Einfluss von Cd14 auf die intestinale Homöostase und den Verlauf von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im Mausmodell
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Stephanie Buchheister
Lüdenscheid
Hannover 2016
Dr. rer. nat. Manuela Büttner
Institut für Versuchstierkunde (MHH)
1. Gutachter: Univ.-Prof. A. Bleich, PhD
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. O. Distl
Tag der mündlichen Prüfung: 29.04.2016
Diese Arbeit wurde durch Sachmittelbeihilfen der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des DFG-Projektes „Bedeutung von CD14 für intestinale Barriere- und Abwehrmechanismen im Darm“ gefördert
Meinem Vater, in großer Dankbarkeit.
Meiner Mutter, in stillem Gedenken.
1) CD14 plays a protective role in experimental IBD by enhancing the intestinal barrier function
Stephanie Buchheister, Manuela Buettner, Marijana Basic, Andreas Noack, Gerhard Breves, Barbara Buchen, Lydia M Keubler, Christoph Becker, André Bleich
(Manuskript in Vorbereitung)
2) Time to Integrate to Nest Test Evaluation in a Mouse DSS-Colitis Model
Christine Häger, Lydia M. Keubler, Svenja Biernot, Jana Dietrich, Stephanie Buchheister, Manuela Buettner, André Bleich
PLoS One. 2015 Dec 4;10(12):e0143824
Abstracts:
Wissenschaftliche Vorträge:
Digestive Disease Week 2016, San Diego, USA
Cd14 is a protective factor in experimental colitis by enhancing the intestinal barrier function
S. Buchheister, M. Buettner, Barbara Buchen, Christoph Becker, A. Bleich
Wissenschaftliche Poster:
GV-SOLAS Konferenz 2015, Hannover, Deutschland
Cd14 is a protective factor in experimental colitis by tightening the intestinal barrier function
S. Buchheister, M. Buettner, A. Siebert, A. Smoczek, A. Bleich
S. Buchheister, M. Buettner, A. Siebert, A. Smoczek, A. Bleich
Seeon Konferenz 2015, Chiemsee, Deutschland
Cd14 plays a protective role in experimental models of colitis by enhancing the intestinal barrier function
S. Buchheister, M. Buettner, A. Siebert, A. Smoczek, A. Bleich
ICMI Konferenz 2015, Berlin, Deutschland
Cd14 is a modifier of IBD development by influencing the intestinal barrier function Stephanie Buchheister, Manuela Buettner, Anna Smoczek, Anja Siebert André Bleich
GV-SOLAS Konferenz 2015, Frankfurt, Deutschland
Cd14 might be a modifier of IBD development by influencing the intestinal barrier function
Stephanie Buchheister, Marijana Basic, Manuela Buettner, Anna Smoczek, Marion Burmester, Bernd Schröder, Gerhard Breves, André Bleich
Seeon Konferenz 2014, Chiemsee, Deutschland
Cd14 might modify the intestinal barrier function in IBD development.
Stephanie Buchheister, Marijana Basic, Manuela Buettner, Anna Smoczek, Marion Burmester, Bernd Schröder, Gerhard Breves, André Bleich
CTC 2014, Berlin, Deutschland
Cd14 might influence IBD development by modulating intestinal barrier function Stephanie Buchheister, Marijana Basic, Manuela Buettner, Anna Smoczek, André Bleich
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ... I Abkürzungsverzeichnis ... V
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 2
2.1 Die intestinale Homöostase ... 2
2.2 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) ... 3
2.3 Die Darmbarriere ... 6
2.3.1 Die epitheliale Darmbarriere ... 6
2.3.2 Immunologische Faktoren der Darmbarriere ... 9
2.4 Mausmodelle zur Erforschung von CED ... 12
2.5 CD14 ... 14
2.5.1 Funktion von CD14 ... 15
2.6 Ziele dieser Doktorarbeit ... 18
3 Material und Methoden ... 19
3.1 Geräte ... 19
3.2 Chemikalien ... 19
3.3 Versuchstiere ... 20
3.3.1 Tierhaltung ... 20
3.3.2 Tierschutz ... 20
3.3.3 Mausstämme ... 21
3.4 Kolitismodelle ... 21
3.4.1 Basale Charakterisierung Cd14 defizienter Mäuse (CD14- Charakterisierung) ... 21
3.4.2 Akute Kolitis ... 22
3.4.3 Chronische Kolitis ... 24
3.4.4 Transferkolitis ... 25
II
3.5 Bestimmung der intestinalen Permeabilität in vivo ... 26
3.6 Magnetresonanztomographie (MRT) ... 28
3.7 Histologie ... 29
3.7.1 Entnahme und Präparation des Dickdarms ... 29
3.7.2 Anfertigen der histologischen Präparate ... 30
3.7.3 Histologische Auswertung der CD14-Charakterisierung, des chronischen Kolitismodells und der Transferkolitis ... 30
3.7.4 Histologische Auswertung der DSS-induzierten Kolitis ... 32
3.8 Immunhistologie ... 34
3.8.1 Anfertigen von Gewebsschnitten für die immunhistologische Färbung ... 34
3.8.2 Occludin (OCLN) ... 35
3.8.3 Apoptose/TUNEL-Assay ... 35
3.8.4 Proliferation/Ki67 ... 36
3.9 Real-Time-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) ... 36
3.9.1 Probengewinnung und Lagerung ... 36
3.9.2 Isolierung der RNA ... 37
3.9.3 Reverse-Transkriptase PCR (RT-PCR) zur Herstellung der cDNA ... 37
3.9.4 Real-Time-PCR (qRT-PCR) mit SYBR®Green ... 38
3.9.5 Real-Time PCR mit TaqMan® ... 39
3.10 Multiplex Analyse von Mesenteriallymphozytenkulturüberständen ... 40
3.10.1 Entnahme der Mesenteriallymphknoten und Zellkultur zur Gewinnung der Lymphozytenkulturüberstände ... 40
3.10.2 Multiplex-Assay ... 42
3.11 Western-Blot Analysen von CD14 ... 42
3.11.1 Probengewinnung und Lagerung ... 42
3.11.2 Proteinisolierung und –bestimmung nach Bradford ... 43
3.11.3 Sodium-Dodecyl-Sulfat Polyacrylamide (SDS-Page) Gelelektrophorese ... 43
3.11.4 Western-Blot ... 44
3.11.5 Entwicklung der Filme und Auswertung ... 45
3.12 Enzyme-Linked-Immunoabsorbend-Assay (ELISA) ... 45
3.12.1 Probengewinnung und Lagerung ... 45
3.12.2 Durchführung des CD14-ELISA ... 45
III
3.13 Zell-Sortierung CD4+CD62L+ Zellen für die Transferkolitis ... 46
3.13.1 Gewinnung der Gesamtleukozytenpopulation ... 46
3.13.2 Antikörperfärbung und Zellsortierung ... 46
3.13.3 Aufarbeitung und Injektion der naiven T-Zellen ... 48
3.14 Statistische Auswertung ... 49
4 Ergebnisse ... 50
4.1 CD14-Charakterisierung im steady state ... 50
4.1.1 Einfluss von CD14 auf die epitheliale Darmbarriere im steady state ... 50
4.1.2 Einfluss von CD14 auf Entzündungsparameter im steady state ... 56
4.2 Akute Kolitis ... 62
4.2.1 Cd14-defizientes Tiermodell in der akuten Kolitis ... 62
4.2.2 Cd14-überexprimierendes Tiermodell in der akuten Kolitis ... 72
4.3 Chronische Kolitis ... 89
4.3.1 Einfluss von Cd14 auf die epitheliale Darmbarriere im chronischen Kolitismodell ... 90
4.3.2 Einfluss der Cd14-Defizienz auf Entzündungsparameter im chronischen Kolitismodell ... 95
4.4 Transferkolitis ... 101
4.4.1 Transfer einer naiven kolitogenen T-Zellpopulation aus B6-WT Spendermäusen in B6-Rag1-/- vs. B6-Rag1-/-Cd14-/- Empfängertiere ... 101
4.4.2 Transfer einer naiven kolitogenen T-Zellpopulation aus B6-WT vs. B6- Cd14-/- Spendermäusen in B6-Rag1-/- Empfängertiere ... 107
5 Diskussion ... 112
6 Zusammenfassung ... 129
7 Summary ... 132
8 Anhang ... 134
8.1 Geräte und Chemikalien ... 134
8.1.1 Laborgeräte und Computersoftware ... 134
8.1.2 Verbrauchsmaterialien ... 136
8.1.3 Chemikalien , Reagenzien und Kits ... 137
8.1.4 Puffer und Lösungen ... 141
8.1.5 Antikörper ... 145
IV
8.1.6 Primer ... 146
9 Literaturverzeichnis ... 147
10 Tabellenverzeichnis ... 170
11 Abbildungsverzeichnis ... 171
12 Danksagung ... 175
13 Erklärung ... 176
V
Abkürzungsverzeichnis
°C Grad Celsius
% Prozent
® Eingetragene Marke
TM Trademark
µg Mikrogramm
µL Mikroliter
µm Mikrometer
λ Wellenlänge
2D Zweidimensional
Abb. Abbildung
AG Antigen
AJ Adherens junctions
AK Antikörper
APC Allophycocyanin
APC-Cy7 Allophycocyanin–Cyanin7 APS Ammoniumperoxodisulfat Aqua dest. Destilliertes Wasser
B6-Cd14-/- C57BL/6J.129S1-Cd14tm1Smg B6-DKO B6.129S1P2-Il10tm1CgnCd14tm1Smg B6-Il10-/- C57BL/6J.129P2-Il10tm1Cgn
B6-Tg-Cd14 B6.B6D2-Tg(Mt-Cd14)M14S B6-Rag1-/- B6.129S7-Rag1tm1Mom
B6-Rag1-/-Cd14-/- B6.Cg-Rag1tm1Mom Cd14tm1Smg
VI
B6-WT C57BL/6J.129P2-Il10tm1Cgn+/+
Breg Regulatorischer B-Zelle BSA Rinderserumalbumin bzw. Beziehungsweise CD Cluster of differentiation
Cdcs Cytokine deficiency induced colitis susceptibility
