Chemikalien - Material und Methoden - Einfluss von Cd14 auf die intestinale Homöostase und den

3 Material und Methoden

3.2 Chemikalien

Die verwendeten Chemikalien, Reagenzien und Kits sind im Angang 8.1.3 aufgeführt.

Wenn keine weiteren Anmerkungen vorgenommen wurden, sind die Chemikalien in höchster Reinheit und Qualität von folgenden Firmen bezogen worden:

Carl Roth AG, Karlsruhe, Deutschland Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Biochrom AG, Berlin, Deutschland Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Fluka, Riedel-de Haën, Seelze, Deutschland

Detaillierte Angaben über die verwendeten Puffer und Lösungen sind in Anhang 8.1.4 zu finden.

Detaillierte Angaben über die verwendeten Antikörper und Primer sind in Anhang 8.1.5 und 8.1.6 zu finden.

20 3.3 Versuchstiere

3.3.1 Tierhaltung

Alle Mäuse dieser Studie wurden vom Zentralen Tierlabor (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) bezogen. Die Haltung der Tiere erfolgte in Gruppenhaltung von zwei bis fünf Tieren in einzelbelüfteten Käfigen („individually ventilated cage“ =IVC). Die Tiere wurden in Typ 22 Polysulfon® Käfigen (ibs tecnomara GmbH, Fernwald, Deutschland) gehalten und mit handelsüblichem, pelletierten Zuchtfutter (Altromin1310, Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG, Lage, Deutschland) und autoklaviertem (134°C/10min.) Wasser ad libitum versorgt. Zu den Tierräumen hatte nur eine begrenzte Anzahl an Personen in Schutzkleidung Zutritt (Überschuhe, Kittel, Mundschutz, Haube - Trockenbarriere). Im Raum selbst herrschten kontrollierte Umweltbedingungen. Die Temperatur betrug 21 ± 2°C und die relative Luftfeuchtigkeit lag bei 55 ± 10%. Der Beleuchtungszyklus von 14 Stunden (h) Licht und 10 h Dunkelheit wurde durch eine Kunstlichtquelle mit einer Intensität von 400 Lux generiert. Der Luftwechsel lag bei 12-14 pro h. Als Einstreu wurde Weichholzgranulat verwendet, welches einmal die Woche erneuert wurde.

Die Tiere wurden gemäß den FELASA-Empfehlungen regelmäßig und routinemäßig gesundheitlich überwacht. Ebenso fand eine regelmäßige genetische Überprüfung der Nullmutationen in den Knockout-Stämmen per PCR statt.

3.3.2 Tierschutz

Diese Studie wurde entsprechend den Bestimmungen des Deutschen Tierschutzgesetzes und der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere durchgeführt. Diese Versuche wurden von dem Niedersächsischem Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit genehmigt (AZ #11/0499).

21 3.3.3 Mausstämme

Alle in dieser Studie verwendeten Mausstämme und deren Abkürzungen sind in der folgenden Tabelle 1, getrennt nach Kolitismodellen, aufgelistet. Im Folgenden werden nur noch die Abkürzungen des jeweiligen Stammes gebraucht.

Tabelle 1: Verwendete Mausstämme und deren Abkürzungen im Kolitismodell

Stamm Abkürzung Kolitismodell

C57BL/6J.129P2-Il10^tm1Cgn+/+ B6-WT* CD14 Charakterisierung akute Kolitis

C57BL/6J.129S1-Cd14^tm1Smg B6-Cd14^-/- CD14 Charakterisierung akute Kolitis

B6.B6D2-Tg(Mt-Cd14)M14S B6-Tg-Cd14 akute Kolitis C57BL/6J.129P2-Il10^tm1Cgn B6-Il10^-/- chronische Kolitis B6.129S1P2-Il10^tm1CgnCd14^tm1Smg B6-DKO chronische Kolitis B6.129S7-Rag1^tm1Mom B6-Rag1^-/- Transferkolitis B6.Cg-Rag1^tm1MomCd14^tm1Smg B6-Rag1^-/-Cd14^-/- Transferkolitis

*Dieser Stamm entstand bei der Generierung der B6-Il10^-/-Tiere und dient hier als Kontrollgruppe. Die verwendete Abkürzung müsste korrekterweise B6-Il10^+/+ lauten, wird im Folgenden aber der Übersicht halber vereinfacht als B6-WT bezeichnet.

