Effekt von Milchinhaltsstoffen (Lactose und Casein), Sojaeiweiß und Calciumzulagen auf den Calcium- ,
Phosphat- und Knochenstoffwechsel beim Schwein mit Vitamin-D-Mangel
I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades eines
D O C T O R M E D I C I N A E V E T E R I N A R I A E durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Pornchai Krongsawatkul
aus Nonthaburi, Thailand
Hannover 2000
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. J. Harmeyer
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. J. Harmeyer 2. Gutachter: PD Dr. M. Kaske
Tag der mündlichen Prüfung: 15 Juni 2000
Meinen Eltern
gewidmet
1 Einleitung... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Intestinaler Transport von Calcium ... 3
2.1.1 Passiver Transport ... 3
2.1.2 Aktiver Transport... 5
2.1.2.1 Der Calciumtransport durch die Bürstensaummembran (Abb. 2.1)... 6
2.1.2.2 Transcellulärer Ca-Transport (Abb. 2.2)... 12
2.1.2.3 Die Ausschleusung von Calcium durch die basolaterale Membran in den interstitiellen Raum (Abb. 2.3)... 18
2.1.3 Transcaltachia... 22
2.2 Einfluss des Futters auf die Calciumverdaulichkeit ... 25
2.2.1 Calcium ... 25
2.2.2 Der Einfluss von Lactose ... 27
2.2.3 Der Einfluss von Caseinphosphopeptiden ... 30
2.3 Mechanismen und Regulation der Calciumausscheidung durch die Nieren... 31
2.3.1 Die Einzelschritte des tubulären Transports... 32
2.3.2 Die Calciumresorption in einzelnen Tubulusabschnitten... 34
2.3.3 Die hormonelle Beeinflussung der renalen Calciumresorption... 36
3 Material und Methoden ... 40
3.1 Versuchstiere ... 40
3.2 Versuchsplan ... 42
3.2.1 Erste Versuchsserie ... 43
3.2.1.1 Versuchsanstellung... 43
im Knochen ... 48
3.2.2 Zweite Versuchsserie... 49
3.2.2.1 Versuchsanstellung... 49
3.2.2.2 Fütterung... 49
3.2.2.3 Probennahmen ... 50
3.3 Analytische Methoden... 52
3.3.1 Ionisiertes Calcium und pH-Messung... 52
3.3.2 Gesamtcalcium ... 52
3.3.3 Anorganisches Phosphat ... 53
3.3.4 Aktivität der alkalischen Phosphatase... 53
3.3.5 CrEDTA... 53
3.4 Statistische Methoden... 54
4 Ergebnisse... 57
4.1 Erste Versuchsserie ... 57
4.1.1 Einfluss des Futters auf Blutparameter ... 57
4.1.1.1 Gesamtcalcium ... 57
4.1.1.2 Ionisiertes Calcium... 63
4.1.1.3 Anorganisches Phosphat ... 68
4.1.1.4 Alkalische Phosphotase (AP)... 72
4.1.2 Einfluss des Futters auf das Körpergewicht ... 76
4.1.3 Einfluss des Futters auf den Mineralstoffgehalt des Knochens (BMC) ... 80
4.1.4 Chymus... 80
4.1.5 Zusammenfassung der Ergebnisse der ersten Versuchsserie... 87
4.2 Zweite Versuchsserie (Bilanzversuche) ... 88
4.2.1 Das Körpergewicht während der Bilanz ... 89
4.2.2 Scheinbare Verdaulichkeit des Calciums und die Calciumbilanz ... 89
4.2.3 Scheinbare Verdaulichkeit des Phosphors und die Phosphorbilanz ... 90
4.2.4 Plasmaparameter... 93
4.2.5 Unterschiede aufgrund des unterschiedlichen Calcitriolstatus der Versuchstiere ... 94
4.2.6 Zusammenfassung der Ergebnisse der zweiten Versuchsserie... 96
5 Diskussion... 98
5.1 Erste Versuchsserie ... 98
5.1.1 Das Gesamtcalcium des Plasmas ... 98
5.1.1.1 Wirkungen von Casein ... 100
5.1.1.2 Wirkungen von Lactose... 102
5.1.2 Das ionisierte Calcium des Plasmas... 105
5.1.3 Die Konzentration von anorganischem Phosphat im Plasma... 106
5.1.4 Die Aktivität der alkalischen Phosphatase im Plasma... 107
5.1.5 Entwicklung des Körpergewichts ... 109
5.1.6 Der Mineralstoffgehalt in der entfetteten Knochenmasse (BMC) ... 109
5.1.7 Wirkstoffe im Soja ... 110
5.1.8 Chymusparameter ... 113
5.2 Zweite Versuchsserie (Bilanzversuche) ... 116
5.2.1 Calcium ... 116
5.2.2 Phosphor... 119
5.2.3 Plasmaparameter... 121
ATPase Adenosintriphosphatase AS Austauscher
BLM-VDR in basolateraler Membran lokalisierler Vitamin D Rezeptor BMC bone mineral content (Knochenmineralstoffgehalt)
bPTH bovine parathyroid hormone
[Ca2+]i intrazelluläre freie Calciumkonzentration CaBP Calcium-Bindungs-Protein Cal Calmodulin
cAMP Cyclo-Adenosinmonophosphat CAT1 Calciumtransportprotein
cGMP Cyclo-Guanosinmonophosphat CPP Caseinphosphopeptide
CrEDTA chrom-ethylene-diamine-tetraacetic acid CS Cytoskelett
DM dry matter
ECaC epithelial calcium channel
EGTA ethylene-glycol-tetraacetic acid
Fm-s Flux von mucosal nach serosal Fs-m Flux von serosal nach mucosal
ICa,s-m Calciumionenstrom von serosal nach mucosal ICa,m-s Calciumionenstrom von mucosal nach serosal
km Michaelis Konstante
Lys Lysosom OVX ovariektomiert mRNA Messenger-Ribonucleinsäuren
N Anzahl der Tiere
Pi Anorganisches Phosphat
PVDR-I pseudo vitamin D deficiency rickets, type I (Pseudo-Vitamin D- Mangelrachitis, Typ 1)
TF Tubulusflüssigkeit
TNFα α-Tumor-Nekrose-Faktor Trans Transcaltachia TM Trockenmasse UF Ultrafiltrat uS ursprüngliche Substanz
VDR Vitamin-D-Rezeptor
1 Einleitung
Vitamin D ist bei Haustieren als der wichtigste langfristige Regulator des Calciumhaushaltes anzusehen. Vor allem durch seine stimulierende Wirkung auf den Darm paßt es die Calciumabsorption an den Bedarf an. Neben dieser zentralen Rolle des Vitamins D gibt es jedoch eine Reihe von Nahrungsfaktoren, die die Calciumabsorption des Darmes beeinflussen. Dazu zählen einmal der Calciumgehalt des Futters selbst und weitere Milchbestandteile, wie Lactose und Phosphopeptide.
Bisher ist es jedoch eine offene Frage, wie stark sich der Calciumhaushalt bei Tieren durch diese Nahrungsfaktoren, unabhängig vom Vitamin D, beeinflussen läßt.
Geeignete tierexperimentelle Untersuchungen zur Beantwortung dieser Frage sind schwierig, da der Effekt einer oder mehrerer der oben genannten Substanzen auf den Calciumhaushalt bei gesunden Tieren stets gegenregulatorische, durch Vitamin- D-ausgelöste Effekte hervorruft. Diese Gegenregulation kann den primären Effekt der Zulage weitgehend maskieren.
Als besonders geeignet zur Untersuchung dieser Frage erschienen daher Tiere, bei denen der unerwünschte Vitamin-D-abhängige gegenregulatorische Effekt ausgeschaltet ist. Solche Tiere standen in Form von Schweinen mit einem erblichen Calcitriolmangel zur Verfügung.
Ziel der hier vorgelegten Untersuchung war es zu prüfen, ob und in welchem Umfang die Nahrungsfaktoren Calcium, Lactose und Bestandteile von Milchprotein, unabhängig vom Vitamin D, den Calciumhaushalt beeinflussen. Die Substanzen wurden Absetzferkeln teils einzeln und teils in Kombination mit dem Futter verabreicht. Zur Beurteilung des Effektes der Zulagen wurden in einer ersten Versuchsserie eine Reihe vom Plasmaparametern und der Mineralstoffgehalt des Knochens gemessen. Bei einer Ration, die sich in dieser Versuchsserie als
besonders wirksam erwies, wurde der Effekt auf den Calciumhaushalt in Bilanzversuchen weiter charakterisiert.
2 Literaturübersicht
2.1 Intestinaler Transport von Calcium
2.1.1 Passiver Transport
Die Darmschleimhaut kann Calcium aktiv und passiv aufnehmen. Der aktive Transport erfolgt transcellulär, der passive Transport paracellulär. Der aktive Transport benötigt chemische Energie in Form von ATP und kann auch entgegen einem chemischen und/oder elektrischen Gradienten ablaufen. Ein Netto-Calciumtransport durch passive Mechanismen setzt dagegen entweder eine elektrische Triebkraft in Form eines transepithelialen Potentials oder eine chemische Triebkraft in Form eines Konzentrationsgefälles zwischen der luminalen und basolateralen Seite der Schleimhaut voraus.
Aus Untersuchungen, die vorwiegend mit Ratten durchgeführt wurden, vertreten BRONNER und PANSU (1999) die Auffassung, dass bei normaler Vitamin-D- Versorgung von Tieren und auch beim Menschen der größte Teil des Calciums passiv aus dem Darm absorbiert wird. Wird die Calciumaufnahme über die Norm hinaus weiter erhöht, nimmt der passiv aufgenommene Teil des Calciums auf Kosten des aktiven Transports weiter zu. Nach Auffassung dieser Autoren findet die passive Aufnahme im distalen Bereich des Jejunums und im Ileum statt, der aktive Transport dagegen im Duodenum und im vorderen Jejunum. Die Autoren begründen ihre Auffassung u.a. mit der Beobachtung, dass fast 90 % der Zeit, die der Chymus im Duodenum verweilt, auf das hintere Jejunum und Ileum entfällt. Nur weniger als 2 % der intestinalen Verweilzeit befindet sich der Chymus im Duodenum. Die Autoren stützten ihre Auffassung u.a. auf Untersuchungen von DUFLOS et al. (1995) und PANSU et al. (1981).
