Cd14-überexprimierendes Tiermodell in der akuten Kolitis

4 Ergebnisse

4.1 CD14-Charakterisierung im steady state

4.2.2 Cd14-überexprimierendes Tiermodell in der akuten Kolitis

Die Ergebnisse innerhalb des akuten Kolitismodells zeigten eine höhere Suszeptibilität Cd14-defizienter Tiere gegenüber Wildtyptieren für eine DSS Abbildung 32: Multiplex-Analyse sezernierter Zytokine aus CD3-stimulierten Zellen der Mesenteriallymphknoten im Cd14-defizienten Modell unter DSS Gabe. Die zellfreien Kulturüberstände wurden nach 24 h hinsichtlich ihres Zytokinmusters untersucht. (n=7; im Fall von RANTES n=2, Mean ± SEM, t-Test)

induzierte Kolitis. Um diesen möglichen protektiven Effekt von CD14 auf die Entwicklung einer akuten Darmentzündung weiter zu eruieren, wurde ein Cd14-überexprimierendes Tiermodell gewählt. Bei diesen transgenen Mäusen (B6-Tg-Cd14) lässt sich durch die orale Gabe von Zinksulfat (ZnSO4) über das Trinkwasser eine Überexpression von sCD14 induzieren (siehe Material und Methoden 3.4.2.1).

Um einen möglichen Effekt durch Zinkionen auf die untersuchten Parameter zu berücksichtigen, bzw. diesen von einem möglichen Effekt durch CD14 abzugrenzen, wurden entsprechende Wildtyptiere, die in gleicher Weise Zinksulfat über das Trinkwasser erhielten, ebenfalls mit untersucht.

Zunächst wurde in Proben des distalen Dünndarms untersucht, ob in den transgenen B6-Tg-Cd14 Tieren durch die Gabe von ZnSO4 über das Trinkwasser für 4 Tage zuverlässig eine erhöhte Expression des Cd14 Gens sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene induziert wird. Die Ergebnisse der qRT-PCR zeigten, dass sich bei B6-Tg-Cd14 Mäusen durch die Gabe von ZnSO4 sowohl im steady state (B6-Tg-Cd14 + H2O vs. B6-Tg-Cd14 + ZnSO4), als auch unter entzündlichen Bedingungen (B6-Tg-Cd14 + DSS vs. B6-Tg-(B6-Tg-Cd14 + ZnSO4/DSS) eine signifikant höhere Cd14-Expression hervorrufen lässt (Abb. 33). Des Weiteren ist eine erhöhte Cd14 Expression von B6-Tg-Cd14 + DSS im Vergleich zu B6-Tg-Cd14 + H2O zu erkennen.

Bei den entsprechenden B6-WT Kontrollgruppen zeigte sich kein Einfluss von ZnSO4

auf die Cd14 Expression. Auch blieb eine Erhöhung der Cd14-Expression unter DSS-Gabe aus.

Abbildung 33:Ergebnisse der qRT-PCR von Proben des distalen Dünndarms (dsi) von Cd14 bei B6-Tg-Cd14 und B6-WT Mäusen. Die relative Genexpression (RQ) ist logarithmisch in Bezug auf eine Referenzprobe angegeben. (n=3-5; Mean ± SEM, einfaktorielle ANOVA mit anschließendem Tukey Test)

Zusätzlich wurden innerhalb der transgenen Versuchsgruppe Western-Blot Analysen des CD14-Proteins durchgeführt (Abb. 34). Hierbei konnte das Cd14-Expressionsmuster der qRT-PCR auf Proteinebene bestätigt werden. Sowohl im steady state als auch unter DSS-Gabe wurde bei B6-Tg-Cd14 Mäusen durch die Gabe von ZnSO4 zuverlässig eine erhöhte CD14 Expression induziert.

Anschließend wurden quantitative ELISA-Untersuchungen des dsi der transgenen Mäuse durchgeführt, die die Ergebnisse des Western Blots bestätigten. Auch hier zeigten die zinkbehandelten transgenen Tiere in jedem Fall eine signifikant höhere CD14 Expression als die Tiere, die kein Zink über das Trinkwasser erhielten (Abb.