3.4 Kolitismodelle

Der Einfluss von Cd14 auf die intestinale Homöostase wurde in drei verschiedenen Kolitismodellen sowie unter basalen (steady state) Bedingungen untersucht. Die Methoden zur Charakterisierung der Darmerkrankung sind in den unterschiedlichen Modellen gleich und werden im Anschluss an ihre Beschreibung eingehend beschrieben.

3.4.1 Basale Charakterisierung Cd14 defizienter Mäuse (CD14-Charakterisierung)

Um den Einfluss von Cd14 unter nicht entzündlichen steady state Bedingungen zu analysieren, wurden unbehandelte Cd14-defiziente Mäuse in verschiedenen Altersgruppen untersucht. Für die Versuche zur Bestimmung der intestinalen

Permeabilität in vivo wurden 4, 8, 16 und 24 Wochen alte weibliche Mäuse verwendet. Für die übrigen Experimente wurden 4, 12 und 24 Wochen alte Tiere in einem ausgewogenen Verhältnis beider Geschlechter untersucht.

Es ergeben sich folgende Versuchsgruppen:

04 Wochen: B6-WT 04 Wochen: B6-Cd14^-/- 12 Wochen: B6-WT 12 Wochen: B6-Cd14^-/- 24 Wochen: B6-WT 24 Wochen: B6-Cd14

-/-3.4.2 Akute Kolitis

Der Einfluss von Cd14 wurde weiterhin innerhalb einer akuten Entzündung des Darms untersucht. Hierbei wurde die Darmentzündung chemisch durch die Gabe von Dextran-Natrium-Sulfat (DSS) (Dextran-Sulfat-Sodium-Salt-Reagent-Grade MP Biomedicals) über das Trinkwasser für 7 Tage induziert. Die hierfür geeignete DSS-Konzentration, die histologisch zwar eine deutliche Kolitis hervorrief, jedoch nicht zu schwerwiegenden klinischen Symptomen führte, wurde im Vorfeld am empfänglichen Stamm (B6-Cd14^-/-) ausgetestet. Sie beträgt für die hier verwendete DSS-Charge 1%. Die Mäuse wurden im Verlauf des Experimentes täglich gewogen (Taschenwaage CM 320-1N, Kern® + Sohn GmbH), wobei ein Gewichtsverlust von mehr als 20% des Ausgangs-Körpergewichts als Abbruchkriterium für den Versuch galt.

3.4.2.1 Cd14-defizientes Tiermodell

Im Rahmen dieses akuten Kolitismodells wurde der Einfluss von Cd14 durch den Vergleich Cd14-defizienter Tiere mit entsprechenden Wildtypen untersucht. Hierbei wurden ausschließlich weibliche Mäuse in einem Alter von 8 bis 12 Wochen verwendet.

23 Es ergeben sich folgende Versuchsgruppen:

B6-WT + DSS

B6-Cd14^-/- + DSS

3.4.2.2 Cd14-Überexpression

Zusätzlich wurde innerhalb der DSS induzierten Kolitis ein möglicher protektiver Effekt von CD14 an Cd14-überexprimierenden Mäusen (B6-Tg-Cd14) erforscht. Bei diesem transgenen Mausstamm ist dem Cd14 Gen ein Metallothionein-Promotor vorgeschaltet, der durch das Vorhandensein von Zink-Ionen aktiviert wird. Somit kann bei diesen Mäusen durch die Gabe von Zinksulfat (ZnSO4) (Zink-Sulfat-Lösung, Sigma Aldrich) über das Trinkwasser eine Überexpression von sCD14 induziert werden (TAMURA et al. 1999). Die erforderliche Dauer und Konzentration der ZnSO4-Gabe, die zuverlässig eine signifikante Überexpression an Cd14 nach sich zieht, wurde durch Vorversuche (sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene) getestet. Hierbei hat sich eine Gabe von 0,5M ZnSO4 über einen Zeitraum von 4 Tagen als geeignet herausgestellt. Auch im Rahmen der Cd14-Überexpression wurden ausschließlich weibliche Tiere in einem Alter von 8 bis 12 Wochen verwendet.

