Besonderheiten von TRPV5 und TRPV6

Zwei Mitglieder der TRP-Familie spielen bei der Aufrechterhaltung der Ca²⁺-Homöostase (Kap. 2.2) eine herausragende Rolle. Der Nachweis eines apikal lokalisierten Ca²⁺-Kanals (ECaC) in epithelialen Zellen der Niere, des vorderen Dünndarms und der Plazenta beim Kaninchen (HOENDEROP et al. 1999) sowie eines zu 75 % homologen Calcium-Transportproteins (CaT1) in Duodenum, proximalem Jejunum, Caecum und Colon der Ratte (PENG et al. 1999) stellten bedeutende Schritte im Hinblick auf die Klärung der transzellulären Ca²⁺-Transportprozesse dar (Kap. 2.3.2).

In der Folge konnten diese Kanäle bzw. ihre Orthologa bei weiteren Spezies, u. a. bei der Maus (SUZUKI et al. 2000 a), dem Menschen (MÜLLER et al. 2000 a; PENG et al. 2000 b;

BARLEY et al. 2001) und beim Schwein (HINTERDING 2002), nachgewiesen werden. Durch die Reformation der Nomenklatur der TRP-Proteine (Kap. 2.4.1) wurden sie der Vanilloid-Rezeptor-Unterfamilie als TRPV5 (ECaC1, CaT2) bzw. TRPV6 (CaT1, ECaC2) zugeteilt (MONTELL et al. 2002 b). Im Vorfeld dieser Neuordnung war darüber hinaus in dem Protein CaT-like (CaT-L), dessen Expression in Plazenta, Pankreas, Speicheldrüsen sowie malignen Prostatatumoren beschrieben wurde, ein neuer, eng verwandter Ca²⁺-Kanal vermutet worden (WISSENBACH et al. 2001; NIEMEYER et al. 2001). Kritische Vergleiche von humanem CaT1 und CaT-L belegten jedoch, dass die Sequenzen der Proteine nahezu identisch sind und dass somit keine ausreichenden Hinweise dafür vorliegen, CaT-L als eigenständigen Kanal zu klassifizieren (GUNTHORPE et al. 2002). Im Gegensatz dazu konnte das humane TRPV5-Gen auf Chromosom 7q35, TRPV6 in unmittelbarer Nachbarschaft auf Chromosom 7q33-34 identifiziert werden. Hierdurch wurde der Nachweis erbracht, dass es sich nicht um zwei verschiedene Spleißvarianten mit identischem genetischem Hintergrund, sondern wahrscheinlich um das Produkt einer evolutionären Genduplikation handelt (MÜLLER et al. 2000 b; PENG et al. 2001 a).

Strukturelle und funktionelle Eigenschaften

Innerhalb der Vanilloid-Rezeptor-Unterfamilie der TRP-Kanäle bilden TRPV5 und TRPV6 eine eigenständige Gruppe, wie sich anhand der genetischen Verwandtschaft zeigen lässt (Abb. 2.3). Lediglich etwa 30 % Sequenzhomologie bestehen mit den ersten beiden Vertretern dieser Subfamilie (TRPV1 und TRPV2), allerdings finden sich in einigen Bereichen (besonders zwischen S5 und S6) einige hochkonservierte Abschnitte (BENHAM et al. 2002).

Daneben existieren weitere grundlegende strukturelle Gemeinsamkeiten.

Literaturübersicht

Wie bereits für die anderen Mitglieder der TRP-Familie beschrieben, sind TRPV5 und TRPV6 ebenfalls durch sechs transmembranale Domänen (S1–S6) gekennzeichnet (Abb. 2.4).

Zwischen dem fünften und sechsten Transmembransegment befindet sich eine kurze, hydrophobe Schleife (pore loop), welche im Gesamtkanal an der Bildung der Pore Anteil hat.

Im Bereich der relativ langen, zytosolischen C- bzw. N-Termini finden sich die Hauptunterschiede zwischen den beiden Proteinen. Drei (TRPV5) respektive vier (TRPV6) Ankyrin-Bindungsdomänen (Kap. 2.4.2) sind nahe dem amino-terminalen Ende lokalisiert.

Verschiedene N-Glykosylierungsstellen sowie potentielle Regionen für eine Phosphorylierung mittels Proteinkinase A bzw. C bilden weitere Strukturmerkmale dieser Kanäle.

In Analogie zu den CNG- und den spannungsabhängigen K⁺-Kanälen sind funktionale TRP-Kanäle aus vier Untereinheiten aufgebaut (GUNTHORPE et al. 2002). Erste Analysen über die Struktur der Pore weisen allerdings auf einige Unterschiede zu diesen hin (VOETS et al. 2004).