Es gibt jedoch eine Reihe anderer Untersuchungen, ebenfalls an Ratten, aber auch bei anderen Tieren, deren Ergebnisse zu erheblichen Zweifeln an dieser Auffassung Anlass geben. KARBACH (1992) hat den Calciumtransport durch isolierte Darmschleimhäute des Duodenums, Jejunums und Ileums von Ratten in Ussingkammern in Abwesenheit elektrischer und chemischer Gradienten untersucht.
Der Autor errechnet aus diesen Versuchen, dass unter diesen Bedingungen über die Gesamtlänge des Darmes zwar 60 bis 70 % des unidirectionalen Calciumfluxes von mucosal nach serosal (Fm-s) paracellulär, also passiv erfolgt. Über den größten Teil des Darmes hinweg, nämlich dem Jejunum und Ileum, war der umgekehrt gerichtete unidirectionale Flux von Calcium von serosal nach mucosal (Fs-m) jedoch doppelt so hoch wie der m-s-Flux. In diesen Darmabschnitten lag also eine Nettosekretion von Calcium in das Darmlumen vor. Nur im vorderen Dünndarmabschnitt, und besonders im Duodenum, war eine Nettoabsorption von Calcium nachweisbar. Da die Konzentration des ionisierten Calciums im hinteren Abschnitt des Dünndarms oft niedriger ist als in der interstitiellen Flüssigkeit (Harmeyer, pers. Mitt.), scheint eine chemische Triebkraft für eine passive Calciumabsorption in diesem Darmabschnitt nicht vorhanden. Ferner ist unwahrscheinlich, dass in diesem Darmabschnitt in situ eine elektrische Triebkraft in Form eines transmuralen Potentials vorliegt, die die zum Lumen gerichtete chemische Triebkraft ausgleichen könnte. Untersuchungen bei verschiedenen Tierarten haben ergeben, dass das Darmlumen gegenüber der Blutseite der Schleimhaut negativ polarisiert ist. Eine solche Polarisation fördert in diesem Darmabschnitt ebenfalls einen passiven Nettotransport von Calcium vom Blut in Richtung Lumen und steht einer Nettoabsorption entgegen.
Eine aktive Vitamin-D-abhängige Calciumabsorption findet auch bei der Ratte nur im Duodenum statt (BEHAR und KERSTEIN 1976). Die etwas provokante These von BRONNER und PANSU (1999), dass der wachsende Organismus seinen Bedarf an Calcium allein durch passive Absorption decken kann, könnte für Ratten möglicherweise zutreffend sein. Versuche von KOLLENKIRCHEN et al. (1991) haben gezeigt, dass sich bei Vitamin-D-defizienten Ratten die Calciumkonzentration des Blutes allein durch eine Erhöhung des Calciumgehaltes des Futters auf 2 % auf normale Werte
(~2,5 mmol/l) stabilisieren lässt. Es gibt bisher jedoch keine Hinweise darauf, dass dies auch bei größeren Säugetierspezies der Fall ist. Ratten sind als vorwiegend nachtaktive Tiere bei der Regulation des Calciumhaushaltes in einem hohen Maße unabhängig von Vitamin D (HARMEYER 1991). So entwickelten Ratten allein durch Verabreichung einer Vitamin-D-freien Ration bei normalem Calcium- und Phosphatangebot keine typische Hypocalcämie (AU und RAISZ 1967). Erst durch zusätzliche Absenkung des alimentären Calciumangebots lässt sich dieser Effekt erzielen. Andere permanent unterirdisch lebende Nagerspezies, wie z.B. die Afrikanischen Nacktmullen (Heterocephalus Glaber), scheinen bei der Regulation des Calciumhaushaltes vollständig von Vitamin-D-unabhängig zu sein (BUFFENSTEIN und YAHAV 1991).
Bei Schweinen liegt für die Regulation des Calciumhaushaltes dagegen eine wesentlich größere Abhängigkeit von Vitamin D vor als bei der Ratten. Bei wachsenden Calcitriol- defizienten Tieren konnte durch Erhöhung des Calciumgehaltes des Futters (bis auf 2%) die Entstehung einer Hypocalcämie nicht verhindert werden (SCHLUMBOHM und HARMEYER, unveröffentlicht). Schweine sind nach diesen Befunden für einen ausgeglichenen Calciumhaushalt auf einen aktiven Vitamin-D-abhängigen Transport von Calcium im Darm angewiesen.
2.1.2 Aktiver Transport
Der aktive Transport von Calcium durch die Darmmucosa ist für die meisten erwachsenen Säugetiere und Vögel lebensnotwendig (DELUCA 1983). Er wird vorwiegend durch Calcitriol (1,25(OH)2D3), der biologisch aktiven Form des Vitamins D, kontrolliert. Bei Mangel an Vitamin D ist der Darm nicht in der Lage, Calcium aktiv aus dem Lumen aufzunehmen und in das Blut zu transportieren. Bei Vitamin-D-Mangel entwickelt sich beim wachsenden Tier daher rasch eine Rachitis und beim erwachsenen Tier eine Osteomalazie. Der Mechanismus des aktiven Vitamin-D-abhängigen Calciumtransports lässt sich funktionell in drei Teilschritte unterteilen:
1. die Calciumaufnahme durch die Bürstensaummembran der Enterocyten 2. den Transport des Calciums von der Bürstensaummembran durch das Cytosol zur basolateralen Seite der Mucosazellen und
3. die Abgabe des Calciums in die interstitielle serosaseitige Flüssigkeit durch die basolaterale Membran der Enterocyten.
Nach gegenwärtiger Vorstellung sind alle drei Teilschritte durch Vitamin D beeinflussbar (WASSERMAN und FULLMER 1995, BRONNER 1992). Dabei kann es sich sowohl um genomische als auch um nicht-genomische Wirkungen handeln.
Genomische Effekte implizieren die Aktivierung und Expression eines oder mehrerer Gene; die zwischen Reizauslösung und Reizbeantwortung liegende Zeit beträgt mehrere Stunden bis Tage. Nicht-genomische Effekte können in der Aktivierung oder Inaktivierung von Ionenkanälen, Ionenpumpen oder anderer Funktionsproteine bestehen. Die dafür benötigte Zeit beträgt meist nur wenige Minuten. Die intestinale Calciumabsorption ist ferner der Hauptregulator der systemischen, auf den Gesamtorganismus ausgerichteten Calciumhomöostase (HARMEYER und KAUNE 1988). Dieser Prozess wird bedarfsabhängig, z.B. während des Wachstums, bei Lactation oder in Abhängigkeit vom Calciumgehalt des Futters, geregelt.
2.1.2.1 Der Calciumtransport durch die Bürstensaummembran (Abb. 2.1)
Die aus einer Doppellipidschicht bestehende Bürstensaummembran ist für Calciumionen primär undurchlässig. Seit langem wurde vermutet, dass die Calciumaufnahme aus dem Darmlumen in den Enterocyten durch ein oder mehrere spezifische Proteine vermittelt wird. Hierbei könnte es sich um einen Calciumkanal (eine Pore) oder um einen Cotransporter handeln. Der Calciumeintritt von luminal in den Enterocyten wird durch einen hohen elektrochemischen Gradienten angetrieben. Die freie (ionisierte) Calciumkonzentration des Chymus kann pH-abhängig zwischen 0,2 und 3,0 mmol/l betragen. Die intracelluläre freie Calciumkonzentration liegt demgegenüber bei 0,1 µmol/l. Daraus ergibt sich ein Konzentrationsverhältnis zwischen Darmlumen und Cytoplasma von teilweise mehr als 10.000 zu 1. Die elektrische Triebkraft (intracellulär
negativ) ist für Calcium ebenfalls in das Zellinnere gerichtet. Isolierte Bürstensaumvesikel vom Duodenum von Vitamin-D-defizienten Schweinen zeigen eine konzentrationsabhängige, sättigbare Aufnahme von Calcium (KAUNE et al.1992), die durch Behandlung der Schweine mit Vitamin D erhöht wurde.
ECaC
CAT1 Ca2+
VDR
Calcitriol CS
Cal Lys
?
+ _
Abb. 2.1: Apicale Aufnahme von Calcium in Enterocyten, ECaC = Calcitriol- sensitiver epithelialer Calciumkanal, CAT1 = Calcitriol insensitiver Calciumtransporter, Cal = Calmodulin, VDR = Vitamin-D-Rezeptor, CS = Cytoskelett, Lys = Lysosomen
KOWARSKI und SCHACHTER (1980) haben aus Bürstensaummembranen von Ratten ein Calcium-Bindungs-Protein mit einem Molekulargewicht von 20.000 D mit hoher Calciumbindungsaktivität (Dissoziationskonstante 0,32 µM) isoliert. Seine Bindungsaktivität für Calcium lag deutlich höher als die des Calcium-Bindungs-Proteins im Cytosol (2,25 µmol). Sie vermuten, dass dieses Protein an der Vitamin-D-vermittelten Calciumaufnahme durch die Bürstensaummembran beteiligt ist. In weiteren Untersuchungen konnten KOWARSKI et al. (1987) dieses Protein in stark abnehmender Konzentration im gesamten Dünn- und Dickdarm von Ratten, wie auch in mehreren anderen Organen, nachweisen. Der Gehalt im Darm war Vitamin-D-abhängig und stieg bei Verfütterung einer calciumarmen Ration im Futter an. Auch SHIMURA und WASSERMAN (1984) haben in isolierten Bürstensaummembranen von Küken spezifische Vitamin-D-abhängige Calcium-Bindungs-Proteine mit hoher spezifischer Affinität für Calcium nachgewiesen. Neuere Untersuchungen von LARSSON et al.
