Versuchsdesign - Interaktion zwischen Selektion auf Leistungseffizienz und Adaptationsvermögen

Das Aktenzeichen des im Folgenden beschriebenen Tierversuchs lautet 33.19-42502-04-15/1988. Um die Effekte einer restriktiven Fütterung auf die Ca-Homöostase von Legehennen aufzudecken, wurde eine Studie an 132 Hennen durchgeführt. Hierfür wurden vier verschiedene Linien (Gallus gallus domesticus) verwendet, die sich in ihrem phylogenetischen Ursprung und ihrem Legeleistungsni-veau unterschieden. Die Linien WLA und BLA entspringen dem Zuchtprogramm von Lohmann Tierzucht GmbH und zeichnen sich durch ein hohes Leistungsniveau mit ca. 320 Eiern pro Jahr aus. Die Linien R11 und L68 entstammen einer nicht-selektierten Ressourcenpopulation des Instituts für Nutztiergenetik, FLI, und werden mit einer Leistung von ca. 200 Eiern pro Jahr als Minderleistungstiere kategorisiert.

Phylogenetisch wurde zwischen Weißlegern und Braunlegern unterschieden, die verschiedenen Genpools angehören (LYIMO et al. 2014). Die Weißleger WLA und R11 stammen von der Rasse White Leghorn ab und sind näher miteinander ver-wandt, als mit den Braunlegern BLA (entstammt Rhode Island Red) und L68 (ent-stammt New Hampshire).

Alle Tiere sind am gleichen Tag geschlüpft und wurden unter denselben Bedingun-gen in Bodenhaltung aufgezoBedingun-gen. Am Tag des Schlupfes erhielten sie zur späteren Identifizierung eine Flügelmarke. In der 16. LW bezogen die Tiere verschiedene Ab-teile und wurden in Hinblick auf die spätere Versuchsphase in verschiedene Gruppen eingeteilt. Die erste Ca-Restriktionsphase begann in der 31. Lebenswoche, die im Zeitraum des Legemaximums liegt, und die letzte endete in der 52. Lebenswoche.

Abbildung 7 stellt den Versuchsablauf graphisch dar. Für den Versuch wurden vier verschiedene Linien verwendet, von denen jeweils 11 Tiere das Kontrollfutter und 22 Tiere eine Ca-restriktive Fütterung erhielten. Während die Tiere in den Kontroll-gruppen ein Alleinfuttermittel mit einem Ca-Gehalt von 4,26 % erhielten, wurde den Tieren in den Versuchsgruppen das gleiche Futter, allerdings mit einem reduzierten Ca-Gehalt von 1,09 % gegeben. Damit sollte der Ca-Haushalt der Versuchsgruppen

durch drei je dreiwöchige Ca-Restriktionsphasen wiederholt belastet werden. Zwi-schen den einzelnen Ca-Restriktionsphasen lagen sechswöchige Erholungsperio-den, am Ende der letzten Ca-Restriktionsphase wurden die Hennen zur Gewebeent-nahme getötet.

Es wurden insgesamt sechs Blutentnahmen vorgenommen, die vor jeder Futterum-stellung bzw. vor der Tötung stattfanden, um die Plasma-Gehalte von Cat, Ca²⁺, Pi, Gesamtprotein und 25-OH-D3 zu bestimmen. Zu den gleichen Zeitpunkten wurden Ultraschalluntersuchungen der Ovarien vorgenommen, um den Reproduktionsstatus der Tiere festzuhalten.

Für die Eiablage standen sogenannte Autonester zur Verfügung, die durch Trans-ponder erkannten, welches Tier das Nest betreten hat, und, ob ein Ei gelegt wurde.

Zudem verhinderten sie ein Eintreten weiterer Tiere. Nach der Eiablage rollte das Ei automatisch in eine Auffangstation ab, sodass ein Manipulieren des Eis durch die Hennen nicht möglich war. Auch Eier, die nicht ins Nest gelegt, sondern frei ins Abteil verlegt wurden, wurden eingesammelt. Durch tägliches Einsammeln der abgerollten und der im Abteil verlegten Eier konnte die Legeleistung der Linien bestimmt werden.

