Real-Time PCR

3.8.1 Grundlagen

Die Real-Time PCR, auch „quantitative PCR“ (QPCR) genannt, stellt eine Weiterentwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (Kap. 3.5) dar. Während mit letzterer Methode eine Quantifizierung der DNA-Mengen lediglich im Endprodukt der Reaktion, z. B. durch fluoreszierende Banden in einem Gel oder markierte, hybridisierte Sonden, durchführbar ist („Endpunkt-Analyse“), erlaubt die Real-Time PCR eine verlässlichere Aussage über die initial vorhandene Menge an Template. Das zuerst verwendete Protokoll sah eine Detektion entstandener doppelsträngiger DNA (dsDNA) mittels einer Videokamera unter Verwendung des interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffes EtBr (Kap. 3.6.1) vor. Die hierbei erstellten Aufnahmen konnten anschließend unter Zuhilfenahme einer Analyse-Software ausgewertet werden (HIGUCHI et al. 1993). Weitere Verbessung erfuhr die Real-Time PCR durch Einführung neuer Fluoreszenzfarbstoffe wie dem SYBR^® Green I, welches mit hoher Affinität unter deutlicher Zunahme der Fluoreszenz bevorzugt an dsDNA bindet und einen vielfach sensitiveren Nachweis ermöglicht (SCHNEEBERGER et al. 1995).

Mit modernen Real-Time-Thermocyclern ist mittlerweile die Möglichkeit gegeben, die Fluoreszenzzunahme und damit die Akkumulation der PCR-Produkte während des Amplifikationsschrittes durch kontinuierliche Messung in Echtzeit zu verfolgen (WITTWER et al. 1997). Die gemessenen Werte werden hierbei um die unspezifische Hintergrundfluoreszenz korrigiert, gegen die jeweilige Zyklusnummer aufgetragen und zumeist als sigmoidale Kurve dargestellt, in deren linearem Abschnitt der Anstieg der Fluoreszenzwerte dem Zuwachs an spezifischem PCR-Produkt proportional ist (MORRISON et al. 1998; WOO et al. 1998).

Auch zur Quantifizierung von RNA-Mengen kann die Real-Time PCR eingesetzt werden. Da die RNA allerdings vor der eigentlichen PCR in ein geeignetes Template (cDNA) mittels Reverser Transkriptase umgeschrieben werden muss (Kap. 3.4), spricht man bei einem solchen Verfahren von „reverse transcription quantitative PCR“ (RT-QPCR). Hierbei sind grundsätzlich zwei Vorgehensweisen denkbar: Zum einen kann die cDNA-Synthese als separater Arbeitsschritt der PCR vorgeschaltet werden (Two-step), zum anderen ist es möglich, die Reverse-Transkriptase-Reaktion erst im Real-Time-Thermocycler – im selben Reaktionsgefäß wie die anschließende QPCR (One-step) – ablaufen zu lassen (BUSTIN 2000).

Material und Methoden

3.8.2 Durchführung

Bei der Ausführung der Real-Time PCR wurde das Stratagene^® Brilliant™ Quantitative PCR Core Reagent Kit (Stratagene, La Jolla, CA 92037, USA) unter Verwendung des Farbstoffes SYBR^® Green I (SYBR^® Green I nucleic acid gel stain, Molecular Probes Europe B. V., NL-2333 AA Leiden) auf der Basis bereits erhobener Daten eingesetzt (HINTERDING 2002).

Für jede zu untersuchende Sequenz wurden pro Reaktionsansatz 2,5 µl 10×Core-PCR-Puffer, 1 µl dNTP-Mix (je 10 mmol · l^-1), 1,5 µl MgCl2 (50 mmol · l^-1), je 1,5 µl Primer („forward“

bzw. „reverse“, 10 pmol · µl^-1), 0,375 µl ROX Reference Dye (5 µmol · l^-1), 2,5 µl SYBR^® Green I (10 000× konzentrierte Lösung in DMSO, 1 : 3 000 verdünnt) sowie 0,25 µl SureStart™ Taq DNA-Polymerase (5 U · µl^-1) als „Mix“ vermischt. Abweichend hiervon betrugen die Mengen je Primer 0,25 µl bei TRPV5 und 0,1 µl bei TRPV6. Ferner wurde zur Bestimmung von TRPV6 die Menge MgCl2 auf 2,0 µl erhöht. Autoklaviertes Aq. dest. wurde in erforderlichem Umfang zugegeben, um nach Verteilung der Mischungen auf die Reaktions-gefäße und Einbringen der Templates ein Gesamtvolumen von 25 µl pro Ansatz zu erhalten.

Die synthetisierte cDNA wurde vor dem Einsatz in der Real-Time PCR photometrisch quantifiziert (Kap. 3.4) und das zu einem Gehalt von 2 µg dsDNA äquivalente Volumen zu den Ansätzen für die TRPV6-Bestimmung hinzugegeben. Für TRPV5 wurden 4 µl, für β-Aktin, Calbindin-D9k und PMCA1b 0,1 µl cDNA verwendet. Ein „Leerwert“ (NTC), in welchem die cDNA durch autoklaviertes Aq. dest. substituiert worden war, diente als Negativkontrolle der Reaktion. Bei jedem Durchgang wurde ein Doppelansatz untersucht.

In Tab. 3.4 sind die Basensequenzen der verwandten Primer dargestellt. Diese waren spezifisch für die Teilsequenzen der entsprechenden RNA, welches durch das Programm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) der GenBank des NCBI (National Center for Biotechnology Information, U. S. National Library of Medicine, Bethesda, MD 20894, USA) überprüft wurde. Die Teilsequenzen für das β-Aktin, das Calbindin-D9k und die PMCA1b sind unter den Kennungen AF054837, L13068 bzw. X53456 in der GenBank des NCBI registriert.