(1998) berichten über die Anwesenheit eines spannungsabhängigen, Nifedipin hemmbaren L-Calciumkanals in Enterocyten des Atlantischen Thunfischs (Gadus morhua). Die Aktivierung dieses Kanals führte zu einem transienten Anstieg der freien Calciumkonzentration in Enterocyten. Die Autoren vermuten, dass dieser Calciumkanal an der bürstensaumseitigen intestinalen Calciumaufnahme beteiligt ist.
PENG et al. (1999) identifizierten mit molekularbiologischen Methoden aus Duodenalmucosa von Ratten (ausgehend von größenfraktionierter Poly A+-RNA und einer daraus erstellten cDNA-Bibliothek durch Screening in Krallenfrosch(Xenopus laevis)-Oocyten als Expressionssystem) ein Calcium-Transportprotein (CAT1). Mittels
„Northern Blotts“ stellten sich fest, dass das Protein bei Ratten auch in der apicalen Membran des proximalen Jejunums, Caecums und Colons, nicht jedoch in der Niere, exprimiert wird. Seine Lokalisation auch im Caecum und Colon bestätigt Ergebnisse anderer Autoren, die auch in diesen Darmabschnitten einen Nettotransport von Calcium nachgewiesen haben (KARBACH et al. 1991). Die Expression des Proteins im Darm wird nicht durch Calcitriol oder Calciummangel stimuliert. Nach ihren Untersuchungen in Xenopus laevis Oocyten vermittelt das Protein einen sättigbaren elektrogenen Calciumtransport mit einem Ladungs/Ca2+-Verhältnis von etwa 2:1. Dies lässt vermuten,
dass der Calciumtransport nicht mit anderen Ionen gekoppelt ist. Der elektrogene Calciumtransport durch diesen Kanal ist zwar potentialabhängig, aber nicht wie bei erregbaren Zellen potentialgesteuert. Er wird darüber hinaus durch basische pH-Werte stimuliert, ist für Sr2+ und Br2+ durchlässig, nicht durchlässig für Mg2+ und wird durch Mn2+ nicht gehemmt. Die Autoren messen diesem Protein, das im Sinne einer erleichterten Diffusion den Eintritt von Calcium in die Enterocyten vermitteln könnte, beim intestinalen Calciumtransport eine große Bedeutung bei. Die Auffassung begründen sie auch mit Untersuchungen über die Primärstruktur des Proteins, die ergeben haben, dass es potentielle regulatorisch operierende Phosphorylierungsstellen aufweist für Proteinkinase A, Proteinkinase C und dass es N-gekoppelte Glycosylierungsstellen besitzt. Diese potentiellen regulatorischen Bingungsstellen könnten die Aktivität des Proteins, z.B. rückgekoppelt über Änderungen der intracellulären freien Calciumkonzentration, steuern. So wurde die Aktivität von CAT1 in Xenopus laevis Oocyten durch Entleerung intracellulärer Calciumspeicher und dem dadurch ausgelösten Anstieg der freien intracellulären Calciumkonzentration gehemmt. Eine solcher Effekt würde bedeuten, dass in Enterocyten Calcitriol die Calciumaufnahme nicht direkt, sondern nur indirekt, z.B. durch Stimulation des basolateralen Auswärtstransports von Calcium, reguliert. Laufende Untersuchungen werden vermutlich in Kürze weiteren Aufschluss über diese Frage geben.
Das CAT1-Protein weist ferner 75 % Sequenzhomologie zu einem anderen epithelialen Calciumkanal-Protein (ECaC) auf, das mit der gleichen Strategie wie CAT1 kloniert wurde. ECaC wurde zuerst in Tubulusepithelzellen des Verbindungsstückes und des corticalen Sammelrohrs von Kaninchen identifiziert (HOENDEROP et al. 1999, HOENDEROP et al. 2000) (Näheres dazu Kap.3.2.1). Das Protein kommt aber auch in der apicalen Membran von Duodenalenterocyten vor (HOENDEROP et al. 2000). Es wird im Gegensatz zu CAT1 durch Calcitriol stimuliert, ist für Ba2+ undurchlässig und wird durch Mn2+ kompetitiv und konzentrationsabhängig gehemmt. Untersuchungen zur Sekundärstruktur des Proteins lassen vermuten, dass es als Homo-Tetramer eine Membranpore für den Transport von Calcium bildet. Die celluläre Expression dieses Proteins ist calcitriolabhängig. Seine Primärstruktur weist ähnlich wie bei CAT1
potentielle regulatorisch wirkende Phophorylierungsstellen für Proteinkinase C sowie für cAMP- und cGMP-abhängige Proteinkinasen auf. Daher vermuten HOENDEROP und Mitarb., dass die intestinale Absorptionsrate von Calcium auf der Stufe der luminalen Calciumaufnahme reguliert wird und dass ECaC dabei eine herausragende Funktion zu kommt. Beide Kanalproteine (CAT1 und ECaC) könnten aufgrund ihrer Primärstruktur („ankyrin repeats“) auch Anschluss an das Cytoskelett gewinnen (PENG et al. 1999, HOENDEROP et al. 2000).
Bei der Suche nach den molekularen Effekten von Calcitriol auf den Darm haben NEMERE und SZEGO (1981) isolierte Enterocyten vom Dünndarm normaler Ratten u.a.
mit Calcitriol inkubiert und anschließend die Freisetzung verschiedener lysosomaler Enzyme und die Aufnahme von Radiocalcium in die isolierten Enterocyten gemessen.
Sie stellten in diesen Versuchen fest, dass sich durch Zugabe von Calcitriol in etwa physiologischer Konzentration (65 pM) die Calciumaufnahme in die Zellen innerhalb von 25 Minuten um etwa 10 % signifikant erhöhte.
GLENNEY und WEBER (1980) isolierten von Mikrofilamentankern des F-Aktins aus intestinalen Mäuseepithelzellen ein 110.000 D Calmodulin-Bindungs-Protein, das Calmodulin in An- und Abwesenheit von Calcium mit gleicher Affinität bindet. Durch Zugabe von Trifluoperazin, einem Phenothiazinderivat, kann Calmodulin reversibel vom Protein abgespalten werden. COUDRIER et al. (1981) zeigten in weiterführenden Untersuchungen, dass dieses Bindungsprotein auch in Dünndarmenterocyten von Schweinen mit Mikrofilamentankern der basalen und lateralen Membran assoziiert ist.
Über die mögliche Funktion dieses Proteins konnten die Autoren jedoch nichts sagen.
Isolierte Bürstensaummembranen von Küken weisen einen hohen Gehalt an Calmodulin, auf. Durch Verabreichung von 1,25(OH)2D3 (Calcitriol) stieg die Calmodulinbindung an diesem Protein an (BIKLE et al. 1984a). Ferner stimulierte 1,25(OH)2D3 beim Küken die Bindung von Calmodulin an Myosin I, einer 110 kD ATPase, durch die F-Aktin Filamente an der Mikrovillusmembran verankert werden (MOOSEKER et al. 1991, WOLENSKI et al. 1993). Es wurde ferner beobachtet, dass
1,25(OH)2D3 den Calmodulingehalt in duodenalen Bürstensaummembranen erhöht (KAUNE et al. 1994). Diese Untersuchungen lassen vermuten, dass bürstensaumseitig doch ein calcitriolabhängiger Transport von Calcium existiert und dass dieser durch die luminale Membran in der Weise durch Calcitriol beeinflusst wird, dass sich die Funktion oder Konzentration eines oder mehrerer dort lokalisierter Proteine verändern. Nach den vorliegenden Daten handelt es sich hierbei nicht um einen Kurz- sondern um einen Langzeiteffekt von Calcitriol.
Andere Autoren haben vermutet, dass durch Vitamin D die Fluidität der bürstensaumseitigen Membran des Darmes und dadurch seine Fähigkeit zur Calciumaufnahme beeinflusst wird (RASMUSSEN et al. 1982). Wieder andere konnten in späteren Untersuchungen mit Liposomen an Bürstensaummembranvesikeln von Ratten nachweisen, dass eine Zunahme des Phospholipid- oder Cholesteringehaltes der Membran die Calciumaufnahme in die Vesikel verminderte (SCHEDL et al. 1989). Durch Behandlung mit Vitamin D änderte sich die Membranfluidität jedoch nicht (SCHEDL et al. 1994). Auch BIKLE et al. (1984b) konnten keine Beziehung zwischen Vitamin D, Membranfluidität und Calciumaufnahme durch die Bürstensaummembran nachweisen.
Die bisherigen Beobachtungen sprechen daher nicht dafür, dass die stimulierenden Effekte von Vitamin D auf die luminale Aufnahme von Calcium durch eine Beeinflussung der Membranfluidität zustande kommen.
Zusammenfassung
Zu den wichtigsten Merkmalen, die beim Eintritt von Calcium aus dem Darmlumen in die Darmschleimhaut eine Rolle spielen, gehören, dass die Diffusion von Calcium aus dem Lumen in die Enterocyten energetisch begünstigt ist, dass die Aufnahmen durch spezifische direkt und indirekt durch Calcitriol gesteuerte Calciumkanäle (CAT1, ECaC) erfolgt und dass das Mikrofilamentsystem sowie Calmodulin in noch nicht genau bekannter Weise an diesem Prozess beteiligt sind. Ob aus Lysosomen stammende Enzyme dabei zusätzlich eine Rolle spielen, ist bisher nicht klar. Änderungen der apicalen und basolateralen Membranfluidität werden durch Calcitriol nicht hervorgerufen.
2.1.2.2 Transcellulärer Ca-Transport (Abb. 2.2)
Ionenmikroskopische Untersuchungen an Darmschleimhäuten von Vitamin-D- defizienten Küken haben gezeigt, dass sich das durch die Bürstensaummembran in die Zelle eingetretene Calcium in Membrannähe anreichert (CHANDRA et al. 1990).