Für TRPV5 und TRPV6 konnte gezeigt werden, dass homo- und heterotetramere Komplexe durch Co-Expression einer unterschiedlichen Anzahl dieser beiden Subtypen in jedweder Permutation möglich sind. Die hierbei beobachteten Charakteristika der Mischformen stellen Übergänge zwischen den homotetrameren Strukturen dar (HOENDEROP et al. 2003 b).

Abb. 2.4: A, Modell der TRPV6-Proteinstruktur (modifiziert nach MONTELL et al. 2002 a).

Die sechs Transmembransegmente (S1–S6) und die an der Porenregion beteiligte Schleife (P) sowie die N-terminalen Ankyrin-Domänen (A) sind schematisch dargestellt. B, Vermutliche tetramere Struktur eines funktionalen Kanals aus TRPV5- bzw. TRPV6-Proteinen (nach HOENDEROP et al. 2000 b).

Literaturübersicht

Von allen bekannten TRP-Proteinen stellen TRPV5 und TRPV6 die am meisten Ca²⁺ -selektiven Kanäle dieser Familie dar. Für die bei physiologischen Membranpotentialen regelmäßig offenen Kanäle konnten PCa/PNa-Permeabilitätsverhältnisse von ungefähr 107 (TRPV5, VENNEKENS et al. 2000) bzw. etwa 130 (TRPV6, YUE et al. 2001) errechnet werden.

Die ungleiche Spezifität der beiden Transporter wird sowohl zwischen Proteinen als auch zwischen den verschiedenen Spezies an unterschiedlichen Km-Werten in der Literatur deutlich. Für TRPV5 wurden Werte von 0,2 mmol · l^-1 (HOENDEROP et al. 1999) bis 0,66 mmol · l^-1 (PENG et al. 2000 a), für TRPV6 von 0,25 mmol · l^-1 (PENG et al. 2000 b) bis 0,44 mmol · l^-1 (PENG et al. 1999) beschrieben. Den deutlichsten kinetischen Unterschied zeigen die beiden Kanal-Proteine in ihrer Inaktivierung bei negativen Membranpotentialen durch extrazellulären Ca²⁺- bzw. Ba²⁺-Einstrom (HOENDEROP et al. 2001; NILIUS et al. 2002).

In Abwesenheit zweiwertiger, extrazellulärer Kationen allerdings werden TRPV5 und TRPV6, wie alle anderen Ca²⁺-selektiven Kanäle, für monovalente Kationen permeabel.

Hierbei zeigen beide ein Phänomen, welches als „anomalous mole-fraction behaviour“

bekannt ist (VENNEKENS et al. 2000; YUE et al. 2001). Die beschriebenen sowie weitere funktionelle Eigenschaften veranlassten einige Autoren dazu, besonders im TRPV6-Protein eine molekulare Grundlage für den CRAC-Kanal zu vermuten (YUE et al. 2001). Durch diesen, auf DNA-Basis noch nicht geklärten Kanal wird ein Ca²⁺-Einstrom in die Zelle (ICRAC, Ca²⁺ release-activated Ca²⁺ current) durch die Entleerung intrazellulärer Ca²⁺-Speicher induziert (PAREKH u. PENNER 1997). Im Anschluss durchgeführte, genauere Untersuchungen sprechen mittlerweile eher gegen diese Theorie, können allerdings eine mögliche Beteiligung von TRPV6 nicht ausschließen (VOETS et al. 2001, 2003; SCHINDL et al. 2002;

CLAPHAM 2002; BÖDDING et al. 2002, 2003; ABEELE et al. 2003; KAHR et al. 2004).

Regulation und Beeinflussbarkeit

Die Regulation der beiden TRPV-Kanäle scheint durch mehrere Faktoren möglich zu sein.

Eine Co-Expression beider Kanäle mit den Ca²⁺-Transportproteinen Calbindin-D9k und Calbindin-D28k, der Plasmamembran-Ca²⁺-ATPase (PMCA) und dem Na⁺-Ca²⁺-Austauscher (NCX) sowie der Nachweis Vit. D-abhängiger Elemente (VDRE) in der Promotorregion von TRPV5 deuten auf eine Regulation durch Vitamin D hin (HOENDEROP et al. 1999, 2000 a;

MÜLLER et al. 2000 a, 2000 b). Verschiedene Caco-2-Zelllinien zeigten nach Inkubation mit 1,25-Dihydroxycholecalciferol [1,25(OH)2D3] einen deutlichen Anstieg der TRPV6-mRNA (WOOD et al. 2001; FLEET et al. 2002). Der Einfluss von Calcitriol auf die beiden Kanalproteine wird jedoch unterschiedlich diskutiert. Einige Berichte lassen vermuten, dass

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TRPV6 am Darm Vit. D3-unabhängig exprimiert wird (PENG et al. 1999; BARLEY et al. 2001).