Folgendes Versuchsprotokoll wurde gewählt:

Tage

0 4 11

Start ZnSO4 Start DSS Sektion

Abbildung 4: Versuchsprotokoll akute Kolitis - Cd14 Überexpression

Um einen möglichen Effekt durch die erhöhte Konzentration von Zink-Ionen auf die untersuchten Parameter zu eruieren bzw. diesen von einem Effekt durch die Cd14-Überexpression abzugrenzen, ergeben sich folgende Versuchsgruppen:

B6-Tg-Cd14 + H2O B6-Tg-Cd14 + ZnSo4 B6-Tg-Cd14 + DSS

B6-Tg-Cd14 + DSS + ZnSo4

B6-WT + H2O

B6-WT + ZnSo4

B6-WT + DSS

B6-WT + DSS + ZnSo4

3.4.3 Chronische Kolitis

Für die Analyse der Auswirkungen von Cd14 innerhalb einer chronischen Entzündung des Darms wurde das Modell der Il10-defizienten Maus gewählt. Für die Versuche im Rahmen dieses Kolitismodells wurden demnach Mäuse, die sowohl für das Cd14 Gen als auch für das Il10 Gen defizient sind (sog. DKO = Double-Knockouts), verwendet. Als Kontrollstamm dient hier B6-Il10^-/-. Da Il10-defiziente Mäuse im Verlauf ihres Lebens spontan an einer Kolitis erkranken (KÜHN et al.

1993), wurden hier, analog zur basalen CD14-Charakterisierung, Mäuse verschiedener Altersklassen untersucht. Wie bei den Versuchen der CD14-Charakterisierung, wurden für die Versuche zur Bestimung der intestinalen Permeabilität in vivo ausschließlich weibliche Tiere verwendet, für die übrigen Experimente wurden beide Geschlechter seziert.

25 Es ergeben sich folgende Versuchsgruppen:

04 Wochen: B6-Il10^-/- 04 Wochen: B6-DKO 12 Wochen: B6-Il10 -/-12 Wochen: B6-DKO 24 Wochen: B6-Il10 -/-24 Wochen: B6-DKO

3.4.4 Transferkolitis

Das Modell der Transferkolitis wurde gewählt, um den Einfluss von Cd14 auf eine chronische Form der Kolitis über T-Zell vermittelte Mechanismen zu untersuchen.

Hierbei wurde eine Kolitis in immundefizienten B6-Rag1^-/-Cd14^-/- und B6-Rag1 -/-Rezipienten durch den Transfer von naiven CD4+CD62L+ T-Zellen verschiedener immunkompetenter Spendermäuse induziert. Im Modell der Transferkolitis wurden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet, wobei ein Zelltransfer ausschließlich von weiblich zu weiblich bzw. männlich zu männlich erfolgte. Nach Transfer der Zellen wurde an zwei Terminen eine in vivo Analyse der Darmentzündung durch magnetresonanztomographische Bildgebung durchgeführt.

Die Mäuse wurden im Verlauf des Experimentes dreimal wöchentlich gewogen, wobei ein Gewichtsverlust von mehr als 20% des Ausgangs-Körpergewichts als Abbruchkriterium für den Versuch galt. Im Verlauf des Experiments entwickelten die Empfängermäuse, je nach Spenderstamm, eine mehr oder weniger schwere Kolitis, sodass sich folgende Versuchsgruppen mit unterschiedlichem Versuchsprotokoll ergeben:

26 B6-WT in B6-Rag1

-/-B6-WT in B6-Rag1^-/-Cd14^-/-

B6-WT in B6-Rag1 -/-B6-Cd14^-/- in B6-Rag1

-/-Wochen

0 5 11

Injektion der

Zellen MRT MRT Sektion

Wochen

0 3

Injektion

der Zellen MRT MRT Sektion

7 8

Abbildung 5: Versuchsprotokoll Transferkolitis

3.5 Bestimmung der intestinalen Permeabilität in vivo

Zur Bestimmung der intestinalen Permeabilität in vivo wurde die Menge an Fluorescein-Iso-Thiocyanat(FITC)-Dextran bestimmt, die vier Stunden nach oraler Aufnahme im Urin der Mäuse detektiert werden konnte.