35).

Abbildung 34: Western-Blot Analyse von CD14 mit einer Belichtungszeit von 4 Minuten im dsi. Als endogene Kontrolle diente GAPDH (Belichtungszeit 2 Minuten).

Im Vergleich sind Cd14-überexprimierende B6-Tg-Cd14 Mäuse mit und ohne ZnSO4

im steady state und unter DSS-Gabe dargestellt.

CD14

+ZnSO4/DSS +DSS

+ZnSO4

+H2O

GAPDH

Abbildung 35: CD14-ELISA in dsi Proben von B6-Tg-Cd14 Mäusen mit und ohne ZnSO4 im steady state und unter DSS-Gabe. Die CD14 Konzentration wurde in Bezug auf die Proteinmenge der Proben dargestellt.(n=4-5; Mean ± SEM, einfaktorielle ANOVA mit anschließendem Tukey test)

Auch hinsichtlich der CD14-Expression im Plasma der transgenen Versuchstiere konnte per ELISA deutlich gezeigt werden, dass eine Gabe von 0,5M ZnSO4 eine sehr deutliche Überexpression an sCD14 hervorruft. Zinkbehandelte B6-Tg-Cd14 Mäuse zeigten durchgehend eine signifikante Erhöhung der CD14 Expression im Vergleich zu den Tieren ohne Zinksulfatgabe. Des Weiteren wiesen hierbei die transgenen Mäuse, die DSS über das Trinkwasser erhielten, signifikant höhere CD14-Konzentrationen im Plasma auf als die Mäuse, die nur H2O zu sich nahmen.

Innerhalb der Wildtypkontrollgruppe zeigten sich keine Unterschiede bezüglich der CD14-Expression im Plasma durch die Gabe von ZnSO4 (Abb. 36).

Der klinische Verlauf der DSS-induzierten Kolitis unterschied sich nicht zwischen den Versuchsgruppen der transgenen Mäuse. Sowohl die Versuchsgruppe mit als auch die Gruppe ohne Überexpression entwickelte ab Tag 5 des Versuches Durchfall und verloren im Versuchsverlauf unter DSS-Gabe gleichermaßen an Gewicht, unabhängig vom CD14 Status (Abb. 37A).

Im Falle der untersuchten B6-WT Kontrollgruppen ergaben sich ebenfalls keine Unterschiede bezüglich des klinischen Erscheinungsbildes und des Gewichtsverlaufes unter DSS-Gabe, unabhängig von der Zinksulfatgabe. (Abb. 37B).

Abbildung 36: CD14-ELISA in Plasma Proben von B6-Tg-Cd14 und B6-WT Mäusen mit und ohne ZnSO4 im steady state und unter DSS-Gabe. Die CD14 Konzentration wurde in ng/mL Plasma angegeben.(n=3-5; Mean ± SEM, einfaktorielle ANOVA mit anschließendem Tukey Test)

Abbildung 37: Gewichtsverlauf im Cd14-überexprimierenden Tiermodell unter DSS Gabe. Es wurde eine akute Kolitis durch die Gabe von 1% DSS für 7d über das Trinkwasser der Mäuse induziert. Die Cd14-Überexpression wurde zuvor in den transgenen B6-Tg-Cd14 Mäusen durch die Gabe von 0,5M ZnSo4 über das Trinkwasser induziert und wurde über den Versuchszeitraum aufrechterhalten. Der

Gewichtsverlauf wurde täglich erfasst und in % vom Ausgangsgewicht dargestellt.

A: B6-Tg-Cd14 + DSS und B6-Tg-Cd14 + ZnSo4/DSS B: B6-WT + DSS und B6-WT + ZnSO4/DSS (n=8; Mean ± SEM, zweifaktorielle ANOVA mit anschließendem Sidak Test)

4.2.2.1 Einfluss der Cd14-Überexpression auf die epitheliale Darmbarriere im akuten Kolitismodell

Auch innerhalb des Cd14-überexprimierenden Tiermodells wurde im Rahmen der akuten DSS-induzierten Kolitis zunächst die intestinale Permeabilität in vivo durch Messung der parazellulären FITC-Dextran Aufnahme nach oraler Gavage bestimmt.