Durch Behandlung der Tiere mit Vitamin D gewinnt die Darmschleimhaut die Fähigkeit, dieses membrannahe Calcium in das Cytosol weiter zu befördern und am anderen Zellpol abzugeben. WASSERMAN und FULLMER (1995) vermuten, dass der
?
Ves
VDR CS
Ca2+
Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+
CaBP9K
Calcitriol
Colchicin, Cytochalasin B
+ _
Abb. 2.2: Transcellulärer Transport von Calcium, CaBP9K = Cytosolisches calcitriolabhängiges Calcium-Bindungs-Protein, MG 9K, Ves = calciumhaltige Vesikel, CS = Cytoskelett (Hemmung durch Colchicin und Cytochalasin B), VDR
= Vitamin-D-Rezeptor
Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+
Abtransport von Calcium aus der Nähe der Bürstensaummembran durch Vitamin D vermittelt wird und dass es in Verbindung mit dem Abtransport des Calciums aus der luminalen Zellregion zu einer Öffnung der Calciumkanäle auf der Bürstensaumseite kommt.
Beim Transport von Calcium von der luminalen auf die basolaterale Seite der Zelle steht diese vor der schwierigen Aufgabe, dieses zu bewerkstelligen, ohne dass die als Regulator fungierende intracelluläre freie Calciumkonzentration dabei in nennenswertem Umfang ansteigt. Dies impliziert, dass das besonders beim wachsenden Organismus in relativ großen Mengen absorbierte Calcium das Cytosol nur in gebundener und nicht-ionisierter Form migrieren darf (BOURDEAU und LAU 1992).
Zwei Mechanismen, mit denen die Zelle dieses Problem lösen könnte, wurden in diesem Zusammenhang diskutiert:
- eine Calbindin-vermittelte Diffusion und
- ein transcellulärer Transport in Membranvesikeln.
Im Zusammenhang mit der Frage nach den cellulären Mechanismen des Vitamin-D- abhängigen Calciumtransports berichten WASSERMAN und TAYLER erstmals 1966 über ein durch Vitamin-D-induziertes, spezifisches, 28 kD Calcium-Bindungs-Protein (CaBP28k, Calbindin) in der Dünndarmmucosa von Küken. In den folgenden Jahren wurde in Darmschleimhäuten von Ratten (KALLFELZ et al. 1967), Schweinen (FORSYTH et al. 1972) und vielen weiteren Tierarten ebenfalls ein Vitamin-D- abhängiges Calcium-Bindungs-Protein nachgewiesen mit einem Molekulargewicht von 9 kD (Übersicht dazu s. NORMAN 1979). Dieses Calcium-Bindungs-Protein ist bei Vitamin-D-defizienten Tieren nicht nachweisbar THOMASSET et al. 1981). Erst nach Verabreichung von Vitamin D oder nach Verabreichung eines seiner biologisch aktiven Metaboliten wird es im Darm gebildet. Das aviäre Calbindin28k bindet vier Mol Calcium pro Mol (BREDDERMAN und WASSERMAN 1974) und das Calbindin9k der Säuger zwei Mol Calcium pro Mol CaBP (FULLMER et al. 1985). Erste Untersuchungen deuteten darauf hin, dass eine große Parallelität besteht zwischen der Konzentration von
Calbindin in der Darmmucosa und der Calciumtransportrate des Darms. WASSERMAN (1969) misst diesem Protein für den Vitamin-D-vermittelten Calciumtransport im Darm eine große Bedeutung bei. Andere Untersuchungen ergaben aber auch, dass der Calbindingehalt in der Dünndarmmucosa von Ratten nicht nur durch Verabreichung von Vitamin D ansteigt, sondern auch durch eine Reduktion des Calciumgehaltes des Futters. In diesen Versuchen kam es in 24 h zu einem Anstieg der Calbindinkonzentration um etwa 50 % (FREUND und BRONNER 1975). Es besteht durchaus die Möglichkeit, dass der durch Calciummangel ausgelöste Anstieg an Calbindin auch durch Calcitriol vermittelt wurde. So könnte der Calciummangel zu einer vermehrten Ausschüttung von PTH geführt haben, die ihrerseits eine verstärkte renale Synthese von Calcitriol in Gang gesetzt hat.
Unter dem Einfluss von Vitamin D nimmt in Enterocyten von Säugetieren der Gehalt des 9 kD und bei Vögeln der Gehalt des 28 kD Calbindins (Calcium-Bindung-Protein) stark zu. Calbindin wird bei der Passage von Calcium durch die Darmzelle eine wichtige Funktion zugeschrieben. Durch physikochemische Berechnungen (KRETZINGER et al.
1982) konnte gezeigt werden, dass das gesamte absorbierte Calcium theoretisch, an Calbindin gebunden entlang eines Konzentrationsgradienten von der luminalen zur basolateralen Seite migrieren kann.
In anschließenden Untersuchungen zur molekularer Charakterisierung des Calbindins wurde gezeigt, dass die Calciumbindung an das 9 kD Calbindin des Schweines in einer Wechselwirkung mit einem Tyrosinrest besteht und dass das Molekül kein Cystein und Tryptophan enthält (DORRINGTON et al. 1974). Es besteht die Möglichkeit, dass es aufgrund der besonderen Aminosäuren-Zusammensetzung zu einer Faltung des Proteins kommt, die erst die hohe Bindungsaffinität zu Calcium ermöglicht. PANSU et al.
(1989) berichten, dass der aktive Calciumtransport in isolierten Darmsäckchen von Ratten durch Zugabe von Theophyllin, einem Phosphordiesterasehemmer, gehemmt wird. Da durch dieses Agens die mucosale Calciumaufnahme und die basolaterale Calciumabgabe nicht beeinflusst wurden, vermuten die Autoren, dass der Effekt von Theophyllin auf den Calciumtransport darin besteht, dass Theophyllin die
Calciumbindung an Calbindin hemmt und auf diese Weise die transcelluläre Transportrate von Calcium vermindert.
Mit molekularbiologischen Methoden wurde der funktionelle Zusammenhang zwischen einer Verabreichung von Vitamin D und der Bildung von Calbindin eindeutig bewiesen. So kommt es bei Vitamin-D-defizienten Ratten (DUPRET et al. 1987) und Küken (THEOFAN et al. 1986) bereits 15 min nach Verabreichung von 650 pmol 1,25(OH)2D3/100 g Körpergewicht zu einer Verdoppelung der Transskriptionsrate des Calbindin-Gens. Etwa eine Stunde später ist das Maximum erreicht. Anschließend folgt eine transiente Zunahme der CaBP-mRNA-Konzentration sowie eine zeitlich fast parallele 24-stündige Zunahme der Calbindinkonzentration. Es wird vermutet, dass das Calbindin-Gen durch den im Cytosol und in der Kernfraktion nachweisbaren Vitamin-D- Rezeptor (VDR) in Anwesenheit von Calcitriol angeschaltet wird (WALTERS et al. 1980).
Die Calbindinkonzentration der Darmmucosa nimmt im Verlauf des Dünndarms von oral nach aboral immer mehr ab (THOMASSET et al. 1981). Parallel dazu vermindert sich auch die aktive Komponente des intestinalen Calciumtransport vom Duodenum bis zum Ileum. Bei Ratten (PANSU et al. 1983) und Schweinen (eigene Untersuchungen) ist im Ileum in vitro kein aktiver Calciumtransport mehr nachweisbar.
WASSERMAN et al. (1992) vermuten, dass das Calcium, an Calbindin gebunden, transcellulär transportiert wird und dass von der luminalen zur basolateralen Membran des Enterocyten ein zunehmender Affinitätsgradient für Calcium besteht. Die höchste Affinität für Calcium besitzt nach dieser These die basolaterale ATP-abhängige Calciumpumpe mit einer km von 0,17 µmol/l. Folge dieses von mucosal nach serosal durch die Zelle laufenden ansteigenden Affinitätsgradienten für Calcium ist ein gleich gerichtetes Konzentrationsgefälle an ionisiertem Calcium, das als Triebkraft für den transcellulären Transport angesehen wird. Nach BRONNER et al. (1986) soll die Calbindinkonzentration der Darmmucosa den Geschwindigkeits-begrenzenden Schritt für den transmuralen Calciumtransport darstellen. WASSERMAN et al. (1992) sehen diese Überlegungen BRONNERS jedoch noch nicht als überzeugend an.
Bereits kurze Zeit nach der Entdeckung des Calbindins gab es auch Berichte, die zeigten, dass keine so enge Parallelität besteht zwischen der Calciumtransportrate einerseits und dem Calbindingehalt der Mucosa andererseits (HARMEYER und DELUCA 1969), wie sie von WASSERMAN und Mitarbeiter postuliert und teilweise demonstriert wurde. HARMEYER und DELUCA (1969) stellten fest, dass bei Vitamin-D- defizienten Küken nach Vitamin-D-Verabreichung eine verstärkte Calciumabsorption aus dem Dünndarm bereits nach 10 h einsetzte. Eine Zunahme an Calbindin war in den untersuchten Darmsegmenten dagegen erst nach 19-20 h nachweisbar. Die Calciumtransportrate lief der Calbindinkonzentration also zeitlich voraus. Auch der zeitliche Verlauf beider Merkmale während der folgenden 5 Tage nach der Vitamin-D- Gabe war nicht deckungsgleich. Auch THOMASSET et al. (1979) konnten bei Vitamin- D-defizienten Ratten nach Verabreichung von Vitamin D keine Kongruenz zwischen den Änderungen im CaBP-Gehalt der Darmmucosa einerseits und der Calciumtransportrate andererseits feststellen. Sie wiesen in ihrer Arbeit auf zahlreiche ähnliche Befunde anderer Autoren hin und kommen zu dem Schluss, dass die Höhe des Calciumtransports durch die Darmmucosa nicht direkt von der Calbindinkonzentration der Mucosa abhängt. Schließlich stellten SCHRÖDER et al. (1998) an isolierten Duodenalschleimhäuten von neugeborenen Ferkeln mit erblichem Calcitriolmangel fest, dass bei diesen Tieren der aktive Calciumtransport von mucosal nach serosal genau so groß war wie bei Calcitriol-gesunden Kontrollferkeln. Die Calbindinkonzentration der Darmmucosa betrug bei den Ferkeln mit Calcitriolmangel im Vergleich zu gleich alten gesunden Kontrolltieren jedoch nur 43 %. Diese Beobachtung spricht ebenfalls dafür, dass zwischen dem Calbindingehalt der Darmschleimhaut und der Calciumabsorption keine enge Korrelation besteht.