cDNA Komplementäre DNA
CED Chronisch entzündliche Darmerkrankungen
Cldn4 Claudin 4
CLR C-type lectin like receptor
cm Zentimeter
CO2 Kohlenstoffdioxid
COX Cyclooxygenase
CT Cycle-treshold
d Tag
DAPI 4-6-Diamidino-2-Phenylindoldihydrochlorid DKO Double-Knockout
DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease
DSS Dextran-Natrium-Sulfat (dextran-sodium-sulfate) DTT Dithiothreitol
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA Enzyme linked immunosorbant assay
FACS Durchflusszytometrie (fluorescence-activated cell sorting)
VII
FCS fetales Kälberserum
FELASA Federation of European Laboratory Animal Sience Associations FITC Fluoreszeinisothiocyanat
g Gramm
G Erdbeschleunigung
ggr. Geringgradig
GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase GALT Darm-assoziiertes lymphatisches Gewebe
h Stunde
H&E Hämatoxylin-Eosin
HEPES 4-Hydroxyethyl-1-Piperazinethansulfonsäure
hgr. Hochgradig
HRP Horseradichperoxidase
Hz Hertz
IBD Inflammatory Bowel Disease IEC intestinale Epithelzelle IFNγ Interferon gamma
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
IRF Interferon regulatory factor
IVC Einzelbelüfteter Käfig (individually ventilated cage)
Kap. Kapitel
kDa Kilodalton
Kg Kilogramm
Konz. Konzentration
VIII
L Liter
L. propria Lamina propria
LOG Dekadischer Logarithmus LPS Lipopolysaccharid
M Molar
mA Milliamper
Max. Maximum
mCD14 Membrangebundenes CD14
mg Milligramm
MHH Medizinische Hochschule Hannover
Min. Minimum
min. Minute
mL Milliliter
mLn. Mesenteriallymphknoten
mM Millimolar
mm Millimeter
m.o.w. Mehr oder weniger
mRNA Messenger Ribonukleinsäure MRT Magnetresonanztomographie MSME Multi Slice Multi Echo
n.d. Nicht detektierbar
NFAT Nuclear factor of activated T-cells
NFκB Nuclear factor of Kappa light chain enhancer in B-cells
ng Nanogramm
NLR NOD-like receptor
IX
nm Nanometer
NOD Nucleotide-binding Oligomerization Domain
Ocln Occludin
OD Optische Dichte
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung
PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
PE Phycoerythrin
PI3K Phosphatidylinosityl-3-Kinase
pg Pikogramm
PGE2 Prostaglandin E2 PGN Peptidoglykan
pH Negativer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration PKC Proteinkinase C
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PPAR-γ Peroxisome proliferator-activated receptor gamma PRR Pattern recognition receptor
qRT-PCR Quantitative Real-Time-PCR QTL Quantitative trait locus
RAG Recombination activating gene
RANTES Regulated on activation, normal T cell expressed and secreted RLR RIG-I-like receptor
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
RT-PCR Reverse Transkriptase PCR
RT Raumtemperatur
X
RQ Relative Genexpression (relative quantification) SAMP Senescence accelerated mouse prone
sCD14 Lösliches CD14
SDS Natriumdodecylsulfat (sodiumdodecylsulfate)
sek. Sekunde
SEM Standardfehler der Mittelwerte
STAT Signal transducer and acivator of transcription T. submucosa Tela submucosa
Tab. Tabelle
TBST Tris-gepufferte Salzlösung mit Tween TEMED Tetramethylethylendiamin
TGFβ Transforming growth factor beta TH-Zelle T-Helfer-Zelle
TIRAP Toll interleukin 1 receptor domain containing adaptor protein
TJ Tight junction
TJL The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA) TJP1 Tight junction protein 1
TLR Toll-Like Rezeptor
TNFα Tumor-Nekrose-Faktor alpha
TRAF Tumor-nekrosis-factor-rezeptor-α-associated factor TRAM TRIF related adaptor molecule
Treg Regulatorische T-Zelle
TRIF TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β TUNEL TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling
Tzyt Zytotoxische T-Zelle
XI
U Unit
u.a. Unter anderem
V Volt
v.a. Vor allem Vergr. Vergrößerung vgl. Vergleiche
Vol. Volumen
vs. Versus
W Watt
WT Wildtyp
z.B. Zum Beispiel ZnSO4 Zinksulfat
ZO-1 Zonula-occludens Protein 1 ZTL Zentrales Tierlaboratorium
1
1 Einleitung
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) sind rezidivierende Entzündungen des Gastrointestinaltraktes, deren humanen Haupterkrankungsformen Morbus Crohn (MC) und Colitis Ulcerosa (CU) darstellen. Die genaue Äthiopathogenese von CED ist bislang noch nicht vollständig aufgeklärt, wobei als allgemein akzeptierte Hypothese gilt, dass die Darmentzündung das Resultat einer überschießenden Immunreaktion gegenüber primär nicht pathogenen intestinalen Mikroorganismen in einem genetisch empfänglichen Individuum ist. Bei der Entwicklung einer CED kommt es zu einem Zusammenbruch der intestinalen Barriere, was mit einer erhöhten Exposition des Immunsystems mit luminalen Antigenstrukturen und einer verminderten immunologischen Toleranz einhergeht (GROSCHWITZ u. HOGAN 2009; CERF-BENSUSSAN u. GABORIAU-ROUTHIAU 2010).
Das „Cluster of Differentiation 14“-Protein (CD14) ist ein Ko-Rezeptor diverser Toll- Like-Rezeptoren (TLR) und spielt vor allem im Zusammenhang mit TLR4 bei der Erkennung des Lipopolysachharids (LPS) gramnegativer Bakterien eine bedeutende Rolle (ZANONI u. GRANUCCI 2013). Durch genetische Analysen im experimentellen Kolitismodell der Interleukin 10 defizienten Maus (Il10-/-) konnte Cd14 als krankheitsmodulierendes Kandidatengen identifiziert werden (M. F. DE BUHR et al.
2006). Mäuse mit einem genetischen Knockout für Cd14 zeigten sich empfänglicher für eine Dextran-Natrium-Sulfat (DSS)-induzierte Kolitis (M. F. DE BUHR et al. 2009) und keimfrei gehaltene Cd14-/- Mäuse wiesen nach oraler Monoassoziation mit Escherichia coli Nissle 1917 (E. coli Nissle) eine höhere bakterielle Translokationsrate in Leber und Milz auf als die entsprechenden Wildtypkontrollen (BASIC 2014). Innerhalb humaner CED konnten Polymorphismen im Cd14- Promotorgen mit einem erhöhten Erkrankungsrisiko für MC und CU assoziiert werden (KLEIN et al. 2002; GAZOULI et al. 2005).
Im Rahmen dieser Doktorarbeit soll nun der Einfluss von Cd14 auf den Verlauf experimentell induzierter Darmentzündungen in verschiedenen Kolitismodellen (akute DSS-induzierte Kolitis, chronische Il10-/--basierte Kolitis, T-Zelltransferkolitis) unter Verwendung Cd14-defizienter Mäuse analysiert werden. Um einen möglichen protektiven Effekt von Cd14 auf die Entwicklung einer Kolitis eruieren zu können, sollen zusätzlich Cd14-überexprimierende Mäuse innerhalb einer DSS-induzierten Kolitis untersucht werden. Die geplanten Untersuchungen betreffen vor allem intestinale Barrieremechanismen und umfassen sowohl die Charakterisierung der epithelialen Integrität als auch die Analyse immunologischer Faktoren innerhalb der Darmbarriere
2
2 Literaturübersicht
2.1 Die intestinale Homöostase
Der Gastrointestinaltrakt ist ein offenes ökologisches System, das unmittelbar nach der Geburt von einer Vielzahl verschiedenster Mikroorganismen besiedelt wird (CERF-BENSUSSAN u. GABORIAU-ROUTHIAU 2010). Mit ca. 100 Milliarden Bakterien pro Gramm (g) Koloninhalt (ZENEWICZ et al. 2009) übertrifft die Anzahl der intestinalen Mikroorganismen die der wirtseigenen Zellen um das 10- bis 100- fache (SURANA u. KASPER 2014). Ein gesundes Individuum steht in einer symbiotischen Wechselbeziehung mit diesen kommensalen Mikroorganismen im Darmlumen, bei der beide Seiten gleichermaßen voneinander profitieren: Zum einen dient der Verdauungstrakt des Wirtes den intestinalen Mikroorganismen als ökologische Nische und Nahrungsquelle und zum anderen trägt die kommensale Mikroflora zur physiologischen Funktionsweise des Darms bei. In diesem Zusammenhang sorgt die Mikroflora für eine begrenzte Vermehrung möglicher pathogener Mikroorganismen, schließt essentielle Nahrungsbestandteile auf und trägt schließlich zur Reifung des wirtseigenen Immunsystems bei (CERF- BENSUSSAN u. GABORIAU-ROUTHIAU 2010; SURANA u. KASPER 2014). Es existiert somit ein dynamischer Gleichgewichtszustand zwischen den intestinalen Mikroorganismen, den Epithelzellen des Darms und dem Immunsystem des Wirts.
