Verlauf der postnatalen Entwicklung des Vitamin D-abhängigen Ca2+-Transportes im Dünndarm von Ferkeln

Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover

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Verlauf der postnatalen Entwicklung des Vitamin D-abhängigen Ca

-Transportes

im Dünndarm von Ferkeln

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Magnus Brandenburger

aus Kiel

Hannover 2004

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. B. Schröder

1. Gutachter: Prof. Dr. B. Schröder 2. Gutachter: Prof. Dr. T. Spillmann

Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2004

Gefördert mit Mitteln der Deutschen Forschungsgemeinschaft

„Unanfechtbare Wahrheiten gibt es überhaupt nicht, und wenn es welche gibt, so sind sie langweilig.“

Theodor Fontane, Der Stechlin (1897)

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis

Inhalt

Abkürzungsverzeichnis... V

1 Einleitung ... 1

2 Literaturübersicht ... 2

2.1. Biologische Bedeutung von Calcium... 2

2.2 Calcium-Homöostase... 3

2.2.1 Regulation auf zellulärer Ebene ... 3

2.2.2 Regulation auf systemischer Ebene... 4

2.3 Intestinaler Calciumtransport... 7

2.3.1 Parazellulärer Ca²⁺-Transport... 7

2.3.2 Transzellulärer Ca²⁺-Transport... 8

2.4 TRP-Kanäle... 10

2.4.1 Grundlagen und Nomenklatur ... 10

2.4.2 Strukturelle Eigenschaften... 12

2.4.3 Physiologische Bedeutung... 13

2.4.4 Besonderheiten von TRPV5 und TRPV6... 15

2.5 Vitamin D ... 21

2.5.1 Grundlagen ... 21

2.5.2 Nomenklatur und Biotransformation... 21

2.5.3 Aufgabe und Wirkung ... 23

2.6 Entwicklung des Gastrointestinaltraktes in der frühen postnatalen Lebensphase ... 24

2.6.1 Morphologische und funktionelle Veränderungen... 24

2.6.2 Besonderheiten des intestinalen Ca²⁺-Transports bei Ferkeln... 25

Inhaltsverzeichnis

3 Material und Methoden ... 27

3.1. Versuchstiere... 27

3.2 Probenentnahme... 28

3.2.1 Blutprobenentnahme... 28

3.2.2 Probenentnahme für die RNA-Isolierung... 29

3.2.3 Probenentnahme für die Präparation intestinaler Bürstensaummembranvesikel 29 3.2.4 Probenentnahme für die Messung in Ussing-Kammern... 29

3.3 Isolierung von Gesamt-RNA ... 30

3.4 cDNA-Synthese ... 31

3.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ... 32

3.5.1 Grundlagen ... 32

3.5.2 Durchführung ... 33

3.6 Darstellung und Isolierung der DNA... 34

3.6.1 Agarose-Gelelektrophorese ... 34

3.6.2 Extraktion der PCR-Produkte... 35

3.7 Sequenzierung... 35

3.8 Real-Time PCR... 36

3.8.1 Grundlagen ... 36

3.8.2 Durchführung ... 37

3.8.3 Auswertung... 39

3.9 Präparation intestinaler Bürstensaummembranvesikel ... 40

3.10 Messung der Aufnahmeraten in Bürstensaummembranvesikel... 43

3.10.1 Durchführung ... 43

3.10.2 Berechnung von [Ca²⁺]f... 44

3.10.3 Inkubationsansatz zur zeitabhängigen Glukoseaufnahme... 45

3.10.4 Inkubationsansatz zur zeitabhängigen Calciumaufnahme... 45

3.10.5 Inkubationsansatz zur konzentrationsabhängigen Calciumaufnahme... 46

3.10.6 Berechnung der Calciumaufnahme und der kinetischen Kenngrößen ... 46

Inhaltsverzeichnis

3.11 Ussing-Kammer-Technik... 48

3.11.1 Präparation der Darmepithelien... 48

3.11.2 Inkubation der Gewebe... 48

3.11.3 Messung der unidirektionalen Ca-Fluxraten ... 49

3.11.4 Berechnung der Ca-Fluxraten... 50

3.12 Analytische Methoden... 51

3.12.1 Bestimmung von Calcium im Blutplasma... 51

3.12.2 Bestimmung von Calcitriol und 25-Hydroxycholecalciferol ... 51

3.12.3 Bestimmung des Proteingehalts ... 51

3.12.4 Bestimmung der Aktivität der alkalischen Phosphatase ... 52

3.12.5 Bestimmung der Aktivität der Na⁺/K⁺-ATPase... 53

3.13 Chemikalien ... 54

3.14 Statistik... 55

4 Ergebnisse ... 57

4.1 Charakterisierung des Tiermodells ... 57

4.1.1 Verlauf der Calciumkonzentrationen im Plasma nach der Geburt und Einfluss von Vitamin D3... 57

4.1.2 Verlauf der Calcium-, Calcitriol- und 25-OHD3-Konzentrationen im Plasma nach der Behandlung mit Vitamin D3... 58

4.1.3 Untersuchungen zum Ca²⁺-Transport am intakten Epithel... 60

4.1.4 Fazit ... 61

4.2 Molekularbiologische Studien ... 62

4.2.1 Expression der enterozytären Ca²⁺-Transportkomponenten... 62

4.3 Funktionelle Untersuchungen ... 69

4.3.1 Charakterisierung der BSMV ... 70

4.3.2 Kinetik der Ca²⁺-Aufnahme während der postnatalen Entwicklung und Beeinflussbarkeit durch Vitamin D3... 74

4.3.3 Versuche zur möglichen Wirkung des Ca²⁺-Kanalblockers Ruthenium Rot am Schweinedarm ... 77

Inhaltsverzeichnis

5 Diskussion... 78

5.1 Charakterisierung des Tiermodells ... 79

5.1.1 Verlauf der Calcium-, Calcitriol- und 25-OHD3-Konzentrationen im Plasma und Einfluss von Vitamin D3... 79

5.1.2 Untersuchungen zum Ca²⁺-Transport am intakten Epithel... 80

5.2 Molekularbiologische Studien ... 82

5.3 Funktionelle Untersuchungen ... 88

5.3.1 Kinetik der Ca²⁺-Aufnahme und Einfluss von Vitamin D3... 88

5.3.2 Wirkung des Ca²⁺-Kanalblockers Ruthenium Rot ... 90

5.4 Modell der postnatalen Anpassung des intestinalen Calciumtransports .... 92

6 Zusammenfassung ... 94

7 Summary ... 96

8 Literaturverzeichnis... 98

Anhang ... 125

Puffer und Lösungen... 125

A1 Messung in Ussing-Kammern ... 125

A2 Präparation intestinaler Bürstensaummembranvesikel... 126

A3 Bestimmung der Aufnahmeraten in Bürstensaummembranvesikel ... 127

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

ANCOVA analysis of covariance (Kovarianzanalyse) ANOVA analysis of variance (Varianzanalyse) Aq. dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser) ATP(ase) Adenosintriphosphat(ase)

bp Basenpaare

BSMV Bürstensaummembranvesikel [Ca²⁺]f Konzentration freier Ca²⁺-Ionen [Ca²⁺]ges Gesamtkonzentration an Ca²⁺-Ionen

cDNA complementary DNA (komplementäre DNA)

CT threshold cycle (PCR-Zyklus, in dem die Reporterfluoreszenz die Hintergrund- fluoreszenz signifikant übersteigt)

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DNase Desoxyribonuklease

dNTP 2′-Desoxyribonukleosid-5′-triphosphat

dsDNA double-stranded DNA (doppelsträngige DNA) DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EGTA Ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetat EtBr Ethidiumbromid

g Vielfaches der Erd- oder Normalfallbeschleunigung (gn = 9,80665 m · s^-2) HEPES N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N′-2-ethansulfonsäure

IC50 inhibitory concentration (Konzentration einer Substanz, bei der ein definiertes System um 50 % gehemmt wird)

I. E. Internationale Einheit (1 I. E. Vit. D3 entspricht 0,025 µg Vitamin D3) i. m. intramuskulär

Jms Fluxrate von mukosal nach serosal Jnet Nettofluxrate (Jnet = Jms – Jsm) Jsm Fluxrate von serosal nach mukosal KM Körpermasse

Abkürzungsverzeichnis

Km MICHAELIS-MENTEN-Konstante, Halbsättigungskonstante bei sättigbarem Transport

KO knockout (Versuchstierstamm, bei dem die Expression eines spezifischen Gens unterbunden worden ist; vgl. WT)

NCX Na⁺/Ca²⁺-exchanger (Na⁺/Ca²⁺-Austauscher) NTC no template control (Kontrolle ohne Template)

1α-OHase 25-Hydroxycholecalciferol-1α-Hydroxylase (CYP27B1) 1,25(OH)2D3 1α,25-Dihydroxycholecalciferol, Calcitriol

25-OHD3 25-Hydroxycholecalciferol, Calcidiol p probability value (Irrtumswahrscheinlichkeit)

PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) p. i. post injectionem (nach der Injektion)

PMCA Plasmamembran-Ca²⁺-ATPase p. n. post natum (nach der Geburt)

r Korrelationskoeffizient

r² Bestimmtheitsmaß

RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) RNase Ribonuklease

rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) RR Ruthenium Rot

RT Raumtemperatur s. A. spezifische Aktivität

SD standard deviation (Standardabweichung)

SEM standard error of the mean (Standardfehler des Mittelwertes) Tab. Tabelle

TAE Tris-Acetat-EDTA

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

TRP(V) transient receptor potential channel (– vanilloid receptor subfamily) U unit

VDR Vitamin D-Rezeptor Vit. Vitamin

Vmax maximale Aufnahmerate

WT Wildtyp (Versuchstierstamm, mit unveränderter Expression eines spezifischen Gens; vgl. KO)

x arithmetisches Mittel

Einleitung

1 Einleitung

Aufgrund seiner vielfältigen Aufgaben im Organismus kommt dem Mengenelement Calcium eine besondere Bedeutung in der Ernährung von Wirbeltieren zu. Die aktive Aufnahme, welche beim monogastrischen Säugetier vorwiegend im vorderen Dünndarm stattfindet, stellt einen wichtigen Schritt in der Aufrechterhaltung der systemischen Calcium-Homöostase dar.

