Antikörperinkubation und Proteindetektion

Nachdem die Membranen blockiert waren, konnten sie am nächsten Tag mit ver-schiedenen Antikörpern inkubiert werden (s. Tabelle 9). Erst wurde ein primärer Anti-körper hinzugegeben, der spezifisch an das zu detektierende Protein bindet, nicht-gebundene Antikörper wurden durch einen Waschschritt entfernt. Ein sekundärer Antikörper, der mit dem Enzym Meerrettichperoxidase konjugiert ist, bindet an den primären Antikörper und kann mit einer Chemilumineszenz sichtbar gemacht werden.

Das Chemilumineszenz-Substrat Pierce™ ECL (Thermo Fisher Scientific) wurde für 5 min auf die Membranen gegeben. Durch die Aktivität der Meerrettichperoxidase kam es zu einer Lichtemission, die mit einem ChemiDoc™ XRS (Bio-Rad Laboratori-es) detektiert werden konnte. Die Lichtintensität einer Bande, welche mit dem Pro-teingehalt korreliert, konnte mit einer Image Lab™ 5.2 Software (Bio-Rad Laboratori-es GmbH) quantifiziert werden.

Die Stärke des Lichtsignals wird von dieser Software als optische Dichte angegeben.

Der Vergleich der optischen Dichte verschiedener Proteinbanden darf nur innerhalb einer Membran erfolgen, da geringste Unterschiede in der Handhabung der Memb-ranen zu unterschiedlichen Signalen führen können. Für die Detektion jedes Trans-portproteins wurde für jedes Gewebe und für jede Hühnerlinie eine Membran ange-fertigt. Somit war ein Vergleich zwischen den Kontroll- und Versuchstieren (alternie-rend aufgetragen) nur innerhalb jeder Linie möglich.

Um das Risiko einer fehlerhaften Auswertung aufgrund labortechnischer Fehler mög-lichst gering zu halten, muss die nachgewiesene Expression der Proteine

normali-68

siert werden. Dies kann anhand eines kontinuierlich exprimierten Strukturproteins oder anhand des Gesamtprotein-Gehalts einer Spur erfolgen. Da nur für die Detekti-on vDetekti-on PMCA in den Darmgeweben ein geeignetes Strukturprotein (Villin) zur Verfü-gung stand, wurde in allen anderen Fällen gegen den Gesamtprotein-Gehalt norma-lisiert. Hierfür wurden die Membranen nach der Kamera-Aufnahme kurz in PBS ge-spült und dann über Nacht in mit Essigsäure versetzter Tinte inkubiert. Die Tinte färbt alle Proteine einer Spur an, sodass die Membranen nach Trocknung erneut von der Kamera aufgenommen und durch die gleiche Software wie oben beschrieben analy-siert werden konnten.

Für den Nachweis von Villin mussten die entsprechenden Membranen erst gestrippt werden, um die bereits gebunden Antikörper zu entfernen. Zuerst wurden die Memb-ranen 2 mal für 10 min mit PBS gewaschen, um das Chemilumineszenz-Substrat zu entfernen. Anschließend wurden die Membranen für 45 min mit einem sauren Strip-ping-Puffer (0,2 M Glycin, 0,05 % Tween 20, 1 % SDS, pH 2) inkubiert. Die Membra-nen wurden jeweils 2 mal für 10 min erst mit PBST, dann mit PBS gewaschen und anschließend über Nacht mit in PBST gelöstem Magermilchpulver (5 %ig) blockiert.

Die Antikörperinkubationsbedingungen (s. Tabelle 9), sowie die Detektion der Pro-teinbanden gleichen dem bereits oben erklärten Prinzip.

69

Tabelle 9: Antikörperinkubationsbedingungen für CaBPD28k, PMCA und Villin

CaBPD_28k PMCA Villin

Blockierung 10 %ige PBST-Milch über Nacht bei 4 °C

5 %ige PBST-Milch, über Nacht bei 4 °C

5 %ige-PBST Milch, über Nacht bei 4 °C Spülen nicht spülen kurz spülen in PBST kurz spülen in PBST

Primärer

70 3.4 Statistik

Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit der Computerprogrammen JMP 12.0.1 (SAS Institute GmbH) und GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). Auch die Darstellung der Daten erfolgte mithilfe von GraphPad Prism 8, bzw. mithilfe von MS Excel 2010 (Microsoft Corporation).