Hierbei wird sowohl eine protektive Immunantwort entgegen möglicher Pathogene herbeigeführt als auch eine entzündliche Immunreaktion gegenüber der kommensalen Darmflora verhindert (MALOY u. POWRIE 2011). Diese stete Homöostase wird durch intestinale Barrieremechanismen ermöglicht und ist Grundvoraussetzung für eine friedliche Koexistenz von Wirt und kommensaler Mikroflora und das Vorhandensein eines physiologischen, nicht-entzündlichen Darmmilieus. Durch den Zusammenbruch dieser Barrieremechanismen wird der intestinale Gleichgewichtszustand gestört, was eine überschießende Immunantwort gegenüber primär nicht pathogenen Mikroorganismen zur Folge haben kann (PETERSON u. ARTIS 2014). Im Zusammenhang mit solchen Barrierestörungen stehen pathologische Veränderungen des Verdauungstraktes, wie beispielsweise chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) (FARHADI et al. 2003; NALLE u.
TURNER 2015).
3
2.2 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED)
CED sind ein Komplex chronisch rezidivierender Entzündungen des Gastrointestinaltraktes, die durch eine überschießende Immunreaktion gegenüber primär nicht pathogenen Mikroorganismen gekennzeichnet sind (UHLIG u. POWRIE 2009). Im humanen Bereich stellen Morbus Crohn (MC) und Colitis Ulcerosa (CU) die beiden Hauptkrankheitsformen dar. Die beiden Erkrankungstypen weisen sowohl Gemeinsamkeiten als auch Unterschiede bezüglich ihrer Ausprägung und ihres Verlaufs auf. Die Entzündungsreaktion in MC kann grundsätzlich alle Abschnitte des Verdauungstraktes gleichermaßen betreffen, wobei typischerweise das terminale Ileum die Hauptlokalisation der Erkrankung darstellt und die Erkrankung sich oft erstmals oberhalb der Peyerschen-Platten manifestiert (XAVIER u. PODOLSKY 2007). Die Entzündung ist hier transmuraler Natur und betrifft somit alle Wandschichten des Darmes. Makroskopisch finden sich Verdickungen der Darmwand in Form sogenannter Pseudopolypen, nicht verkäsende Granulome und Ulzerationen der Darmschleimhaut (STROBER et al. 2007). Typisch sind hier sogenannte Skip-Lesions innerhalb entzündeter Bereiche des Darms, die gänzlich unbetroffen erscheinen (JONES-HALL u. GRISHAM 2014). Komplikationen des Krankheitsgeschehens in Form von fistulierten Bereichen des Darms und Strikturen kommen vor (STROBER et al. 2007). Histologisch finden sich diffuse Entzündungszellinfiltrationen, hauptsächlich in Form von Makrophagen und Lymphozyten, eine deutliche Hyperplasie des Kryptepithels und nicht verkäsende, granulomatöse Bereiche (XAVIER u. PODOLSKY 2007). Zu den klinischen Symptomen zählen klassischerweise solche gastrointestinaler Natur in Form von abdominalem Schmerz, (blutigem) Durchfall und Gewichtsverlust, aber gelegentlich finden sich auch extraintestinale Manifestationen des Krankheitsgeschehens, wie beispielsweise Anämie, Fieber oder Entzündungsreaktionen der Haut oder der Augen (BAUMGART u. SANDBORN 2007). Innerhalb der CU ist ausschließlich das Kolon der Patienten betroffen und die Entzündungsreaktion beschränkt sich auf die oberflächliche Schleimhautschicht der Darmwand. Auch hier finden sich Erosionen und Ulzerationen des Darmepithels zusammen mit Kryptabszessen. Die Symptome entsprechen weitestgehend denen von MC. Histologisch zeigen sich Entzündungszellinfiltrationen und häufig eine deutliche Reduktion der Muzinschicht (XAVIER u. PODOLSKY 2007). Beide Erkrankungen verlaufen schubweise mit einer Erstmanifestation, die meist im jung adulten Alter zwischen 20 und 40 Jahren liegt (PICCO u. CANGEMI 2009). Die Inzidenz ist v.a. in den westlichen Industrienationen (USA, Nord- und Mitteleuropa) am höchsten, wobei die Erkrankungsrate zur Zeit auch in weniger wirtschaftlich entwickelten Gebieten stark ansteigt (BENCHIMOL et al. 2011; BURISCH u. MUNKHOLM 2013). Das Auftreten von CED zeigt eine deutliche familiäre Häufung. In 2,2, bis 16,2% der betroffenen MC-Patienten ist
4
ebenfalls ein Verwandter ersten Grades betroffen und somit stellt eine positive Familiengeschichte bezüglich CED den größten unabhängigen Risikofaktor für die Entwicklung einer Erkrankung dar (BAUMGART u. CARDING 2007). Die Konkordanzrate in monozygoten Zwillingen allerdings beträgt 30-35% für MC und lediglich 10-15% für CU, sodass nicht-genetische Faktoren ebenso eine bedeutende Rolle innerhalb der Pathogenese von CED zu spielen scheinen (KHOR et al. 2011).
Durch genomweite Assoziationsstudien und Kopplungsanalysen wurden zahlreiche Suszeptibilitätsgene auf 12 Chromosomen identifiziert, wobei keines der Gene konsistent in allen genomweiten Scans vertreten war (BAUMGART u. CARDING 2007). Des Weiteren sind auch nur 12%, bzw. 18% aller genetischen Risikofaktoren allein für MC und CU spezifisch (JONES-HALL u. GRISHAM 2014). Den ersten und wahrscheinlich meisterforschten Suszeptibilitätslocus für CED stellt das Gen codierend für „nucleotide-binding oligomerization domain 2“ (NOD2) dar, ein sogenannter Pattern Recognition Receptor (PPR) des angeborenen Immunsystems für die Erkennung bakteriellen Muramyldipeptids (PETERSON u. ARTIS 2014). Im Zusammenhang mit einem Knockout für das Nod2 Gen konnten Studien in Mäusen sowohl protektive als auch krankheitsfördernde Wirkungen des Moleküls bezüglich experimenteller Darmentzündungen zeigen (PETERSON u. ARTIS 2014; NALLE u.
TURNER 2015). Somit stellen CED ein polygenetisches und multifaktorielles Krankheitsgeschehen dar, dessen Ursache das Zusammenwirken sowohl genetischer- und immunologischer- als auch zahlreicher Umwelteinflüsse darstellt (XAVIER u. PODOLSKY 2007).
Bisher konnte noch kein alleiniger exakter Mechanismus für die Entwicklung von CED formuliert werden. Es gilt allerdings als weit akzeptierte Grundhypothese, dass CED das Resultat einer Immunreaktion gegenüber der kommensalen Mikroflora in einem genetisch empfänglichen Individuum darstellen (KHOR et al. 2011). Eine veränderte Zusammensetzung der intestinalen Mikroflora oder eine verringerte intestinale mikrobielle Diversität, v.a. auch im Zusammenhang mit einem hohen Hygieneregime und verringerter mikrobiellen Exposition innerhalb einer „westlichen“
Lebensweise, können zu dysregulierten Immunreaktionen gegenüber einer primär nicht pathogenen Mikroflora führen (JONES-HALL u. GRISHAM 2014). Eine solche Dysbiose kann zu einer relativen Zunahme bestimmter Bakterien, z.B. adherent- invasiven Escherichia coli (E. coli), führen, die mit der Entwicklung von CED assoziiert werden (MANICHANH et al. 2006; MARTINEZ-MEDINA et al. 2009). Des Weiteren existieren in CED-Patienten oftmals genetische Polymorphismen, die im Zusammenhang mit einer herabgesetzten bakteriellen Clearance stehen (KHOR et al. 2011). In vielen Patienten wird oftmals eine erhöhte bakterielle Translokation festgestellt (CHASSAING u. DARFEUILLE-MICHAUD 2011). Auch eine allgemeine Erhöhung der intestinalen Permeabilität wird als mögliche Ursache für eine erhöhte mukosale Antigenexposition und einer damit verbundenen überschießenden
5
Immunreaktion in Verbindung gebracht. Oftmals korreliert eine Permeabilitätserhöhung des Darmepithels positiv mit dem Schweregrad des Krankheitsschubs von CED Patienten. Ein erneuter Anstieg der intestinalen Permeabilität geht hierbei oftmals einem erneuten klinischen Schub voraus und stellt somit den Vorboten eines Rückfalls dar (WYATT et al. 1993; D'INCA et al. 1999).
Des Weiteren existieren viele Fälle, in denen gesunde Verwandte von CED Patienten ebenfalls erhöhte intestinale Permeabilitäten aufweisen, ohne jedoch eine Krankheit zu entwickeln (SÖDERHOLM et al. 1999; SECONDULFO et al. 2001). Dies spricht für eine Annahme von einer primären Permeabilitätserhöhung als mögliche Ursache für die Entwicklung von CED. In Folge der Entzündungsreaktion zeigen CED- Patienten hohe Konzentrationen inflammatorischer Zytokine, v.a. von Tumor- Nekrose-Faktor alpha (TNFα) und Interferon gamma (IFNγ), die dann ihrerseits zu einer weiteren Permeabilitätserhöhung des Darmepithels führen können und einen Circulus vitiosus der chronischen Entzündung aufrecht erhalten (FASANO u. SHEA- DONOHUE 2005). In einigen Fällen kann eine antibiotische Behandlung von CED- Patienten erfolgsversprechend sein. Je nach Patient und Krankheitsverlauf stellen konventionelle Behandlungen mit Glukokortikoiden und Immunmodulatoren (z.B.
Thiopurine oder Methodextran), oder eine Therapie mit Cyclooxygenase 2 (COX2)- Inhibitoren (z.B. Mesalamin, Sulfasalazin) eine krankheitslindernde Therapieoption dar (NIELSEN 2014). Chirurgisches Entfernen der entzündeten Darmabschnitte kann innerhalb der CU zu einer vollständigen Kur der Erkrankung führen, ist aber bei MC nur in komplizierten Krankheitsverläufen indiziert und dann auch nur von palliativem Nutzen (BAUMGART u. SANDBORN 2007). Das vielversprechendste Mittel zur Behandlung von CED stellen zur Zeit TNFα-Antagonisten (z.B. Infliximab) dar.