Die Untersuchung der Eier auf Eigewicht, Bruchfestigkeit, Schalengewicht und Scha-lendicke erfolgte in den letzten vier Tagen vor, während der gesamten Ca-Restriktionsphasen und bis zum zwölften Tag nach Abschluss der Ca-Restriktion täglich, in der restlichen Zeit wöchentlich.

Abbildung 7: Zeitstrahl des Versuchsablaufs

vertikale Pfeile = Blutentnahme, Ultraschallkontrolle; graue Balken = Untersuchung der Eischalen

Nach der Tötung wurde Gewebe aus dem Duodenum und Ileum isoliert, um eine strukturelle Untersuchung der Ca²⁺-Absorption im Dünndarm vorzunehmen. Zusätz-lich wurde der Legedarm entnommen und Gewebe aus der Eischalendrüse isoliert, um die Strukturen zu untersuchen, die an der Ca²⁺-Sekretion in das Lumen beteiligt sind. Anhand von Nierengewebe wurde die Expression der Enzyme analysiert, von denen angenommen wurde, dass sie an dem Vitamin D-Metabolismus von Hühnern beteiligt sind. Es wurden auch die Tibiotarsi und Humeri der Tiere entnommen und auf Bruchfestigkeit und relativen Anteil des kortikalen Knochengewebes untersucht.

Die Daten zur Knochengesundheit und Follikeluntersuchung wurden durch das Insti-tut für Nutztiergenetik und das Institut für Tierschutz und Tierhaltung, FLI, erhoben und werden in dieser Dissertation nur teilweise vorgestellt, sofern diese Daten für die Interpretation der vorliegenden Ergebnisse von Bedeutung sind.

44 3.2 Material

3.2.1 Haltung und Fütterung

Die Studie wurde mit den in Kapitel 3.1 genannten Hühnerlinien durchgeführt: WLA, BLA, R11 und L68. Es wurden 33 Tiere je Linie, also insgesamt 132 Tiere für die Studie untersucht. Die Tiere wurden in sechs Abteilen in Bodenhaltung gehalten. In jedem Abteil hausten je 11 Tiere einer Minderleistungslinie und 11 Tiere einer Hoch-leistungslinie, von denen jeweils eine zu den Braunlegern und eine zu den Weißle-gern gehörte (s. Tabelle 1). Die 8 m²-großen Abteile waren mit Hobelspänen einge-streut und die Ausstattung beinhaltete Nippeltränken, zwei Futtertröge und vier Nes-ter. Futter und Wasser standen ad libitum zur Verfügung.

Tabelle 1: Belegungsplan der Abteile; graue Felder markieren die Kontrollgruppen Abteil Braunleger, Tierzahl Weißleger, Tierzahl

1 L68, 11 WLA, 11

2 BLA, 11 R11, 11

3 L68, 11 WLA, 11

4 BLA, 11 R11, 11

5 L68, 11 WLA, 11

6 BLA, 11 R11, 11

Vom Zeitpunkt der Einstallung (16. LW) bis zu Beginn der experimentellen Fütterung (31. LW) erhielten alle Tiere ein handelsübliches Alleinfuttermittel für Junghennen von AGRAVIS Raiffeisen AG. Wie im Versuchsaufbau (Kapitel 3.1) beschrieben, un-terschied sich das Futter zwischen der Kontroll- und Versuchsgruppe hinsichtlich des Ca-Gehalts. Die Futtermittel für die 21-wöchige experimentelle Phase wurden durch das Institut für Tierernährung, FLI, hergestellt. Die Zusammensetzung und Inhaltstof-fe sind in Anhang B tabellarisch dargestellt. Die beiden Futtermittel wurden durch das Institut für Futtermittel, LUFA Nord-West, analysiert (Prüfberichte in Anhang C). Zu

den sechs Zeitpunkten der Blutentnahmen wurde mittels einer digitalen Tischwaage (CPA 16001S, Sartorius Corporate Administration GmbH) die Körpergewichte der Hennen erfasst, um Hinweise auf die Futteraufnahme zu erhalten.