Um die Versuchsbedingungen zu standardisieren und einen möglichst gleichen Füllungszustand des Gastrointestinaltraktes zu gewährleisten, wurde den Mäusen vier Stunden vor Versuchsbeginn sowohl Futter als auch Wasser entzogen. Im Anschluss daran wurde den Mäusen 0,6 mg FITC-Dextran Lösung (4kDa, Sigma-Aldrich) pro g Körpergewicht durch orale Gavagierung eingegeben. Um den Urin der Tiere zu gewinnen, wurden diese dann einzeln für einen Zeitraum von weiteren vier

Stunden in Stoffwechselkäfige verbracht. In dieser Zeit stand den Tieren Wasser, jedoch weiterhin kein Futter zur Verfügung. Im Anschluss daran wurde das Gesamtvolumen des ausgeschiedenen Urins mittels Pipette bestimmt und in lichtgeschützten Reaktionsgefäßen gesammelt. Da die Fluoreszenzintensität des FITC-Dextrans eine starke pH Abhängigkeit zeigt (LORENZ u. GRUENSTEIN 1999), wurden die Urinproben der Mäuse in einem Verhältnis von 1:2 mit 0,5M 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure (HEPES-Puffer) verdünnt, wobei ein einheitlicher pH-Wert von 7,4 erreicht wurde. Anschließend wurden die Fluoreszenzintensitäten in jeweils 50 µL der Proben in einer schwarzen 96-well Platte (Flat Bottom Plate, Bio-Plex Pro^TM, Bio-Rad Laboratories) im Fluoreszenzanalysegerät (VICTOR^TM X3 Multilabel Plate Reader, Perkin Elmer) bei einer Wellenlänge von 490 nm/535 nm für 1 Sekunde pro Probe gemessen. Eine definierte Menge in HEPES gelösten FITC-Dextrans wurde als Standardkonzentrationsreihe verwendet.

Da verschiedene Parameter, wie z.B. das Alter oder Geschlecht, die glomeruläre Filtrationsrate beeinflussen können (HACKBARTH u. HACKBARTH 1981), wurden innerhalb dieses Versuches ausschließlich weibliche Mäuse verwendet. Um bei der Kalkulation des parazellulär aufgenommenen FITC-Dextrans die individuelle physiologische Autofluoreszenz des Urins (LICHARDUSOVA et al. 2010) berücksichtigen zu können, wurde der Urin jeder Maus zusätzlich einen Tag vor dem Hauptversuch mithilfe der Stoffwechselkäfige aufgefangen und die Eigenfluoreszenz des Urins individuell bestimmt. Dies hatte zur Folge, dass die Mäuse den Aufenthalt im Stoffwechselkäfig bereits gewöhnt waren und erhöhte Stresslevel die glomeruläre Filtrationsrate nicht noch zusätzlich beeinflussen konnten.

28 Futter und Wasserentzug

Orale Gavage von 0,6mg/g KG FITC-Dextran

4h Sammeln von Urin

Messen der Fluoreszenzintensität

Abbildung 6: Versuchsprotokoll intestinale Permeabilität in vivo

Um die Gesamtmenge des wiedergefundenen FITC-Dextrans in ng kalkulieren zu können, wurde das Volumen des ausgeschiedenen Urins mit der Fluoreszenzintensität pro µL Probe multipliziert.