Obwohl die mit der Absorption in Zusammenhang stehenden Transportvorgänge seit langem Gegenstand zahlreicher Untersuchungen sind, konnte der genaue Mechanismus bis dato noch nicht hinreichend geklärt werden.

Weitgehende Übereinstimmung herrscht hinsichtlich der Vorstellung, dass sich die dem Ca²⁺- Transport zugrunde liegenden Abläufe prinzipiell in drei Teilschritte gliedern lassen.

Zunächst erfolgt die Absorption über Ca²⁺-Kanäle der enterozytären Bürstensaummembran unter Nutzung eines zelleinwärts gerichteten elektrochemischen Gradienten. Für die anschließende Beförderung der aufgenommenen Ionen von der luminalen zur basolateralen Seite der Zelle spielt das Ca²⁺-Bindungsprotein Calbindin-D9k eine essentielle, noch nicht umfassend geklärte Rolle. Den terminalen Schritt stellt die Ausschleusung des Calciums aus der Zelle mit Hilfe der basolateral gelegenen, primär-aktiven Plasmamembran-Ca²⁺-Pumpe (PMCA1b) dar. Durch die Entdeckung von zwei genetisch eng verwandten epithelialen Calciumkanälen, TRPV5 und TRPV6, zunächst bei Kaninchen und Ratte, später auch beim Schwein, bieten sich neue Ansatzpunkte zur näheren Charakterisierung der intestinalen Ca²⁺- Transportprozesse. Bereits zuvor konnte für das Schwein an einem Tiermodell mit erblichem Calcitriolmangel nachgewiesen werden, dass die Regulation der intestinalen Calciumabsorption bis etwa zur vierten Lebenswoche von diesem Metaboliten des Vitamins D3 unabhängig ist. Mit zunehmendem Alter allerdings gerät der Mechanismus dann immer stärker unter den Einfluss von Calcitriol.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Veränderungen im Ca²⁺-Transport beim Ferkel auf molekularbiologischer und epithelialer Ebene über die frühe postnatale Lebensphase als Verlaufsstudie zu erfassen. Zu diesem Zweck sollten die Ergebnisse funktioneller Analysen mit Untersuchungen zur mRNA-Expression wichtiger Gene des Ca²⁺-Transportes, namentlich TRPV5, TRPV6, Calbindin-D9k und PMCA1b, verknüpft werden. Darüber hinaus sollte festgestellt werden, ob und ggf. ab welchem Lebensalter eine Veränderung der vorstehend genannten Parameter durch eine Vitamin D3-Behandlung auch bei solchen Tieren nachgewiesen werden kann, die nicht unter exogenen oder endogenen Einschränkungen des Calcium-Vitamin D-Systems stehen.

Literaturübersicht

2 Literaturübersicht

2.1 Biologische Bedeutung von Calcium

Calcium, das fünfthäufigste Element in der Erdkruste, ist als wichtigstes kationisches Mengenelement des Körpers von essentieller Bedeutung für den Organismus der meisten Lebewesen. Bei den Säugetieren finden sich etwa 99 % dieses Erdalkalimetalls in der Substanz von Knochen und Zähnen, während nur ca. 1 % im Extra- und Intrazellulärraum vorliegen.

Calcium in ionisierter Form (Ca²⁺) fungiert als ein universaler Second messenger im Zusammenhang mit unzähligen Abläufen innerhalb des Organismus, wie der Steuerung der Aktivität von Enzymen, Ionenpumpen oder Cytoskelett-Komponenten (NOWYCKY u.

THOMAS 2002). Neben der präsynaptischen Freisetzung von Neurotransmittern, z. B. an der motorischen Endplatte, vermittelt Calcium die Fusion von Vesikeln zwischen intrazellulären Kompartimenten (HEIDELBERGER et al. 1994; BECKERS u. BALCH 1989). Darüber hinaus ist Ca²⁺ als wichtiger Co-Faktor bei der Blutgerinnung (Faktor IV) und bei der Regulation der Muskelkontraktion von Bedeutung (MORIN 1980; VAN BREEMEN u. SAIDA 1989). Zur Steuerung der Sekretion vieler endo- und exokriner Drüsen, zum intestinalen Elektrolyttransport und zur Kapazitation des Säugerspermiums trägt dieses Element ebenfalls bei (MUALLEM 1989; DONOWITZ u. WELSH 1986; PUROHIT et al. 1999). Nicht zuletzt in Verbindung mit Abläufen innerhalb des Zellzyklus, von der Zellteilung bis hin zur Apoptose, spielt Ca²⁺ eine besondere Rolle (TOMBES u. BORISY 1989; TOMBES et al. 1992). Systemisch wirkt Ca²⁺ als wichtiger Faktor zur Membranpotentialstabilisierung und hat somit einen besonderen Einfluss auf die Erregungsbildung und –leitung am Herzen (BERRIDGE 2003).

Literaturübersicht

2.2 Calcium-Homöostase

2.2.1 Regulation auf zellulärer Ebene

Aufgrund der vielfältigen Funktionen von Ca²⁺ innerhalb der Zelle, welche in der Regel über einen zehn- bis 100fachen Anstieg der intrazellulären Konzentration freier Calciumionen ([Ca²⁺]f) vermittelt werden, besteht die Notwendigkeit, diese in Ruhe auf einem niedrigen Niveau von etwa 100 nmol · l^-1 zu halten (BROWN 1991). Während der Gesamtcalciumgehalt einiger Zellen durchaus in derselben Größenordnung liegen kann wie die extrazelluläre Calciumkonzentration, besteht der bedeutsame Unterschied darin, dass intrazellulär höchstens 0,1 % des Calciums in ionisierter Form vorliegen, während dies extrazellulär spezies- spezifisch etwa zur Hälfte der Fall ist. Hierdurch herrscht über der Plasmamembran, zusammen mit dem Membranpotential, ein deutlicher, zelleinwärts gerichteter elektro- chemischer Gradient vor. Bereits kleine Permeabilitätsänderungen können somit zu signifikanten Fluktuationen in der zytosolischen [Ca²⁺]f führen (CARAFOLI 1987). Ferner ist aus intrazellulären Speichern, wie dem endoplasmatischen Retikulum, eine rasche Ca²⁺- Mobilisierung möglich. Die schnelle Zunahme der [Ca²⁺]f kann so als ein funktionelles Signal interpretiert werden (NEMERE u. NORMAN 1991).

Um ihre Second-messenger-Funktion aufrechtzuerhalten, ist in der Folge eines solchen Anstiegs die Entfernung überschüssiger Ca²⁺-Ionen aus dem Zytosol notwendig. Die Zelle nutzt hierfür Adenosintriphosphat-(ATP-)abhängige Ca²⁺-Pumpen (primär aktiver Transport) oder bedient sich, mittels Na⁺/Ca²⁺-Austauschern (NCX), der erleichterten Diffusion. Calcium wird dabei in intrazelluläre Speicher wie Zellorganellen, v. a. das endoplasmatische Retikulum und – weniger ausgeprägt – die Mitochondrien, transportiert (CARAFOLI 1987).

Obwohl einige Zellen auf diese Weise recht effektiv das freigesetzte Ca²⁺ wieder verwerten können, wird in vielen Geweben der größte Teil über die Plasmamembran aus dem Intrazellulärraum eliminiert (PAREKH u. PENNER 1997). Weiterhin besteht die Möglichkeit, freies Calcium im Zytoplasma an Ca²⁺-bindende Proteine, wie das ubiquitär vorkommende Calmodulin, zu koppeln.

Insbesondere Zellen, die neben einem Einstrom des Calciums als Second messenger zusätzlich große Mengen an Ca²⁺ durch das Zytosol schleusen, können diese physiologische Aufgabe nur erfüllen, wenn ihnen weitere intrazelluläre Calciumpuffer zur Verfügung stehen.

Dies ist z. B. in den Ca²⁺-absorbierenden Zellen der Niere und des Darms der Fall. Dabei kann man davon ausgehen, dass beispielsweise ein Enterozyt in jeder Sekunde eine

Literaturübersicht

Calciummenge aufnimmt, die der gesamten [Ca²⁺]f in der Zelle äquivalent ist (KAUNE 1992).