Die Werte wurden zunächst mithilfe eines Kolmogorov-Smirnov-Tests auf Normalver-teilung getestet. Die Blutparameter wurden mit einer zweifaktoriellen Varianzanalyse (2way ANOVA) mit den Faktoren Diät und Linie ausgewertet und die RNA-Expressionsdaten mit einer dreifaktoriellen Varianzanalyse (3way ANOVA) mit den Faktoren Diät, Phylogenie und Leistungsniveau. Durch einen ANOVA F-Test konnte ermittelt werden, ob signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen bestanden. Für die Blutparameter werden die Least Significant Means (LSM), für die Expressionsda-ten die arithmetischen Mittelwerte (x̅) mit den dazugehörigen Standardfehlern (SEM) dargestellt. Im Falle einer Signifikanz, wurde ein Fisher’s LSD Test (RNA-Expression) bzw. ein Tukey HSD Test (Blutparameter) für einen Mehrfachvergleich der Mittelwer-te durchgeführt. Da die DaMittelwer-ten der RNA-Expression von CYP24A1 nicht normalverMittelwer-teilt waren, wurde ein nicht-parametrischer Mann-Whitney-Test angewendet.

Die Eischalenqualitätsparameter wurden für die Linien einzeln mit den Faktoren Diät und Zeit mit einer 2way ANOVA ausgewertet. Für einen Mehrfachvergleich zeigte ein Sidak’s Post Test signifikante Unterschiede zwischen der Kontroll- und Versuchs-gruppen für die einzelnen Tage an. Für die Auswertung des Anteils beschädigter Eischalen wurde ein Fisher’s Exact Test mit MS Excel durchgeführt. Auch hier fand ein Vergleich der der Kontroll- und Versuchsgruppen für jeden einzelnen Tag statt.

Die Verlaufsgraphen zeigen den arithmetischen Mittelwert (x̅).

Die Ergebnisse der Western Blot Analysen wurden mithilfe eines parametrischen T-Tests analysiert. Da im Falle der Proteinexpression von CaBPD28k der Linie L68 die Werte nicht normalverteilt waren, wurde hier ein Mann-Whitney-Test durchge-führt. Die Proteinexpressionen werden mit den arithmetischen Mittelwerten (x̅) und den dazugehörigen Standardfehlern (SEM) dargestellt.

Das Signifikanzniveau wurde jeweils bei p < 0,05 festgesetzt.

71 4 Ergebnisse

4.1 Plasmaparameter

Zur Übersichtlichkeit werden im Folgenden nur die jeweiligen Plasmaparameter zum Ende der Ca-Restriktionsphasen (zweiter, vierter und sechster Blutentnahmezeit-punkt) dargestellt. Grund hierfür ist, dass nur diese Werte für die Fragestellung, ob sich eine Ca-Restriktion auf die Plasmaparameter auswirkt, relevant sind. Für die statistische Auswertung mittels 2way ANOVA wurden jedoch alle Zeitpunkte berück-sichtigt. Die Werte der ersten, dritten und fünften Blutentnahme sind in Anhang D bis H aufgeführt.

4.1.1 25-OHD3 im Plasma

Die 25-OHD3-Analyse hat gezeigt, dass die deutlichste Reduktion der Konzentration bei der Linie BLA am Ende jeder Ca-restriktiven Phase stattfand (s. Tabelle 10). Die Werte der Linie BLA fielen in jeder Phase um mehr als 40 %. Bei den anderen drei Linien wurde zwar eine geringe Reduktion der 25-OHD3-Konzentration festgestellt, diese war aber nicht signifikant, außer bei der Linie R11 am zweiten Blutentnahme-zeitpunkt.