Welche Funktion dem Vitamin-D-abhängigen Calcium-Bindungs-Protein des Darms für den aktiven Calciumtransport und insbesondere für die Passage des Calciums durch die Zelle von mucosal nach serosal zukommt, muss somit weiter als unbeantwortete Frage angesehen werden.
NORMAN und LEATHERS (1982) konnten mit Hilfe eines photosensitiven, antikörperbasierten UV-Assays zeigen, dass beim Rind auch die intestinale alkalische Phosphatase calciumabhängig mit Calmodulin interagiert. Die physiologische Bedeutung diese Phänomens ist nicht bekannt. Ferner gibt es Hinweise, dass Calcium auf der Bürstensaumseite des Enterocyten durch Endocytose in Membranvesikel aufgenommen wird, die dann intracellulär mit Lysosomen verschmelzen und basolateral durch exocytotische Prozesse abgegeben wurden (NEMERE und NORMAN 1990, NEMERE et al. 1986).
Zu der Frage eines möglichen Transports von Calcium durch die Darmzelle, das in Vesikeln verpackt durch den Zellraum bewegt wird, liegen bisher nur wenige Untersuchungen vor. Solche Vesikel könnten basolateral mit der Membran verschmelzen und das Calcium an die extracelluläre Flüssigkeit abgeben. NASSAR et al. (1988) haben die Kinetik der Aufnahme von Radiocalcium in isolierte Duodenalschleimhautstreifen bei frisch getöteten Ratten über etwa 60 Sekunden gemessen. Sie stellten fest, dass die aufgenommene Calciummenge und die Aufnahmerate nach 30 minütiger Vorinkubation der Schleimhäute mit Colchicin oder Cytochalasin-B signifikant gehemmt wurde. Der Mitosehemmer Colchicin unterbricht das Mikrotubulusystem der Zelle und hemmt den an Mikrotubuli gebundenen Transfer von Molekülen durch die Zelle. Cytochalasin-B zerstört die Mikrofilamentorganisation in der Zelle und damit auch einen möglichen an dieses Cytoskelett gebundenen Transport.
Außer diesen bisher beschriebenen, am aktiven Transport von Calcium beteiligten, Mechanismen wurde in akuten in vivo Versuchen mit vasculär perfundierten Duodenalsegmenten von Vitamin-D-defizienten Küken ein sogenannter
„Kurzzeiteffekt“ von Calcitriol auf die Calciumabsorption beschrieben (NEMERE et al.
1984). Zugabe von Calcitriol zum vasculären Perfusat in einer Konzentration von 130 bis 650 µmol/l stimulierte nach 10 bis 15 min die Calciumabsorption konzentrationsabhängig bis über 100 %. Dieser Effekt war ebenfalls durch Colchicin hemmbar. Der basale und Calcitriol induzierte Calciumtransport wurde durch Colchicin nicht beeinflusst. Außerdem war der Effekt von Calcitriol bei Vitamin-D-depletierten Küken nicht nachweisbar. Der
Mechanismus dieses als „Transcaltachia“ bezeichneten Effektes ist bisher noch nicht geklärt (s.u.).
Zusammenfassung
Die vorausgegangenen Ausführungen zeigen, dass der transcelluläre Transport von Calcium durch die Darmmucosa besonders während der Wachstumsphase durch einen großen Calciumstrom bei gleichzeitig niedriger freier Calciumkonzentration gekennzeichnet ist. Das calcitriolabhängige, im Cytosol vorliegende Calbindin fungiert bei diesem Prozess vermutlich als Calcium-Carrier. Die genaue Funktion dieses Proteins ist jedoch noch ungeklärt, da die Calcium-Transportrate der Zellen in vielen Fällen nicht eng mit der Calbindinkonzentration korreliert. Ferner gibt es Hinweise darauf, dass Calcium in Vesikeln transcellulär durch Enterocyten transportiert wird.
2.1.2.3 Die Ausschleusung von Calcium durch die basolaterale Membran in den interstitiellen Raum (Abb. 2.3)
Während die physikochemischen Bedingungen an der Bürstensaumseite des Enterocyten ausreichen, um passiv die Aufnahme von Calcium in die Zelle und seine Passage durch die Zelle zu ermöglichen, ist die Abgabe von Calcium an der basolateralen Seite ohne Energieverbrauch nicht möglich. Ein elektrisches Potential von etwa 70 mV (außen positiv) und ein chemisches Potential von etwa 104 stehen einer spontanen Calciumabgabe nach außen entgegen. Vermutlich drei verschiedene Mechanismen kommen für die Abgabe von Calcium auf der basolateralen Seite in Betracht (WASSERMAN et al. 1992)
- eine ATP-abhängige Calciumpumpe - ein 3Na+/Ca2+ Austauscher
- calciumhaltige Vesikel
Das Vorkommen und die Funktion einer ATP-abhängigen Calciumpumpe und eines Natrium/Calcium Austauschers sind durch zahlreiche Untersuchungen gut belegt (s.u.).
Die Funktionen und physiologische Bedeutung von calciumhaltigen Vesikeln, die via Exocytose basolateral Calcium in den interstitiellen Raum abgeben könnten, sind dagegen noch weitgehend spekulativ.
Ca2+ Ca2+
Ca2+
AS
Ca- ATPase
Ca2+ Ca2+
ATP
ADP
? Ca2+
3 Na+
?
Ves VDR
Calcitriol
CaBP9K
+ _
Abb. 2.3: Basolateraler Transport von Calcium, AS = elektrogener 3 Na+/Ca2+
Austauscher, VDR = Vitamin-D-Rezeptor, CaBP9K = calcitriolinduzierter Calcium-Bindungs-Protein, MG 9K, Ves = calciumhaltige Vesikel, Trans = Transcaltachia, BLM-VDR = Calcitriol sensitiver basolateraler Vitamin-D- Rezeptor
BLM- VDR Trans
Ca2+
?
Ca2+ Ca2+
GHIJSEN et al. (1983) konnten an isolierten innen/auswärts gerichteten basolateralen Membranvesikeln aus Duodenalenterocyten von Ratten zeigen, dass diese Vesikel bei Anwesenheit von ATP Calcium aus dem Inkubationsmedium in die Vesikel transportieren. Der anschließend mit anderen Methoden gemessene Transport war außer von ATP von calcitriolabhängig und nahm im Darm vom Duodenum über Jejunum bis zum Ileum ab. Die Autoren identifizierten unten den gleichen Versuchsbedingungen auch einem 3Na+/Ca2+-Austauscher in basolateralen Membranvesikeln, der nicht von Calcitriol abhängig war und in allen Dünndarmabschnitten in gleicher Konzentration nachweisbar war. Die Autoren vermuten, dass dieser Austauscher unter Ausnutzung des an der basolateralen Membran bestehenden, einwärts gerichteten Natriumgradienten Calcium aus der Zelle nach außen transportiert. Untersuchungen von FAVUS et al. (1983) mit isolierten Dünndarmschleimhäuten von Ratten erbrachten den Befund, dass die Ca-ATPase-Aktivität und der Calciumtransport von mucosal nach serosal durch Calmodulin, ein ubiquitäres intracelluläres Calcium-Bindungs-Protein, stimuliert und durch Trifluoperazin, einen Calcium-Calmodulin-Antagonisten, gehemmt wird. Zugabe von Ouabain oder Ethacrinsäure, beide Hemmer der Na/K-ATPase, beeinflussten die Ca-ATPase Aktivität nicht.
Eine Zeitlang wurde die Frage, ob die Aktivität der basolateralen Ca-ATPase Calcitriol abhängig ist, kontrovers diskutiert. EMILE et al. (1987) stellten fest, dass die messbare Pumpaktivität in den basolateralen Membranen der Dünndarmschleimhaut bei Vitamin- D-defizienten und Vitamin-D-repletierten Ratten nicht vom Vitamin-D-Status der Tiere, sondern von der Präparationsmethode der vesikelabhängig sei. Diese Befunde wurden jedoch von verschiedenen anderen Autoren nicht bestätigt (WASSERMAN et al. 1992).
Ferner konnten ARMBRECHT et al. (1994) und ZELINSKI et al. (1991) zeigen, dass in der Dünndarmmucosa von Ratten die Konzentration der mRNA, die für die basolaterale Ca-ATPase codiert, unter dem Einfluss von 1,25(OH)2D3 deutlich zunahm. Die Konzentration der die Ca-ATPase codierende mRNA nahm außerdem mit steigendem Alter, sowie vom Dünndarm in Richtung Ileum, deutlich ab. Die Konzentrationsänderungen der mRNA wiesen eine hohe Korrelation mit dem aktiven Calciumtransport in isolierte basolaterale Membranvesikel und, wie aus anderen
Untersuchungen bekannt, mit dem transcellulären Calciumtransport auf.