Die parazelluläre Dextranaufnahme unterschied sich innerhalb der transgenen Versuchsgruppe zwischen Mäusen mit und ohne DSS-Gabe nicht. Allerdings wiesen die CD14-überexprimierenden Mäuse bei gleichzeitiger Gabe von ZnSO4 und DSS tendenziell deutlich niedrigere Dextranaufnahmen auf als die Mäuse ohne CD14 Überexpression. Innerhalb der B6-WT Kontrollgruppe zeigte sich bezüglich der Dextranaufnahme ebenfalls kein Unterschied zwischen den unbehandelten B6-WT Mäuse (B6-WT + H2O) und den DSS-behandelten B6-WT Mäusen (B6-WT + DSS).

Die erniedrigte Permeabilität bei gleichzeitiger ZnSO4 und DSS-Gabe zeigte sich in dieser Versuchsgruppe allerdings nicht. Dies deutet darauf hin, dass die Abnahme der intestinalen Permeabilität der CD14 überexprimierenden Mäuse (B6-Tg-Cd14 + ZnSO4/DSS) im Vergleich zu den Tieren ohne Überexpression (B6-Tg-Cd14 + DSS) durch einen Effekt des CD14 hervorgerufen wird und nicht durch die Zinkionen selbst ausgelöst wurde.

Abbildung 38: Bestimmung der intestinalen Permeabilität im Cd14-überexprimierenden Modell unter DSS-Gabe in vivo. Die Abbildung zeigt die parazellulär aufgenommene Menge FITC-Dextran in ng innerhalb von 4 h. A: B6-Tg-Cd14 B: B6-WT (n=3-6; Mean ± SEM, einfaktorielle ANOVA mit anschließendem Tukey Test)

Im weiteren Verlauf wurde die mRNA Expression von Zo-1, Ocln und Cldn4 im Zäkum unter DSS-Gabe per qRT-PCR quantifiziert (Abb. 39A-C).

Im Falle der mRNA Expression von Zo-1 zeigten CD14 überexprimierende B6-Tg-Cd14 Tiere (B6-Tg-B6-Tg-Cd14 + ZnSO4) im steady state einen tendenziellen Anstieg gegenüber den Mäusen der unbehandelten B6-Tg-Cd14 Gruppe (B6-Tg-Cd14 + H20). Dieser Anstieg blieb bei den entsprechenden Wildtypkontrollen (B6-WT + ZnSO4) aus. Die gleiche Tendenz einer höheren Zo-1 Expression unter Zinkgabe war unter entzündlichen Bedingungen zwischen den Mäusen der Kontrollgruppen B6-WT + DSS und B6-WT + ZnSO4/DSS zu erkennen. Ansonsten ergaben sich keine Unterschiede bezüglich der relativen Genexpression von Zo-1 zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen.

Bezüglich des Ocln zeigte sich kein Einfluss der ZnSO4-Gabe unter basalen Bedingungen (+ H2O vs. + ZnSO4) in beiden Stämmen. Innerhalb der transgenen Versuchsgruppe zeigten DSS behandelte transgene B6-Tg-Cd14 Mäuse (B6-Tg-Cd14 + DSS) unter entzündlichen Bedingungen gegenüber den unbehandelten B6-Tg-Cd14 Tieren (B6-B6-Tg-Cd14 + H2O) einen sehr leichten Abfall der Ocln Expression.