Für den Nachweis von TRPV5 und TRPV6 sowie β-Aktin wurden bereits zuvor ermittelte Oligonukleotidsequenzen verwendet (HINTERDING 2002). Die Primer waren so gewählt, dass in der PCR Bereiche zwischen 110 und 139 bp Länge amplifiziert werden konnten.

Die Synthesebedingungen der PCR im Real-Time-System (Mx4000™ Multiplex Quantitative PCR System, Stratagene, La Jolla, CA 92037, USA) sind dem Programmablauf in Tab. 3.5 zu entnehmen.

Material und Methoden

Primer „reverse“ (5′→ 3′) TCG TTG CCG ATG GTG ATG GGG TTC TCG GAC CTT TCA GTA A CCG TCA TTT GTA CCA TCA CCA GGG ATG TAG TCC TGG ACA AAG G GGT TGA TAT CCT GTC TGT CTT CCA

Primer „forward“ (5′→ 3′) AGA TCG TGC GGG ACA TCA A CCC AAA AGT CTC CTG CAG AAC T AAC TTC GAG TGC TTG CGA GAT GGA AGT ACA AGA GCA GCT ATC TGA GA CCA CCA CAG TGA TGC TGG AA

Tab. 3.4: Primersequenzen der in der PCR und Real-Time PCR verwandten Oligonukleotide. Gen β-Aktin Calbindin-D9k PMCA1b TRPV5 TRPV6 Beschreibung Denaturierung und Aktivierung Denaturierung, Zyklusbeginn Annealing und Elongation Erstellen einer Schmelzkurve

Dauer 10 min 15 s 1 min je 30 s

Temperatur 95,0 °C 95,0 °C 60,0 °C 55,0–95,0 °C

Schritt Nr. 1 2 3 4

Tab. 3.5: Ablauf der Real-Time PCR. Die Abfolge der Schritte 2 und 3 wurde 39-mal wiederholt. Das Erstellen der Schmelzkurve erfolgte nach initialer Abkühlung auf 55,0 °C durch Temperaturerhöhung um 1 °C alle 30 s.

Material und Methoden

3.8.3 Auswertung

Die in der Real-Time PCR gemessenen Daten (Kap. 3.8.2) wurden über die Ermittlung der CT-Werte mit Hilfe der geräteeigenen Software (Mx4000™ Multiplex Quantitative PCR System Software Version 3.00, Stratagene, La Jolla, CA 92037, USA) ausgewertet.

Die ermittelten Fluoreszenzwerte wurden hierbei zunächst um die unspezifische Hintergrund-fluoreszenz korrigiert. Durch Auftrag der Fluoreszenzzunahme (dRn) gegen die jeweilige Zykluszahl ließ sich der Punkt darstellen, an welchem die Reporterfluoreszenz die Hintergrundfluoreszenz signifikant überstieg. Beschrieben wird dieser Zeitpunkt im Ablauf der PCR durch eine rechnerisch ermittelte Zykluszahl, den CT-Wert, welcher sich aus dem Schnittpunkt der Fluoreszenzkurve mit einer Basislinie ergibt. Der CT-Wert ist dem Logarithmus der in der eingesetzten cDNA-Menge enthaltenen Kopienanzahl des ent-sprechenden Gens umgekehrt proportional. Je mehr Template initial vorhanden ist, umso geringer ist die erforderliche Anzahl an Zyklen, bis das Fluoreszenzsignal über dem Hintergrund detektierbar ist.

Zur Berücksichtigung etwaiger Variationen in eingesetzter cDNA-Menge und Effektivität des cDNA-Syntheseschrittes (Kap. 3.4), wurden die Ergebnisse für jedes untersuchte Gen hierbei auf einen internen Standard, das β-Aktin, normiert. Dieses erfolgte durch Differenzbildung der erhaltenen CT-Werte jeder Probe (Gleichung 1). Um dem unterschiedlichen Volumen an Template im PCR-Ansatz Rechnung zu tragen (Kap. 3.8.2), wurde zur Auswertung der TRPV6-Daten eine modifizierte Formel verwendet (Gleichung 2).

Aktin

Ein Unterschied von 1,0 zwischen zwei ∆CT-Werten weist darauf hin, dass in der Probe, welche dem höheren ∆CT-Wert zuzuordnen ist, nur die halbe Menge an cDNA-Ausgangsstrang für die untersuchte Basensequenz vorhanden war, setzt man eine Ver-dopplung der amplifizierten DNA-Abschnitte in jedem Zyklus voraus (MULLIS et al. 1986;

NEDELMAN et al. 1992). Bei dieser Betrachtung ist zu berücksichtigen, dass die Effizienz der

Material und Methoden

Amplifikation innerhalb der Zyklen und zwischen den Produkten variieren kann (WANG et al. 1989). Nach LIVAK und SCHMITTGEN (2001) liegt die Effizienz für Produkte bis etwa 150 bp Länge allerdings bei näherungsweise 100 %. Vergleichbare Werte konnten auch in Untersuchungen von PFAFFL (2001) erzielt werden.

Für einen Vergleich der Gruppen untereinander konnte mittels nachfolgender Berechnung der relative Gehalt an cDNA-Matrize für die untersuchten Gene berechnet werden (Gleichung 3):

2

Matrize

-cDNA

Menge

rel. = ⁻ (Gleichung 3)