Allerdings existiert diesbezüglich immerhin noch in 30% der Patienten eine primäre Unwirksamkeit und in weiteren 30% der Patienten stellt sich über die Zeit der Behandlung ein sekundärer Wirkungsverlust ein (NIELSEN 2014). Komplikationen und Nebenwirkungen der Therapie mit den genannten Medikamenten sind v.a.
opportunistische Infektionen durch systemische Immunsuppression, aber auch sekundäre Lymphome und Krebs. Neue Therapieansätze sind somit dringend erforderlich und u.a. auch durch anti-alpha4-adhesine gefunden worden. Neuere Therapieoptionen sind Immunstimulantien oder die siRNA basierte Inhibition pathogenetisch bedeutsamer Moleküle (NIELSEN 2014). Ansätze, die sich gegen diverse Interleukine (z.B. anti-IL17, anti-IL-23) richten oder eine Therapie mit immunmodulatorischem IL-10 haben sich oftmals als nicht wirksam herausgestellt (MOZAFFARI et al. 2015). Bisher wurden also hauptsächlich inhibitorisch wirksame Pharmaka gewählt, für die zukünftige Entwicklung neuer Medikamente wären v.a.
krankheitsmodulierende „Therapeutics“ interessant (NIELSEN 2014).
6 2.3 Die Darmbarriere
Die intestinale Barriere verhindert sowohl das unkontrollierte Eindringen darmassoziierter Mikroorganismen in wirtseigenes Gewebe als auch eine überschießende Immunreaktion gegenüber luminalen Antigenstrukturen und trägt somit in hohem Maße zur Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase bei (CERF- BENSUSSAN u. GABORIAU-ROUTHIAU 2010). Auf zellulärer Ebene besteht die intestinale Barriere aus einem epithelialen Anteil, als eher physikalische Abgrenzung, aber auch aus immunologischen Faktoren (FARHADI et al. 2003). Beide Komponenten tragen gleichermaßen zur Aufrechterhaltung eines nicht-entzündlichen Darmmilieus bei und sollen im Folgenden näher beschrieben werden. Einen weiteren wichtigen Teil der Darmbarriere stellen biochemische Faktoren dar. In diesem Zusammenhang stehen v.a. eine mehrlagige Mukus-Schicht und sezernierte antimikrobielle Peptide (MALOY u. POWRIE 2011), die für eine Begrenzung der mikrobiellen Invasion der Darmschleimhaut sorgen. Diese Faktoren sind allerdings nicht Hauptaugenmerk dieser Doktorarbeit und werden im weiteren Verlauf nicht näher beschrieben.
2.3.1 Die epitheliale Darmbarriere
Die zelluläre Auskleidung der Darmschleimhaut besteht aus einer einlagigen Epithelzellschicht. Diese intestinalen Epithelzellen (IEZ) bilden eine selektiv permeable Barriere, die auf der einen Seite die Resorption von Nährstoffen, Elektrolyten und Wasser zulässt, auf der anderen Seite aber eine effektive Schutzbarriere gegenüber dem Eindringen luminaler Toxine, Antigene und der intestinalen Flora darstellt (DEURING et al. 2013). Durch eine intakte IEZ-Schicht existieren zwei Passagemöglichkeiten: Der transzelluläre Weg durch die Epithelzellen selbst, der durch die apikalen und basolateralen Zellmembranen begrenzt wird, und der parazelluläre Weg zwischen den Epithelzellen entlang.
Letztgenannter wird durch ein komplexes Proteinnetzwerk kontrolliert, welches als mechanische Zell-Zell-Verbindungen den Bereich zwischen den IEZs abdichtet.
Dieses Netzwerk besteht aus Desmosomen und den sogenannten adherens junctions (AJ) und tight junctions (TJ). Desmosomen und AJs stellen eine eher mechanische Verbindung zwischen den Epithelzellen dar, während die TJ die eigentliche interzelluläre Abdichtung und Kontrolle des parazellulären Stofftransports übernehmen (GROSCHWITZ u. HOGAN 2009).
7 2.3.1.1 Aufbau und Funktion der TJ
Die verschiedenen TJ-Proteine formen dynamische, gürtelartige Multiproteinkomplexe um die IEZs und kontrollieren so den selektiven parazellulären Stofftransport. Die TJ-Proteine umfassen vier Hauptfamilien von Transmembranproteinen: Occludin, die Gruppe der Claudine, „junctional adhesion molecules“ und Tricellulin. Das Expressionsmuster der Proteine variiert in den verschiedenen Darmabschnitten, aber grundsätzlich bilden die extrazellulären Proteinanteile die interzelluläre Abdichtung als solche aus und die intrazellulären Anteile verbinden sich über das TJ-Adaptermolekül Zonula-occludens mit dem Aktin- Zytoskelett der Zellen (GROSCHWITZ u. HOGAN 2009).
Occludin (OCLN) stellt das erstentdeckte Protein der TJ Familie dar (FURUSE et al.
1993), wobei über dessen exakte Funktion zur Zeit noch kontrovers diskutiert wird (GONZALEZ-MARISCAL et al. 2008). Sowohl in vitro als auch in vivo Studien konnten eine regulative Rolle des Proteins bezüglich der parazellulären Permeabilität zeigen (BALDA et al. 1996; MCCARTHY et al. 1996). Allerdings wiesen Ocln- defiziente Mäuse keine veränderte Permeabilität für Ionen im Vergleich zu entsprechenden Wildtypkontrollen auf (SCHULZKE et al. 2005), sodass angenommen wird, dass die TJ-Komplexe langfristig in der Lage sind sich dynamisch an wechselnde Bedingungen anzupassen. Die Gruppe der Claudine (CLDN) stellt eine Gruppe integraler Membranproteine dar, die ein gewebs- und entwicklungsabhängiges Expressionsmuster aufweisen (LAL-NAG u. MORIN 2009).
Insgesamt existieren 24 verschiedene Claudine, die sich in ihrer Funktionsweise teilweise stark unterscheiden. CLDN1 beispielsweise ist ein überlebenswichtiges, den Interzellularraum abdichtendes, Protein (FURUSE et al. 2002), während das
Abbildung 1: Aufbau der TJ
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CLDN2 durch die Bildung kationenspezifischer Poren die Permeabilität kleiner Ionen erhöht (AMASHEH et al. 2009). Das CLDN4, was im Rahmen dieser Doktorarbeit näher untersucht wird, ist ebenfalls ein abdichtendes Protein dessen Expression in vitro negativ mit der Leitfähigkeit für Natriumionen korreliert (VAN ITALLIE et al.
2001). Das „tight junction protein 1“, auch als Zonula-occludens Protein (ZO-1) bezeichnet, verbindet dann seinerseits die intrazellulären Anteile des OCLN und der CLDN mit dem Aktin-Zytoskelett und ist somit für die Formation der TJ-Komplexe essentiell (ULLUWISHEWA et al. 2011).
2.3.1.2 Veränderungen der intestinalen Permeabilität
Eine intestinale Permeabilitätserhöhung kann grundsätzlich durch zwei verschiedene Wege geschehen: 1) Durch direkten zellulären Schaden oder 2) durch eine Erhöhung der TJ-Permeabilität (NALLE u. TURNER 2015). Die intestinale Permeabilität kann hierbei durch verschiedene Faktoren reguliert werden, darunter fallen v.a. die Apoptose epithelialer Zellen und die Modifikation der TJ-Permeabilität durch Proteinkinasen oder Zytokine, aber auch zahlreiche exogene Faktoren, wie z.B. „Stress“, Alkohol und bestimmte Nahrungsallergene sind in der Lage die intestinale Permeabilität zu verändern (GROSCHWITZ u. HOGAN 2009;
ULLUWISHEWA et al. 2011). Im Zusammenhang mit einer Permeabilitätserhöhung durch Zytokine stehen v.a. TNFα und IFNγ, die beiderseits zu einer Erhöhung der TJ- Permeabilität, v.a. durch die negative Wirkung auf die Ocln-Expression, führen und sich in ihrer Wirkung gegenseitig zu potenzieren vermögen (WANG et al. 2005; YE et al. 2011). Das Interleukin 10 (IL-10) hingegen verringert die intestinale Permeabilität, v.a. über die Hemmung barriereschädigender Modulatoren (AL-SADI et al. 2009).
Eine Erhöhung der intestinalen Permeabilität steht im Zusammenhang mit diversen Erkrankungen wie z.B. Diabetes mellitus, Zöliakie und besonders mit dem Komplex der CED (GROSCHWITZ u. HOGAN 2009; DEURING et al. 2013). Innerhalb humaner CED korreliert eine Permeabilitätserhöhung des Darmepithels positiv mit dem Schweregrad des Krankheitsschubs und ein erneuter Anstieg der intestinalen Permeabilität geht oftmals einem erneuten klinischen Schub voraus (WYATT et al.
1993; D'INCA et al. 1999; NALLE u. TURNER 2015). Somit stellt eine veränderte intestinale Permeabilität und die damit verbundene Störung der intestinalen Homöostase einen kritischen Schritt in der Pathogenese von CED dar.
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2.3.2 Immunologische Faktoren der Darmbarriere
Die hohe mikrobielle Dichte des Gastrointestinaltraktes stellt eine enorme immunologische Herausforderung dar, da sowohl ein adäquater Schutz gegenüber möglichen pathogenen Mikroorganismen gewährleistet sein, gleichzeitig aber auch eine dauerhaft überschießende Immunreaktion gegenüber der kommensalen Mikroflora verhindert werden muss. In Folge dessen entwickelte das lokale intestinale Immunsystem zahlreiche Anpassungen, um eine dauerhafte intestinale Homöostase in antigenreichem Milieu aufrecht erhalten zu können. Anatomisch sind die Immunzellen sowohl in den Mesenteriallymphknoten (mLn.), dem Darm- assoziierten-lymphatischen-Gewebe (GALT), bestehend aus den Peyerschen- Platten, den Zäkalplatten und isolierten Lymphfollikeln, aber auch diffus im Gewebe der Darmschleimhaut lokalisiert (SHALE et al. 2013).