3.2.2 Blutproben

Blutentnahmen wurden zwischen 13 und 17 Uhr vorgenommen, da dies ungefähr der Zeitraum der frühen Eischalenkalzifizierung war. Das Blut wurde durch Punktion der Vena cutanea ulnaris superficialis gewonnen und durch Verwendung einer Safety-Multifly®-Nadel ohne Kontakt mit Sauerstoff entnommen. Dabei wurde das Blut in verschiedene Röhrchen abgenommen: Kalium-EDTA, Lithium-Heparin und Calcium-balanciertes Lithium-Heparin (alle Produkte von Sarstedt AG & Co. KG). Direkt im Anschluss erfolgte eine Messung des pHs und der Konzentration von der Ca²⁺, N⁺ und K⁺ mit einem Blutgas-Analysesystem (s. Kapitel 3.3.1.1). Nach Zentrifugation des Vollbluts mit einer Megafuge 1.0R (Heraeus Holding GmbH, Hanau) für 10 min bei 2.000 rpm wurde das überständige Plasma auf Eis aliquotiert und in einer isolier-ten Box mit Kühlpacks transportiert. Anschließend wurde die eine Hälfte der Aliquots bei -20 °C, die andere Hälfte bei -80 °C eingefroren.

3.2.3 Eier

Um die Veränderungen der Eischalenqualität im Laufe der Ca-restriktiven Fütterung zu analysieren, wurden vier Tage vor der Futterumstellung, sowie die gesamte rest-riktive Fütterungsphase und bis zwölf Tage nach der Ca-restrest-riktiven Phase alle Eier eingesammelt und bis zur Untersuchung auf die Qualitätsparameter bei 4 °C gela-gert.

3.2.4 Tötung und Gewebeentnahme

Am Ende der dritten Ca-Restriktionsphase wurden die Hennen durch eine 10-minütige CO2-Begasung getötet. Die zu untersuchenden Gewebe (Duodenum,

Ileum, ESG, Niere) wurden unverzüglich nach der Tötung entnommen, bearbeitet und innerhalb von max. 20 min mittels flüssigen Stickstoffs konserviert. Der Trans-port der Proben erfolgte auf Trockeneis und die anschließende Lagerung bei -80 °C.

Allen 132 Tieren wurden Knochen zur Qualitätsbestimmung entnommen. Für die Be-stimmung der mRNA- und Proteinexpression der Ca²⁺-transportierenden Strukturen und der Hydroxylasen in der Niere (hier nur mRNA-Bestimmung) wurden Gewebe-proben von 64 der 132 Hennen entnommen. Die 64 Tiere für die Genexpressions-studien wurden zwischen 18 und 22 Uhr getötet. Grund hierfür ist die geschätzte Phasen des Ovulationszyklus, nach der sich das Ei zu diesem Zeitpunkt schon in der Kalzifizierung befinden sollte und gleichzeitig noch eine Absorption von Ca aus dem Darm stattfinden konnte. Das Ei erreicht die Eischalendrüse nach etwa 7 Lichtstun-den (BAIN et al. 2016), zu diesem Zeitpunkt findet noch Futteraufnahme statt. Mit Beginn der Dunkelphase sistiert die Futteraufnahme, es wird jedoch noch bis zu 4 bis 5 Stunden Futter aus dem Intestinaltrakt resorbiert, bis dieser vollständig geleert ist (ENGELHARDT et al. 2015). Wenn die Kalzifizierung bereits stattfindet und gleich-zeitig noch Ca aus dem Darm absorbiert werden kann, wird eine Hochregulation der Ca²⁺-transportierenden Strukturen im Darm aufgrund des erhöhten Ca-Bedarfs er-wartet.

3.2.4.1 Instestinaltrakt

Der Intestinaltrakt wurde zusammen mit dem Legedarm nach Eröffnung der Bauch-höhle entnommen. Es folgte eine Präparation des Konvoluts zur Ansicht der einzel-nen Darmabschnitte. Das gesamte Duodenum und der distale Teil des Ileums wur-den abgetrennt und in eisgekühlte physiologische Kochsalzlösung gelegt. Die Darm-abschnitte wurden am Mesenterialansatz aufgeschnitten und in der physiologischen Kochsalzlösung gespült. Der Darm wurde mit der luminalen Seite nach oben auf eine gekühlte Glasplatte gelegt. Durch Abschabung mit einem Objektträger wurde die Tu-nica mucosa abpräpariert. Die präparierte TuTu-nica mucosa wurden in flüssigem Stick-stoff eingefroren und in ein Scintillationsgefäß überführt. Die Zeit zwischen Tötung und Einfrieren des Gewebes betrug max. 20 bis 30 min.