Dieser Abfall war bei den DSS behandelten B6-WT Mäusen (B6-WT + DSS) gegenüber unbehandelten B6-WT Mäusen (B6-WT + H2O) deutlicher, wenn auch nicht statistisch signifikant. Innerhalb der DSS-Gruppen kam es bei den CD14 überexprimierenden B6-Tg-Cd14 Mäusen (B6-Tg-Cd14 + ZnSO4/DSS) gegenüber DSS behandelten B6-Tg-Cd14 Tieren ohne Überexpression (B6-Tg-Cd14 + DSS) zu einem hochsignifikanten Anstieg der Ocln-Expression weit über das Expressionslevel der basalen B6-Tg-Cd14 Gruppen (+ H2O, + ZnSO4) hinaus. Innerhalb der Kontrollgruppen konnte bei DSS behandelten B6-WT Mäusen unter Zinkgabe (B6-WT + ZnSO4/DSS ) zwar ebenfalls ein leichter Anstieg der Ocln-Expression gezeigt werden, welcher jedoch statistisch nicht signifikant war. Dies deutet darauf hin, dass die Erhöhung der Ocln-Expression in den B6-Tg-Cd14 Mäusen nicht durch ZnSO4

hervorgerufen wird, sondern durch die erhöhte CD14-Konzentration bedingt ist.

Die Ergebnisse der Cldn4-Expression zeigten zunächst einen tendenziellen Abfall der Expressionsrate unter basalen Bedingungen bei den CD14 überexprimierenden B6-Tg-Cd14 Mäusen (B6-Tg-Cd14 + ZnSO4 ) gegenüber unbehandelten B6-Tg-Cd14 Tieren (B6-Tg-Cd14 + H2O), welcher bei den entsprechenden Wildtypgruppen nicht gezeigt werden konnte. In beiden Stämmen kam es unter DSS-Gabe zu einem deutlichen Abfall der Cldn4-Expression, welcher im Falle der DSS behandelten B6-WT Mäuse gegenüber unbehandelten B6-B6-WT auch signifikant war. Dieser Abfall konnte durch die gleichzeitige Gabe von Zinkionen in beiden Stämmen (+ DSS vs. + ZnSO4/DSS) tendenziell verhindert werden, was darauf hindeutet, dass CD14 bezüglich der erhöhten Cldn4-Expression keinen deutlichen Effekt hat und die Veränderungen wahrscheinlich durch das ZnSO4 selbst bedingt sind.

Abbildung 39:Ergebnisse der qRT-PCR von Zäkumproben von A Zo-1, B Ocln und C Cldn4 im Cd14-überexprimierenden Modell unter DSS-Gabe. Die relative Genexpression (RQ) ist in Bezug auf eine Referenzprobe angegeben. (n=7;

Mean ± SEM, einfaktorielle ANOVA mit anchließendem Tukey Test)

Um die Erhöhung der Occludinexpression durch die CD14 Überexpression auf Proteinebene zu bestätigen, wurden immunhistologische OCLN-Färbungen in den Zäka der Tiere durchgeführt (Abb. 40). Hierbei war ein deutlicher Anstieg der epithelialen OCLN-Expression in den DSS behandelten überexprimierenden Mäusen (B6-Tg-Cd14 + ZnSO4/DSS) gegenüber behandelten Mäusen ohne Überexpression (B6-Tg-Cd14 + DSS) zu erkennen.

Als nächstes wurde die Apoptoserate in den Zäka der Tiere mittels TUNEL-Assay bestimmt (Abb.41). Hierbei zeigten sich keine Unterschiede bezüglich der Zell-Apoptoseraten zwischen den Kontrollgruppen B6-Tg-Cd14 + H2O und B6-Tg-Cd14 + ZnSO4 im steady state. Unter entzündlichen Bedingungen wiesen die transgenen DSS behandelten CD14 überexprimierende Mäuse (B6-Tg-Cd14 + ZnSO4/DSS) gegenüber den DSS behandelten transgenen Mäusen ohn e Überexpression (B6-Tg-Cd14 + DSS) ebenfalls keine Unterschiede in den Zell-Apoptoseraten des Zäkums auf. Innerhalb der Wildtyp-Kontrollgruppen zeigten sowohl die Mäuse der Gruppe B6-WT + H2O gegenüber B6-WT + ZnSO4 als auch die Mäuse der Gruppe B6-WT + DSS gegenüber B6-WT + ZnSO4/DSS keine Unterschiede in der Anzahl apoptotischer Zellen im Zäkum. Dies zeigt, dass sCD14 hier keinen direkten Effekt auf die Zell-Apoptoseraten zu haben scheint.