2.3.2.1 Zelluläre angeborene Abwehrmechanismen der Darmbarriere
Zu den zellulären angeborenen Abwehrmechanismen des Darms gehören neutrophile, eosinophile und basophile Granulozyten, Mastzellen und myelomonozytische Zellen in Form von dendritischen Zellen und Makrophagen.
Intestinale Makrophagen stellen das größte Reservoir von Gewebsmakrophagen im menschlichen Organismus dar und verkörpern 10-20% der mononukleären Zellen in der Lamina propria (L. propria) des Darms (GOLDER u. DOE 1983). Die Anzahl residenter Makrophagen korreliert positiv mit der mikrobiellen Dichte der jeweiligen Darmabschnitte und ist entsprechend im Kolon am größten (S. H. LEE et al. 1985) und in keimfrei gehaltenen Mäusen verringert (NIESS u. ADLER 2010).
Gewebsmakrophagen des Darms fungieren, in Kontrast zu den Makrophagenpopulationen anderer Gewebe, nicht als professionelle antigenpräsentierende Zellen, sondern zeigen eine hohe lokale phagozytische und bakterizide Aktivität. Somit verhindern sie aktiv die Invasion potentiell pathogener Mikroorganismen und die Akkumulation apoptotischer Zellen im Gewebe (SCHENK u. MUELLER 2007). Intestinale Makrophagen entwickeln sich aus einwandernden Monozyten des Blutes und differenzieren sich anschließend innerhalb des Darmgewebes zu residenten Gewebsmakrophagen weiter. Diese Makrophagen weisen ein Expressionsmuster an Oberflächenrezeptoren auf, welches für eine natürliche Anergie der Zellen gegenüber luminalen Antigenen sorgt (MOWAT u.
BAIN 2011). Anders als andere Makrophagenpopulationen reagieren intestinale, residente Makrophagen refraktär gegenüber Stimulation mit Lipopolysachharid (LPS) gramnegativer Bakterien. Sie reagieren nach Antigenkontakt nicht mit einer T-
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zellaktivierenden Sekrektion proinflammatorischer Zytokine, sondern sezernieren das regulatorische Zytokin IL-10, was für die Aufrechterhaltung homöostatischer Bedingungen und die Förderung der epithelialen Integrität sorgt (B. WEBER et al.
2009). Residente intestinale Makrophagen sind des Weiteren nicht proliferationsfähig, sondern durchlaufen nach einigen Wochen den programmierten Zelltod, um anschließend durch neue Blutmonozyten ersetzt zu werden (SCHENK u.
MUELLER 2007). Unter entzündlichen Bedingungen allerdings wandern rekrutierte inflammatorische Makrophagenpopulationen in das Darmgewebe ein, die ihrerseits ein verändertes Expressionsmuster von Oberflächenmolekülen zugunsten einer proinflammatorischen Immunantwort aufweisen (MOWAT u. BAIN 2011).
Inflammatorische Makrophagen spielen im Zusammenhang mit CED eine bedeutende Rolle. Im entzündeten Gewebe von CED-Patienten mit aktivem Krankheitsgeschehen ist die Anzahl an Makrophagen, die einen inflammatorischen Phänotyp aufweisen, erhöht. Diese Makrophagen stellen innerhalb der Pathogenese von CED die Hauptquelle an TNFα-produzierenden Zellen dar (B. WEBER et al.
2009). Des Weiteren kann die Entwicklung einer Darmentzündung im Mausmodell durch eine Ablation der intestinalen Makrophagenpopulation verhindert werden (WATANABE et al. 2003). Die Population der Gewebsmakrophagen des Darms leistet also einen wichtigen Beitrag zum Erhalt der intestinalen Homöostase und ist ein weiterer kritischer Punkt innerhalb der Pathogenese entzündlicher Veränderungen des Verdauungstraktes.
2.3.2.2 Erworbene Abwehrmechanismen der Darmbarriere
Zu den erworbenen Abwehrmechanismen des Immunsystems gehören sowohl B- als auch T-Lymphozyten. Die B-Zellpopulation kann weiterhin in B1-Zellen, deren Funktion unabhängig von T-Zellen stattfindet und B2-Zellen, die eine T- Zellabhängige Antikörperproduktion zeigen, unterteilt werden (MONTECINO- RODRIGUEZ u. DORSHKIND 2012). Eine wichtige Funktion der B-Lymphozyten ist die Produktion von Immunglobulinen (Ig), wobei im Zusammenhang mit dem intestinalen Immunsystem hier v.a. die Sekretion von IgA zu nennen ist. Die Hauptaufgabe des IgA ist die Neutralisation mukusassoziierter Viren, Begrenzung der bakteriellen Translokation in die L. propria und Hemmung des mikrobiellen Wachstums (SLACK et al. 2014). Die Sekretion des IgA ins Darmlumen geschieht mittels des Polyimmunoglobulin-Rezeptors (pIgR) der IEZs (BRUNO et al. 2011).
Eine weitere wichtige Untergruppe der B-Zellen stellt die der regulativen B-Zellen (Bregs) dar, die ihrerseits durch die Produktion immunmodulatorischer Zytokine (v.a.
IL-10) für den Erhalt der intestinalen Homöostase und Wahrung der Gewebsintegrität sorgen (RAY et al. 2012). Die T-Zellpopulation lässt sich anhand der
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Oberflächenantigene zunächst grob in CD4+ T-Helferzellen (TH-Zellen) und CD8+
zytotoxische T-Zellen (Tzyt) unterteilen. Innerhalb der TH-Population existieren verschiedene Subgruppen (TH1, TH2, TH17; und regulative T-Zellen/Tregs), die sich anhand ihres sezernierten Zytokinmusters unterscheiden und somit den Verlauf der Immunantwort bestimmen (SHALE et al. 2013). Generierung und Aktivierung von TH1-Zellen, hauptsächlich durch IL-12 Sekretion antigenpräsentierender Zellen, resultiert in einer proinflammatorischen Antwort in Form von IFNγ. Dies spielt sowohl in der Abwehr gegen intrazelluläre Pathogene, aber auch in der Pathogenese autoimmuner Erkrankungen und chronischer Entzündungsreaktionen, wie CED, eine Rolle. Eine Aktivierung der Th2-Zellen führt u.a. zu einer Sekretion von IL-4, IL-10 und IL-13 und steht hauptsächlich im Zusammenhang mit der Abwehr gegen extrazelluläre, parasitäre Infektionen, aber auch mit allergischen Reaktionen, Asthma und auch CED (ZENEWICZ et al. 2009). Die Population der TH17 Zellen wird induziert durch den Transforming growth factor beta (TGFβ) und IL-6 und wird durch das Vorhandensein von IL-21 und IL-23 stabilisiert. TH17 Zellen führen zur Sekretion von IL-17a und auch IL-10. Die Rolle der TH17 Zellen in der Pathogenese entzündlicher Geschehen ist kontrovers diskutiert und es ist nicht ganz klar ob dieser Zelltyp Erkrankungen wie CED begünstigt oder innerhalb dieser sogar protektive Wirkungen innehat (SHALE et al. 2013). Die Tregs schließlich können wiederum auch verschiedenen Subpopulationen zugeteilt werden (u.a. Forkhead-Box-P3 induzierte Tregs, CD25 exprimierende Tregs). Allen Treg-Populationen gemein ist die Sekretion von IL-10 und TGFβ und die damit verbundene immunmodulatorische Wirkung und den Erhalt und Induktion eines homöostatischen Milieus. Dysfunktionen in Bezug auf die Treg Population spielen eine große Rolle innerhalb autoimmuner Geschehen und sind ein weiterer Schlüsselfaktor innerhalb der Pathogenese der CED (BARNES u. POWRIE 2009).
12 2.4 Mausmodelle zur Erforschung von CED
Zur Erforschung von CED sind mittlerweile zahlreiche verschiedene Tiermodelle etabliert. Bisher ist allerdings keines dieser Modelle in der Lage das exakte klinische und immunologische Bild von MC oder CU abzubilden. Je nach Forschungsschwerpunkt bergen die verschiedenen Modelle also sowohl Vor- als auch Nachteile bezüglich Reproduzierbarkeit der Entzündungsreaktion und Möglichkeit der Übertragung auf die humane Situation (JONES-HALL u. GRISHAM 2014). Bei den experimentellen Darmentzündungsmodellen in der Maus entwickelt sich die Darmentzündung entweder spontan, wird chemisch induziert, durch T- Zelltransfer vermittelt oder durch genetische Modifikation hervorgerufen.
Zu den Modellen, die spontan an einer Darmentzündung erkranken, gehören beispielsweise SAMP1/Yit Mäuse (senescence accelerated mouse prone) (MATSUMOTO et al. 1998) oder auch Mäuse des C3H/HeJBir Substammes (SUNDBERG et al. 1994).
Chemisch lässt sich eine Darmentzündung v.a. durch 2,4,6- Trinitrobenzensulfonsäure (TNBS) (ELSON et al. 1996) oder Dextran-Natrium-Sulfat
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Darmbarriere
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(DSS) induzieren (OKAYASU et al. 1990). Der Vorteil einer chemisch induzierten Kolitis ist die hohe Reproduzierbarkeit der Entzündungsreaktion und die vielfältigen Möglichkeiten zur Erforschung genetischer Einflussfaktoren. Die Empfänglichkeit der Mäuse für eine DSS-Kolitis hängt sowohl von Faktoren, die die Maus betreffen, als auch von der verwendeten Chemikalie selbst ab (Molekulargewicht, Konzentration, Charge), sodass es unter Umständen schwierig sein kann Studien verschiedener Autoren direkt miteinander zu vergleichen (CHASSAING et al. 2014). Das klinische Bild einer DSS-induzierten Kolitis beinhaltet v.a. Gewichtsverlust und teilweise stark blutigen Durchfall, sowie eine deutliche Verkürzung der Kolonlänge. Histologisch finden sich Erosionen und großflächige Ulzerationen des Darmepithels, Veränderungen der physiologischen Darmarchitektur und diffuse Entzündungszellinfiltrationen. Insgesamt weist dieses Modell viele Gemeinsamkeiten zum Bild der CU auf (PERSE u. CERAR 2012).