47 3.2.4.2 Eischalendrüse

Der Legedarm wurde nach Entnahme zur Übersicht ausgebreitet und es wurde do-kumentiert, ob Dotterkugeln im Ovar vorhanden waren. Die Eischalendrüse, die als sackartige Erweiterung zwischen Vagina und Eileiter erkennbar ist, wurde abgetrennt und aufgeschnitten. Es wurde dokumentiert, ob sich ein Ei in Kalzifizierung in der Eischalendrüse befand. Das Gewebe wurde in gekühlte physiologische Kochsalzlö-sung gelegt. Die weitere Vorgehensweise war identisch mit der Präparation des Darmgewebes.

3.2.4.3 Niere

Das Nierengewebe wurde nach Entfernung des Darmkonvuluts und des Legedarms in der dorsalen Bauchhöhle sichtbar. Ein etwa 1 mal 0,5 cm großer Bereich wurde mit einem scharfen Löffel entfernt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und in ein Scin-tillationsgefäß überführt. Zwischen Tötung und Gewebeentnahme lagen max. 10 min.

48 3.3 Methoden

3.3.1 Blutprobenanalyse 3.3.1.1 Ca²⁺ im Vollblut

Die Messung des ionisierten Ca-Gehalts im Vollblut wurde unverzüglich nach der Blutprobenentnahme mit dem Blutgas-Analysesystems RAPIDLab 348EX (Siemens Healthcare GmbH) durchgeführt. Während maximalen Wartezeiten von 20 min wur-den die Proben auf Eis gelagert.

3.3.1.2 Cat im Plasma

Für die Messung des Gesamtcalciums (Cat) im lithiumheparinisierten Plasma wurden Proben aus -20° C bei Raumtemperatur aufgetaut. Alle zu verwendenden Lösungen wurden vor Verwendung aus dem Kühlschrank genommen und auf Raumtemperatur gebracht. Für die spätere Berechnung der Konzentrationen wurden ein Leerwert so-wie eine Standardreihe mit bekannten Ca-Konzentrationen (0,1; 0,5; 1; 2; 3; 4;

5 mmol/l) aus einer 10 mM-Stammlösung angesetzt. Nach einer 1:2 Verdünnung der Proben und Standards mit Tris wurden 9,5 µl mit einer 8-fach Pipette in Doppelan-satz in eine Mikrotiterplatte pipettiert. In jede Vertiefung wurden erst 185 µl einer Lö-sung gegeben, die 2-Amino-2-Methylpropanol enthielt (pH 10,7). Dann kamen 185 µl einer Lösung hinzu, die o-Kresolphthalein-Komplexon mit 8-Hydroxychinolin enthielt.

Ca bildet mit o-Kresolphthalein-Komplexon in alkalischer Lösung einen violetten Komplex. Nach Inkubation für 10 min konnte mittels eines Tecanreaders (Infinite®

M200, Tecan Trading AG) und einer Magellan™ 7.1-Software (Tecan Trading AG) bei einer Wellenlänge von 570 nm die Intensität der violetten Färbung gemessen werden, welche sich direkt proportional zu der Ca-Konzentration verhält. Die Extink-tions- und Konzentrationswerte der Standardreihe bildeten eine lineare Regression, durch die aus den Extinktionswerten der Proben die Konzentrationen des Cat be-rechnet werden konnten. Wegen der vorangegangenen Verdünnung mussten die Werte mit zwei multipliziert werden. Als Kontrollproben wurden Precinorm und ein

„Plasma-Mix“, der aus 5 Hühner-Plasma-Proben gepoolt wurde, auf jeder Platte mit-geführt, aus denen der inter-assay Variationskoeffizient bestimmt werden konnte.