Beim Vergleich der Kontrollgruppen aller Linien untereinander konnte zudem festge-stellt werden, dass die Werte der Kontrolltiere der Linien WLA, L68 und R11 zu je-dem Zeitpunkt basal auf einem signifikant niedrigeren Niveau waren als die der Linie BLA. Durch die Ca-restriktive Fütterung reduzierten sich die verhältnismäßig hohen 25-OHD3-Konzentrationen der Linie BLA und erreichten das Level der anderen Li-nien.

72

Tabelle 10: 25-OHD3-Konzentrationen (ng/ml) zu den Blutentnahmezeitpunkten 2, 4 und 6

Parameter Gruppe Blutentnahmezeitpunkt

2 4 6

25-OHD3

[ng/ml]

BLA Kon 33,82 ± 2,08 ^a 34,42 ± 2,31 ^a 29,00 ± 2,28 ^a Ca- 11,15 ± 2,08 ^bc 19,43 ± 2,31 ^b 16,91 ± 2,28 ^b L68 Kon 14,45 ± 2,08 ^bc 15,33 ± 2,31 ^b 14,73 ± 2,28 ^b Ca- 11,00 ± 1,90 ^bc 11,46 ± 2,11 ^b 11,76 ± 2,09 ^b WLA Kon 9,92 ± 2,08 ^bc 14,37 ± 2,31 ^b 17,32 ± 2,28 ^b Ca- 11,44 ± 2,08 ^bc 11,31 ± 2,31 ^b 10,10 ± 2,28 ^b R11 Kon 18,09 ± 2,08 ^b 18,73 ± 2,31 ^b 14,35 ± 2,28 ^b Ca- 7,79 ± 1,90 ^c 13,41 ± 2,11 ^b 9,02 ± 2,09 ^b

LSM ± SEM, n= 5 (außer L68 und R11 (Ca-), n= 6), 2way ANOVA: BE 2: Linie p < 0,001, Diät p < 0,001, Line*Diät p < 0,001; BE 4: Linie p < 0,001, Diät p < 0,001, Linie*Diät p < 0,0487; BE 6: Linie p < 0,001, Diät p < 0,001; Tukey HSD Test (p < 0,05): verschiedene Buchstaben innerhalb einer Spal-te repräsentieren einen signifikanSpal-ten UnSpal-terschied

4.1.2 Cat und Ca²⁺ im Plasma

Die Cat-Werte im Plasma nahmen bei allen Versuchslinien am Ende der ersten Ca-Restriktionsphase (Blutentnahmezeitpunkt (BE) 2) im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollgruppen signifikant ab. Zur Übersicht sind die Cat- und Ca²⁺-Werte der Blut-entnahmezeitpunkte 2, 4 und 6 in Tabelle 11 dargestellt. Nach der zweiten und drit-ten Ca-Restriktionsphase (BE 4 und 6) konnte nur eine signifikante Reduktion der Cat-Werte im Plasma bei den Weißlegern (WLA und R11) im Vergleich zu den jewei-ligen Kontrollgruppen festgestellt werden. Auch die Ca²⁺-Plasmakonzentration hat sich in Folge der Ca-restriktiven Diät verringert. Diese Reduktion der Ca²⁺ -Plasmakonzentration konnte allerdings bei den Minderleistungslinien (L68 und R11) am Ende der letzten Ca-Restriktionsphase (BE 6) nicht mehr festgestellt werden.

Die Versuchstiere der Linie WLA, die Ca-restriktiven versorgt wurden, wiesen am Ende der Ca-Restriktionsphasen die niedrigsten Ca²⁺-Konzentrationen (BE 2: 1,19 ± 0,04; BE 4: 1,15 ± 0,03; BE 6: 1,01 ± 0,04) im Vergleich zu den anderen Linien auf.

Relativ betrachtet blieb der Anteil der Ca²⁺-Konzentration in Relation zur Cat-Konzentration bis auf zwei Ausnahmen gleich. Bei den R11 Hennen waren die

73

relativen Ca²⁺-Konzentration der restriktiv mit Ca gefütterten Tiere zum zweiten Blut-entnahmezeitpunkt signifikant höher, wie auch bei den WLA Hennen zum vierten Blutentnahmezeitpunkt. Der relative Anteil von Ca²⁺ ist in Tabelle 12 dargestellt.