Das Prinzip einer T-Zellvermittelten Darmentzündung, einer sogenannten Transferkolitis, ist die Injektion naiver T-Zellpopulationen (z.B. CD4+CD62L+ T- Zellen) in immunsupprimierte Mausmodelle, z.B. in recombinase-activated-gene (Rag1)-defiziente Mäuse (OSTANIN et al. 2009). Da die Empfängertiere keine eigenen funktionellen T- und B-Zellen aufweisen, fehlt nach Transfer der naiven T- Zellen die immunologische Regulation durch T- und Breg Populationen, sodass es zu einer überschießenden Immunreaktion gegenüber luminalen Antigenstrukturen kommt (JONES-HALL u. GRISHAM 2014). Die Mäuse entwickeln 3 bis 4 Wochen post Transfer das klinische Bild einer chronischen Kolitis in Form von Gewichtsverlust und Durchfall, gepaart mit histologischen Krypthyperplasien, diffusen Entzündungszellinfiltrationen und teilweise auch Ulzerationen der Darmschleimhaut (MUDTER et al. 2002). Die Entwicklung einer Kolitis ist in diesem Modell vom Vorhandensein von Mikroorganismen abhängig, da keimfrei gehaltene Empfänger keinerlei Krankheitssymptome entwickeln (FENG et al. 2010). Der Krankheitsverlauf kann des Weiteren durch den gezielten Kotransfer von Treg-Populationen gemildert werden, sodass dieses Modell attraktiv für die Erforschung von T-Zellantworten innerhalb einer chronischen Darmentzündung ist (POWRIE et al. 1993).
Schließlich kann eine Kolitis auch durch gezielte genetische Modifikation hervorgerufen werden, wie es beispielsweise bei der TNFΔare (KONTOYIANNIS et al.
1999) oder der Il-10-Knockout Maus der Fall ist (KÜHN et al. 1993). IL-10 ist ein regulatives Zytokin, was von verschiedenen Immunzellen sezerniert wird. Das IL-10 hemmt eine proinflammatorische Immunantwort und wirkt sich positiv auf den Erhalt der Epithelzellintegrität des Darmepithels aus. Somit trägt IL-10 in hohem Maße zur Aufrechterhaltung eines homöostatischen Darmmilieus und zur Wiederauflösung eines entstandenen inflammatorischen Prozesses bei. Fehlt der Einfluss dieses Zytokins, kommt es, ähnlich wie bei der Transferkolitis, zu einer Immunreaktion
14
gegenüber luminalen Antigenstrukturen und somit zu einer Darmentzündung, die alle Darmabschnitte betreffen kann (JONES-HALL u. GRISHAM 2014). Die Entwicklung dieser Il10-/--basierten Kolitis ist vom Vorhandensein von Mikroorganismen abhängig.
So entwickeln keimfrei gehaltene Il10-defiziente Mäuse keinerlei Erkrankungserscheinungen und bei bakteriell besiedelten Mäusen hängt die Ausprägung der Darmentzüngung von der Zusammensetzung des intestinalen Mikrobioms ab (MÄHLER u. LEITER 2002; KEUBLER et al. 2015).
Interessanterweise ist der Verlauf der Erkrankung abhängig vom verwendeten Hintergrundstamm. Il10-/--Mäuse des C3H/HeJBir Hintergrundes entwickeln eine wesentlich höhergradige Kolitis als Mäuse des C57BL/6J Hintergrundes (BRISTOL et al. 2000). Analysen sogenannter quantitative trait loci, die mit einer erhöhten Kolitisempfänglichkeit dieser Tiere assoziiert sind, identifizierten insgesamt 10
„cytokine deficiency induced colitis susceptibility“ (Cdcs) – loci, die die Basis zur Erforschung genetischer Modulatoren des Krankheitsgeschehens darstellen (FARMER et al. 2001). Auf dem murinen Chromosom 18 befindet sich der Cdcs6 Lokus, der einen Suszeptibilitätslokus der C57BL/6J Maus trägt. Ein attraktives Kandidatengen dieses Genabschnittes stellt das „Cluster of Differentiation 14“ (Cd14) Gen dar (M. F. DE BUHR et al. 2006), was im Fokus dieser Doktorarbeit steht.
2.5 CD14
Das 55 kDa große Glykoprotein CD14 weist eine flexible hufeisenförmige Struktur auf (ZANONI u. GRANUCCI 2013) und existiert zum einen als zellmembrangebundener, glykosylphosphatidylinostitol(GPI)-geankerter Oberflächenrezeptor (mCD14) und zum anderen als lösliches Protein ohne die GPI- Verankerung (sCD14). Das sCD14 wird entweder direkt, als alternative Splicing- Variante ohne exprimierten GPI-Anker, gebildet oder entsteht als 49 kDa Molekül nachträglich aus der membrangebundenen Form durch Proteolyse der zellulären Verankerung (DURIEUX et al. 1994). Die Erstbeschreibung von CD14 war die eines Monozytenmarkers (GOYERT et al. 1986). Vor der Entdeckung des Toll-Like- Receptor 4 (TLR4) wurde CD14 dann im Zusammenhang mit der Erkennung bakteriellen LPS als eigenständiger sogenannter Pattern-Recognition-Receptor (PRR) beschrieben (PUGIN et al. 1994). Nach heutigem Wissensstand zählen zur Gruppe der PRRs sowohl die oberflächenassoziierten TLRs, „C-type lectin like receptors“ (CLRs) und „scavenger receptors“ als auch die löslichen, intrazellulären
„RIG-I-like receptors“ (RLRs) und „NOD-like receptors“ (NLRs) (BLANDER u.
SANDER 2012). PRRs werden von einer Vielzahl immunologischer und nicht- immunologischer Zellen exprimiert und dienen der zellulären Erkennung strukturell
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konservierter Antigenstrukturen und anschließender Aktivierung immunologischer Signaltransduktionswege.
2.5.1 Funktion von CD14
CD14 selbst gilt heute als Ko-Rezeptor von TLR2 und TLR4 und dient somit der Erkennung von zellwandstämmigem Peptidoglykan und LPS grampositiver und gramnegativer Bakterien (WRIGHT et al. 1990; PUGIN et al. 1994). Mittlerweile wurde CD14 aber auch als Ko-Rezeptor von TLR3,6,7 und 9 (AKASHI-TAKAMURA u. MIYAKE 2008; BAUMANN et al. 2010; C. WEBER et al. 2012) und auch im Zusammenhang mit der Erkennung apoptotischer Zellen durch Makrophagen beschrieben (SCHLEGEL et al. 1999; DEVITT et al. 2004). Somit nimmt das Molekül durch die Bindung eines breiten Spektrums an Liganden eine wichtige Rolle innerhalb immunologischer Prozesse ein. Als Ko-Rezeptor von TLR4 bindet das N- terminale Ende des CD14-Moleküls verschiedene Anteile des LPS und bildet zusammen mit dem „lipopolysachharid-binding-protein“ (LBP) einen Komplex, der wiederum an TLR4 bindet (ZANONI u. GRANUCCI 2013). Im klassischen Fall führt die Bildung des LPS/CD14/TLR4 Komplexes zusammen mit dem TLR4 assoziierten MD2 Molekül zunächst zur Signaltransduktion durch die Adaptermoleküle „toll interleukin 1 receptor (TIR) domain containing adapter protein“ (TIRAP) und „myeloid differentiation primary response gene“ (MyD88) zu einer frühen Aktivierung und nukleären Translokation von „nuclear factor kappa light chain enhancer of B-cells“
(NFκB) und auch zur Aktivierung von „mitogen-activated-protein-kinases“ (MAPKs) (AKIRA u. HOSHINO 2003). Die Aktivierung von NFκB schließlich führt u.a. zu einer erhöhten Transkription von IL-1β, IL-6, IL-12 und TNFα, die dann wiederum eine frühe proinflammatorische Immunreaktion einleiten (BLANDER u. SANDER 2012).
Im Anschluss an dieses frühe Ereignis wird TLR4 dann in einer CD14-abhängigen Weise endozytiert, woraufhin ein zweiter Signaltransduktionsweg durch die Adaptermoleküle „TIR-domain containing adaptor inducing interferon β“ (TRIF) und
„TRIF related adaptor molecule“ (TRAM) eingeleitet wird, der über die Aktivierung von „interferon regulatory factor 3“ (IRF3) zu einer Sekretion von Interferonen vom Typ I (IFNα und IFNβ) und zusätzlich zu einer weiteren, späten Aktivierung von NFκB führt (ZANONI et al. 2011). Des Weiteren existiert ein eigenständiger, TLR- unabhängiger, Signalweg von CD14, der eine Aktivierung von „nuclear factor of activated T-cells“ (NFAT) bewirkt und somit u.a. die Apoptoseinduktion dendritischer Zellen (DC), B-Zelldifferenzierung und Prostaglandin E2 (PGE2) -Sekretion einleitet (ZANONI et al. 2009; ZANONI u. GRANUCCI 2013). Studien zeigten, dass CD14 zwar für die Erkennung geringer LPS Dosen in vitro und in vivo zwingend erforderlich ist, die TLR4-Aktivierung durch höhere LPS Dosen oder durch das Vorhandensein
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lebender Bakterien aber auch unabhängig von CD14 stattfinden kann (MOORE et al.