Aus diesem Grund finden sich im Zytoplasma u. a. jener Zellen spezielle Ca²⁺- Bindungsproteine, deren Expression vom Vitamin D-Hormon (Calcitriol) abhängig ist und welche deshalb als Calbindin-D bezeichnet werden (WASSERMAN u. TAYLOR 1966; TAYLOR

u. WASSERMAN 1967; CORRADINO u. WASSERMAN 1968). Nach ihrem Molekulargewicht lassen sich in dieser Gruppe zwei Vertreter unterscheiden: das zunächst im Vogeldarm nachgewiesene Calbindin-D28k und das leichtere Calbindin-D9k, welches aus Enterozyten von Säugetieren isoliert werden konnte (WASSERMAN u. TAYLOR 1966; KALLFELZ et al. 1967).

Beide Proteine, die mittlerweile in einer Vielzahl von Geweben beschrieben wurden, können je Molekül vier (Calbindin-D28k) bzw. zwei (Calbindin-D9k) Ca²⁺-Ionen mit hoher Affinität binden. Trotz ihrer ähnlichen Funktion weisen sie dabei allerdings keinerlei Sequenz- homologie auf (JOHNSON u. KUMAR 1994). Durch einen noch nicht abschließend geklärten Mechanismus fördert die Expression von Calbindin den transzellulären Calciumtransport (Kap. 2.3.2), was zur Aufrechterhaltung der systemischen Ca²⁺-Homöostase besonders in Niere und Darm von Bedeutung ist, und trägt gleichzeitig dazu bei, die [Ca²⁺]f in der Zelle aus den eingangs genannten Gründen auf niedrigem Niveau zu halten (FEHER et al. 1992;

SCHRÖDER et al. 1996).

2.2.2 Regulation auf systemischer Ebene

Der Calciumhaushalt der Säugetiere ist auch auf systemischer Ebene eng reguliert. Um eine gleichmäßige Ca²⁺-Konzentration im Blut und somit im Extrazellulärraum auch unter den wechselnden Bedingungen eines nicht-aquatischen Lebensraumes aufrechterhalten zu können, haben Wirbeltiere im Verlauf der Evolution ein komplexes homöostatisches System entwickelt. Hierbei ist ein Zusammenspiel von Darm, Knochen und Niere unter dem Einfluss verschiedener Hormone, die zum Teil durch zellständige Ca²⁺-Sensoren induziert werden, unabdingbar (BROWN u.MACLEOD 2001).

Der Plasmacalciumspiegel variiert beim Schwein, je nach Alter, Rasse und Geschlecht, in unterschiedlichem Umfang und liegt für adulte Tiere zwischen 2,3 und 2,8 mmol · l^-1, während Saugferkel eine Konzentration von 2,7 bis 3,1 mmol · l^-1 aufweisen (KOLB 1989).

Veränderungen durch den unterschiedlichen Ca²⁺-Gehalt der Ration sowie bei Sauen durch den Reproduktionszustand sind möglich (WURYASTUTI et al. 1991; SCHRÖDER 1996). Im Zusammenhang mit der Calcium-Homöostase ist primär der Anteil des ionisierten Ca²⁺ im Plasma von Bedeutung, welcher etwa 60 % der Gesamtmenge ausmacht (BROWN 1991). Das

Literaturübersicht

übrige Calcium hingegen, von dem ca. 35 % an Plasmaproteine, bevorzugt Albumine, gebunden ist und ungefähr 5 % als Komplexverbindungen mit organischen Säuren vorliegt, ist dem Organismus nur indirekt zugänglich.

Während die Aufnahme von Calcium durchweg über den Darm stattfindet, ist der größte Anteil des im Körper vorhandenen Minerals (nahezu 99 %) als Gerüstsubstanz und begrenzt als Reserve im Knochen eingelagert. Die Exkretion von Ca²⁺ aus dem Organismus schließlich erfolgt hauptsächlich über die Nieren. Im adulten Säugetier werden dabei etwa 98 % des ultrafiltrierten Ca²⁺ resorbiert; 83 % auf parazellulärem Weg im proximalen Tubulus und dicken, aufsteigenden Ast der Henleschen Schleife, die restlichen 15 % im distalen Tubulus als aktiver Transport gegen einen Konzentrationsgradienten (HOENDEROP et al. 2000 b).

Entsprechend der intestinal aufgenommenen Menge findet sich nur ein kleiner Anteil (ca. 2 %) im Harn, was wesentlich zur Aufrechterhaltung der Ca²⁺-Homöostase beiträgt (HOENDEROP et al. 2000 b, 2002 b). Beim Menschen ist die mit dem Urin ausgeschiedene Calcium-Menge wesentlich größer als bei anderen Tieren (GUÉGUEN u. POINTILLART 2000).

Auf physiologische Weise belasten Faktoren wie Wachstum, Trächtigkeit oder Laktation (erhöhter Bedarf), aber auch wechselnde Ca²⁺-Gehalte in der Nahrung (verändertes Angebot) die Calcium-Homöostase und erfordern eine Adaptation an veränderte Bedingungen. Möglich wird dieses über die hormonale Regulation des Blutcalciumspiegels durch Parathormon (PTH) und Calcitriol (Vitamin D-Hormon) sowie durch Calcitonin (AUDRAN u. KUMAR 1985;

JONES et al. 1998; BROWN et al. 1999).

Bereits bei einer geringgradigen Hypocalcämie sorgt die erniedrigte Plasma-Ca²⁺- Konzentration über hoch sensible „Ca²⁺-sensing“-Rezeptoren (CaR) an den Nebenschild- drüsen innerhalb weniger Sekunden für eine Sekretion von PTH (BROWN 1991; BROWN u.

MACLEOD 2001). Dieses von den Hauptzellen der Parathyreoidea gebildete Peptidhormon fördert am Knochen die Auflösung von Hydroxylapatit und führt damit zu einer verstärkten Mobilisation von Ca²⁺. In der Niere bewirkt es zum einen die erhöhte Absorption des glomerulär filtrierten Ca²⁺ und stimuliert zum anderen die Biosynthese von Calcitriol (BINDELS et al. 1991; FRIEDLANDER u. AMIEL 1994). Ein Anstieg der Plasmakonzentration dieses Steroidabkömmlings führt zu einer erhöhten intestinalen Calciumaufnahme und unterstützt, in Anwesenheit von PTH, die Resorption von Ca²⁺ in der Niere sowie seine Freisetzung aus dem Knochen (HARMEYER u. KAUNE 1988; FRIEDMAN u. GESEK 1993). Zu der Biosynthese und den Wirkungen von Calcitriol wird ferner auf Kap. 2.5 verwiesen.

Literaturübersicht

Abb. 2.1: Vergleich der Regulationsmechanismen der systemischen Ca²⁺-Homöostase bei Hypocalcämie (A) und Hypercalcämie (B). Die wichtigsten Zielorgane der Hormone (Niere, Darm, Knochen) sind schematisch dargestellt. PTH, Parathormon; CT, Calcitonin;

↑ Hochregulation, ↓ Herunterregulation, → hemmender Einfluss.

Die Freisetzung von Calcitonin aus den parafollikulären, sog. C-Zellen der Schilddrüse hingegen stellt neben einer Abnahme der PTH- und Calcitriolspiegel die Reaktion auf eine erhöhte extrazelluläre Ca²⁺-Konzentration dar. Calcitonin, wie das PTH ein Peptidhormon, unterdrückt die resorptiven Effekte von PTH am Knochen und führt zu einer vermehrten Einlagerung von Calcium in das Skelettsystem. Gleichzeitig wird die tubuläre Aufnahme von Ca²⁺ an der Niere gehemmt, sodass es zu einer gesteigerten Exkretion mit dem Harn kommt (KOVARIK 1983).

Eine Zusammenfassung der vorstehend beschriebenen Regulationsmechanismen zeigt Abbildung 2.1. Säugetieren gelingt es so, die Konzentration an freiem ionisierten Calcium im Extrazellulärraum relativ konstant zwischen 1,0 und 1,3 mmol · l^-1 zu halten (BROWN 1991).

Literaturübersicht

2.3 Intestinaler Calciumtransport

Die intestinale Ca²⁺-Absorption ist von entscheidender Bedeutung für die Ca²⁺-Homöostase der Wirbeltiere (Kap. 2.2). Mit Ausnahme kleinerer, bei Säugern bereits vor der Geburt über die Plazenta absorbierter Mengen, ist das gesamte postnatal hinzugekommene Calcium im Körper dem Organismus letzten Endes über die Nahrung zugeführt worden. Für die Ca²⁺-Aufnahme am Darm stehen dabei grundsätzlich zwei Möglichkeiten zur Verfügung: der parazelluläre und der transzelluläre Weg. Der jeweilige Beitrag zum Gesamttransport über das Epithel unter In vivo-Bedingungen ist für die verschiedenen Darmabschnitte nicht im Einzelnen bekannt. Der Ca²⁺-Transport am Darm lässt sich durch eine Vielzahl von Substanzen positiv beeinflussen. Hierzu zählen u. a. Laktose (ARMBRECHT u.

WASSERMAN1979), Östrogene (GALLAGHER et al. 1980), einige unverdauliche Kohlenhydrate (MOROHASHI et al. 1998) und natürlich Vitamin D (KAUNE et al. 1992;

HEANEY et al. 1997), welches besonders als Calcitriol (Kap. 2.2.2) die intestinale Aufnahme von Ca²⁺ stimuliert.