Es kann daher heute als gesichert angesehen werden, dass für einen aktiven transmuralen Calciumtransport durch die Darmschleimhaut die Ca-ATPase notwendig ist. Bei einem möglichen Vitamin-D-unabhängigen transcellulären Transport von Calcium aus dem Darm in das Blut könnte der Calciumausstrom aus der Zelle dagegen zu einem Teil durch den 3Na+/Ca2+-Austauscher vermittelt werden. Im Einklang mit dieser Vorstellung stehen auch die Ergebnisse von TIMMERMANS et al. (1991), die bei neugeborenen Ferkeln mit erblichem Calcitriolmangel und bei gesunden Kontrollferkeln die Konzentration der basolateralen Ca-ATPase gemessen haben. Die Konzentration dieser Pumpe entsprach der aktiven Calciumtransportrate der Tiere. Isolierte Duodenalschleimhäute dieser beiden Tiergruppen wiesen einen gleich großen aktiven Calciumtransport auf, der im Falle der Tiere mit erblichem Calcitriolmangel jedoch Vitamin-D-unabhängig war. Die Konzentration der basolateralen Ca-ATPase war bei beiden Tiergruppen gleich groß.
Zusammenfassung
Zusammenfassend ist festzustellen: die Ausschleusung von Calcium aus den Enterocyten ist ein Energie verbrauchender Prozess. Sie wird hauptsächlich von einer calcitriolabhängigen Calciumpumpe bewerkstelligt. Daneben gibt es in der basolateralen Membran noch einen Vitamin-D-unabhängigen 3Na/Ca-Austauscher, der vielleicht als Antiporter Calcium nach außen transportieren kann. Ob auch vesiculär transportiertes Calcium durch Exocytose die Zelle verlässt, ist bisher nicht geklärt.
Insgesamt ist über die Bedeutung von Vitamin D für den Calciumtransport durch die Darmschleimhaut folgendes festzuhalten: bei fast allen abgesetzten Säugetieren entwickelt sich nur in Anwesenheit von Vitamin D ein aktives Calciumtransportsystems in der Darmschleimhaut. Unter dem Einfluss dieses Vitamins kommt es an der luminalen Seite der Zelle zu einem erleichterten Eintritt von Calcium in Form einer erhöhten Calciumpermeabilität. Im Cytosol nimmt die Calbindinkonzentration stark zu und die Pumpleistung der basolateralen Calcium-
ATPase steigt ebenfalls an. Bei diesen calcitriolabhängigen Veränderungen handelt es sich teilweise um genomische, teilweise aber vermutlich um nicht-genomische Effekte.
Über das funktionelle Zusammenwirken der einzelnen durch Vitamin D induzierten Effekte zu einem integrierten transmuralen Transportsystem, besonders auch im Hinblick auf die Transcaltachia, besteht noch keine vollständige Klarheit.
2.1.3 Transcaltachia
Als Transcaltachia bezeichnet man eine nach wenigen Minuten einsetzende Zunahme der intestinalen Calciumabsorption bei Vitamin-D-repletierten Tieren nach Zugabe von Calcitriol.
In einem Versuchsansatz mit normalen Küken beobachteten NEMERE und Mitarbeiter (1984) einen zeitlich relativ schnell eintretenden Effekt von Calcitriol auf den Darm. In diesen Versuchen wurde das isolierte Duodenum gesunder Küken entweder isoliert oder in vivo vasculär perfundiert. Die Zugabe von Calcitriol zum Perfusat (130 bis 650 pM) stimulierte bereits nach 6 Minuten konzentrationsabhängig signifikant die Calciumabsorption, die sich bei Zugabe höherer Calcitriolkonzentrationen mehr als verdoppelte. Bereits 30 Minuten nach Zugabe des Hormons war der Effekt maximal.
Zugabe von Colchicin, einer mit den Mikrotubuli der Zellen interagierenden Substanz, unterdrückte den Effekt. Auffällig war auch, dass er nur bei normalen, nicht aber auch bei Vitamin-D-defizienten Küken auslösbar war.
Weitere Versuche dieser Art unter ähnlichen, aber besser definierten experimentellen Bedingungen schlossen sich an, in denen der Effekt genauer charakterisiert wurde (NEMERE und NORMAN 1986). Diese Versuche ergaben, dass der stimulierende Effekt von Calcitriol auf die Calciumabsorption bereits 2 Minuten nach Zugabe des Hormons nachweisbar war, und dass ein ähnlicher, gegenüber Calcitriol zeitlich etwas verzögerter Effekt auch durch Zugabe des synthetisch gewonnenen, bovinen PTH- Fragments (bPTH (1-34)) zum Perfusat auslösbar war. Anschließende weitere Untersuchungen zur Aufklärung dieses Phänomens wurden mit vasculär und teilweise
auch zusätzlich mit luminal perfundierten Duodenalsegmenten normaler Küken durchgeführt. Aus diesen Versuchen ergab sich , dass eine Zugabe von Calciumionophoren zum Perfusat, wie Ionomycin (DE BOLAND und NORMAN 1990) und K 8644 (DE BOLAND et al. 1990), den gleichen Effekt auslöste wie eine Zugabe von Calcitriol. Nifedipin (1 µM), ein Calciumkanalblocker, hemmte dagegen den Effekt (DE BOLAND et al. 1990).
Die ausschließliche Depolarisation der basolateralen Membran der Enterocyten, wie sie durch Erhöhung der Kaliumkonzentration im Perfusat von etwa 5 auf 70 mM erreicht werden kann, löste auch bereits den Effekt aus (DE BOLAND und NORMAN 1990), der, wie auch bei Zugabe der Calciumionophoren, mit einem Anstieg der intracellulären freien Calciumkonzentration [Ca2+]i (von 168 auf 363 nM) einherging. Aus der Beobachtung, dass dieser Anstieg der [Ca2+]i , wie auch die Transcaltachia, nach Zugabe von EGTA zum Perfusat ausblieb, schlossen die Autoren, dass der [Ca2+]i- Anstieg auf einem Ca-Einstrom von basolateral beruhte (DE BORLAND und NORMAN 1990, NEMERE und NORMAN 1990). Diese Beobachtungen führten zu der Vermutung, dass der transcaltachische Effekt durch einen Anstieg der [Ca2+]i vermittelt wurde.
Die Frage war jetzt, ob und auf welchem Signalweg es bei der Calcitriol induzierten Transcaltachia zu einem [Ca2+]i-Anstieg kam. Versuche zu diesem Problem mit dem gleichen Modell wie oben zeigten, dass auch bei Zugabe eines Phorbolesters (Tetradeconyl-Phorbol-Acetat), einem Aktivator der Proteinkinase C, und bei Zugabe des Adenylatcyclase-Aktivators Forskolin zum Perfusat Transcaltachia eintrat. Jede Erhöhung der [Ca2+]i , unabhängig davon, ob sie über die Proteinkinase C oder die Proteinkinase A (Forskolin) induziert wird, scheint daher einen transcaltachischen Effekt hervorzurufen. Ob diese Signalwege zur Aktivierung der [Ca2+]i auch der durch Calcitriol induzierten Transcaltachia zugrunde liegen, ist bisher jedoch noch offen.
In 1994 identifizierten NEMERE und Mitarbeiter einen mit basolateralen Membranen von Küken Enterocyten-assoziierten Vitamin-D-Rezeptor (BLM-VDR), der Calcitriol und 24,25(OH)2D3, vermutlich an verschiedenen Domänen, spezifisch bindet. Die
Befunde dieser Autoren geben Hinweise darauf, dass die Bindungseigenschaften und/oder die Konzentration dieses Rezeptors mit dem transcaltachischen Effekt korrelierten.
Welche Rolle der Transcaltachia bei der Vitamin D gesteuerten Kontrolle des Calciumhaushaltes zukommt, ist bisher noch nicht klar. Allgemein ist festzustellen, dass bisher in zahlreichen Versuchen zur Charakterisierung und Entschlüsselung des aktiven Vitamin-D-abhängigen intestinalen Calciumtransports mit isolierten Darmschleimhäuten von verschiedenen Tierarten gezeigt wurde, dass in all diesen Versuchen ein aktiver Calciumtransport durch die Darmschleimhaut von mucosal nach serosal stattfindet.
Dieser Calciumtransport setzt eine ausreichende Versorgung der Versuchstiere mit Vitamin D voraus und ist in soweit Vitamin D abhängig. Die unter diesen Bedingungen in vitro verwendeten Inkubationslösungen enthielten in der Regel kein Calcitriol. Für die Frage, welche Bedeutung der Transcaltachia für die intestinale Calciumabsorption insgesamt und damit für den Calciumhaushalt, zukommt, lässt sich vielleicht dadurch abschätzen, ob die Transcaltachia auch unter den in vitro Bedingungen isolierter Darmschleimhäute in der Ussingkammern auslösbar ist und wie groß der Effekt im Vergleich zum aktiven Ca-Transport insgesamt ist. Solche Versuche wurden von KAUNE (1992) mit isolierten Darmschleimhäuten von Absatzferkeln in Ussingkammern durchgeführt. Die serosal zugegebene Menge Calcitriol lag mit 370 pM etwa zwei- bis dreifach oberhalb der physiologischen Calcitriolkonzentration des Blutplasmas. Unter diesen Bedingungen erhöhte sich die Nettocalciumabsorption der Darmschleimhäute gegenüber Calcitriol freien Kontrollen spontan um gut 25 %. Dieser Befund spricht dafür, dass der transcaltachische Effekt auch in vivo eine Rolle spielt.
Die Arbeitsgruppe von NORMAN, die diesen Effekt als erste näher untersucht hat, betrachtet ihn wegen seiner spontanen Auslösbarkeit als einen typischen nicht- genomischen Effekt. Es sollte bei dieser Betrachtungsweise jedoch nicht außer acht gelassen werden, dass der Effekt nur bei Tieren mit normalem Vitamin-D-Status, nicht aber bei Vitamin-D-defizienten Tieren nachweisbar ist. Auch wenn man annimmt, dass der BLM-VDR nicht durch Calcitriol neu gebildet, sondern bereits vorhanden ist und
durch Calcitriol nur aktiviert wird, kann diese Aktivierung offenbar nicht spontan erfolgen, denn sonst müssten Vitamin-D-defiziente Tiere auch nach Zugabe von Calcitriol Transcaltachia zeigen. Für die Auslösung der Transcaltachia reicht die spontane Anwesenheit von Calcitriol allein also nicht aus. Das Hormon muss offenbar auch bereits vorher über längere Zeit vorhanden sein und in der Darmschleimhaut die für den Effekt notwendigen Voraussetzungen schaffen. Diese könnten darin bestehen, dass die BLM-VDR erst unter dem zeitlich vorangehenden Einfluss von Calcitriol gebildet oder aktiviert werden.