2000; LLOYD-JONES et al. 2008). Dieser CD14-unabhängige TLR-Signalweg führt ausschließlich zu einer Aktivierung des MyD88 Weges, der TRIF Weg kann nur in Anwesenheit von CD14 aktiviert werden (JIANG et al. 2005). CD14 wird innerhalb des angeborenen Immunzell-Kompartimentes hauptsächlich von myelomonozytischen Zellen exprimiert, kommt aber auch auf der Oberfläche neutrophiler Granulozyten vor (GOYERT et al. 1986; SIMMONS et al. 1989).
Innerhalb des adaptiven Immunsystems konnte eine CD14 Expression von B-Zellen (ZIEGLER-HEITBROCK et al. 1994), bisher aber nicht von T-Zellen gezeigt werden.
Das sCD14 ist in der Lage auch an Zellen zu binden, die kein mCD14 tragen und in diesen Zellen eine LPS Erkennung über TLR4 einzuleiten (FREY et al. 1992). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass auch IECs sowohl mCD14 exprimieren als auch dass sie eine erhebliche Menge an sCD14 sezernieren (HORNEF et al. 2002;
ORTEGA-CAVA et al. 2003). Innerhalb von CED konnten einige Autoren Promotorpolymorphismen im Cd14 Gen im Zusammenhang mit einer erhöhten Erkrankungsrate an MC und CU zeigen (KLEIN et al. 2002; GAZOULI et al. 2005), andere Autoren konnten hier keine Assoziation zu CED beschreiben (ARNOTT et al.
2004; PETERS et al. 2005). Interessanterweise exprimieren humane residente Makrophagen unter homöostatischen Bedingungen keinerlei CD14 im Darm (SMITH et al. 2001), in CED Patienten hingegen ist die CD14 Expression durch die Rekrutierung inflammatorischer Makrophagen deutlich erhöht (ROGLER et al. 1997;
FROLOVA et al. 2008; LAKATOS et al. 2011). Somit scheint CD14 innerhalb der Pathogenese humaner CED eine Rolle zu spielen.
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Nach der Identifizierung von CD14 als Kandidatengen innerhalb einer Il10-/--basierten Kolitis wurden quantitative Expressionsanalysen von Cd14 im Darmgewebe zwischen Mäusen der Stämme C57BL/6J (B6) und C3H/HeJBir (C3Bir) durchgeführt.
Hierbei konnte eine wesentlich höhere Cd14 mRNA Expression von C3Bir im Vergleich zu B6 gezeigt werden. Des Weiteren wiesen Mäuse mit einem Il10- Knockout ebenfalls höhere Cd14 Genexpressionen im Darm auf als entsprechende Wildtypen (M. F. DE BUHR et al. 2006). Dieser Expressionsunterschied konnte auf eine CD14 Expression der IECs, aber v.a. auf unterschiedliche sCD14 Konzentration im Darmgewebe zwischen den beiden Stämmen zurückgeführt werden (MAIKE DE BUHR 2008). Analysen der Cd14-Promotorregion ließen eine erhöhte Promotoraktivität des Cd14 Gens von C3H im Vergleich zu B6 erkennen (HEITKAMP 2012). Versuche mit Cd14-defizienten Mäusen zeigten sowohl auf B6- als auch auf C3Bir-Hintergrund eine höhere Empfänglichkeit der Tiere gegenüber einer DSS- induzierten Kolitis. Innerhalb der Il10-/--basierten chronischen Kolitis zeigten
Abbildung 3: Signaltransduktionswege durch CD14
1: Der LBP/LPS/CD14-Komplex aktiviert den MyD88-abhängigen
Signaltransduktionsweg, der zu einer Aktivierung und nukleären Translokation von NFκB führt.
2: Im Anschluss daran wird TLR4 in einer CD14 abhängigen Weise endozytiert und der TRIF-abhängige Signaltransduktion eingeleitet. Dieser führt letztendlich zur Bildung von Typ 1 Interferonen.
3: Ein TLR-unabhängiger CD14 Signaltransduktionsweg existiert in der Aktivierung von NFAT, was u.a. zur Differenzierung von B-Zellen, Apoptose dendritischer Zellen (DCs) und zu einer Sekretion von PGE2 führt.
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doppeltdefiziente Cd14-/-Il10-/- Mäuse eine deutlich höhergradige Darmentzündung als die Il10-defizienten Kontrollen (M. F. DE BUHR et al. 2009). Keimfrei gehaltene Mäuse, die mit E. coli Nissle monoassoziiert wurden, wiesen schließlich eine erhöhte bakterielle Translokationsrate in Leber und Milz auf als entsprechende Cd14- kompetente Kontrolltiere und zeigten innerhalb des Darms auch höhere Zell- Apoptoseraten als diese (BASIC 2014). Somit existiert vermutlich ein protektiver Effekt von Cd14 auf den Verlauf einer experimentellen Darmentzündung, wahrscheinlich über die Stärkung intestinaler Barrieremechanismen.
2.6 Ziele dieser Doktorarbeit
Innerhalb dieser Doktorarbeit soll nun der Einfluss von Cd14 auf den Verlauf einer experimentellen Darmentzündung im Mausmodell näher untersucht werden. Der vermutete protektive Effekt von CD14 soll hierbei sowohl innerhalb verschiedener Kolitismodelle (akute DSS-induzierte Kolitis, chronische Il10-/--basierte Kolitis, Transferkolitis) auf Grundlage eines Cd14-Knockouts als auch durch die Untersuchung Cd14-überexprimierender Tiere im akuten Kolitismodell bestätigt werden. Der Fokus der Untersuchungen liegt hierbei v.a. auf einem möglichen stärkenden Einfluss von CD14 auf intestinale Barrieremechanismen, weshalb zunächst der Einfluss des Gens auf epitheliale Funktionen charakterisiert werden soll. In einem zweiten Schritt erfolgt dann die Analyse eines möglichen Einflusses von Cd14 auf immunologische Faktoren, wobei das Hauptaugenmerk hierbei v.a. auf T-Zellvermittelten Abwehrmechanismen liegt. Es ergeben sich somit folgende zwei Arbeitshypothesen:
1) CD14 fördert die intestinale Barriere über einen Einfluss auf Epithelzellfunktionen und angeborene Abwehrmechanismen, da es den Einfluss von TLR2 und TLR4 auf die Barriere und Regenerationseigenschaften von Epithelzellen verstärkt.
2) CD14 fördert die intestinale Barriere über einen Einfluss auf das adaptive Immunsystem und hier v.a. über T-Zellvermittelte Immunmechanismen. sCD14 dient hierbei zur Regulation der Aktivität von Effektor und regulatorischen T Zellen.
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3 Material und Methoden
3.1 Geräte
Die in dieser Studie verwendeten Geräte und Verbrauchsmaterialien sind in Anhang 8.1.1 und 8.1.2 aufgelistet.
3.2 Chemikalien
Die verwendeten Chemikalien, Reagenzien und Kits sind im Angang 8.1.3 aufgeführt.
Wenn keine weiteren Anmerkungen vorgenommen wurden, sind die Chemikalien in höchster Reinheit und Qualität von folgenden Firmen bezogen worden:
Carl Roth AG, Karlsruhe, Deutschland Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Biochrom AG, Berlin, Deutschland Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Fluka, Riedel-de Haën, Seelze, Deutschland
Detaillierte Angaben über die verwendeten Puffer und Lösungen sind in Anhang 8.1.4 zu finden.
Detaillierte Angaben über die verwendeten Antikörper und Primer sind in Anhang 8.1.5 und 8.1.6 zu finden.
20 3.3 Versuchstiere
3.3.1 Tierhaltung
Alle Mäuse dieser Studie wurden vom Zentralen Tierlabor (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) bezogen. Die Haltung der Tiere erfolgte in Gruppenhaltung von zwei bis fünf Tieren in einzelbelüfteten Käfigen („individually ventilated cage“ =IVC). Die Tiere wurden in Typ 22 Polysulfon® Käfigen (ibs tecnomara GmbH, Fernwald, Deutschland) gehalten und mit handelsüblichem, pelletierten Zuchtfutter (Altromin1310, Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG, Lage, Deutschland) und autoklaviertem (134°C/10min.) Wasser ad libitum versorgt. Zu den Tierräumen hatte nur eine begrenzte Anzahl an Personen in Schutzkleidung Zutritt (Überschuhe, Kittel, Mundschutz, Haube - Trockenbarriere). Im Raum selbst herrschten kontrollierte Umweltbedingungen. Die Temperatur betrug 21 ± 2°C und die relative Luftfeuchtigkeit lag bei 55 ± 10%. Der Beleuchtungszyklus von 14 Stunden (h) Licht und 10 h Dunkelheit wurde durch eine Kunstlichtquelle mit einer Intensität von 400 Lux generiert. Der Luftwechsel lag bei 12-14 pro h. Als Einstreu wurde Weichholzgranulat verwendet, welches einmal die Woche erneuert wurde.
Die Tiere wurden gemäß den FELASA-Empfehlungen regelmäßig und routinemäßig gesundheitlich überwacht. Ebenso fand eine regelmäßige genetische Überprüfung der Nullmutationen in den Knockout-Stämmen per PCR statt.
3.3.2 Tierschutz
Diese Studie wurde entsprechend den Bestimmungen des Deutschen Tierschutzgesetzes und der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere durchgeführt. Diese Versuche wurden von dem Niedersächsischem Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit genehmigt (AZ #11/0499).
21 3.3.3 Mausstämme
Alle in dieser Studie verwendeten Mausstämme und deren Abkürzungen sind in der folgenden Tabelle 1, getrennt nach Kolitismodellen, aufgelistet. Im Folgenden werden nur noch die Abkürzungen des jeweiligen Stammes gebraucht.