2.3.1 Parazellulärer Ca

-Transport

Die parazelluläre Ca²⁺-Aufnahme am Darm kann prinzipiell über den gesamten Darmtrakt erfolgen (PANSU et al. 1981), ist aber vor allem im distalen Dünndarm nachzuweisen (NELLANS 1990;BRONNER 1992). Es handelt sich dabei um einen passiven, nicht sättigbaren Prozess, welcher neben der luminalen Ca²⁺-Konzentration auch vom transepithelialen elektrischen Gradienten abhängig ist (PANSU et al. 1983 a). Die Bedeutung des parazellulären Transports für die Calciumabsorption scheint mit steigender Konzentration an freiem Ca²⁺ im Chymus zuzunehmen (WASSERMAN u. FULLMER 1983), sodass er auch im proximalen Dünndarm einen Einfluss haben kann (PANSU et al. 1983 b). Bei einem hohen Calciumgehalt in der Ration wird der Anteil des parazellulär aufgenommenen Ca²⁺ auf bis zu 50 % geschätzt (NELLANS 1988, 1990). Untersuchungen an Ratten haben gezeigt, dass diese bis zum dritten Tag post natum (p. n.) für den Ca²⁺-Transport nahezu ausschließlich den parazellulären Weg verwenden. Mit zunehmendem Lebensalter scheint diese passive Komponente allerdings abzunehmen, um ab dem 35. Lebenstag auf niedrigem Niveau zu stagnieren. Im Gegenzug dazu nimmt der aktive, sättigbare Anteil am Transport zu (PANSU et al. 1983 a, 1983 b).

Literaturübersicht

2.3.2 Transzellulärer Ca

-Transport

Im Gegensatz zur parazellulären Absorption beruht der transzelluläre Transport auf einem aktiven, sättigbaren Geschehen. Der vordere Teil des Dünndarms, besonders das Duodenum, ist der Hauptort dieses Vorgangs, der auch gegen einen elektrochemischen Gradienten erfolgen kann (PANSU et al. 1981). Die transepitheliale Ca²⁺-Aufnahme (Abb. 2.2) lässt sich dabei in einen Prozess aus mindestens drei Einzelschritten unterteilen (BRONNER et al. 1986).

Im ersten Schritt, von dem vermutet wird, dass es sich um die geschwindigkeitsbestimmende Komponente handelt, erfolgt die Aufnahme des Ca²⁺ in die Zelle (HOENDEROP et al. 1999).

Da die luminale Konzentration an freien Calciumionen auch im Schweinechymus regelmäßig im millimolaren Bereich liegt (DINTZIS et al. 1995), besteht zur intrazellulären [Ca²⁺]f ein deutlicher Konzentrationsgradient (Kap. 2.2.1). Darüber hinaus begünstigt die transmembranale Potentialdifferenz von etwa 50 mV (innen negativ) die Ca²⁺-Aufnahme, sodass dieser Vorgang keine Energie erfordert (FULLMER 1992). Aufgrund der lipophilen Eigenschaften der Zellmembran und ihrer eigenen Ladung ist es den Ca²⁺-Ionen jedoch nicht möglich, ohne weitere Transportsysteme durch diese Lipid-Doppelschicht zu gelangen. Zwei Möglichkeiten sind hierfür aufgezeigt worden: der passive Durchtritt durch spezifische Ca²⁺- Kanäle oder durch Endozytose (Abb. 2.2). Während die erste Variante bereits durch den Nachweis von zwei Transportproteinen aus der TRP-Kanalfamilie, TRPV5 und TRPV6, belegt werden konnte (Kap. 2.4), ist die zweite Möglichkeit umstritten.

Bei dem auch als „Transcaltachia“ bezeichneten Vorgang handelt es sich um einen binnen Minuten einsetzenden, stimulierenden Effekt („fast response“) von Calcitriol auf die Ca²⁺- Absorption (NEMERE et al. 1984; NEMERE u. NORMAN 1990). Auch durch andere Substanzen, wie Forskolin oder PTHrP, ließ sich dieses Phänomen auslösen (ZHOU et al. 1992). Nach bisherigen Erkenntnissen wird Calcium dabei apikal in endozytotische Vesikel aufgenommen und, nach Verschmelzen mit Lysosomen, zur basolateralen Membran transportiert, wo es durch Exozytose freigesetzt wird. Der Transport durch die Zelle soll dabei entlang der Mikrotubuli stattfinden. Für diese Theorie spricht, dass durch die Zugabe von Colchicin, welches die Assoziation der Mikrotubuli hemmt, dieser Effekt beeinflusst werden konnte (NEMERE u. NORMAN 1987, 1990; SCHRÖDER et al. 1998 a, 1998 b, 2000). Die zuvor be- schriebenen Beobachtungen waren nur an Tieren mit einem physiologischen Calcitriolstatus, nicht jedoch an Vitamin D-defizienten Tieren nachweisbar (NEMERE et al. 1984). Der genaue Mechanismus der „Transcaltachia“ ist allerdings noch weitgehend unklar.

Literaturübersicht

Der zweite Teilschritt besteht aus dem Transport des aufgenommenen Ca²⁺ durch das Zytosol.

Da freies Ca²⁺ auch innerhalb der Zelle, u. a. als Second messenger, von Bedeutung ist, muss hierbei gewährleistet sein, dass die entsprechenden Funktionen nicht beeinträchtigt werden.

Dazu wird Ca²⁺ intrazellulär an Calbindin-D gebunden (Kap. 2.2.2), welches, im Gegensatz zur Niere, im Darm von Säugetieren nur als Calbindin-D9k und nicht als Calbindin-D28k von Bedeutung zu sein scheint (DELORME et al. 1983; SCHRÖDER et al. 1996). Die genaue Art und Weise, in der Calbindin den Transport durch das Zytosol vermittelt, ist noch unbekannt.

Allerdings konnte nachgewiesen werden, dass durch dieses Protein gebundenes Ca²⁺ ca.

70-mal schneller als bei freier Diffusion durch die Zelle wandert (BRONNER et al. 1986).

Abb. 2.2: Modell des transzellulären Ca²⁺-Transports im Dünndarm. Dargestellt sind die Aufnahme über epitheliale Calciumkanäle (obere Bildhälfte) und der zytosolische Transport mittels Vesikeln (untere Bildhälfte). CBP, Calbindin-D9k; VDR, Vitamin D-Rezeptor;

PMCA, Plasmamembran-Ca²⁺-ATPase; NCX, Na⁺/Ca²⁺-Austauscher.

Literaturübersicht

Den letzten Schritt schließlich stellt die Ca²⁺-Extrusion an der basolateralen Membran dar. Im Kontrast zur apikalen Aufnahme, liegt dieser ein energieabhängiger Prozess zugrunde, da die Ausschleusung gegen einen elektrochemischen Gradienten erfolgt. Hierfür exprimieren Zellen eine ATP-verbrauchende Plasmamembran-Ca²⁺-ATPase (PMCA1b) sowie einen 3 Na⁺/Ca²⁺- Austauscher (NCX1). Beide Transportsysteme scheinen sich durch Vit. D stimulieren zu lassen (WASSERMAN et al. 1992 a, 1992 b; VAN ABEL et al. 2003), obwohl dazu teilweise widersprüchliche Ergebnisse vorliegen (VAN CORVEN et al. 1987; KAUNE et al. 1990;

VAN CROMPHAUT et al. 2001). Während davon ausgegangen wird, dass die PMCA am Enterozyten für den basolateralen Ca²⁺-Transport essentiell ist, soll der NCX im Darm, entgegen den Verhältnissen in der Niere, nur eine geringe Bedeutung haben (VAN OS 1987;

KAUNE et al. 1992; HOENDEROP et al. 2000 a).

2.4 TRP-Kanäle

2.4.1 Grundlagen und Nomenklatur

Der erste TRP-Kanal wurde bei Untersuchungen an Photorezeptoren von Drosophila melanogaster entdeckt. Eine hierbei nachgewiesene, spontan auftretende Drosophila-Mutante reagierte auf einen länger einwirkenden Lichtreiz mit einem fortschreitenden Abfall der an den Photorezeptoren abgeleiteten Spannung bis auf das Ausgangsniveau (COSENS u.

MANNING 1969). Dieses Phänomen wurde als „vorübergehendes Rezeptorpotential“ (transient receptor potential) und die Tiere kurz als trp-Mutanten bezeichnet (MINKE et al. 1975).

In der Folge wurde gezeigt, dass die beobachteten atypischen Spannungsverläufe und somit die Erschöpfung der Erregungsleistung auf eine unzureichende Versorgung an intrazellulärem Calcium zurückzuführen sind. Durch Klonieren und Sequenzieren des trp-Gens konnte schließlich geklärt werden, dass es sich bei dem TRP-Protein um einen Ca²⁺-Kanal handelt (MONTELL u. RUBIN 1989). Neben der Entdeckung des ersten, namensgebenden TRP-Kanals konnten für Drosophila zwei weitere Gene nachgewiesen werden (HARDIE u. MINKE 1992;

PHILLIPS et al. 1992; XU et al. 2000). Zusammen mit dem trp-Gen sind trpl und trp-γ u. a. für die lichtinduzierten Spannungen (light induced currents, LIC) am Photorezeptor verantwortlich (HARDIE 2001). Ausgehend von diesen Genen wurde die neue Familie der TRP-Kanäle begründet.