3.6 Magnetresonanztomographie (MRT)

Nicht-invasive magnetresonanz-basierte Bildgebung ist ein geeignetes Verfahren zur Phänotypisierung im chronischen Kolitismodell (MICHAEL et al. 2013). Daher wurde der Verlauf der Transferkolitis in vivo durch magnetresonanztomographische Bildgebung analysiert. Die Messungen erfolgten an einem Kleintierscanner (PharmaScan, Bruker, BioSpin, 7 Tesla). Um möglichst exakte Messungen durch Reduktion der Bewegungsartefakte und einen hohen Schärfegrad der Bilder zu gewährleisten, wurde den Mäusen 15 Minuten vor Beginn der Messung Klonidin (Clonidine hydrochloride, Sigma Aldrich) in einer Dosis von 10 µg/kg subcutan verabreicht, was zu einer reversiblen Reduktion der Darmmotilität für einen Zeitraum von ca. 2 Stunden führte. Die Anästhesie wurde mit einer Konzentration von 3%

Isofluran (Isofluran CP®, CP Pharma) und einem Sauerstofffluss von 2 L pro Minute (min.) über drei min. eingeleitet. Die Erhaltung der Narkose erfolgte mit 1,5 bis 2%

Isofluran, je nach individuellem Bedarf. Für die Messung im MRT wurden die Mäuse in Bauchlage verbracht, mit Augensalbe (Bepanthen Augensalbe, Bayer) versorgt und durch eine Wärmeplatte, welche zusätzlich zur Fixation des Tieres diente, vor Auskühlung geschützt. Die Isofluranversorgung erfolgte über eine Atemmaske. Die Anästhesietiefe wurde durch Registrierung der Atemfrequenz über einen Sensor überwacht, der unter dem Tierkörper angebracht wurde. Gemessen wurde fett- und bewegungsunterdrückt mit einer Multi Slice Multi Echo (MSME) Sequenz mit drei Echos und einer Echo-Zeit von 11000 ms im 2D Modus (256x256). Die totale Scan-Zeit betrug 8 min. 30 sek. Die Kontrast-Bandbreite betrug 5923,8 Hz. Die 46 Gewebsschnitte wurden axial gemessen, bei einer Schnitt- und Zwischenschnittdicke von jeweils 1 mm.

Als Parameter für das Vorhandensein bzw. den Schweregrad einer Kolitis wurde die Dicke der Kolon- und Rektumwand in mm als Indikator einer Hyperplasie des Darmepithels herangezogen. Diese wurden mithilfe des Computerprogramms ImageJ durchgeführt. Für die Messung der Darmwanddicke wurden jeweils drei aufeinanderfolgende Querschnitte des Darms vermessen, wobei sich das erste Bild auf Höhe des kaudalen Pols der rechten Niere befand. Pro Schnittbild wurden jeweils 8 Messungen (0°, 45°, 90°, 135°, 180°, 225°, 270°, 315°) durchgeführt und schließlich der Mittelwert hieraus bestimmt. Für die Quantifizierung der Entzündung des Zäkums wurde ein sogenannter Gewebsintensitätsfaktor ermittelt. Dazu wurden die Graustufen der gesamten Zäkumwand auf drei aufeinanderfolgenden Bildern gemessen, durch die Anzahl der eingeschlossenen Pixel geteilt und auf die entsprechende Intensität der Rückenmuskulatur normalisiert.

3.7 Histologie

3.7.1 Entnahme und Präparation des Dickdarms

Die Tötung der Mäuse erfolgte mittels CO2-Inhalation und anschließendem Entbluten. Nach Durchtrennung des knöchernen Beckenrings wurde der Dickdarm, inkl. des Rektums, in Gänze entnommen. Das Zäkum wurde am Übergang zum proximalen Kolon von diesem getrennt und in eine Standardeinbettkassette (Firma Medite) gelegt. Der restliche Darm wurde mit gepufferter Salzlösung (PBS, siehe Puffer und Lösungen 8.1.4) gespült und als sogenannte „modifizierte Swiss Roll“ in

eine Standardeinbettkassette überführt. Hierbei kommt das proximale Kolon in der Mitte der Kassette zu liegen und der Rest des Organs wird schneckenhausartig um das Zentrum herumgeführt, sodass das Bild einer Rolle entsteht. Die beiden Kassetten wurden dann für vier Tage in 4%-iges, gepuffertes Formalin (hergestellt aus 37% Formaldehyd, Firma Carl Roth) überführt und somit fixiert. Nach Fixation wurde das Zäkum mit einem Skalpell in zwei gleich große Hälften geteilt und nachträglich vom Darminhalt befreit. Die Hälften wurden mit der Anschnittseite nach unten dann wieder in die Kassette gelegt.