Alle Reagenzien für diese Methode (Standard, Lösung 2, Lösung 3, Tris) wurden selbst hergestellt (s. Tabelle 2). Der inter-assay Variationskoeffizient betrug 6,3 % der intra-assay Variationskoeffizient 5,1 %.

Tabelle 2: Zusammensetzung der Reagenzien, welche für die Cat-Messung verwen-det wurden

0,147 g abwiegen und in 100 ml A.dest. lösen.

Lösung 2

2-Amino-2-Methylpropanol 3,5 mM

156 g

2-Amino-2-Methylpropanol (FW 89,14 g/l) abwiegen und mit ca. 300 ml A.dest. auffüllen.

50 3.3.1.3 Pi im Plasma

Die lithiumheparinisierten Plasmaproben wurden aus -20° C bei Raumtemperatur aufgetaut. Alle zu verwendenden Lösungen wurden vor Verwendung auf Raumtem-peratur gebracht. Vor der Bestimmung wurde eine Enteiweißung mit einer TCA-Lösung durchgeführt. Es wurde ein Leerwert und eine Standardreihe mit be-kannten Phosphat-Konzentrationen (0,5; 1; 1,5; 2,5; 3,5; 5; 6 mmol/l) aus einer 6mM-Stammlösung angesetzt. Nach Verdünnung der Proben und Standards mit TCA in einem Verhältnis von 1:10 wurde für 10 min mit 3000 U/min bei 4 °C (GS-15R Zentrifuge, Beckmann) zentrifugiert. Die Überstände wurden in neue Röhrchen ge-gossen und hieraus wurden 100 µl mit einer 8-fach Pipette in Doppelansatz in eine Mikrotiterplatte pipettiert. Es kamen zwei Lösungen à 100 µl hinzu, die Ammonium-vanadat mit Salpetersäure bzw. Ammoniummolybdat mit Schwefelsäure enthielten.

Das anorganische Phosphat bildet in salpetersaurer Lösung mit Molybdat und Vana-dat einen gelben Farbkomplex. Nach 10-minütiger Inkubation konnte die Farbintensi-tät nach gleichem Prinzip wie bei der Cat-Messung, aber bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen werden. Auch hier wurden Precinorm und der „Plasma-Mix“ als Kontrollproben mit aufgetragen.

Auch die Reagenzien für diese Methode (Standard, Lösung 1, Lösung 2, TCA) wur-den selbst hergestellt (s. Tabelle 3). Der inter-assay Variationskoeffizient betrug 6,2 % der intra-assay Variationskoeffizient 4,0 %.

Tabelle 3: Zusammensetzung der Reagenzien, welche für die Pi-Messung verwen-det wurden

Lösung 1 Ammoniumvanadat 21 mM

1,23 g Ammoniumvanadat (FW 117,0 g/l) abwiegen und in 500 ml 0,28 N HNO3

abgedunkelt lösen.

Lösung 2 Ammoniummolybdat 40 mM

24,72 g Fa. ids® verwendet, welcher für humanes Serum und Plasma entwickelt wurde. Bei diesem Assay konkurrieren das 25-OHD3 aus der Probe und Biotin-markiertes-25-OHD3 um die Antikörper, mit denen die Platte beschichtet ist. Mit Peroxidase markiertes Avidin wird hinzugegeben und es kommt zu einer Bindung des Biotins mit dem Avidin. Durch ein chromogenes Substrat (TMB) entsteht eine Farbreaktion, die rechtzeitig durch eine Stopplösung beendet wird, sodass die Farbintensität noch im zu detektierenden Bereich liegt.

Die lithiumheparinisierten Proben wurden aus -20 °C bei Raumtemperatur aufgetaut und anschließend für 5 min bei 14.000 rpm abzentrifugiert. Gleichzeitig wurden alle Reagenzien für mindestens 90 min auf Raumtemperatur gebracht. Zuerst wurden 25 µl von jedem der sieben Standards (0; 6,5; 12; 20,2; 33,2; 51,6; 96,8 ng/ml), von

jeder Kontrolle (Sollwerte 12,8 und 52 ng/ml) und jeder Probe in ein neues Röhrchen pipettiert. In jedes Röhrchen wurde 1 ml eines Freisetzungsreagenz hinzugegeben, das Biotin-markiertes 25-OHD3 enthielt. Anschließend wurden hieraus 200 µl in die Vertiefungen der mit Antikörper beschichteten Platte in Doppelansatz gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden bei 23 °C wurden die Vertiefungen 3 mal mit 250 µl einer Waschlösung gewaschen und schließlich auf einem Tuch ausgeklopft.