74

Tukey HSD Test (p < 0,05): verschiedene Buchstaben innerhalb einer Spalte repräsentieren einen signifikanten Unterschied

Tukey HSD Test (p < 0,05): verschiedene Buchstaben innerhalb einer Spalte repräsentieren einen signifikanten Unterschied

Tukey HSD Test (p < 0,05): * = signifikanter Unterschied zwischen Kon und Ca-

75

Tabelle 12: Relativer Ca²⁺-Anteil am Cat zu den Blutentnahmezeitpunkten 2, 4 und 6

Parameter Gruppe Blutentnahmezeitpunkt

2 4 6

Ca²⁺in Relation

zu Cat

[%]

BLA Kon 24,97 ± 2,31 ^b 27,14 ± 1,73 ^a 26,01 ± 1,65 ^a Ca- 23,25 ± 2,31 ^b 22,41 ± 1,22 ^ab 20,04 ± 1,17 ^abc L68 Kon 23,02 ± 2,31 ^b 23,97 ± 1,81 ^ab 20,24 ± 1,65 ^abc Ca- 24,76 ± 1,63 ^b 24,85 ± 1,22 ^ab 19,67 ± 1,17 ^bc WLA Kon 22,31 ± 2,31 ^b 18,79 ± 1,73 ^b 17,60 ± 1,65 ^bc Ca- 22,16 ± 1,63 ^b 25,46 ± 1,22 ^a 18,00 ± 1,17 ^c R11 Kon 22,07 ± 2,31 ^b 22,25 ± 1,73 ^ab 19,26 ± 1,65 ^abc

Ca- 34,03 ± 1,71 ^a 25,65 ± 1,25 ^a 23,88 ± 1,19 ^ab

LSM ± SEM, n =11 (Kon) bzw. n = 22 (Ca-), 2way ANOVA: BE 2: Linie p < 0,345, Diät p < 0,0396, Line*Diät p < 0,0042; BE 4: Linie*Diät p < 0,0021; BE 6: Linie p < 0,0029, Linie*Diät p < 0,0043;

Tukey HSD Test (p < 0,05): verschiedene Buchstaben innerhalb einer Spalte repräsentieren einen signifikanten Unterschied

76 4.1.3 Gesamtprotein im Plasma

Die Gesamtprotein-Konzentration im Plasma war bei den Versuchslinien im Ver-gleich zu den Kontrolllinien am Ende der Ca-Restriktionsphasen (BE 2, 4 und 6) ten-denziell niedriger. Allerdings waren die Unterschiede nur bei der Linie R11 zum zwei-ten Bluzwei-tentnahmezeitpunkt und bei den Linien L68 und WLA zum vierzwei-ten Bluzwei-tent- Blutent-nahmezeitpunkt signifikant (s. Tabelle 13).

Tabelle 13: Gesamtprotein-Konzentrationen im Plasma (mg/ml) zu den Blutentnah-mezeitpunkten 2, 4 und 6

Tukey HSD Test (p < 0,05): verschiedene Buchstaben innerhalb einer Spalte repräsentieren einen signifikanten Unterschied, * = signifikanter Unterschied zwischen Kon und Ca-

4.1.4 Pi im Plasma

Bei der statistischen Auswertung der Pi-Konzentrationen im Plasma konnten größten-teils keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen gezeigt werden (s. Ta-belle 14). Lediglich die Werte der Ca-restriktiv gefütterten R11 Hennen waren zum

77

zweiten Blutentnahmezeitpunkt um ca. 25 % signifikant niedriger als die der entspre-chenden Kontrollgruppe.