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Die Erforschung anderer, TRP-verwandter Gene in diversen Spezies, wie Ratte, Maus, Kaninchen, Mensch, Rind und Caenorhabditis elegans, an einer Vielzahl von Lokalisationen erforderte bald die Einführung von Subfamilien in die Klassifikationsstruktur. Im Laufe der Zeit war eine vielfältige Namensgebung entstanden, in welcher einerseits für zahlreiche Gene mehrere Bezeichnungen existierten, andererseits jedoch selbst nahe verwandte Gene Namen erhalten hatten, die in keinem Zusammenhang zueinander standen. Da außerdem Mitglieder aus verschiedenen Unterfamilien in Einzelfällen identische Namen aufwiesen, wurde eine grundlegende Neuordnung der Nomenklatur notwendig (MONTELL et al. 2002 b). Die Familie der TRP-Kanäle besteht bei den Säugetieren mittlerweile aus mindestens 21 bekannten Genen, die sich auf drei Subfamilien verteilen (CLAPHAM et al. 2003). Die Einordnung in die Unterfamilien wurde auf der Grundlage der Ergebnisse phylogenetischer Untersuchungen vorgenommen (Abb. 2.3).

Abb. 2.3: Phylogenetische Verbindung zwischen den bei Säugetieren nachgewiesenen Mitgliedern der TRP-Familie. In den Klammern sind frühere Bezeichnungen der Proteine wiedergegeben (modifiziert nach CLAPHAM et al. 2003).

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Hierbei wurden eingeführt:

a) die kanonische TRP-Unterfamilie (TRP-Canonical, TRPC), zuvor auch als short-TRPs (STRPs) bezeichnet, welche jene Proteine beinhaltet, die am nächsten mit den klassischen Drosophila-TRP-Proteinen verwandt sind,

b) die Vanilloid-Rezeptor-Unterfamilie (TRPV), früher OTRPC, nach dem osm-9-Gen von C. elegans, nun benannt nach dem ersten bei Säugetieren gefundenen Vertreter, dem Vanilloid-Rezeptor 1 (VR1), jetzt TRPV1,

und schließlich

c) die TRPM-Unterfamilie, vormals bekannt als long-TRPs (LTRPs) aufgrund des im Vergleich zu den klassischen TRP-Kanälen ungewöhnlich langen, zytosolischen N-Terminus. Die Bezeichnung TRPM leitet sich vom ersten Buchstaben des Wortes

‚Melastatin’ ab, dem früheren Namen des begründenden Kanals jener Subfamilie und dem jetzigen TRPM1.

Aufgrund der fortschreitenden Veränderung innerhalb einzelner Unterfamilien sei für die aktuelle Nomenklatur an dieser Stelle auf die „IUPHAR ion channel database“ verwiesen (CATTERALL et al. 2003).

2.4.2 Strukturelle Eigenschaften

Die ganze TRP-Familie gehört zur Überfamilie der nicht-selektiven Kationen-Kanäle. In dieser Familie finden sich ebenfalls spannungsabhängige K⁺-, Na⁺- und Ca²⁺-Kanäle, genauso wie durch zyklische Nukleotide beeinflusste (cyclic nucleotid gated, CNG) und durch Hyperpolarisation aktivierte, zyklische Nukleotidkanäle (HCN) (BENHAM et al. 2002).

Voraussagen über den Aufbau dieser Kanäle deuten auf eine sechs transmembranale Segmente (S1–S6) umfassende Struktur mit einer die Porenregion auskleidenden Schleife (re-entrant pore-lining loop) zwischen dem fünften und sechsten Transmembransegment hin (PHILLIPS et al. 1992). In dieser Region finden sich auch die am höchsten konservierten Bereiche innerhalb der ganzen TRP-Familie (Abb. 2.4 A).

Zu den wichtigen Strukturmerkmalen der TRP-Kanäle, welche in den verschiedenen Subfamilien in unterschiedlichem Umfang vertreten sind, gehören die drei bis vier meist hochkonservierten Ankyrin-Domänen (ankyrin repeats) des N-terminalen zytosolischen Endes. Dieses sind 33 Aminosäuren lange Motive, die bei vielen unterschiedlichen Proteinen

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angetroffen werden können, sodass eindeutige Aussagen über ihre Funktionen in diesen Kanälen nicht möglich sind. Bekannt ist jedoch ihre Eigenschaft, spezifische Protein-Protein- Interaktionen zu vermitteln sowie Membranproteine mit dem Zytoskelett zu verbinden (MICHAELY u. BENNETT 1993; SEDGWICK u. SMERDON 1999). Obwohl erst wenig über die Quartärstruktur der meisten TRP-Proteine bekannt ist, deutet ein Vergleich mit spannungsabhängigen K⁺-Kanälen und CNG-Kanälen auf eine Homo- oder Heterotetramerie des Gesamtkanals hin (Abb. 2.4 B), an deren Aufbau die Ankyrin-Motive möglicherweise einen wichtigen Anteil haben (BENHAM et al. 2002).

Ein weiteres Merkmal der TRP-Kanäle stellt die vor allem bei Mitgliedern der TRPC- und TRPM-Subfamilien vor dem C-terminalen Ende aufzufindende, 25 Aminosäuren lange TRP- Domäne dar, eine gleichfalls hochkonservierte Region innerhalb der TRP-Familie, deren eigentliche Funktion noch unbekannt ist (MONTELL 2001).

2.4.3 Physiologische Bedeutung

Intrazelluläres Calcium dient als Vermittler bei einer Vielzahl von physiologischen Signalprozessen. Um dieser Rolle nachkommen zu können, müssen Aufnahme und Freisetzung eng kontrolliert werden. Hierbei spielt der Inositol-Lipid-Weg (PIP2-Kaskade), welcher zu den am weitesten verbreiteten Signalübertragungsprozessen gehört, eine entscheidende Rolle.

Ausgehend von plasmamembranaler Rezeptoraktivierung kommt es über G-Protein- vermittelte Phospholipase C-(PLC-)Aktivität zu einer Spaltung von Phosphatidylinositol-4,5- bisphosphat (PIP2) in das lösliche Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) und das membrangebundene Diacylglycerol (DAG) (BERRIDGE u. IRVINE 1989). Der nachfolgende biphasische Anstieg der zytosolischen Ca²⁺-Konzentration beruht auf unterschiedlichen Vorgängen. Bei den sog. speicherabhängigen Ca²⁺-Kanälen, auch SOC-Kanäle (store operated calcium channels) genannt, vermittelt zunächst IP3 die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern. In der Folge kommt es nun zu einem Einstrom über membrangebundene Calciumkanäle, welche durch die Entleerung dieser Speicher aktiviert werden. In nicht-erregbaren Zellen, wie den Epithelien des Verdauungstraktes, stellt dieser Weg den Hauptanteil der Ca²⁺-Aufnahme dar, während in erregbaren Zellen der Einstrom in der Regel über spannungsabhängige Ca²⁺-Kanäle stattfindet (PAREKH u. PENNER 1997).

Speicherunabhängige Ca²⁺-Kanäle hingegen reagieren entweder auf den Anstieg des zytosolischen Calciums, z. B. auch durch, aber nicht aufgrund der Entleerung intrazellulärer Speicher, oder aber diese werden durch andere Signalkaskaden wie den DAG-Zweig des

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Inositol-Lipid-Weges aktiviert (PUTNEY u. MCKAY 1999). Zurzeit sind die Proteine der TRP- Familie die einzigen Inositol-vermittelten Calciumkanäle, welche sowohl speicherabhängige als auch speicherunabhängige Sensitivitäten beinhalten (MINKE u. COOK 2002).

Die Abhängigkeit ihrer Aktivierung von der PLC ist für die TRP-Proteine der Säugetiere nur eingeschränkt gegeben. Während diese für einige Kanäle, vor allem aus der TRPC-Familie, zutrifft, werden andere über Faktoren wie Hitze, Kälte oder Veränderungen des Zellvolumens aktiviert. Interessanterweise sprechen einzelne Kanäle dabei oft auf ein weites Spektrum unterschiedlichster Stimuli an (MONTELL et al. 2002 a).

Die eigentlichen Funktionsabläufe im Gewebe, an welchen die TRP-Kanäle direkt oder indirekt beteiligt sind, erweisen sich, soweit bereits bekannt, als ebenso vielfältig wie die Lokalisationen der Proteine im Körper. TRP-Kanäle sind in vielen Organen, hauptsächlich im Gehirn, aber auch in Herz, Lunge, Leber, Milz, Niere, Darm, Hoden, Prostata, Ovarien, Plazenta, Uterus und vaskulärem Gewebe nachgewiesen worden. Dabei waren sie sowohl in neuronalen Zellen als auch in endothelialen und epithelialen Zellen sowie in glatten Muskelzellen vertreten.

Während die klassischen Proteine TRP und TRPL bei der Phototransduktion von Drosophila melanogaster eine entscheidende Rolle spielen, sind z. B. TRPC2-Kanäle für die Pheromonerkennung im Vomeronasalorgan und bei der Akrosomreaktion im Spermium einiger Säugetiere von Bedeutung (LIMAN et al. 1999; JUNGNICKEL et al. 2001). Mitglieder der TRPV-Subfamilie sind beteiligt an Funktionen wie Hitze- und Schmerzperzeption (TRPV1 bis TRPV4), Osmorezeption (TRPV4) oder epithelialer Calciumaufnahme. TRPM- Proteine schließlich sind von potentieller Bedeutung bei der Regulation des Zellzyklus, für das Geschmacks- (TRPM5) oder Kälteempfinden (TRPM8) (STROTMANN et al. 2000; VOETS

u. NILIUS 2003).