Abbildung 40:Immunhistologische Färbung des Zäkums Cd14-überexprimierender Mäuse für OCLN unter DSS-Gabe (repräsentative Auswahl). OCLN stellt sich auf der luminalen Seite entlang der Epithelzellschicht in rot dar (Pfeile). Die Zellkerne (blau) wurden mit DAPI angefärbt. (40-fache Gesamtvergrößerung)

A= B6-Tg-Cd14 + DSS B= B6-Tg-Cd14 + ZnSO4/DSS A B

50 µm

Im weiteren Verlauf wurde die Proliferationsrate der L. propria Zellen im Zäkum durch immunhistologische Färbung mit Ki67 bestimmt (Abb. 42). Im steady state zeigten die Tiere, die Zink erhalten haben, eine signifikant höhere Proliferationsrate der L.

propria Zellen (CD14 überexprimierende B6-Tg-Cd14 + ZnSO4 vs. B6-Tg-Cd14 + H2O Mäuse und B6-WT + ZnSO4 vs. B6-WT + H2O Mäuse), wobei die CD14 überexprimierenden B6-Tg-Cd14 Mäuse (B6-Tg-Cd14 + ZnSo4) im Mittel eine wesentlich höhere Proliferationsrate aufweisen, als die Mäuse der Gruppe B6-WT + ZnSO4. Unter DSS-Gabe wiesen die Mäuse der Gruppe B6-WT + ZnSO4/DSS gegenüber denen der Gruppe B6-WT + DSS ebenfalls einen signifikant höheren Anteil proliferierender Zellen auf, wohingegen hinsichtlich der Proliferationsraten zwischen DSS behandelten CD14 überexprimierenden B6-Tg-Cd14 Mäusen (B6-Tg-Cd14 + ZnSO4/DSS) und B6-Tg-Cd14 ohne Überexpression (B6-Tg-Cd14 + DSS) unter entzündlichen Bedingungen kein Unterschied mehr bestand. Die Ergebnisse zeigen, dass Zinkionen die Proliferationsraten der L. propria Zellen signifikant zu erhöhen scheinen. Dieser Effekt wird wahrscheinlich bei den transgenen Tieren durch eine erhöhte Entzündungszellproliferation bei den Mäusen der Gruppe B6-Tg-Cd14 + DSS gegenüber denen der Gruppe B6-Tg-B6-Tg-Cd14 + ZnSO4/DSS überlagert.

Abbildung 41: Auswertung der immunhistologischen TUNEL-Färbung der Zäka im Cd14-überexprimierenden Modell unter DSS-Gabe. Die Abbildung zeigt die Anzahl TUNEL-positiv gefärbter Zellen je Gesichtsfeld. A: B6-Tg-Cd14 B: B6-WT (n=3-6;

Mean ± SEM, einfaktorielle ANOVA)

4.2.2.2 Einfluss einer Cd14-Überexpression auf Entzündungsparameter des Darms im akuten Kolitismodell

Nach den Untersuchungen zur epithelialen Darmbarriere sollte auch ein möglicher Einfluss einer Cd14-Überexpression auf immunologische Parameter des Darms erfolgen. Hierfür wurden zunächst histologische Beurteilungen H&E gefärbter Organschnitte des Dickdarms mittels des semiquantitativen Auswertungsschemas für eine DSS-induzierte Kolitis (siehe Material und Methoden 3.4.2.1) vorgenommen (Abb. 43). Im steady state zeigte sich innerhalb der transgenen Versuchsgruppe kein Unterschied zwischen den unbehandelten transgenen Mäusen (B6-Tg-Cd14 + H2O) und den zinkbehandelten CD14 überexprimierenden Tieren (B6-Tg-Cd14 + ZnSO4) bezüglich der Morphologie des Darms. In beiden Versuchsgruppen wurden keine Anzeichen einer Darmentzündung oder andere pathologische Veränderungen gefunden. Unter DSS-Gabe zeigte sich ein deutlicher Unterschied innerhalb der transgenen Versuchsgruppen. DSS behandelte CD14 überexprimierende Mäuse (B6-Tg-Cd14 + ZnSO4/DSS) wiesen im Kolon einen signifikant geringeren histologischen Score auf, als DSS behandelte transgene Tiere ohne Überexpression (B6-Tg-Cd14 + DSS). Dieser Unterschied konnte im Zäkum nicht gezeigt werden.