Tabelle 14: Pi-Konzentrationen im Plasma (mmol/l) zu den Blutentnahmezeitpunkten 2, 4 und 6

Parameter Gruppe Blutentnahmezeitpunkt

2 4 6

Pi

[mmol/l]

BLA Kon 2,19 ± 0,14 ^a 2,07 ± 0,15 ^a 1,98 ± 0,13 ^a Ca- 1,88 ± 0,10 ^ab 1,86 ± 0,11 ^a 1,99 ± 0,09 ^a L68 Kon 1,90 ± 0,14 ^ab 1,92 ± 0,15 ^a 1,63 ± 0,13 ^a Ca- 1,73 ± 0,10 ^ab 1,60 ± 0,10 ^ab 1,72 ± 0,09 ^a WLA Kon 1,41 ± 0,14 ^b 1,75 ± 0,15 ^ab 1,58 ± 0,13 ^a Ca- 1,60 ± 0,10 ^b 1,34 ± 0,10 ^b 1,78 ± 0,09 ^a R11 Kon 2,16 ± 0,14 ^a 1,96 ± 0,15 ^a 1,89 ± 0,13 ^a Ca- 1,61 ± 0,10 ^b 1,65 ± 0,10 ^ab 1,66 ± 0,09 ^a

LSM ± SEM, n = 11 (Kon) bzw. n = 22 (Ca-), 2way ANOVA: BE 2: Linie p < 0,001, Diät p < 0,0115, Line*Diät p < 0,0170; BE 4: Linie p < 0,0132, Diät p < 0,001; BE 6: Linie p < 0,0189;

Tukey HSD Test (p < 0,05): verschiedene Buchstaben innerhalb einer Spalte repräsentieren einen signifikanten Unterschied

78 4.2 Ca²⁺-transportierende Strukturen

Die Expression der Ca²⁺-transportierenden Strukturen CaBPD28k und PMCA wurde im Duodenum, Ileum und in der Eischalendrüse mittels qRT PCR und Western Blot analysiert. TRPV6 wurde nur an der Hälfte der Tiere im Duodenum mittels qRT PCR untersucht (s. Abbildung 11). In Abbildung 12, Abbildung 13 und Abbildung 14 wer-den die normalisierten Werte der absoluten mRNA-Expression gezeigt. Die normali-sierten Werte der Proteinexpression werden in Relation zur Kontrollgruppe darge-stellt. Insgesamt waren die basalen mRNA-Expressionen des CaBPD28k und der PMCA im Ileum im Vergleich zum Duodenum niedriger, was sich mit den Befunden von STAHL (2013) und SUGIYAMA et al. (2007) deckt.

4.2.1 Duodenum 4.2.1.1 TRPV6

Da sich die Detektion der mRNA-Expression von TRPV6 bereits bei STAHL (2013) als schwierig erwies, wurde in dieser Studie nur probeweise an der Hälfte der Tiere die Expression im Duodenum im Hinblick auf potenzielle Unterschiede zwischen den Linien untersucht. In der Arbeit von STAHL (2013) wurde nur die Linie Lohman Brown verwendet, während in der vorliegenden Arbeit vier verschiedene Linien un-tersucht wurden. Unter Verwendung der gleichen Primer wie JONCHÈRE et al.

(2012) war die mRNA-Expression aber zu niedrig, um eine Auswertung vorzuneh-men. Auf Abbildung 11 ist deutlich zu erkennen, dass die Amplifikationskurven aller Proben (grüne Kurven) außerhalb der Standardreihe (rote Kurven) lagen und somit einen Gehalt von weniger als 10³ Kopien aufwiesen. Auch andere Studien konnten keine ausreichende mRNA-Expression im aviären Intestinum detektieren (STAHL 2013 u. GLOUX et al. 2018).

79

Abbildung 11: Amplifikationskurven in Doppelbestimmung von TRPV6 im Duodenum

n = 32; rote Kurven = Standardreihe (10⁷ – 10³ Kopien); grüne Kurven = getestete Proben; blaue Linie bzw. Kurve = Negativkontrolle

4.2.1.2 CaBPD28k und PMCA

Die Ca-restriktive Fütterung führte im Duodenum zu einer gesteigerten mRNA-Expression von CaBPD28k und PMCA, die aber in Bezug auf CaBPD28k nur bei den Linien L68 und R11 signifikant war und in Bezug auf PMCA bei den Linien BLA und L68. Auch die Proteinexpression nahm bei den Versuchstieren im Vergleich zu den Kontrolltieren zu. Diese Steigerung war in Bezug auf CaBPD28k bei allen Li-nien signifikant, außer bei der Linie L68.