3.7.2 Anfertigen der histologischen Präparate

Nach Beendigung der Fixation und Zuschnitt des Zäkums wurden die Organe über Nacht paraffinisiert (Paraffin Histoplast, Thermo Fischer) und im Anschluss daran manuell eingebettet. Es wurden 3 µm dicke Gewebsschnitte beider Organe hergestellt und im Färbeautomaten mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) eingefärbt.

3.7.3 Histologische Auswertung der CD14-Charakterisierung, des chronischen Kolitismodells und der Transferkolitis

Die histologische Auswertung der Präparate erfolgte geblindet, an einem Lichtmikroskop (Carl Zeiss Mikroskopie GmbH) bei einer Gesamtvergrößerung vom 40-, 100- und 400-fachen der tatsächlichen Größe. Für die Beurteilung der Darmmorphologie der Cd14-defizienten Mäuse im steady state, des chronischen Kolitismodells und der Transferkolitis kam ein bereits etabliertes, semiquantitatives Auswertungsverfahren zum Einsatz, welches in Kooperation mit dem Jackson Laboratory (TJL) entwickelt wurde (BLEICH et al. 2004). Bei diesem Auswertungsverfahren wurden pro Darmabschnitte jeweils vier Parameter beurteilt, wobei je nach Schweregrad der Veränderungen die Punktzahlen 1 (mild) bis 3 (schwerwiegend) vergeben wurden. Das Vorliegen einer Peritonitis wurde mit einem zusätzlich zu vergebenen Punkt berücksichtigt.

31 I. Schweregrad der Entzündung

1 = Mild: Kleine, fokal begrenzte oder weit auseinander liegende multifokale, entzündete Bereiche;

Zellinfiltrationen begrenzt auf Lamina Propria (L. propria) 2 = Entweder multifokale oder lokal ausgebreitete entzündete

Bereiche; Entzündungszellinfiltrationen schließen die Tela Submukosa (T. submucosa) ein

3 = Schwerwiegend: Großflächige Ulzerationen (≥ 20 Krypten); Entzündungszellinfiltrationen bis einschließlich der Lamina Muscularis (L. muscularis)

+ 1 bei Vorliegen einer Peritonitis (Wanddurchbruch) II. Grad der Hyperplasie

1 = Mild: Morphologisch unveränderte Epithelzellschicht;

Länge der Krypten zwei- bis dreimal dicker als angrenzende Bereiche, bzw. Kontrollbereiche

2 = Moderat: Epithelzellschicht zwei- bis dreimal dicker als normal, hyperchromatische Zellen, weniger Dichte an Becherzellen, vereinzelt Krypten mit Verzweigungsmuster 3 = Schwerwiegend: Epithel ausgesprochen verdickt

(vier-oder mehrfach), deutliche Hyperchromasie der Zellen, wenige bis keine Becherzellen vorhanden, hohe Mitoserate von Zellen innerhalb der Krypten, zahlreiche Krypten mit Verzeigungsmuster

III. Grad der Gewebsulzeration

1 = 1-2 Ulzerationen pro 20 Krypten 2 = 1-4 Ulzerationen pro 20-40 Krypten

3 = Jede Form der Ulzeration, die die vorherigen Kriterien übersteigt

IV. Prozentualer Anteil veränderter Bereiche 1 = 10 - 30%

2 = 40 - 70%

3 = ≥ 70%

Das Kolon wurde für die Auswertung in drei Teile aufgeteilt (proximaler, mittlerer und distaler Teil), die getrennt voneinander untersucht wurden. Somit ergibt sich für das Zäkum eine Gesamtpunktzahl von 12 und für das gesamte Kolon eine maximal zu erreichende Punktzahl von 36.