Tabelle 1: Verwendete Mausstämme und deren Abkürzungen im Kolitismodell
Stamm Abkürzung Kolitismodell
C57BL/6J.129P2-Il10tm1Cgn+/+ B6-WT* CD14 Charakterisierung akute Kolitis
C57BL/6J.129S1-Cd14tm1Smg B6-Cd14-/- CD14 Charakterisierung akute Kolitis
B6.B6D2-Tg(Mt-Cd14)M14S B6-Tg-Cd14 akute Kolitis C57BL/6J.129P2-Il10tm1Cgn B6-Il10-/- chronische Kolitis B6.129S1P2-Il10tm1CgnCd14tm1Smg B6-DKO chronische Kolitis B6.129S7-Rag1tm1Mom B6-Rag1-/- Transferkolitis B6.Cg-Rag1tm1MomCd14tm1Smg B6-Rag1-/-Cd14-/- Transferkolitis
*Dieser Stamm entstand bei der Generierung der B6-Il10-/- Tiere und dient hier als Kontrollgruppe. Die verwendete Abkürzung müsste korrekterweise B6-Il10+/+ lauten, wird im Folgenden aber der Übersicht halber vereinfacht als B6-WT bezeichnet.
3.4 Kolitismodelle
Der Einfluss von Cd14 auf die intestinale Homöostase wurde in drei verschiedenen Kolitismodellen sowie unter basalen (steady state) Bedingungen untersucht. Die Methoden zur Charakterisierung der Darmerkrankung sind in den unterschiedlichen Modellen gleich und werden im Anschluss an ihre Beschreibung eingehend beschrieben.
3.4.1 Basale Charakterisierung Cd14 defizienter Mäuse (CD14- Charakterisierung)
Um den Einfluss von Cd14 unter nicht entzündlichen steady state Bedingungen zu analysieren, wurden unbehandelte Cd14-defiziente Mäuse in verschiedenen Altersgruppen untersucht. Für die Versuche zur Bestimmung der intestinalen
22
Permeabilität in vivo wurden 4, 8, 16 und 24 Wochen alte weibliche Mäuse verwendet. Für die übrigen Experimente wurden 4, 12 und 24 Wochen alte Tiere in einem ausgewogenen Verhältnis beider Geschlechter untersucht.
Es ergeben sich folgende Versuchsgruppen:
04 Wochen: B6-WT 04 Wochen: B6-Cd14-/- 12 Wochen: B6-WT 12 Wochen: B6-Cd14-/- 24 Wochen: B6-WT 24 Wochen: B6-Cd14-/-
3.4.2 Akute Kolitis
Der Einfluss von Cd14 wurde weiterhin innerhalb einer akuten Entzündung des Darms untersucht. Hierbei wurde die Darmentzündung chemisch durch die Gabe von Dextran-Natrium-Sulfat (DSS) (Dextran-Sulfat-Sodium-Salt-Reagent-Grade MP Biomedicals) über das Trinkwasser für 7 Tage induziert. Die hierfür geeignete DSS- Konzentration, die histologisch zwar eine deutliche Kolitis hervorrief, jedoch nicht zu schwerwiegenden klinischen Symptomen führte, wurde im Vorfeld am empfänglichen Stamm (B6-Cd14-/-) ausgetestet. Sie beträgt für die hier verwendete DSS-Charge 1%. Die Mäuse wurden im Verlauf des Experimentes täglich gewogen (Taschenwaage CM 320-1N, Kern® + Sohn GmbH), wobei ein Gewichtsverlust von mehr als 20% des Ausgangs-Körpergewichts als Abbruchkriterium für den Versuch galt.
3.4.2.1 Cd14-defizientes Tiermodell
Im Rahmen dieses akuten Kolitismodells wurde der Einfluss von Cd14 durch den Vergleich Cd14-defizienter Tiere mit entsprechenden Wildtypen untersucht. Hierbei wurden ausschließlich weibliche Mäuse in einem Alter von 8 bis 12 Wochen verwendet.
23 Es ergeben sich folgende Versuchsgruppen:
B6-WT + DSS
B6-Cd14-/- + DSS
3.4.2.2 Cd14-Überexpression
Zusätzlich wurde innerhalb der DSS induzierten Kolitis ein möglicher protektiver Effekt von CD14 an Cd14-überexprimierenden Mäusen (B6-Tg-Cd14) erforscht. Bei diesem transgenen Mausstamm ist dem Cd14 Gen ein Metallothionein-Promotor vorgeschaltet, der durch das Vorhandensein von Zink-Ionen aktiviert wird. Somit kann bei diesen Mäusen durch die Gabe von Zinksulfat (ZnSO4) (Zink-Sulfat-Lösung, Sigma Aldrich) über das Trinkwasser eine Überexpression von sCD14 induziert werden (TAMURA et al. 1999). Die erforderliche Dauer und Konzentration der ZnSO4-Gabe, die zuverlässig eine signifikante Überexpression an Cd14 nach sich zieht, wurde durch Vorversuche (sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene) getestet. Hierbei hat sich eine Gabe von 0,5M ZnSO4 über einen Zeitraum von 4 Tagen als geeignet herausgestellt. Auch im Rahmen der Cd14-Überexpression wurden ausschließlich weibliche Tiere in einem Alter von 8 bis 12 Wochen verwendet.
Folgendes Versuchsprotokoll wurde gewählt:
Tage
0 4 11
Start ZnSO4 Start DSS Sektion
Abbildung 4: Versuchsprotokoll akute Kolitis - Cd14 Überexpression
24
Um einen möglichen Effekt durch die erhöhte Konzentration von Zink-Ionen auf die untersuchten Parameter zu eruieren bzw. diesen von einem Effekt durch die Cd14- Überexpression abzugrenzen, ergeben sich folgende Versuchsgruppen:
B6-Tg-Cd14 + H2O B6-Tg-Cd14 + ZnSo4 B6-Tg-Cd14 + DSS
B6-Tg-Cd14 + DSS + ZnSo4
B6-WT + H2O
B6-WT + ZnSo4
B6-WT + DSS
B6-WT + DSS + ZnSo4
3.4.3 Chronische Kolitis
Für die Analyse der Auswirkungen von Cd14 innerhalb einer chronischen Entzündung des Darms wurde das Modell der Il10-defizienten Maus gewählt. Für die Versuche im Rahmen dieses Kolitismodells wurden demnach Mäuse, die sowohl für das Cd14 Gen als auch für das Il10 Gen defizient sind (sog. DKO = Double- Knockouts), verwendet. Als Kontrollstamm dient hier B6-Il10-/-. Da Il10-defiziente Mäuse im Verlauf ihres Lebens spontan an einer Kolitis erkranken (KÜHN et al.
1993), wurden hier, analog zur basalen CD14-Charakterisierung, Mäuse verschiedener Altersklassen untersucht. Wie bei den Versuchen der CD14- Charakterisierung, wurden für die Versuche zur Bestimung der intestinalen Permeabilität in vivo ausschließlich weibliche Tiere verwendet, für die übrigen Experimente wurden beide Geschlechter seziert.
25 Es ergeben sich folgende Versuchsgruppen:
04 Wochen: B6-Il10-/- 04 Wochen: B6-DKO 12 Wochen: B6-Il10-/- 12 Wochen: B6-DKO 24 Wochen: B6-Il10-/- 24 Wochen: B6-DKO
3.4.4 Transferkolitis
Das Modell der Transferkolitis wurde gewählt, um den Einfluss von Cd14 auf eine chronische Form der Kolitis über T-Zell vermittelte Mechanismen zu untersuchen.
Hierbei wurde eine Kolitis in immundefizienten B6-Rag1-/-Cd14-/- und B6-Rag1-/- Rezipienten durch den Transfer von naiven CD4+CD62L+ T-Zellen verschiedener immunkompetenter Spendermäuse induziert. Im Modell der Transferkolitis wurden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet, wobei ein Zelltransfer ausschließlich von weiblich zu weiblich bzw. männlich zu männlich erfolgte. Nach Transfer der Zellen wurde an zwei Terminen eine in vivo Analyse der Darmentzündung durch magnetresonanztomographische Bildgebung durchgeführt.
Die Mäuse wurden im Verlauf des Experimentes dreimal wöchentlich gewogen, wobei ein Gewichtsverlust von mehr als 20% des Ausgangs-Körpergewichts als Abbruchkriterium für den Versuch galt. Im Verlauf des Experiments entwickelten die Empfängermäuse, je nach Spenderstamm, eine mehr oder weniger schwere Kolitis, sodass sich folgende Versuchsgruppen mit unterschiedlichem Versuchsprotokoll ergeben:
26 B6-WT in B6-Rag1-/-
B6-WT in B6-Rag1-/-Cd14-/-
B6-WT in B6-Rag1-/- B6-Cd14-/- in B6-Rag1-/-
Wochen
0 5 11
Injektion der
Zellen MRT MRT Sektion
9
Wochen
0 3
Injektion
der Zellen MRT MRT Sektion
7 8
Abbildung 5: Versuchsprotokoll Transferkolitis
3.5 Bestimmung der intestinalen Permeabilität in vivo
Zur Bestimmung der intestinalen Permeabilität in vivo wurde die Menge an Fluorescein-Iso-Thiocyanat(FITC)-Dextran bestimmt, die vier Stunden nach oraler Aufnahme im Urin der Mäuse detektiert werden konnte.
Um die Versuchsbedingungen zu standardisieren und einen möglichst gleichen Füllungszustand des Gastrointestinaltraktes zu gewährleisten, wurde den Mäusen vier Stunden vor Versuchsbeginn sowohl Futter als auch Wasser entzogen. Im Anschluss daran wurde den Mäusen 0,6 mg FITC-Dextran Lösung (4kDa, Sigma- Aldrich) pro g Körpergewicht durch orale Gavagierung eingegeben. Um den Urin der Tiere zu gewinnen, wurden diese dann einzeln für einen Zeitraum von weiteren vier