2.2 Einfluss des Futters auf die Calciumverdaulichkeit
2.2.1 Calcium
Die scheinbare Verdaulichkeit, also die Calciummenge, die vom Darm netto aus dem Futter entnommen wird, ist besonders vom Alter der Tiere und vom Calciumgehalt des Futters abhängig. Bei der Bewertung des Calciumgehaltes darf ferner der Phosphorgehalt der Ration nicht außer acht gelassen werden. Das aus vielen Fütterungsversuchen ermittelte optimale Ca/P Verhältnis ist tierartlich unterschiedlich.
Für Schweine sollte es nicht allzu weit von 1 : 1 abweichen.
Stärker als durch den Calciumgehalt des Futters ist die aktive intestinale Calciumabsorptionsrate besonders in der Wachstumsphase vom Alter der Tiere abhängig. Sie nimmt in den ersten Lebenstagen bzw. -wochen sehr stark ab. Bei drei Monate alten Ratten ist kein aktiver Calciumtransport mehr nachweisbar. Parallel dazu vermindert sich bei Ratten der Gehalt an CaBP9k in der Darmschleimhaut (ARMBRECHT et al. 1979). Auch beim Schwein geht die Ca-Absorptionsrate mit zunehmendem Alter stark zurück (LIBAL et al.1969).
Niedrige Gehalte an Calcium im Futter erhöhen die aktive Calciumabsorptionsrate.
Dieses wurde u.a. in Versuchen mit Ratten (ARMBRECHT et al. 1979, ROULLET et al.
1991), Schweinen (LIBAL et al. 1969) und Menschen (NORMAN et al. 1981) gezeigt.
Bei Ratten geht eine durch ein vermindertes Ca-Angebot stimulierte Calcium- Absorptionrate mit einer Zunahme der CaBP9k Konzentration im Darm einher (ARMBRECHT et al. 1979, ROULLET et al. 1991). Gleichzeitig steigt der mucosale Gehalt an Calmodulin (ROULLET et al. 1991) und der Gehalt an PTH und Calcitriol im Blutplasma (NORMAN et al. 1981). Diese Veränderungen treten speciesabhängig ein bis mehrere Tage nach der Futter- bzw. Nahrungsumstellung ein.
Bei Schweinen führt ein Calciumangebot mit dem Futter über die international akzeptierte Norm hinaus bei Beachtung des richtigen Ca/P Verhältnisses in der Regel nicht zu verbesserter Leistung in Form von Gewichtszunahme und Futterverwertung.
Trotz abnehmender aktiver Calcium-Absorptionsrate nimmt bei einer solchen Ration die absorbierte Calciummenge weiter zu (FERNÁNDEZ et al. 1995). Dies resultiert in deutlich positiven Effekten auf Knochengewichte und geringerer Bruchfähigkeit der Knochen. Bedeutsam an diesem Befund ist vielleicht die Tatsache, dass diese Effekte auf den Knochen weniger von der absoluten Höhe des Calciumangebots als vielmehr von Änderungen der Phosphataufnahme und damit von Änderungen des Ca:P Verhältnisses im Futter beeinflusst wurden (LIBAL et al. 1969).
Die Plasmacalcium-Konzentration wurde durch diese Maßnahmen kaum beeinflusst (NIMMO et al. 1980). Auch die Darreichungsform des Calciums mit dem Futter scheint bei reichlichem Calciumangebot eine Rolle zu spielen. Bei Ratten konnten PANSU und Mitarbeiter (1993) feststellen, dass mit steigendem Calciumangebot in Form eines Phosphatsalzes die Ca-Verwertung besser war als bei Zufuhr des Calciums in Form eines schwer löslichen Carbonatsalzes. Offenbar ist die Verweilzeit dieser Stoffe im Darmlumen nicht lang genug, um das nicht gelöste Calcium in die für eine Absorption geeignete ionisierte Form zu überführen.
Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass auch bei erhöhter oder erniedrigter Calciumzufuhr mit dem Futter die intestinale Calciumaufnahme in etwa bedarfsdeckend reguliert wird.
Keine Untersuchungen liegen bisher jedoch darüber vor, wie der Calciumhaushalt bei Schweinen reagiert, wenn der Calciumgehalt des Futters noch weiter angehoben wird, z.B. bis auf 2 % in der Futtertrockenmasse. Diese Frage war u.a. Gegenstand der hier vorgelegten Untersuchungen.
2.2.2 Der Einfluss von Lactose
Seit vielen Jahren ist bekannt, dass ein Zusatz von Lactose (Milchzucker) die Absorption von Calcium aus dem Darm fördert (LENGEMANN et al. 1959, LENGEMANN 1959). Der Effekt wurde bei Ratten und verschiedenen anderen Säugetierarten beschrieben (ARMBRECHT und WASSERMAN 1976). Der celluläre Mechanismus, der diesem Effekt zugrunde liegt, ist jedoch bis heute nicht vollständig geklärt. Die meisten Autoren vertreten die Auffassung, dass es sich um einen unspezifischen Effekt auf den passiven Transport von Calcium handelt. Es wird vermutet, dass er durch osmotische Effekte der Lactose auf das Chymus und eine Absenkung des pH-Wertes (ALI und EVANS 1967) in bestimmten Darmabschnitten zustande kommt. Dafür spricht die Beobachtung, dass auch die Absorption anderer Ionen, wie z.B. die von Magnesium, durch Lactose positiv beeinflusst wird (ENTRINGER et al. 1975). Ferner spricht für diese Auffassung, dass außer Lactose auch andere organische Moleküle, wie Cholin, D-Galactose und Glucose, einen stimulierenden Effekt auf die Netto-Calciumabsorption aufweisen (FAVUS und BACKMAN 1984, BEHAR und KERSTEIN 1976). Der durch Glucose induzierte Mehrtransport von Calcium in isolierten Ileumsegmenten von Ratten in vivo korrelierte positiv mit dem „solvent drag“ (BEHAR und KERSTEIN 1976). PANSU et al. (1981) haben bei Ratten in abgebundenen Darmsäckchen (ligated loops) die Calciumabsorption mit und ohne Zusatz von Laktose untersucht. Durch Variation der Calciumkonzentration im Darminhalt konnten sie zwischen der aktiven und passiven Komponente der Calciumabsorption unterscheiden.
Sie kamen aufgrund ihrer Daten zu dem Schluss, dass ein Zusatz von Lactose die aktive (sättigbare) Komponente der Calciumabsorption hemmt und die passive (nicht- sättigbare) Komponente fördert.
In Fütterungsversuchen ist der stimulierende Effekt von Lactose auf die Calciumabsorption besonders deutlich, wenn die Ration 20 bis 40 % Lactose in der TM enthält. So stieg bei wachsenden Börgen die scheinbare Calciumverdaulichkeit signifikant von 57 auf 67 %, wenn in der Ration 20 % Stärke durch 20 % Lactose ersetzt wurden (ENTRINGER et al. 1975). Andererseits war in ähnlich angelegten Versuchen der gleichen Autoren die scheinbare Calciumverdaulichkeit (sV.) besser, wenn die Tiere eine Ration mit 40 % Stärke (sV. 46 %) im Vergleich zu 20 % Lactose (sV. 31 %) erhielten. Die Autoren führen dies - für den Leser etwas schwer nachvollziehbar - auf eine möglicherweise kürzere Passagezeit des Chymus bei Stärkefütterung im Vergleich zur Fütterung von Lactose zurück (ENTRINGER et al. 1975).
Bei wachsenden 70 bis 90 g schweren Ratten wurde die intestinale Calciumabsorption in mehreren Darmsegmenten nach Fütterung verschiedener Testrationen gemessen.
Sechs Wochen nach Verfütterung der einzelnen Diäten wurden die Tiere getötet und der Magen-Darm-Trakt zwischen Magen und Caecum in sechs Segmente aufgeteilt. Die relative prozentuale Calciumabsorption in den einzelnen Darmabschnitten wurde mit Hilfe des Chymusmarkers Chromoxid berechnet (ALI und EVANS 1967). Die Zulage von 12 % Lactose zur Grundration verbesserte die Calciumabsorption nur im Bereich des Ileums und im Caecum. Die Autoren führen diesen Effekt der Lactose auf eine pH- Absenkung des Chymus in diesen Darmabschnitten und eine damit verbundene bessere Löslichkeit der Calciumsalze im Chymus zurück.
Auch die Bioverfügbarkeit des durch Lactosezulagen vermehrt absorbierten Futtercalciums wird verbessert. Dies wurde durch die Retention des Futtercalciums im Knochen und in der Muskulatur mit Hilfe der Calciumisotope 45Ca und 47Ca nachgewiesen. Eine Zulage von 20 % Lactose oder von Magermilch zur Grundration verbesserte signifikant die Calciumretention in diesen Geweben (BUCHOWSKI und MILLER 1991). Die Calcitriolspiegel des Blutplasmas blieben dabei unbeeinflusst.