Die Mäuse ohne CD14-Überexpression (B6-Tg-Cd14 + DSS) zeigten hierbei im Kolon einen wesentlich höheren Anteil ulzerierender Bereiche, ausgeprägtere nekrotoische Bereiche und weitreichendere Infiltrationen mit Entzündungszellen als die DSS behandelten CD14 überexprimierenden Mäuse (B6-Tg-Cd14 + ZnSO4/DSS). Die pathologischen Veränderungen der DSS induzierten Kolitis waren Abbildung 42:Auswertung der immunhistologischen Färbung der Zäka für Ki67 im Cd14-überexprimierenden Modell unter DSS-Gabe. Die Abbildung zeigt die Anzahl Ki67-positiv gefärbter Zellen in der L. propria je Gesichtsfeld. A: B6-Tg-Cd14 B: B6-WT (n=6; Mean ± SEM, einfaktorielle ANOVA mit anschließendem Tukey Test)

im Kolon bei den Mäusen ohne CD14-Überexpression (B6-Tg-Cd14 + DSS) gegenüber den transgenen Tieren, die nur Wasser erhielten (B6-Tg-Cd14 + H2O), ebenfalls signifikant höher, wobei die CD14 überexprimierenden Mäuse unter DSS-Gabe (B6-Tg-Cd14 + ZnSO4/DSS) gegenüber den basalen unbehandelten Mäusen (B6-Tg-Cd14 + H2O) keine statistisch signifikanten Unterschiede bezüglich des histologischen Scores aufwiesen.

Um einen möglichen Effekt durch das ZnSO4 von einem durch CD14 abzugrenzen, wurden die Organschnitte von Wildtypen, die ebenfalls zusätzlich zur DSS-Gabe Zink erhalten haben, histologisch beurteilt. (Abb. 44). Hierbei ergaben sich keine Unterschiede bezüglich des histologischen Scorings zwischen den Mäusen der gruppen B6-WT + DSS und B6-WT + ZnSO4/DSS. Dies deutet darauf hin, dass der geringere histologische Score von den CD14 überexprimierenden Mäusen im Vergleich zu den Mäusen ohne CD14-Überexpression unter DSS-Gabe auf einen direkten Effekt von CD14 zurückzuführen ist und nicht durch durch die Gabe von ZnSO4 hervorgerufen wird.

Abbildung 43: Histologische Untersuchung von Zäkum und Kolon im Cd14-überexprimierenden Modell unter DSS-Gabe. Die Abbildung zeigt die Beurteilung H&E gefärbter Schnitte nach einem semiquantitativen Auswertungsschema. (n=6-13;

Median ± Min./Max., Kruskal-Wallis Test mit anschließendem Dunn’s Test)

Im Folgenden sind repräsentative Bilder von den transgenen Versuchsgruppen B6-Tg-Cd14 + DSS und B6-B6-Tg-Cd14 + ZnSO4/DSS dargestellt (Abb. 45 und 46):

Abbildung 44: Histologische Untersuchung von Zäkum und Kolon zinkbehandelter Wildtyptiere im akuten Kolitismodell. Die Abbildung zeigt die Beurteilung H&E gefärbter Schnitte nach einem semiquantitativen Auswertungsschema. (n=6-13;

Median ± Min./Max, Mann-Whitney Test)

Abbildung 45: Histologische H&E gefärbte Schnitte des Kolons von DSS behandelten B6-Tg-Cd14 Mäusen im akuten Kolitismodell (A+C = 5-, B+D = 10-fache Vergrößerung). Insgesamt zeigen sich hochgradige pathologische Veränderungen (Pfeile) in Form von großflächigen Ulzerationen, Muzinretentionen, nekrotischen Bereichen und Entzündungszellinfiltrationen (Kreise) z.T. bis in die L. muscularis und mit Durchbruch in die Bauchhöhle (Peritonitis).

