.000 rpm für 1 min zentrifugiert, wodurch sich gebundene Gesamt-RNA aus der Säule löste.

58

Der RNA-Gehalt in den Präparationen aus Nieren-, Darm- und ESG-Gewebe wurde durch ein NanoDrop™ One Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific) bestimmt.

Ein Probenvolumen, das 200 ng RNA enthielt, wurde mit Ampuwa®-Wasser auf ein Gesamtvolumen von 9,6 µl verdünnt. Zur Synthese von cDNA wurden TaqMan™

Reverse Transcriptase Reagentien (Applied Biosystems, Roche) verwendet. Zu jeder Probe wurden 2,5 µl 10-fach Puffer (25 mM), 5,5 µl MgCl2 (10 mM), 5 µl dNTPs (10 mM), je 0,625 µl Oligo(dt)-Primer und Random-Hexamer-Primer (beide 50 mM), 0,5 µl RNase Inhibitor (20 U/µl) und 0,68 µl Reverse Transkriptase (50 U/µl) pipet-tiert. Dieses Gemisch wurde für eine Stunde in einem Thermocycler (Mastercycler®

gradient, Eppendorf) inkubiert (10 min bei 25 °C, 45 min bei 48 °C, 5 min bei 95 °C, abkühlen auf 4 °C). Die synthetisierte cDNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.

3.3.3.2 Nachweis der RNA-Expression durch qRT PCR

Die RNA-Expression des Strukturproteins ß-Aktin und der Ca²⁺-transportierenden Strukturen TRPV6 (im Duodenum), PMCA und CaBPD28k (beide in Duodenum, Ileum und ESG) wurde mittels einer quantitativen RT PCR ermittelt, ebenso wie CYP24A1, CYP27C1 und VDHAP (in der Niere). Hierfür wurde die wie in Kapitel 3.3.3.1 herge-stellte cDNA verwendet.

Es wurde ein Inkubations-Mix im Doppelansatz hergestellt, der 200 nM spezifischer Primer (s. Tabelle 4) 8 ng cDNA (bzw. 0,8 ng ß-Aktin) und SYBR® Green Master Mix (Sensi FAST™ SYBR® No-ROX Kit, Bioline) enthielt. Ein Reaktionsansatz enthielt Ampuwa®-Wasser anstatt cDNA und diente somit als Negativkontrolle. Es fand eine Amplifikation (3 min bei 95 °C, 40 Zyklen für je 10 s bei 95 °C und 30 s bei 60 °C) der PCR Produkte statt, welche von einem real-time PCR Cycler (CFX connect™, Bio-Rad Laboratories GmbH) detektiert wurden. Die Anzahl der Kopien wurde anhand einer Standardkurve bestimmt, die durch klonierte PCR-Produkte erzeugt wurde. Für die Auswertung wurde die Software Bio-Rad CFX Manager 3.1 (Bio-Rad Laboratori-es GmbH) verwendet. Für eine Schmelzkurvenanalyse wurde die Temperatur von 55

°C alle 10 s um 0,5 °C auf eine Temperatur von 95 °C erhöht, wodurch die

DNA-59

Doppelstränge zu zwei einzelsträngigen Molekülen denaturiert sind. Durch diese Analyse ist eine Differenzierung zwischen DNA-Fragmenten und unspezifischen Pri-merdimeren möglich, da letztere eine niedrigere Schmelztemperatur haben. Die Ex-pression der Zielgene wurde mit der jeweiligen ExEx-pression des Strukturproteins ß-Aktin normalisiert.

Die Effizienz der PCR Assays wurde im Voraus für klonierte PCR-Produkte und Ver-dünnungsreihen von cDNA getestet, wodurch die notwenige Verdünnung der cDNA ermittelt werden konnte. Die Primersequenzen wurden mittels NCBI Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) entwickelt und durch die Fa. Thermo Fisher Scientific synthetisiert. In Bezug auf PMCA, CaBPD28k und TRPV6 wurde die Klonie-rung des PCR-Produkts mit Ligation, Transformation und Plasmid-Präparation von STAHL (2013) durchgeführt, ebenso wie die Herstellung einer Verdünnungsreihe, die in der qRT PCR als Standardreihe eingesetzt wurde. Die Klonierung und Herstellung der Verdünnungsreihen von CYP24A1, CYP27C1 und VDHAP wurden im hiesigen Labor durchgeführt.