Tabelle 2: Histologisches TJL Auswertunsschema

Organ Schweregrad Hyperplasie Ulzeration Anteil Gesamt Zäkum

(gesamt) 0 - 3 0 - 3 0 - 3 0 - 3 12

proximales

Kolon 0 - 3 0 - 3 0 - 3 0 - 3

mittleres 36

Kolon 0 - 3 0 - 3 0 - 3 0 - 3

distales

Kolon 0 - 3 0 - 3 0 - 3 0 - 3

3.7.4 Histologische Auswertung der DSS-induzierten Kolitis

Die histologische Auswertung der Präparate erfolgte bei der DSS- induzierten Kolitis ebenfalls geblindet an einem Lichtmikroskop der Firma Zeiss bei einer Gesamtvergrößerung vom 40-, 100- und 400-fachen der tatsächlichen Größe. Für die histologische Auswertung dieses Kolitismodells kam ein anderes Auswertungsschema zum Einsatz. Dieses wurde von Frau Dr. Silke Glage am ZTL speziell für die Auswertung einer DSS-induzierter Kolitis entwickelt und berücksichtigt insbesondere die typischen pathologischen Veränderungen dieses Kolitismodells, wie z.B. den Architekturverlust der Darmwand oder den Epithelzellschaden. Bei diesem semiquantitativen Schema wurden insgesamt sechs Parameter bewertet, die jeweils eine Höchstpunktzahl von 4 erreichen konnten. Hierbei wurde das Zäkum wieder in Gänze beurteilt und konnte maximal eine Gesamtpunktzahl von 23

erreichen. Das Kolon wurde in zwei Teile (proximaler und distaler Teil) aufgeteilt, die getrennt voneinander beurteilt wurden. Demnach ergibt sich eine maximal zu erreichende Punktzahl von insgesamt 46 für das gesamte Kolon.

I. Entzündungszell-Infiltrationen b. Maximale Ausdehnung

1 = Mukosa, L. propria 2 = T. submukosa

3 = Transmural, L. muscularis 4 = Wanddurchbruch, Peritonitis II. Intestinale Architektur

a. Epithelial:

1 = Lokal einzelne Erosionen 2 = Lokal ausgedehnte Erosionen 3 = Zahlreiche Erosionen

4 = Ausgedehnte Ulzerationen

b. Mukosal:

1 = Fokaler Architekturverlust, abgestumpfte Krypten

2 = Moderater Architekturverlust, Muzin-Retentionen

3 = Deutlicher Architekturverlust, Krypt-Nekrosen

4 = Keinerlei physiologische Architekur mehr vorhanden

III. Ausdehnung des Ödems

1 = Ödem in Epithelzellschicht 2 = Ödem in T. submukosa 3 = Ödem in L. muscularis

34 IV. Prozentsatz veränderter Bereiche

1 = 25%

2 = 50%

3 = 75%

4 = 100%

Tabelle 3: Auswertungsschema der DSS-induzierten Kolitis

Organ Ia Ib IIa IIb III IV Gesamt

Zäkum

(gesamt) 0 - 4 0 - 4 0 - 4 0 - 4 0 - 3 0 - 4 23 proximales

Kolon 0 - 4 0 - 4 0 - 4 0 - 4 0 - 3 0 - 4 distales 46

Kolon 0 - 4 0 - 4 0 - 4 0 - 4 0 - 3 0 - 4

3.8 Immunhistologie

3.8.1 Anfertigen von Gewebsschnitten für die immunhistologische Färbung

Für die immunhistologischen Färbungen wurden die Mäuse wie zuvor beschrieben getötet und der Darm in Gänze entnommen. Im Anschluss wurde die Zäkumspitze (ca. 1-2 cm) vom Rest des Zäkums per Scherenschlag abgetrennt und vorsichtig, möglichst gewebsschonend, mit PBS gespült. Danach wurde die gespülte Zäkumspitze in eine Standardeinbettkassette gelegt und darin für 48 h in 4%-igem, gepuffertem Formalin fixiert. Nach Fixation wurde das Organ über Nacht paraffinisiert und im Anschluss daran manuell eingebettet. Auch für die immunhistologischen Färbungen wurden ca. 3 µm dicke Gewebsschnitte angefertigt.