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2.4.4 Besonderheiten von TRPV5 und TRPV6

Zwei Mitglieder der TRP-Familie spielen bei der Aufrechterhaltung der Ca²⁺-Homöostase (Kap. 2.2) eine herausragende Rolle. Der Nachweis eines apikal lokalisierten Ca²⁺-Kanals (ECaC) in epithelialen Zellen der Niere, des vorderen Dünndarms und der Plazenta beim Kaninchen (HOENDEROP et al. 1999) sowie eines zu 75 % homologen Calcium- Transportproteins (CaT1) in Duodenum, proximalem Jejunum, Caecum und Colon der Ratte (PENG et al. 1999) stellten bedeutende Schritte im Hinblick auf die Klärung der transzellulären Ca²⁺-Transportprozesse dar (Kap. 2.3.2).

In der Folge konnten diese Kanäle bzw. ihre Orthologa bei weiteren Spezies, u. a. bei der Maus (SUZUKI et al. 2000 a), dem Menschen (MÜLLER et al. 2000 a; PENG et al. 2000 b;

BARLEY et al. 2001) und beim Schwein (HINTERDING 2002), nachgewiesen werden. Durch die Reformation der Nomenklatur der TRP-Proteine (Kap. 2.4.1) wurden sie der Vanilloid- Rezeptor-Unterfamilie als TRPV5 (ECaC1, CaT2) bzw. TRPV6 (CaT1, ECaC2) zugeteilt (MONTELL et al. 2002 b). Im Vorfeld dieser Neuordnung war darüber hinaus in dem Protein CaT-like (CaT-L), dessen Expression in Plazenta, Pankreas, Speicheldrüsen sowie malignen Prostatatumoren beschrieben wurde, ein neuer, eng verwandter Ca²⁺-Kanal vermutet worden (WISSENBACH et al. 2001; NIEMEYER et al. 2001). Kritische Vergleiche von humanem CaT1 und CaT-L belegten jedoch, dass die Sequenzen der Proteine nahezu identisch sind und dass somit keine ausreichenden Hinweise dafür vorliegen, CaT-L als eigenständigen Kanal zu klassifizieren (GUNTHORPE et al. 2002). Im Gegensatz dazu konnte das humane TRPV5-Gen auf Chromosom 7q35, TRPV6 in unmittelbarer Nachbarschaft auf Chromosom 7q33-34 identifiziert werden. Hierdurch wurde der Nachweis erbracht, dass es sich nicht um zwei verschiedene Spleißvarianten mit identischem genetischem Hintergrund, sondern wahrscheinlich um das Produkt einer evolutionären Genduplikation handelt (MÜLLER et al. 2000 b; PENG et al. 2001 a).

Strukturelle und funktionelle Eigenschaften

Innerhalb der Vanilloid-Rezeptor-Unterfamilie der TRP-Kanäle bilden TRPV5 und TRPV6 eine eigenständige Gruppe, wie sich anhand der genetischen Verwandtschaft zeigen lässt (Abb. 2.3). Lediglich etwa 30 % Sequenzhomologie bestehen mit den ersten beiden Vertretern dieser Subfamilie (TRPV1 und TRPV2), allerdings finden sich in einigen Bereichen (besonders zwischen S5 und S6) einige hochkonservierte Abschnitte (BENHAM et al. 2002).

Daneben existieren weitere grundlegende strukturelle Gemeinsamkeiten.

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Wie bereits für die anderen Mitglieder der TRP-Familie beschrieben, sind TRPV5 und TRPV6 ebenfalls durch sechs transmembranale Domänen (S1–S6) gekennzeichnet (Abb. 2.4).

Zwischen dem fünften und sechsten Transmembransegment befindet sich eine kurze, hydrophobe Schleife (pore loop), welche im Gesamtkanal an der Bildung der Pore Anteil hat.

Im Bereich der relativ langen, zytosolischen C- bzw. N-Termini finden sich die Hauptunterschiede zwischen den beiden Proteinen. Drei (TRPV5) respektive vier (TRPV6) Ankyrin-Bindungsdomänen (Kap. 2.4.2) sind nahe dem amino-terminalen Ende lokalisiert.

Verschiedene N-Glykosylierungsstellen sowie potentielle Regionen für eine Phosphorylierung mittels Proteinkinase A bzw. C bilden weitere Strukturmerkmale dieser Kanäle.

In Analogie zu den CNG- und den spannungsabhängigen K⁺-Kanälen sind funktionale TRP- Kanäle aus vier Untereinheiten aufgebaut (GUNTHORPE et al. 2002). Erste Analysen über die Struktur der Pore weisen allerdings auf einige Unterschiede zu diesen hin (VOETS et al. 2004).

Für TRPV5 und TRPV6 konnte gezeigt werden, dass homo- und heterotetramere Komplexe durch Co-Expression einer unterschiedlichen Anzahl dieser beiden Subtypen in jedweder Permutation möglich sind. Die hierbei beobachteten Charakteristika der Mischformen stellen Übergänge zwischen den homotetrameren Strukturen dar (HOENDEROP et al. 2003 b).

Abb. 2.4: A, Modell der TRPV6-Proteinstruktur (modifiziert nach MONTELL et al. 2002 a).

Die sechs Transmembransegmente (S1–S6) und die an der Porenregion beteiligte Schleife (P) sowie die N-terminalen Ankyrin-Domänen (A) sind schematisch dargestellt. B, Vermutliche tetramere Struktur eines funktionalen Kanals aus TRPV5- bzw. TRPV6-Proteinen (nach HOENDEROP et al. 2000 b).

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Von allen bekannten TRP-Proteinen stellen TRPV5 und TRPV6 die am meisten Ca²⁺- selektiven Kanäle dieser Familie dar. Für die bei physiologischen Membranpotentialen regelmäßig offenen Kanäle konnten PCa/PNa-Permeabilitätsverhältnisse von ungefähr 107 (TRPV5, VENNEKENS et al. 2000) bzw. etwa 130 (TRPV6, YUE et al. 2001) errechnet werden.

Die ungleiche Spezifität der beiden Transporter wird sowohl zwischen Proteinen als auch zwischen den verschiedenen Spezies an unterschiedlichen Km-Werten in der Literatur deutlich. Für TRPV5 wurden Werte von 0,2 mmol · l^-1 (HOENDEROP et al. 1999) bis 0,66 mmol · l^-1 (PENG et al. 2000 a), für TRPV6 von 0,25 mmol · l^-1 (PENG et al. 2000 b) bis 0,44 mmol · l^-1 (PENG et al. 1999) beschrieben. Den deutlichsten kinetischen Unterschied zeigen die beiden Kanal-Proteine in ihrer Inaktivierung bei negativen Membranpotentialen durch extrazellulären Ca²⁺- bzw. Ba²⁺-Einstrom (HOENDEROP et al. 2001; NILIUS et al. 2002).

In Abwesenheit zweiwertiger, extrazellulärer Kationen allerdings werden TRPV5 und TRPV6, wie alle anderen Ca²⁺-selektiven Kanäle, für monovalente Kationen permeabel.

Hierbei zeigen beide ein Phänomen, welches als „anomalous mole-fraction behaviour“

bekannt ist (VENNEKENS et al. 2000; YUE et al. 2001). Die beschriebenen sowie weitere funktionelle Eigenschaften veranlassten einige Autoren dazu, besonders im TRPV6-Protein eine molekulare Grundlage für den CRAC-Kanal zu vermuten (YUE et al. 2001). Durch diesen, auf DNA-Basis noch nicht geklärten Kanal wird ein Ca²⁺-Einstrom in die Zelle (ICRAC, Ca²⁺ release-activated Ca²⁺ current) durch die Entleerung intrazellulärer Ca²⁺-Speicher induziert (PAREKH u. PENNER 1997). Im Anschluss durchgeführte, genauere Untersuchungen sprechen mittlerweile eher gegen diese Theorie, können allerdings eine mögliche Beteiligung von TRPV6 nicht ausschließen (VOETS et al. 2001, 2003; SCHINDL et al. 2002;

CLAPHAM 2002; BÖDDING et al. 2002, 2003; ABEELE et al. 2003; KAHR et al. 2004).

Regulation und Beeinflussbarkeit

Die Regulation der beiden TRPV-Kanäle scheint durch mehrere Faktoren möglich zu sein.

Eine Co-Expression beider Kanäle mit den Ca²⁺-Transportproteinen Calbindin-D9k und Calbindin-D28k, der Plasmamembran-Ca²⁺-ATPase (PMCA) und dem Na⁺-Ca²⁺-Austauscher (NCX) sowie der Nachweis Vit. D-abhängiger Elemente (VDRE) in der Promotorregion von TRPV5 deuten auf eine Regulation durch Vitamin D hin (HOENDEROP et al. 1999, 2000 a;

MÜLLER et al. 2000 a, 2000 b). Verschiedene Caco-2-Zelllinien zeigten nach Inkubation mit 1,25-Dihydroxycholecalciferol [1,25(OH)2D3] einen deutlichen Anstieg der TRPV6-mRNA (WOOD et al. 2001; FLEET et al. 2002). Der Einfluss von Calcitriol auf die beiden Kanalproteine wird jedoch unterschiedlich diskutiert. Einige Berichte lassen vermuten, dass

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TRPV6 am Darm Vit. D3-unabhängig exprimiert wird (PENG et al. 1999; BARLEY et al. 2001).