WEBER et al. (2001) schlossen aus Untersuchungen an Mäusen mit einem mutierten, inaktiven Vit. D-Rezeptor (VDR), dass sowohl TRPV5 in der Niere als auch TRPV6 an Niere und Darm nicht durch 1,25(OH)2D3, sondern vielmehr durch extrazelluläres Calcium reguliert werden. Studien an VDR knockout (KO) Mäusen auf mRNA-Ebene zeigten auf der einen Seite eine Reduktion von TRPV5 und TRPV6 im Darm, während die Gehalte in der Niere unverändert waren. Auf der anderen Seite ließen sich die mRNA-Mengen der Kanäle bei normalen Tieren (Wildtyp, WT) an beiden Lokalisationen durch Calcitriolbehandlung erhöhen (VAN CROMPHAUT et al. 2001). SONG et al. (2003 a) konnten bei VDR-KO Mäusen ebenfalls eine Abnahme der mRNA-Gehalte am Darm, jedoch gleichzeitig einen Anstieg in der Niere beobachten. Bei beiden Autoren führte ein vermehrtes Ca²⁺-Angebot in der Ration zu einem weiteren Absinken der mRNA im Darm, sowohl bei KO- als auch bei WT-Tieren.

HOENDEROP et al. (2002 a) stellten an 25-Hydroxyvitamin D3-1α-Hydroxylase (1α-OHase) knockout Mäusen fest, dass eine Ca²⁺-reiche Ernährung die reduzierten mRNA- und Protein-Mengen von TRPV5 in der Niere wiederherzustellen vermochte, während diese Diät in WT-Tieren zu einer Verminderung der genannten Merkmale führte. Weitere Analysen wiesen bei identischer Fütterung auf einen Anstieg der gleichfalls verringerten TRPV6-mRNA-Expression im Duodenum von KO-Mäusen hin (VAN ABEL et al. 2003). Dieser Anstieg ließ sich in beiden Versuchen bei normaler Ca²⁺-Versorgung wesentlich deutlicher durch Injektionen von 1,25(OH)2D3 induzieren, sowohl bei KO-Mäusen für TRPV5 und TRPV6 am Darm als auch bei KO- und WT-Tieren für TRPV5 in der Niere. TENENHOUSE et al. (2002) berichteten für Na/Pi-Co-Transporter-Gen (Npt2) KO-Mäuse, welche neben einer Hypophosphatämie eine erhöhte 1,25(OH)2D3-Konzentration im Blut, Hypercalcämie sowie Hypercalciurie aufwiesen, parallel mit einer gesteigerten Ca²⁺-Absorption, über eine vermehrte mRNA-Expression von TRPV5 und TRPV6 im Duodenum. Vergleichend untersuchte Mäuse mit einer X-chromosomal-vererbten Hypophosphatämie (Hyp) zeigten demgegenüber bei erniedrigten 1,25(OH)2D3-Serumgehalten eine Hypocalcämie sowie verringerte duodenale Ca²⁺-Absorption und mRNA-Mengen. Die Entwicklung eines TRPV5-KO-Stammes ermöglichte schließlich weitere Forschung zur Bedeutung dieses Kanals. Die betroffenen Mäuse wiesen eine schwere Hypercalciurie sowie deutlich erhöhte Calcitriol-spiegel bei normalem Ca²⁺-Gehalt im Serum auf. Die vermutlich kompensatorisch gesteigerte enterale Calciumabsorption lässt sich dabei möglicherweise durch das erhöhte TRPV6-Niveau auf mRNA- und Proteinebene im Duodenum erklären (HOENDEROP et al. 2003 a).

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Eine Behandlung mit 17β-Estradiol bewirkte bei Ratten, welche nach Ovariektomie zunächst unveränderte mRNA-Gehalte gezeigt hatten, eine erhöhte mRNA-Expression von TPRV5 und TRPV6 im Duodenum sowie TRPV5 in der Niere. Vergleiche mit männlichen 1α-OHase KO-Mäusen legten durch analoge Stimulation von TRPV5 in der Niere und TRPV6 im Darm nahe, dass es sich hierbei um einen 1,25(OH)2D3-unabhängigen Effekt von Östrogenen handelt (VAN ABEL et al. 2002, 2003). Studien an anderen Mäusen hatten zuvor zwar ein östrogenabhängiges Element (ERE) in der Promotorsequenz von TRPV6 entdeckt, allerdings führte die Injektion von 17β-Estradiol in ovariektomierten Tieren weder im Darm noch in der Niere zu einer Veränderung der mRNA-Mengen von TRPV6 (WEBER et al. 2001).

Zusammenfassend deuten die bisher gewonnen Daten darauf hin, dass TRPV5 und TRPV6 durch Calcitriol in ihrer Expression am Darm beeinflusst werden.