Es wurde dann ein Enzymkonjugat hinzugegeben und 30 min bei 23 °C inkubiert.

Der oben genannte Waschschritt wurde wiederholt, anschließend wurde ein Tetra-methylbenzidin-Substrat in die Vertiefungen hinzugegeben. Es folgte wieder eine Inkubation bei 23 °C, nach 30 min wurde die Reaktion mit 100 µl einer Stopplösung beendet. Hierbei änderte sich die Farbe von hellblau zu gelb. Die Absorption wurde mit Hilfe eines Tecanreaders (Infinite® M200, Tecan Trading AG) und einer Magel-lan™ 7.1-Software (Tecan Trading AG) bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 650 nm gemessen. Es wurde eine 4-Parameter-Kurve aus den Exktinktionen der Standards berechnet, durch die die Konzentrationen der Pro-ben errechnet werden konnten. Der inter-assay Variationskoeffizient lag bei 10,1 %, der intra-assay Variationskoeffizient bei 5,2 %.

3.3.1.5 Gesamtprotein im Plasma

Die Messung von Gesamtprotein erfolgte kolorimetrisch nach der Methode von BRADFORD (1976). Der Farbstoff Coomassie-Brilliant-Blue G-250 bindet Proteine in saurer Lösung an ihren kationischen und unpolaren Seitenketten. Die ungebundene, kationische Form ist rot gefärbt und hat ein Absorptionsmaximum bei 470 nm. Durch die Komplexbildung entsteht eine blaue Farbe und das Absorptionsmaximum ver-schiebt sich auf eine Wellenlänge von 595 nm. Anhand der Exktinktionskoeffizienten kann die Proteinkonzentration errechnet werden.

Die lithiumheparinisierten Proben wurden am Vortag aus -20 °C aufgetaut (für die Messung von 25-OHD3) und über Nacht bei 4 °C gelagert. Es wurden Standardlö-sungen mit Konzentrationen von 40; 80; 120; 160 und 200 ng/ml angesetzt. Die

Pro-53

ben wurden 1:400 mit A. dest. verdünnt. Anschließend wurden 50 µl der Standards, Proben und des Leerwerts (A. dest.) in Dreifachansatz in eine Mikrotiterplatte pipet-tiert. Kühl gelagertes SERVA-Reagenz wurde verdünnt (6 ml + 16,5 ml A. dest.) und bis zur Verwendung bei Raumtemperatur dunkel gelagert. Hiervon wurden 200 µl mit einer 8-fach Pipette in jede Vertiefung hinzugegeben. Nach 5-minütiger Inkubation wurde mittels eines Tecanreaders (Infinite® M200, Tecan Trading AG) und einer iControl™-Software (Tecan Trading AG) bei einer Wellenlänge von 595 nm die Far-bintensität gemessen, durch welche die Proteinkonzentrationen berechnet werden konnten.

3.3.2 Eierschalenanalyse

Für die Eierschalenanalyse wurden die Eier zu Beginn gewogen (Waage PC440, Mettler Toledo). Danach wurde die Bruchfestigkeit mittels einer Apparatur gemessen, welche die für den Bruch der Eischale benötigte Kraft anzeigt (s. Abbildung 8). Im nächsten Schritt wurde das Ei entleert und die Schale mit einem Löffel ausgeschabt und für 30 s bei 800 Watt in der Mikrowelle getrocknet. Die getrocknete Eischale wurde anschließend gewogen. Im letzten Schritt wurden in der Nähe des Äquators die Eihäute entfernt und die Schalendicke anhand eines Messschiebers mit einer Genauigkeit von 0,01 mm gemessen (s. Abbildung 9). Das relative Schalengewicht wurde durch Division des absoluten Schalengewichts durch das Eigewicht ermittelt.