5-fach 10-fach

C D

200 µm 100 µm

Abbildung 46: Histologische H&E gefärbte Schnitte des Kolons von DSS behandelten CD14 überexprimierenden B6-Tg-Cd14 Mäusen im akuten Kolitismodell (A+C = 5-, B+D = 10-fache Vergrößerung). Insgesamt zeigen sich gering- bis mittelgradige pathologische Veränderungen (Pfeile) in Form von abgestumpften Krypten, Muzinretentionen, vereinzelten nekrotischen Bereichen und Entzündungszellinfiltrationen (Kreise) z.T. bis in die T. submucosa.

5-fach 10-fach

C D

100 µm 200 µm

In einem nächsten Schritt wurde die mRNA-Expression der inflammatorischen Zytokine Tnfα und Ifnγ per qRT-PCR im proximalen Kolon bestimmt (Abb. 47). Die transgenen Mäuse ohne CD14 Überexpression (B6-Tg-Cd14 + DSS) wiesen unter DSS-Gabe eine signifikant höhere Tnfα Expression auf, als unbehandelte transgene Tiere (B6-Tg-Cd14 + H2O). Der gleiche Unterschied war auch innerhalb der Kontrollgruppe zwischen Mäusen der Gruppen B6-WT + DSS und B6-WT + H2O vorhanden, wenn auch dieser nicht statistisch signifikant war. Unter DSS-Gabe nahm die Tnfα Expression bei gleichzeitiger Zink-Gabe in den Mäusen beider Stämme (B6-Tg-Cd14 + DSS vs. B6-(B6-Tg-Cd14 + ZnSO4/DSS und B6-WT + DSS vs. B6-WT + ZnSo4/DSS) ab, wobei dies innerhalb der transgenen Gruppe zwischen den CD14 überexprimierenden Tieren und denen ohne CD14-Überexpression statistisch signifikant und um einiges deutlicher war als bei den Wildtypmäusen, bei denen nur ein tendenzieller Unterschied erkennbar war. Dies deutet insgesamt daraufhin, dass ZnSO4 die Expression von Tnfα unter DSS Gabe erniedrigt, die gleichzeitig hohe Expression von CD14 die Tnfα-Expression aber wesentlich stärker reduziert.

Im Falle des Ifnγ konnte keine Genexpression im proximalen Kolon der transgenen Mäuse (B6-Tg-Cd14 + DSS und B6-Tg-Cd14 + ZnSO4/DSS) detektiert werden, sodass auf die Untersuchung weiterer Gruppen verzichtet wurde.

Abschließend wurde das Zytokinmuster der T-Zell-Antworten CD14-überexprimierender Mäuse im akuten Kolitismodell per Multiplex-Analyse untersucht (Abb. 48 und 49). Von den untersuchten Zytokinen konnten auch in diesem Modell TNFα, IFNγ, IL-2, IL-6, RANTES und MIG nachgewiesen werden. Unter

Abbildung 47: Ergebnisse der qRT-PCR von Tnfα im Cd14-überexprimierenden Modell unter DSS-Gabe. Die Abbildung zeigt die relative Genexpression in Bezug auf Actb, berechnet mithilfe der 2^ΔΔCT Methode. A: B6-Tg-Cd14 B: B6-WT (n=7;

Mean ± SEM, Kruskal-wallis Test mit anschließendem Dunn‘s Test, Daten nicht normalverteilt – Shapiro Wilk Test auf Normalverteilung)

entzündlichen Bedingungen konnte im Falle von TNFα, IFNγ, IL-2 und RANTES eine signifikant geringere Zytokinproduktion der Zellen aus den CD14 überexprimierenden transgenen Mäusen (B6-Tg-Cd14 + ZnSO4/DSS) im Vergleich zu denen ohne CD14 Überexpression (B6-Tg-Cd14 + DSS) gezeigt werden. Bezüglich des IL-6 und des RANTES war dieser Unterschied ebenfalls vorhanden, wenn auch statistisch nur eine starke Tendenz bestand.