WEBER et al. (2001) schlossen aus Untersuchungen an Mäusen mit einem mutierten, inaktiven Vit. D-Rezeptor (VDR), dass sowohl TRPV5 in der Niere als auch TRPV6 an Niere und Darm nicht durch 1,25(OH)2D3, sondern vielmehr durch extrazelluläres Calcium reguliert werden. Studien an VDR knockout (KO) Mäusen auf mRNA-Ebene zeigten auf der einen Seite eine Reduktion von TRPV5 und TRPV6 im Darm, während die Gehalte in der Niere unverändert waren. Auf der anderen Seite ließen sich die mRNA-Mengen der Kanäle bei normalen Tieren (Wildtyp, WT) an beiden Lokalisationen durch Calcitriolbehandlung erhöhen (VAN CROMPHAUT et al. 2001). SONG et al. (2003 a) konnten bei VDR-KO Mäusen ebenfalls eine Abnahme der mRNA-Gehalte am Darm, jedoch gleichzeitig einen Anstieg in der Niere beobachten. Bei beiden Autoren führte ein vermehrtes Ca²⁺-Angebot in der Ration zu einem weiteren Absinken der mRNA im Darm, sowohl bei KO- als auch bei WT-Tieren.

HOENDEROP et al. (2002 a) stellten an 25-Hydroxyvitamin D3-1α-Hydroxylase (1α-OHase) knockout Mäusen fest, dass eine Ca²⁺-reiche Ernährung die reduzierten mRNA- und Protein- Mengen von TRPV5 in der Niere wiederherzustellen vermochte, während diese Diät in WT- Tieren zu einer Verminderung der genannten Merkmale führte. Weitere Analysen wiesen bei identischer Fütterung auf einen Anstieg der gleichfalls verringerten TRPV6-mRNA- Expression im Duodenum von KO-Mäusen hin (VAN ABEL et al. 2003). Dieser Anstieg ließ sich in beiden Versuchen bei normaler Ca²⁺-Versorgung wesentlich deutlicher durch Injektionen von 1,25(OH)2D3 induzieren, sowohl bei KO-Mäusen für TRPV5 und TRPV6 am Darm als auch bei KO- und WT-Tieren für TRPV5 in der Niere. TENENHOUSE et al. (2002) berichteten für Na/Pi-Co-Transporter-Gen (Npt2) KO-Mäuse, welche neben einer Hypophosphatämie eine erhöhte 1,25(OH)2D3-Konzentration im Blut, Hypercalcämie sowie Hypercalciurie aufwiesen, parallel mit einer gesteigerten Ca²⁺-Absorption, über eine vermehrte mRNA-Expression von TRPV5 und TRPV6 im Duodenum. Vergleichend untersuchte Mäuse mit einer X-chromosomal-vererbten Hypophosphatämie (Hyp) zeigten demgegenüber bei erniedrigten 1,25(OH)2D3-Serumgehalten eine Hypocalcämie sowie verringerte duodenale Ca²⁺-Absorption und mRNA-Mengen. Die Entwicklung eines TRPV5- KO-Stammes ermöglichte schließlich weitere Forschung zur Bedeutung dieses Kanals. Die betroffenen Mäuse wiesen eine schwere Hypercalciurie sowie deutlich erhöhte Calcitriol- spiegel bei normalem Ca²⁺-Gehalt im Serum auf. Die vermutlich kompensatorisch gesteigerte enterale Calciumabsorption lässt sich dabei möglicherweise durch das erhöhte TRPV6-Niveau auf mRNA- und Proteinebene im Duodenum erklären (HOENDEROP et al. 2003 a).

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Eine Behandlung mit 17β-Estradiol bewirkte bei Ratten, welche nach Ovariektomie zunächst unveränderte mRNA-Gehalte gezeigt hatten, eine erhöhte mRNA-Expression von TPRV5 und TRPV6 im Duodenum sowie TRPV5 in der Niere. Vergleiche mit männlichen 1α-OHase KO- Mäusen legten durch analoge Stimulation von TRPV5 in der Niere und TRPV6 im Darm nahe, dass es sich hierbei um einen 1,25(OH)2D3-unabhängigen Effekt von Östrogenen handelt (VAN ABEL et al. 2002, 2003). Studien an anderen Mäusen hatten zuvor zwar ein östrogenabhängiges Element (ERE) in der Promotorsequenz von TRPV6 entdeckt, allerdings führte die Injektion von 17β-Estradiol in ovariektomierten Tieren weder im Darm noch in der Niere zu einer Veränderung der mRNA-Mengen von TRPV6 (WEBER et al. 2001).

Zusammenfassend deuten die bisher gewonnen Daten darauf hin, dass TRPV5 und TRPV6 durch Calcitriol in ihrer Expression am Darm beeinflusst werden.

In ihrer Aktivität werden TRPV5 und TRPV6 durch die Anwesenheit von intrazellulärem ATP und Mg²⁺ beeinflusst. Während ATP notwendig zu sein scheint, um eine stabile Kanalaktivität aufrechtzuerhalten, führen steigende intrazelluläre Mg²⁺-Konzentrationen, besonders in Abwesenheit von ATP, zu einer beschleunigten Blockade monovalenter Kationenströme in transfizierten HEK293-Zellen (HOENDEROP et al. 2001).

Auch der extrazelluläre pH-Wert ist für die Funktion der beiden Proteine von Bedeutung.

Hierbei nimmt der Ca²⁺-Einstrom, durch sinkende Affinitäten der Kanäle, bei erniedrigtem pH-Wert deutlich ab (HOENDEROP et al. 1999; PENG et al. 1999; VENNEKENS et al. 2001 a).

Eine Konformationsänderung des Kanals durch extrazelluläre Protonen scheint hierfür verantwortlich zu sein (YEH et al. 2003). Dieser Effekt könnte eine Grundlage für den in vivo beobachteten Anstieg der Ca²⁺-Exkretion im Harn bei metabolischer und respiratorischer Azidose darstellen (SUTTON et al. 1979; CANZANELLO et al. 1990).

Ferner scheint ein Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration, welcher gleichzeitig den Calciumgehalt in einer Mikrodomäne nahe der Porenregion erhöht, in Form eines negativen Feedbackmechanismus die Calciumaufnahme zu behindern (VENNEKENS et al. 2000;

HOENDEROP et al. 2001, 2002 b). Für TRPV5 konnte gezeigt werden, dass Sequenzen des Carboxyl-Endes hieran Anteil haben (NILIUS et al. 2003). Das Proteinkinase C-Substrat 80K-H scheint dabei als Ca²⁺-Sensor zu fungieren (GKIKA et al. 2004). Ein mehrstufiger Mechanismus, unter Bindung des Ca²⁺-regulativen Proteins Calmodulin, wurde für TRPV6 beschrieben (NIEMEYER et al. 2001).

Sowohl TRPV5 als auch TRPV6 lassen sich u. a. durch Ruthenium Rot (RR) und durch hohe extrazelluläre Mg²⁺-Konzentrationen hemmen. Auffällig ist hierbei, dass TRPV6 eine 100fach

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geringere Affinität für RR aufweist (IC50, TRPV6 ≈ 10 µmol · l^-1, IC50, TRPV5 ≈ 120 nmol · l^-1), wodurch eine Unterscheidung pharmakologisch möglich wird (VENNEKENS et al. 2001 b;

NILIUS et al. 2001; HOENDEROP et al. 2001).

Expression im Organismus

Zahlreiche Untersuchungen haben mittlerweile die Kenntnisse über das Vorkommen der beiden Kanäle in verschiedenen Geweben erweitert. So wurde TRPV5 beispielsweise im distalen Tubulus der Niere, in Plazenta, Duodenum und Jejunum (HOENDEROP et al. 1999), in Pankreas, Hoden, Prostata, Gehirn, Colon und Rektum (MÜLLER et al. 2000 a) sowie in Knochen, Magen, Caecum, Leber, Herz und Milz nachgewiesen (NIJENHUIS et al. 2003). Die Beschreibung von TRPV6 beinhaltet neben dem Duodenum und Jejunum auch Magen, Plazenta, Pankreas, Hoden und Prostata (HOENDEROP et al. 2001), Speicheldrüsen, Caecum und Colon (PENG et al. 1999, 2000 b), Gehirn, Lunge, Knochen, Herz, Skelettmuskel (NIJENHUIS et al. 2003) sowie die Brust- und Schweißdrüsen (ZHUANG et al. 2002).