In ihrer Aktivität werden TRPV5 und TRPV6 durch die Anwesenheit von intrazellulärem ATP und Mg²⁺ beeinflusst. Während ATP notwendig zu sein scheint, um eine stabile Kanalaktivität aufrechtzuerhalten, führen steigende intrazelluläre Mg²⁺-Konzentrationen, besonders in Abwesenheit von ATP, zu einer beschleunigten Blockade monovalenter Kationenströme in transfizierten HEK293-Zellen (HOENDEROP et al. 2001).

Auch der extrazelluläre pH-Wert ist für die Funktion der beiden Proteine von Bedeutung.

Hierbei nimmt der Ca²⁺-Einstrom, durch sinkende Affinitäten der Kanäle, bei erniedrigtem pH-Wert deutlich ab (HOENDEROP et al. 1999; PENG et al. 1999; VENNEKENS et al. 2001 a).

Eine Konformationsänderung des Kanals durch extrazelluläre Protonen scheint hierfür verantwortlich zu sein (YEH et al. 2003). Dieser Effekt könnte eine Grundlage für den in vivo beobachteten Anstieg der Ca²⁺-Exkretion im Harn bei metabolischer und respiratorischer Azidose darstellen (SUTTON et al. 1979; CANZANELLO et al. 1990).

Ferner scheint ein Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration, welcher gleichzeitig den Calciumgehalt in einer Mikrodomäne nahe der Porenregion erhöht, in Form eines negativen Feedbackmechanismus die Calciumaufnahme zu behindern (VENNEKENS et al. 2000;

HOENDEROP et al. 2001, 2002 b). Für TRPV5 konnte gezeigt werden, dass Sequenzen des Carboxyl-Endes hieran Anteil haben (NILIUS et al. 2003). Das Proteinkinase C-Substrat 80K-H scheint dabei als Ca²⁺-Sensor zu fungieren (GKIKA et al. 2004). Ein mehrstufiger Mechanismus, unter Bindung des Ca²⁺-regulativen Proteins Calmodulin, wurde für TRPV6 beschrieben (NIEMEYER et al. 2001).

Sowohl TRPV5 als auch TRPV6 lassen sich u. a. durch Ruthenium Rot (RR) und durch hohe extrazelluläre Mg²⁺-Konzentrationen hemmen. Auffällig ist hierbei, dass TRPV6 eine 100fach

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geringere Affinität für RR aufweist (IC50, TRPV6 ≈ 10 µmol · l^-1, IC50, TRPV5 ≈ 120 nmol · l^-1), wodurch eine Unterscheidung pharmakologisch möglich wird (VENNEKENS et al. 2001 b;

NILIUS et al. 2001; HOENDEROP et al. 2001).

Expression im Organismus

Zahlreiche Untersuchungen haben mittlerweile die Kenntnisse über das Vorkommen der beiden Kanäle in verschiedenen Geweben erweitert. So wurde TRPV5 beispielsweise im distalen Tubulus der Niere, in Plazenta, Duodenum und Jejunum (HOENDEROP et al. 1999), in Pankreas, Hoden, Prostata, Gehirn, Colon und Rektum (MÜLLER et al. 2000 a) sowie in Knochen, Magen, Caecum, Leber, Herz und Milz nachgewiesen (NIJENHUIS et al. 2003). Die Beschreibung von TRPV6 beinhaltet neben dem Duodenum und Jejunum auch Magen, Plazenta, Pankreas, Hoden und Prostata (HOENDEROP et al. 2001), Speicheldrüsen, Caecum und Colon (PENG et al. 1999, 2000 b), Gehirn, Lunge, Knochen, Herz, Skelettmuskel (NIJENHUIS et al. 2003) sowie die Brust- und Schweißdrüsen (ZHUANG et al. 2002).

Hervorgehoben sei an dieser Stelle allerdings, dass die Expressionsmuster beider Kanäle den unterschiedlichen Anforderungen entsprechend speziesspezifisch variieren. Über den Nachweis von TRPV6 in der Niere ist sowohl für den dicken, aufsteigenden Teil der Henleschen Schleife als auch für den distalen Tubulus berichtet worden (SUZUKI et al. 2000 a;

HOENDEROP et al. 2003 b). Auf mRNA-Ebene scheint TRPV6 stärker in der äußeren Medulla präsent zu sein, während TRPV5 vorwiegend im Nierencortex exprimiert wird (PENG et al. 2003). Auch in diversen humanen Tumorgeweben, u. a. in Brustdrüse, Ovar, Colon, Schilddrüse und Prostata, konnte mit steigender Malignität eine zunehmende TRPV6-Expression festgestellt werden (WISSENBACH et al. 2001; PENG et al. 2001 b;

ZHUANG et al. 2002), sodass diesem Protein als prognostischem Tumormarker möglicher-weise in Zukunft eine Bedeutung zukommen wird (FIXEMER et al. 2003).

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