Die Untersuchung der Zellkulturüberstände der Kontrollgruppen zeigten keine Unterschiede zwischen den Mäusen der Versuchsgruppen B6-WT + ZnSO4/DSS und B6-WT + DSS unter entzündlichen Bedingungen. Dies deutet darauf hin, dass die geringere Zytokinkonzentration der Zellen aus den CD14 überexprimierenden Tieren (B6-Tg-Cd14 + ZnSO4/DSS) im Vergleich zu denen aus nicht überexprimierenden Mäusen (B6-Tg-Cd14 + DSS) auf einen direkten Effekt von CD14 zurückzuführen ist und nicht durch die Gabe von ZnSO4 hervorgerufen wird.

Abbildung 48: Multiplex-Analyse sezernierter Zytokine aus CD3-stimulierten Zellen der Mesenteriallymphknoten Cd14-überexprimierender Tiereimakuten Kolitismodell.

Die zellfreien Kulturüberstände wurden nach 24 h hinsichtlich ihres Zytokinmusters untersucht. (n=7; Mean ± SEM, t-Test)

Die Untersuchung Cd14-überexprimierenden Tiere konnte den vermuteten protektiven Effekt von CD14 auf die Entwicklung einer DSS-Kolitis bestätigen. Die Mäuse mit höheren sCD14 Konzentrationen zeigten eine Erhöhung der epithelialen Integrität gegenüber normal-exprimierenden Mäusen unter DSS-Gabe und zeigten weiterhin eine wesentlich mildere Darmentzündung mit geringerer Expression inflammatorischer Zytokine. In Kontrast zu den bisherigen Ergebnissen bezüglich der Zytokinsekretion von T-Zellen zeigten CD14 überexprimierende Mäuse hierbei eine geringere Konzentration inflammatorischer Zytokine, sodass der Einfluss von sCD14 auf die Proliferation von T-Zellen negativ regulierend zu sein scheint.

4.3 Chronische Kolitis

Die bisherigen Ergebnisse zeigten eine erhöhte Suszeptibilität Cd14-defizienter Tiere für eine akute DSS-induzierte Kolitis und deuteten auch auf einen protektiven Effekt Abbildung 49:Multiplex-Analyse sezernierter Zytokine aus CD3-stimulierten Zellen der Mesenteriallymphknoten in den Kontrollgruppen der Cd14-Überexpression im akuten Kolitismodell. Die zellfreien Kulturüberstände wurden nach 24 h hinsichtlich ihres Zytokinmusters untersucht. (n=2-5; Mean ± SEM, t-Test)

einer Cd14-Überexpression innerhalb dieses Modelles hin. In einem nächsten Schritt sollte nun untersucht werden, ob ein ähnlicher Einfluss von Cd14 auch innerhalb einer chronischen Entzündung des Darms besteht. Als Tiermodell wurde hierbei die Cd14-Il10-doppeldefiziente Maus gewählt (B6-DKO). Da Il10-defiziente Mäuse im Altersverlauf spontan eine chronische Entzündung des Darms entwickeln (siehe Material und Methoden 3.5), wurden innerhalb dieses Kolitismodells, analog zur CD14 Charakterisierung im steady state, verschiedene Altersklassen untersucht.

B6-DKO Mäuse entwickelten klinisch im Vergleich zu B6-Il10^-/-Mäusen insgesamt früher den Phänotyp einer Darmerkrankung in Form von rektalen Prolapsen. Die physische Entwicklung der Mäuse war im Vergleich zu gleichaltrigen B6-Il10^-/- Tieren langsamer und die Jungtiersterblichkeit höher. Durch die recht frühe Entwicklung eines rektalen Prolapses war die Zuchtleistung insgesamt schlecht und die Tiere

Im Dokument Einfluss von Cd14 auf die intestinale Homöostase und den Verlauf von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im Mausmodell (Seite 92-110)