3.3.3 PCR

Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ist eine Methode, mit der DNA in-vitro verviel-fältigt werden kann. Dies geschieht innerhalb von 20 – 50 Zyklen, von denen jeder aus einer Denaturierungphase, einer Primerhybridisierungphase und einer Elongati-onsphase besteht. In der ersten Phase wird die doppelsträngige DNA auf 95 °C er-hitzt, wodurch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren gelöst werden und sich die DNA in zwei einzelne Stränge aufteilt. Die zweite Phase dient der Anlagerung (Annealing) spezifischer, synthetisch erzeugter Primer an die DNA, wofür eine Temperatur von 55 – 65 °C notwendig ist. Die optimale Temperatur wird von der Basenpaarenzusammensetzung der Primer bestimmt. In der Elongations-phase (AmplifikationsElongations-phase) werden durch die Taq-Polymerase, die sich an das 3‘-Ende eines Primers anlagert, neue komplementäre DNA-Stränge aus freien dNTPs synthetisiert. Die Primer bilden jeweils den Anfang der neuen Einzelstränge und werden deshalb nicht wieder abgelöst. Die optimale Temperatur für die Wirkung der Taq-Polymerase liegt bei 72 °C. Allerdings kann man die letzten beiden Phasen

Abbildung 8: Apparatur zur Feststellung der Bruchfestigkeit

Abbildung 9: Messchieber zur Feststel-lung der Schalendicke

auch kombiniert bei 60 °C ablaufen lassen, wodurch sich lediglich die Wirkungs-schnelligkeit der Taq-Polymerase verändert. Da im nächsten Zyklus jeweils wieder alle Doppelstränge aufgetrennt und mit freien Nukleotiden aufgefüllt werden, verläuft die Vervielfältigung der Amplifikate exponentiell.

Die qRT PCR ist die präzisiste und sensitivste Methode, mit der Nukleinsäuren quan-titativ detektiert werden können (TEVFIK DORAK 2006). Dabei ruft ein zugesetzter Fluoreszenzfarbstoff (SYBR® Green) ein deutliches Fluoreszenzsignal hervor, wenn er an doppelsträngige DNA bindet. Diese Fluoreszenzsignale, die bei einer Poly-merase-Kettenreaktion durch den Fluoreszenzfarbstoff über eine gewisse Anzahl von Zyklen gesendet werden, können kontinuierlich detektiert werden. Die Fluoreszenz

Abbildung 10: Amplifikationskurve einer RT qPCR von CaBPD28k im Duodenum

Die Kurve zeigt die Fluoreszenz in Abhängigkeit der Zyklen auf. Rote Linien = Verdünnungsstufen der Standardreihe; grüne Linien: Proben; blaue Linien = Negativkontrolle

ist mit der Zahl der Amplifikate positiv korreliert. Eine korrekte Messung kann nur in der Phase der exponentiellen Vermehrung stattfinden, da die Reaktion mit zuneh-mender Zahl der Zyklen in den Bereich der Sättigung übergeht. Aus dem über die Zeit zunehmenden Signal des Farbstoffs lässt sich diese Phase darstellen. Es wird rechnerisch ein Threshold ermittelt, also ein Maß an Fluoreszenz, das deutlich über dem Hintergrund liegt und innerhalb der exponentiellen Phase erreicht wird. Die exakte Anzahl der zum Überschreiten dieses Wertes notwendigen Zyklen korreliert mit der Ausgangsmenge der Ziel-DNA in den jeweiligen Inkubationsansätzen. Die bekannten Ausgangsmengen der Standardreihe können gegen die entsprechenden Treshold-Werte aufgetragen werden, wodurch eine Standardkurve erzeugt werden kann. Diese ist zusammen mit den Treshold-Werten Grundlage für die Berechnung der Anzahl der Kopien der jeweiligen Proben. Typische Amplifikationskurven sind in Abbildung 10 dargestellt.

3.3.3.1 RNA-Isolierung und cDNA-Synthese

Aus den aus Duodenum, Ileum und der Niere entnommenen Gewebeproben wurde die Gesamt-RNA mittels eines RNeasy® Plus Mini Kit (Qiagen) isoliert. Für die Isola-tion aus den Geweben der ESG wurde ein RNeasy® Fibrous Tissue Mini Kit

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