Hinsichtlich der Proteinexpression von PMCA konnte nur bei den Linien BLA und R11 ein signifikanter Anstieg verzeichnet werden. Die Ergebnisse sind in Abbildung 12 graphisch dargestellt.

80

Optische Dichte CaBPD28k/ Gesamtprotein in Relation zur Kontrollgruppe

BLA

Optische Dichte PMCA / Villin in Relation zur Kontrollgruppe

BLA

Abbildung 12: RNA- und Proteinexpression im Duodenum I. RNA-Expression von CaBPD28k und PMCA, x̅ +SEM, n = 8, 3way ANOVA: CaBPD28k: Diät p < 0,001; PMCA: Diät p < 0,001;

Fisher‘s LSD Test (p < 0,05): * = signifikanter Unterschied zwischen Kon und Ca- II. Proteinexpression von CaBPD28k und PMCA, x̅ + SEM, n = 7;

t-Test (p < 0,05): * = signifikanter Unterschied zwischen Kon und Ca-

81 4.2.2 Ileum

Die Expression von PMCA wies auf Proteinebene keine signifikanten Veränderungen in Folge der Ca-restriktiven Diät auf. Auf mRNA-Ebene konnte bei der Linie R11 eine signifikante Zunahme der Expression nachgewiesen werden. Zudem war die mRNA-Expression nach der Ca-restriktiven Diät bei der Linie R11 signifikant höher als bei der Linie L68.

In Bezug auf die CaBPD28k-Proteinexpression führte die Ca-restriktive Diät im Ileum zu einer signifikanten Steigerung. Diese Steigerung war bei der Linie L68 am stärks-ten. Die mRNA-Expression von CaBPD28k nahm bei allen Linien zu, sodass alle Li-nien das gleiche Level erreichten und sich in ihrer mRNA-Expression nicht signifikant voneinander unterschieden. Zur Übersicht sind die Ergebnisse als Graphen in Abbil-dung 13 dargestellt.

82

Optische Dichte CaBPD28k/ Gesamtprotein in Relation zur Kontrollgruppe

BLA

Optische Dichte PMCA / Villin in Relation zur Kontrollgruppe

BLA

WLA L68

R11

Abbildung 13: RNA- und Proteinexpression im Ileum

I. RNA-Expression von CaBPD28k und PMCA, x̅ +SEM, n = 8,

3way ANOVA: CaBPD28k: Diät p < 0,001, Phylogenie p < 0,05; PMCA: Diät p < 0,01, Phylogenie p < 0,01; Fisher‘s LSD Test (p < 0,05): * = signifikanter Unterschied zwischen Kon und Ca-,

# = signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen

II. Proteinexpression von CaBPD28k und PMCA, x̅ + SEM, n = 7, t-Test bzw. Mann-Whitney-Test bei L68, CaBPD28k (p < 0,05): * = signifikanter Unterschied zwischen Kon und Ca-

83 4.2.3 Eischalendrüse

In der Eischalendrüse führte die Ca-restriktive Fütterung nur bei der Linie L68 zu ei-ner signifikanten Steigerung der Expression von CaBPD28k, sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. Die Werte der Kontrollgruppe der Linie WLA waren jedoch in Hinblick auf die mRNA-Expression von CaBPD28k bereits basal signifikant höher als die der Linien BLA und R11. Durch eine Ca-restriktive Fütterung stieg die CaBPD28k-mRNA-Expression der Minderleistungstiere signifikant mehr an als die der entsprechenden Hochleistungstiere. Hier gab es also eine Interaktion zwischen Leis-tungsniveau und Phylogenie.

Die PMCA-Proteinexpression war bei der Linie WLA signifikant niedriger als bei der entsprechenden Kontrollgruppe. In Abbildung 14 sind diese Ergebnisse graphisch dargestellt.