Hervorgehoben sei an dieser Stelle allerdings, dass die Expressionsmuster beider Kanäle den unterschiedlichen Anforderungen entsprechend speziesspezifisch variieren. Über den Nachweis von TRPV6 in der Niere ist sowohl für den dicken, aufsteigenden Teil der Henleschen Schleife als auch für den distalen Tubulus berichtet worden (SUZUKI et al. 2000 a;

HOENDEROP et al. 2003 b). Auf mRNA-Ebene scheint TRPV6 stärker in der äußeren Medulla präsent zu sein, während TRPV5 vorwiegend im Nierencortex exprimiert wird (PENG et al. 2003). Auch in diversen humanen Tumorgeweben, u. a. in Brustdrüse, Ovar, Colon, Schilddrüse und Prostata, konnte mit steigender Malignität eine zunehmende TRPV6-Expression festgestellt werden (WISSENBACH et al. 2001; PENG et al. 2001 b;

ZHUANG et al. 2002), sodass diesem Protein als prognostischem Tumormarker möglicher- weise in Zukunft eine Bedeutung zukommen wird (FIXEMER et al. 2003).

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2.5 Vitamin D

2.5.1 Grundlagen

Die Entdeckung des Vitamin D ist eng verknüpft mit der Erforschung der Rachitis- Erkrankung, die zu Beginn des 20. Jahrhunderts bedeutende Fortschritte machte.

MCCOLLUM et al. (1922) konnten zeigen, dass Lebertran eine von Vitamin A verschiedene fettlösliche Substanz enthält, welche in der Lage ist, die Rachitis zu heilen. Diese Substanz wurde daraufhin als „Vitamin D“ bezeichnet. In der Folge konnten, neben der Aufklärung seiner Struktur als Steroidabkömmling, das ähnliche Ergocalciferol in pflanzlicher Nahrung nachgewiesen werden, das fortan als Vitamin D2, und das Cholecalciferol aus dem tierischen Organismus, welches als Vitamin D3 bezeichnet wurde (DELUCA 1982). Zur effizienten Regulation der Ca²⁺-Homöostase spielt Vit. D nicht nur bei höheren Tieren, sondern auch bei Amphibien eine Rolle (BRUCE u. PARKES 1950).

Nähere Erkenntnisse über die Metabolisierung von Vit. D sowie die Fähigkeit des Organismus zur Eigensynthese lassen mittlerweile den Begriff „Vitamin“ als nicht mehr ganz korrekt erscheinen. Dieser Ausdruck bestimmt „organische Verbindungen, die der Körper bei der üblichen Fütterung nicht bzw. nicht in ausreichendem Maße bildet und die daher mit dem Futter zugeführt werden müssen“ (WIESNER u. RIBBECK 2000). DELUCA (1982) schlägt demgegenüber den Begriff „Prohormon“ vor. Allerdings besteht mit Vitaminen insofern eine Ähnlichkeit als beispielsweise Menschen, welche, z. B. aufgrund ihrer Bekleidung, des Aufenthalts in Gebäuden, des Breitengrades gekoppelt mit ungünstiger Jahreszeit, nicht die notwendige Dosis an ultravioletter (UV) Strahlung erhalten, auf eine exogene Zufuhr angewiesen sind. Trotzdem sind heute, mehr als 80 Jahre nach Entdeckung des Vitamin D, weiterhin viele Fragen im Zusammenhang mit dieser Substanz ungeklärt (HEANEY 1999).

2.5.2 Nomenklatur und Biotransformation

Um im Organismus zu wirken, kann Vitamin D, als Vit. D2 (Ergocalciferol) bzw. Vit. D3

(Cholecalciferol, Calciol), entweder über die Nahrung aufgenommen oder aber im Körper synthetisiert werden. Hierbei entsteht durch UV-Bestrahlung in der Haut aus 7-Dehydrocholesterol Cholecalciferol. Diese Substanz wurde lange Zeit als biologisch aktive Form angesehen, bis Metaboliten mit einer größeren antirachitischen Aktivität entdeckt worden sind (BROWN et al. 1999). Vitamin D3 selbst zirkuliert nicht lange im Blut, sondern

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wird im Fettgewebe gespeichert oder, hauptsächlich in den Hepatozyten, zu 25-Hydroxy- cholecalciferol (Calcidiol) umgewandelt (BLUNT et al. 1968; PONCHON et al. 1969). Calcidiol zeigt eine hohe Affinität zum Vitamin D-Bindungsprotein (DBP) und bildet in der Blutbahn den Hauptmetaboliten. Eine Aktivierung zu 1α,25-Dihydroxycholecalciferol (Calcitriol, Vit. D-Hormon) durch die renale 25-Hydroxyvitamin D-1α-Hydroxylase (CYP1α, CYP27B1) schließt sich an (FRASER u. KODICEK 1970; LAWSON et al. 1971). Calcitriol stellt den aktivsten Metaboliten des Vit. D3 im Körper dar. Die Halbwertszeit allerdings ist nur gering, da diese Substanz die 1α-Hydroxylase auf noch ungeklärte Weise inhibiert und seine eigene Inaktivierung durch Induktion der 25-Hydroxyvitamin D-24-Hydroxylase (CYP24) stimuliert (DELUCA 1982; YOSHIDA et al. 1999; BRENZA u. DELUCA 2000). Schon nach kurzer Zeit kommt es durch 24-Hydroxylierung in der Niere und den Zielgeweben zu einer Degradation des Hormons. Auch ein direkter Abbau des Calcidiols ist auf diesem Weg möglich, allerdings zieht das Enzym Calcitriol als Substrat dem Calcidiol vor (JONES et al. 1998). Weitere Oxidationsschritte mit stetig fortschreitendem Verlust der Wirkung führen schließlich zu einem biologisch inerten Endprodukt (BROWN et al. 1999).

Von den beschriebenen, Cytochrom-P-450-abhängigen Enzymen scheint die Regulation für die 25-Hydroxylasen der Leber (CYP27) nur schwach ausgebildet zu sein, während sich diese für die Synthese und Degradation von Calcitriol wesentlich enger zeigt, was die Bedeutung jenes Cholecalciferol-Abkömmlings unterstreicht (JONES et al. 1998). Es ist mittlerweile eine Vielzahl anderer Metaboliten des Vitamin D bekannt, jedoch stellen die vorgenannten zum jetzigen Zeitpunkt die wichtigsten Formen im Organismus dar.

Um bei den unterschiedlichen Molekulargewichten von Vit. D2, Vit. D3 und ihren verschiedenen Metaboliten eine Vergleichbarkeit zu gewährleisten, wurde empfohlen, die Definition einer Internationalen Einheit (I. E.) Vitamin D mit 0,025 µg ausschließlich auf eine Menge von 65,0 pmol Vit. D3 zu beziehen (NORMAN 1972).

Abweichend von der vorgeschlagenen Nomenklatur werden in der vorliegenden Arbeit Calcidiol bzw. Calcitriol durch 25-OHD3 resp. 1,25(OH)2D3 abgekürzt, da diese oder ähnliche Formen in der internationalen Literatur stark verbreitet und weitgehend akzeptiert sind (LIÉBECQ 1992).

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2.5.3 Aufgabe und Wirkung

Die meisten biologischen Wirkungen von Vitamin D werden durch Bindung an einen spezialisierten, vorwiegend kernständigen Vit. D-Rezeptor (VDR) vermittelt. Dieser fungiert als ligandenaktivierter Transkriptionsfaktor, welcher sich, nach Bildung eines Heterodimers mit dem Retinoid X Rezeptor (RXR), Vitamin D-abhängigen Elementen (VDRE) im Genom anlagert. Unter Rekrutierung weiterer Co-Aktivatoren kann so die Transkription eingeleitet werden (MALLOY et al. 1999). Obwohl auch andere Metaboliten des Vit. D3 an den VDR binden können, ist Calcitriol hierbei in seiner Wirkung deutlich überlegen (KAUNE et al. 1990;

BROWN et al. 1991). Neben einer Aktivierung der mRNA-Transkription wird die Expression einiger Gene, z. B. PTH, durch Vitamin D gehemmt. Der zugrunde liegende Mechanismus ist hierbei noch nicht vollständig geklärt (JONES et al. 1998).

Die beschriebene Aktivierung einzelner Gene nimmt verhältnismäßig viel Zeit in Anspruch.

Während erste Unterschiede auf mRNA-Ebene frühestens nach einer Stunde zu beobachten sind, ist für die Proteinsynthese weitaus mehr Zeit notwendig. Produktion und Einbau ausreichender Mengen sowie die daraus resultierenden Effekte auf den Gesamtorganismus sind normalerweise erst nach Stunden oder Tagen zu registrieren. Demgegenüber tritt ein Teil der Vit. D-Wirkungen, wie eine schnelle Aufnahme von Ca²⁺ aus dem Extrazellulärraum oder die direkte Aktivierung von Enzymen und Second-messenger-Kaskaden, wesentlich früher ein. Diese kurze Reaktionszeit von oft nur Sekunden bis Minuten ist deshalb auf nicht- genomische Wirkungen des Hormons, möglicherweise über membranständige Rezeptoren, zurückzuführen (NORMAN et al. 1992; LÖSEL et al. 2003).

Neben den klassischen Zielorganen Darm, Niere, Knochen und Nebenschilddrüse (Kap. 2.2.2) sind weitere Vit. D-Effekte in einer Vielzahl von Organen beschrieben worden. Hierzu gehören u. a. die antiproliferative, prodifferenzierende Wirkung in Haut, Muskel, Knorpel und Zellen des blutbildenden Gewebes. Ferner fördert Vitamin D das Nervenwachstum sowie die neuronale Regeneration im Gehirn und hat darüber hinaus Einfluss auf verschiedene Vorgänge im Zusammenhang mit Immunabwehr und Fertilität (BROWN et al. 1991).