Vor Beginn der Färbeprotokolle wurden die Gewebsschnitte deparaffinisiert. Dafür wurden die Objektträger 3-mal für jeweils 10 min. in 100%-iges Xylol (Firma J.T.

Baker) verbracht. Es folgte eine Alkoholreihe (Ethanol, BÜFA GmbH & Co. KG) bei der die Objektträger 2-mal für je 2 min. in Alkohollösungen absteigender Konzentration (100%, 95%, 70%) verbracht wurden. Anschließend wurde der Alkohol mit destilliertem Wasser (aqua dest.) abgespült und die Objektträger nach den jeweiligen Färbeprotokollen weiterbehandelt. Während der Inkubationszeiten wurden die Objektträger in eine feuchte Kammer verbracht.

35 3.8.2 Occludin (OCLN)

Um die Proteinexpression der Tight-Junctions (TJ) des Zäkum-Epithels zu untersuchen, wurden die Gewebsschnitte für Occludin gefärbt. Hierfür wurden die unspezifischen Antigenbindungsstellen durch Inkubation mit 20mg/mL Proteinase K (Proteinase K Epicentre Biotechnologies, Biozym Scientific GmbH) in einer Verdünnung von 1:50 in PBS für 15 min. bei Raumtemperatur (RT) demaskiert.

Anschließend erfolgte ein dreimaliger Waschschritt mit PBS. Die Antigenblockierung geschah für 1 h bei Raumtemperatur mit 2,5%-igem Rinderserumalbumin (BSA) gelöst in Tris-gepufferter Salzlösung mit Tween (TBST, siehe Puffer und Lösungen 8.1.4). Im Anschluss wurde zweimal mit PBS gewaschen. Die Inkubation mit dem Primärantikörper (rabbit anti-Occludin polyclonal antibody, Invitrogen) (1:100 in Block-Lösung) fand über Nacht bei 4°C statt. Nach einem dreimaligen Waschschritt mit PBS erfolgte die Inkubation mit dem Sekundärantikörper (donkey anti-rabbit DyLight®594, Abcam) (1:500 in TBST) lichtgeschützt für 1h bei RT. Nach einem abschließenden dreimaligem Waschschritt mit PBS wurden die Gewebsschnitte mit 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) enthaltenden Medium eingedeckelt (Vectashield Mounting Medium, Vector Laboratories, Inc.). Die gefärbten Organschnitte wurden bei 400-facher Vergrößerung mit einem Fluoreszenzmikroskops (Axioskop 40 Mikroskop, Carl Zeiss Mikroskopie GmbH), welches mit einer Kamera (AxioCam Mr Digital Kamera, Carl Zeiss Mikroskopie GmbH) verbunden war, ausgewertet. Die Bilder wurden mit dem Programm AxioVision (Carl Zeiss Mikroskopie GmbH) aufgenommen. Ein Schnitt, bei dem der Primärantikörper durch reine Block-Lösung ersetzt wurde, diente hierbei als Negativkontrolle.

3.8.3 Apoptose/TUNEL-Assay

Erhöhte Apoptoseraten des Darmepithels könnten ein möglicher Faktor sein, der die Integrität des Epithels herabsetzt. Apoptotische Zellen des Zäkums wurden deshalb durch immunhistologische TUNEL (TdTmediated dUTPbiotin nick end labeling) -Färbung (In situ Cell Detection Kit, TMR red, Roche) quantifiziert. Die -Färbung der immunhistologischen Präparate erfolgte gemäß den Angaben des Herstellers. Zur Darstellung der Zellkerne wurden diese mit DAPI angefärbt. Die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen per Sichtfeld wurden bei 400-facher Vergrößerung in je 10 Gesichtsfeldern per Schnitt ausgezählt und der Mittelwert hieraus bestimmt. Die

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