84

Optische Dichte CaBPD28k/ Gesamtprotein in Relation zur Kontrollgruppe

*

Optische Dichte PMCA / Gesamtportein in Relation zur Kontrollgruppe

BLA L68 WLA R11

*

Abbildung 14: RNA- und Proteinexpression in der Eischalendrüse I. RNA-Expression von CaBPD28k und PMCA, x̅ +SEM, n = 8,

3way ANOVA: CaBPD_28k: Diät*Phylogenie p < 0,01, Leistungsniveau*Phylogenie p < 0,01;

Fisher‘s LSD Test (p < 0,05): * = signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen,

# = signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen

II. Proteinexpression von CaBPD28k und PMCA, x̅ + SEM, n = 7, t-Test (p < 0,05): * = signifikanter Unterschied zwischen Kon und

Ca-85 4.3 Renaler Vitamin D-Metabolismus

In den Proben des Nierengewebes wurden die Enzyme CYP24A1 und CY27C1, so-wie das Protein VDHAP auf mRNA-Expressionsebene untersucht. Es wurde ange-nommen, dass diese Strukturen am Vitamin D-Metabolismus beteiligt sind. Die Un-tersuchungen des CYP24A1 und des VDHAP ergaben keine signifikanten Unter-schiede der mRNA-Expression zwischen den Ca-restriktiv gefütterten Tiere und den entsprechenden Kontrolltieren (s. Abbildung 15). Jedoch gab es bei der VDHAP-Expression Unterschiede in Hinblick auf die Phylogenie. Die Linie R11 hatte sowohl basal als auch nach der Ca-Restriktion signifikant höhere Werte als die Linie L68.

Die qRT PCR von CYP27C1 ergab so niedrige Expressionswerte, dass keine Aus-wertung vorgenommen werden konnte und die Untersuchung der zweiten Hälfte der Tiere nicht vorgenommen wurde. Abbildung 16 zeigt, dass die Amplifikationskurven der meisten Proben (grüne Kurven) außerhalb der Standardreihe (rote Kurven) lagen und niedriger waren als der niedrigste Standard mit einem Gehalt von 10³ Kopien.

Kon Ca

Abbildung 15: RNA-Expression von CYP24A1 und VDHAP in der Niere

CYP24A1: x̅ + SEM, n = 8, Mann-Whitney-Test (p < 0,05): keine signifikanten Unterschiede VDHAP: x̅ + SEM, n = 8, 3way ANOVA: Phylogenie p < 0,0029;

Fisher’s LSD Test (p < 0,05): # = signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen

86

Abbildung 16: Amplifikationskurven in Doppelbestimmung von CYP27C1 in der Niere

n = 32, grüne Kurven = getestete Proben; rote Kurven = Standardreihe (10⁷ – 10³ Kopien); blaue Linie bzw. Kurve = Negativkontrolle

87 4.4 Legerate

Die Verläufe der Legerate der drei Ca-Restriktionsphasen sind in Abbildung 17 dar-gestellt. Es ist ersichtlich, dass die vier Linien im Laufe der drei Ca-Restriktionsphasen unterschiedliche Legeraten aufweisen. Basal befanden sich die Hochleistungslinien auf einem Leistungsniveau von ca. 80 – 100 % und die Min-derleistungslinien auf einem Niveau von 60 – 80 %.

In der ersten Ca-Restriktionsphase reagierte weder die Linie WLA noch die Linie L68 mit einer deutlichen Abnahme der Legerate. Die Linie R11 hielt das Leistungsniveau für ca. zwei Wochen aufrecht, danach sank die Legerate jedoch gravierend auf unter 10 %. Die Linie BLA reagierte nach ca. einer Woche mit einer moderaten Abnahme und erreichte ein Niveau von ca. 50 %.

Auch in der zweiten Ca-Restriktionsphase nahm die Legerate der Linie BLA ab, al-lerdings setzte diese Abnahme etwa eine Woche später ein und das Leistungsniveau hielt sich auf ca. 60 %. Bei den anderen drei Linien wurden keine substanziellen Un-terschiede im Vergleich zu den Kontrollgruppen beobachtet. Es konnte aber festge-stellt werden, dass die Unterschiede im Leistungsniveau zwischen den Ca-restriktiv gefütterten Tieren und den entsprechenden Kontrollgruppen bei den Weißlegern (WLA und R11) zum Ende der Ca-Restriktionsphase größer wurden. In der dritten Restriktionsphase wurden ähnliche Werte wie die der zweiten Ca-Restriktionsphase festgestellt.