Isolierte Darmschleimhäute von Ratten aus dem Bereich des Ileums zeigen in Ussingkammern nach Zugabe von 160 mM Lactose bei isoosmotischer Reduktion der
NaCl-Konzentration eine Steigerung des Nettocalciumfluxes von mucosal nach serosal, ICa,s-m. Ohne Lactosezugabe zeigten die Schleimhäute eine signifikante Calciumsekretion von serosal nach mucosal, die durch die mucosale Lactosezugabe verschwand (FAVUS und BACKMAN 1984). Die Schleimhäute waren während der Messungen elektrisch kurz geschlossen, so dass auch kein elektrischer Gradient zwischen beiden Seiten der Schleimhaut bestand. Der isoosmotische Ersatz von NaCl durch Lactose beeinflusste zwar die isoosmotischen Bedingungen zwischen der serosalen und mucosalen Inkubationslösung nicht, resultierte andererseits aber in der Ausbildung von chemischen Gradienten für einzelne Pufferkomponenten (Na+, Cl-, Lactose). Daraus kann ein zusätzlicher Einfluss auf den Nettowasserflux durch die Schleimhaut entstehen, der Einfluss auf den Calciumtransport nehmen kann. Die Autoren stellen in ihren Versuchen fest, dass der durch Lactose induzierte Calciumtransport durch die Schleimhaut eng mit dem Mannitolflux korrelierte, der als Marker für den Nettowasserflux diente (FAVUS und BACKMAN 1984). Sie ziehen daraus auch den Schluss, dass es sich bei dem Lactoseeffekt auf den Calciumtransport vermutlich um eine Stimulation der passiven Komponente des Calciumtransports handelt.
Weniger gut vereinbar mit dieser Schlussfolgerung sind Ergebnisse von ARMBRECHT und WASSERMAN (1976), die mit umgestülpten Darmsäckchen von Ratten gewonnen wurden. In diesen Versuchen wurden umgestülpte Darmsäckchen des Rattenileums 45 Minuten mit einer Lösung mit 160 mM Lactose präinkubiert. Anschließend wurde in diesen Darmsäckchen die Ca-Aufnahme in Lactose freier Lösung gemessen. Die Präinkubation mit Lactose erhöhte die Calciumaufnahme in der ersten Minute nach dem Pufferwechsel um 64 % im Vergleich zu Kontrollsäckchen, die nicht zuvor mit Lactose inkubiert worden waren. Die Autoren vermuten nach diesem Befund einen Einfluss von Lactose auf die absorptiven Eigenschaften der Schleimhaut.
Diese Vermutung konnte in anderen Untersuchungen mit abgesetzten Ferkeln nicht bestätigt werden (HARMEYER et al. unveröffentlicht). In diesem Versuchen wurden Ferkel drei Wochen lang isoenergetisch mit einer Kontrollration mit 40 % Maisstärke
oder mit einer Versuchsration mit 40 % Lactose (statt Maisstärke) gefüttert.
Anschließend wurden die Tiere getötet. In isolierten Schleimhautstückchen vom Duodenum, Jejunum und Ileum wurde der Calciumtransport in Ussingkammern gemessen. Der Inkubationspuffer enthielt keine Lactose. Unter diesen Bedingungen in vitro ergaben sich bei Vitamin-D-defizienten und normal mit Vitamin D versorgten Ferkeln keine Anhaltspunkte für einen stimulierenden Effekt der Lactosefütterung auf den Calciumtransport.
2.2.3 Der Einfluss von Caseinphosphopeptiden
Der positive Effekt von Milchcasein auf die Calciumabsorption ist seit langem bekannt. In 1950 äußerte MELLANDER (1963) erstmals die Vermutung, dass die verbesserte Calciumverdaulichkeit in Verbindung mit Caseinzulagen auf Verdauungsprodukte des Caseins zurückzuführen sei. LEE et al. (1980) fütterten wachsende Ratten mit halbsynthetischen Rationen mit 20 % Casein in der TM bzw. mit Rationen mit einer entsprechenden Menge eines Aminosäurengemisches oder Eialbumin. Sie entdeckten nach Gelfiltration des Darmchymus bei den mit Casein gefütterten Tieren eine Proteinfraktion mit Caseinphosphopeptiden, die für den positiven Effekt auf die Calciumabsorption verantwortlich war. Besonders im Ileumchymus war die Konzentration an löslichem Calcium in Anwesenheit dieser Phosphopeptide stark erhöht. Bei Fütterung einer reinen Caseinration waren diese Verdauungsprodukte des Caseins erstaunlicherweise im Chymus nicht mehr nachweisbar. Eine Zulage von 45 % statt 25 % Casein zu einer Maisstärkeration verbesserte die scheinbare Calciumverdaulichkeit bei Ratten im Laufe eines Futterungsversuchs jedoch noch weiter um 5 bis 7 % (HOWE und BEECHER 1981). Auch die Calciumretention der Tiere nahm zu. Der positive Effekt der Caseinphosphopeptide auf die Calciumabsorption konnte bei Ratten in situ mit Hilfe vom Radiocalcium in isolierten Darmsegmenten direkt nachgewiesen werden (LEE et al. 1983). Er trat hauptsächlich im hinteren Teil des Dünndarms auf. Ferner zeigten diese Versuche indirekt, dass im Chymus dieses Darmabschnitts der Anteil an löslichem Calcium deutlich angestiegen war. Den Befund führten die Autoren auf die Bildung löslicher Calciumkomplexe mit den
Caseinabbauprodukten zurück. Das Calcium aus diesen Komplexen könnte, so die Meinung der Autoren, für eine passive Absorption zusätzlich zu dem übrigen löslichen Calcium im Chymus verfügbar sein. Neuere Untersuchungen, ebenfalls mit Ratten, ergaben, dass eine Hitzebehandlung des Caseins die Bildung von Caseinphosphopeptiden im Darm gegenüber der Verfütterung von nativen Casein stark reduziert (YUAN und KITTS 1994). Ferner zeigten diese Versuche nicht nur eine verbesserte Calciumabsorption durch Zulage von nativem Casein sondern auch eine verbesserte Nutzung des vermehrt absorbierten Calciums. Der Calciumgehalt des Skeletts und seine Bruchfähigkeit hatten bei den mit 20 % Casein gefütterten Tieren gegenüber einer Verfütterung von 20 % Sojaprotein-Isolat signifikant zugenommen.
Auf Grund der vorliegenden Daten ist zu vermuten, dass es sich bei der verbesserten Calciumabsorption in Verbindung mit Caseinzulagen um einen passiven chemo- physikalischen und von Vitamin-D-unabhängigen Effekt handelt.
2.3 Mechanismen und Regulation der Calciumausscheidung durch die Nieren
Die Grobeinstellung eines ausgeglichenen Calciumhaushalts im Sinne einer Anpassung von Calciumaufnahme und Calciumbedarf erfolgt im Darm durch Veränderung der scheinbaren Calciumverdaulichkeit. Die Feineinstellung des Calciumhaushaltes geschieht durch die Nieren. Die renal ausgeschiedenen Calciummengen sind, besonders bei wachsenden Tieren, verglichen mit der wahren Calciumabsorption aus dem Futter, meist sehr gering. Von dem im Blutplasma speziesübergreifend in einer Konzentration von 2,5 mmol/l vorliegenden Calcium sind 55
% ultrafiltrabel. Der Rest ist an Plasmaproteine, vorwiegend an Albumine, gebunden.
Etwa 45 % ist ionisiertes (freies) Calcium und 10 % complexiertes ultrafiltrables, meist an Anionen (Citrat, HCO3-
, HPO42-
) gebundenes Calcium. Unter normalen Bedingungen der Antidiurese werden mehr als 98 % des ultrafiltrierten Calciums tubulär resorbiert (BINDELS 1993); davon 70 bis 85 %, hormonell kaum beeinflussbar, im proximalen
Tubulus und dem dicken aufsteigenden Schenkel der Henleschleife (HOENDEROP et al. 2000). Die restlichen 15 % des glomerulär filtrierten Calciums werden bedarfsabhängig im distalen Konvolut, im Verbindungsstück und dem Anfangsteil des Sammelrohrs resorbiert (SUKI 1979, FRIEDMAN und GESEK 1995). Wie bei vielen anderen lebenswichtigen Inhaltsstoffen im Ultrafliltrat (Natrium, Kalium, Glucose) ist auch die tubuläre Resorption von Calcium zwischen dickem aufsteigendem Schenkel der Henleschleife und Sammelrohr hormonell beeinflussbar. In diesem Bereich wird die Calciumresorption tierartlich unterschiedlich und bedarfsabhängig von Parathormon, Calcitriol und Calcitonin stimuliert (FRIEDMAN und GESEK 1995).
2.3.1 Die Einzelschritte des tubulären Transports
Apicale Calciumaufnahme
Die einzelnen Schritte des tubulären Transports lassen sich wie im Darm in eine apicale Aufnahme, eine cytosolische Diffusion und die basolaterale Abgabe von Calcium unterteilen. Für die energetisch begünstigte apicale Aufnahme von Calcium sind spezifische Calciumkanäle verantwortlich (POUJEOL et al. 1995, TAN und LAU 1993).
Mit molekularbiologischen Methoden wurde aus Epithelien des Verbindungsstückes und des corticalen Sammelrohres in Xenopus laevis-Oocyten ein Calciumkanal (ECaC = epithelial calcium channel) kloniert und in seiner Funktion näher charakterisiert (HOENDEROP et al. 1999). Immuncytochemische Untersuchungen ergaben, dass der Kanal nur in calcitriolsensitiven , Calbindin 28K exprimierenden Zellen nachweisbar ist (HOENDEROP et al. 2000). Die Calcium-Transportfunktion dieses Transmembranproteins ist nicht durchlässig für Ba2+ und Sr2+ und, wie auch der CAT1- Kanal nicht durch Calcium-Kanalblocker hemmbar. Ihm wird bei den Vitamin-D- vermittelten Effekten auf die Calciumresorption der Niere eine wichtige Rolle zugeschrieben. In Duodenalenterocyten kommt der Kanal ebenfalls vor (s. Kap. 2.1.2.1).
Die Calciumkanäle im distalen Tubulus sind, wie auch die der Darmmucosa, durch Calciumkanalblocker, wie Verapamil und Nifedipin, nicht hemmbar (GESEK und FRIEDMAN 1992a). In diesem Merkmal unterscheiden sie sich deutlich von den