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Tabelle 4: PCR Primer für die Quantifikation der RNA-Expression in Darm-, ESG- und Nieren-Gewebe gal ß-Aktin antisense 5’-ggc gaa acc ggc ctt gca ca-3’

PMCA

NM_001168002.3

gal PMCA 1b sense 5’-ggt gca gct atg gaa atg cag gca-3’

233 bp gal PMCA 1b antisense 5’-agc cag ggt cgc ttc tga acc c-3’

CaBPD28k

NM_205513.1

gal CaBPD_28k sense 5’-cag ggt gtc aaa atg tgt gc-3’

215 bp gal CaBPD28k antisense 5’-gcc agt tct gct cgg taa ag-3’

TRPV6

XM_004938143.3

TRPV6 forward primer 5’-aac acc tgt gaa gga gct ggt gag-3’

160 bp TRPV6 reverse primer 5’-tct gct gct tgt ttt gtt gcc-3’

CYP24A1 NM_204979.1

gal CYP24A1 sense 5’-ttg gga agc gga tgt gca tt-3’

103 bp gal CYP24A1 antisense 5’-agg gcc gtc at tagt caa gc-3’

CYP27C1 XM_422077.3

gal CYP27C1 sense 5′-tcg tgg cag gaa tac aga ga-3′

125 bp gal CYP27C1 antisense 5’-act gcc aca tct ttg ggt tt-3’

VDHAP NM_204979.1

gal VDHAP sense 5’-act gaa gca tta ccg agg gc-3’

178 bp gal VDHAP antisense 5’-att tct cct cat gcc acg gg-3’

3.3.4 Western Blot Analysen

Western Blot Analysen stellen eine Möglichkeit dar, Proteine semiquantitativ zu de-tektieren. Prinzipiell wird dabei ein Antikörper-Protein-Komplex gebildet, der aufgrund der gebundenen Antikörper durch verschiedene Methoden detektiert werden kann.

Zuerst findet eine Präparation des Gewebes statt, welche mit einer definierten Men-ge Gesamtprotein auf ein PolyacrylamidMen-gel aufMen-getraMen-gen wird. In einer anschließen-den Elektrophorese weranschließen-den die Proteine im Gel der Größe nach separiert. Im nächs-ten Schritt werden die Proteine elektrophoretisch auf eine Nitrocellulose-Membran geblottet und somit immobilisiert. Diese Membran kann in verschiedenen Schritten mit Antikörper inkubiert werden. Nicht-Protein-Bindungsstellen werden zuerst blo-ckiert, sodass eine nicht-spezifische Bindung der Antikörper verhindert wird. Es folgt eine Inkubation mit einem spezifischen primären und einem unspezifischen

sekundä-61

ren Antikörper. Letzterer ist mit einem Enzym konjugiert, das bei Kontakt mit einem Chemilumineszenz-Substrat zu einer Reaktion führt, die ein chemilumineszierendes Signal aussendet. Durch Aufnahme mit einer speziellen Kamera können die Protein-banden sichtbar gemacht werden und durch eine Software quantifiziert werden. Die Lichtintensität steigt proportional mit dem Proteingehalt.

3.3.4.1 Rohmembran-Präparation

Die Präparation der Rohmembran für die Expressionsanalyse von PMCA wurde durch eine „2 in 1 Präparation“ nach FastPrep® durchgeführt. Das bei -80 °C gela-gerte Gewebe wurde in einen mit flüssigem Stickstoff gekühlten Mörser gegeben und grob zerkleinert. Kleine Stücke mit einem Gesamtgewicht von 0,2 - 0,3 g wurden in

Die Präparation der Rohmembran für die Expressionsanalyse von PMCA wurde durch eine „2 in 1 Präparation“ nach FastPrep® durchgeführt. Das bei -80 °C gela-gerte Gewebe wurde in einen mit flüssigem Stickstoff gekühlten Mörser gegeben und grob zerkleinert. Kleine Stücke mit einem Gesamtgewicht von 0,2 - 0,3 g wurden in

Im Dokument Interaktion zwischen Selektion auf Leistungseffizienz und Adaptationsvermögen an eine reduzierte Calcium-Konzentration im Futter bei Legehennen (Seite 60-0)