Insgesamt konnte die Linie L68 in allen drei Ca-Restriktionsphasen die Legerate auf-rechterhalten, wie auch die Linie WLA, die nur am Ende der zweiten und dritten Pha-se eine reduzierte Legerate aufwies.

88

Abbildung 17: Legerate [%] aller Linien in den drei Ca-Restriktionsphasen

x̅, n = 11 (Kon) bzw n = 22 (Ca-), Fisher’s Exact Test (p < 0,05): * = signifikanter Unterschied zwischen Kon und Ca-

89

Anhand der Detektion der Nestbesuche und Eiablage konnten fünf Tiere identifiziert werden, die das Nest während der gesamten Versuchsperiode von 21 Wochen kein einziges Mal aufgesucht haben (s. Tabelle 15). Die Anzahl der Tiere, die nie ein Ei in das Nest gelegt haben, lag bei 21. Da diese Zahl die Tiere beinhaltet, die das Nest nie besucht haben, muss es Tiere gegeben haben, die das Nest aufgesucht, jedoch kein Ei gelegt haben. Über ein Drittel der Tiere der Linie BLA, die Ca-restriktiv gefüt-tert wurden, haben nie ein Ei in das Nest gelegt. Verlegte Eier kamen laut Stallper-sonal am häufigsten im Abteil 6 vor (Linien BLA und R11, Ca-restriktiv gefüttert). Ei-ne Dokumentation fand in dieser Hinsicht nicht statt.

Tabelle 15: Nestverhalten der verschiedenen Gruppen während der gesamten Ver-suchsperiode

Gruppe Anzahl der Tiere, die das Nest nie besucht haben

Anzahl der Tiere, die nie ein Ei in das Nest gelegt haben

BLA Kon 0 2

Ca- 3 8

WLA Kon 0 0

Ca- 0 0

L68 Kon 0 2

Ca- 1 4

R11 Kon 0 1

Ca- 1 4

Werte zur Verfügung gestellt durch das Institut für Nutztiergenetik, FLI

90 4.5 Parameter der Eischalenqualität

Die Ergebnisse der Eischalenqualität (relatives Schalengewicht, Schalendicke) und des Eigewichts werden in den folgenden Kapiteln für die einzelnen Ca-Restriktionsphasen gezeigt. Eine vertikale gestrichelte Linie markiert jeweils das Ende der Ca-restriktiven Fütterung nach 21 Tagen. Es werden bei der ersten und zweiten Ca-Restriktionsphase zusätzlich noch die ersten zehn Tage der Erholungs-phase dargestellt. Im Falle des Eigewichts werden die absoluten Werte der Ca-restriktiv gefütterten Tiere abgebildet. Für das relative Schalengewicht und die Schalendicke wurde das Verhältnis zu der entsprechenden Kontrollgruppe berech-net, welche mit einer horizontalen, gestrichelten Linie bei 100 % markiert ist. Für die Berechnung des relativen Schalengewichts wurde das absolute Schalengewicht ins Verhältnis zum Eigewicht gesetzt.

Zusätzlich zu den Merkmalen Eigewicht, Schalendicke und relatives Schalengewicht wurde der Anteil der Eier berechnet, die zum Zeitpunkt der Analyse beschädigt wa-ren und somit keinem Bruchfestigkeits-Test unterzogen werden konnten. Eier konn-ten entweder nach Eiablage oder während Handhabung beschädigt worden sein.

Zusätzlich zu den Merkmalen Eigewicht, Schalendicke und relatives Schalengewicht wurde der Anteil der Eier berechnet, die zum Zeitpunkt der Analyse beschädigt wa-ren und somit keinem Bruchfestigkeits-Test unterzogen werden konnten. Eier konn-ten entweder nach Eiablage oder während Handhabung beschädigt worden sein.

Im Dokument Interaktion zwischen Selektion auf Leistungseffizienz und Adaptationsvermögen an eine reduzierte Calcium-Konzentration im Futter bei Legehennen (Seite 81-0)