Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375
e-mail: info@dvg.net · Homepage: http://www.dvg.de ISBN 978-3-86345-094-6
Anne-Sophie Heitkamp Hannover 2012
CD14 für die intestinalen
Barriere- und Abwehrmechanismen im Darm
Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2012
© 2012 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-094-6
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net
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Charakterisierung des Maus-Cd14-Promotors hinsichtlich der Bedeutung von CD14 für die intestinalen Barriere- und Abwehrmechanismen im Darm
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Anne-Sophie Heitkamp
Bielefeld
Hannover 2012
Inst. für Versuchstierkunde (MHH)
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. J. Hedrich
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. O. Distl
Tag der mündlichen Prüfung: 28.05.2012
Diese Arbeit wurde durch Sachmittelbeihilfen der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des DFG-Projektes „Bedeutung von CD14 für intestinale Barriere- und Abwehrmechanismen im Darm“ gefördert.
Meiner Familie.
1 Inhalt
2 Tabellenverzeichnis ... 6
3 Abbildungsverzeichnis ... 7
4 Abkürzungsverzeichnis ... 8
5 Literaturteil ... 17
5.1 Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen (CED) ... 17
5.2 Genetik der CED ... 18
5.2.1 Kopplungsanalysen ... 18
5.2.2 Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) ... 19
5.3 Tiermodelle CED ... 20
5.4 Vorarbeiten ... 23
5.5 Cd14 ... 24
5.6 Ziele dieser Arbeit... 26
6 Material und Methoden ... 27
6.1 Geräte ... 27
6.2 Verbrauchsmaterialien ... 28
6.3 DNS ... 29
6.3.1 Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) ... 29
6.3.2 Mutagenese ... 32
6.3.3 Agarosegelelektrophorese ... 32
6.3.4 Sequenzierung ... 34
6.3.5 Aufreinigung und Fällung von Nukleinsäuren ... 34
6.3.6 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren ... 35
6.3.7 Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) ... 35
6.4 RNS ... 36
6.4.1 Isolierung von RNS aus Zellen... 36
6.4.2 Reverse Transkription (RT) und RT-PCR ... 36
6.5 Plasmide ... 37
6.5.1 Verwendete Plasmide ... 37
6.5.2 Analytische Plasmidpräparation ... 38
6.5.3 Präparation hochreiner Plasmid-DNS ... 39
6.5.4 Maxi-Präparation ... 39
6.6 Ligation/Klonierung/Restriktion ... 40
6.6.1 Ligation von DNS ... 40
6.6.2 T/A-Klonierung ... 40
6.6.3 Spaltung von DNS durch Restriktionsendonukleasen ... 41
6.7 Bakterien ... 41
6.7.1 Verwendete Bakterienstämme ... 41
6.7.2 Transformation von Plasmiden in E. coli ... 42
6.7.3 Blau-Weiß-Selektion ... 43
6.7.4 Kultivierung von E. coli ... 43
6.8 Zellkultur ... 44
6.8.1 Verwendete Zelllinien ... 44
6.8.2 Allgemeine Zellkulturverfahren ... 44
6.8.3 Kryokonservierung von Zellen... 45
6.8.4 Auftauen von Zellen ... 46
6.8.5 Transfektion ... 46
6.8.5.1 Transfektion der murinen Embryonalen Fibroblasten NIH3T3 mit PolyFect Transfection Reagent ... 46
6.8.5.2 Transfektion der murinen Makrophagenzellen RAW264.7 ... 47
6.8.5.2.1 Transfektion mit Fugene® HD Transfection Reagent ... 47
6.8.5.2.2 Transfektion mit XtremeGene® HP DNA Transfection Reagent . 47 6.8.5.2.3 Transfektion mit XtremeGene® 9 DNA Transfection Reagent .... 47
6.8.5.2.4 Transfektion mit Superfect® Transfection Reagent ... 47
6.8.5.2.5 Transfektion mit Targefect® RAW und Virofect® ... 48
6.8.6 Etablierung stabil transfizierter Zellen ... 48
6.8.7 Luziferase-Analyse ... 49
6.8.8 β-Galaktosidase-Analyse ... 50
6.8.9 LPS-Stimulation der Zellen ... 51
6.9 Proteine ... 52
6.9.1 Isolierung von Proteinen aus Zellen ... 52
6.9.2 Proteinbestimmung nach Bradford (BRADFORD et al., 1976) ... 53
6.9.3 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE ) 53
6.9.4 Coomassie Brilliant Blau Färbung ... 55
6.9.5 Western Blot ... 55
6.9.6 Verwendete Antikörper für Western Blot ... 57
6.9.7 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) ... 57
6.9.8 Verwendete Antikörper für EMSA ... 58
7 Ergebnisse ... 59
7.1 Etablierung des Modells für die Promotoranalysen ... 59
7.1.1 Cd14-Expression in murinen Zelllinien in vitro ... 59
7.1.2 Vergleich chemischer Transfektionsmethoden ... 60
7.1.3 Optimierte Cd14-Promotoranalysen in vitro ... 62
7.2 Vergleichende Datenbankanalyse der Transkriptionsfaktorbindungsstellen im Cd14-Promotor von B6 und C3Bir ... 62
7.3 Aktivität der Cd14-Promotoren von C3Bir und B6 ... 64
7.3.1 Bestimmung der Basalaktivität durch Trunkierung der Cd14-Promotoren 64 7.3.1.1 Luziferase-Analyse des C3Bir-Cd14-Promotors ... 64
7.3.1.2 Luziferase-Analyse des B6-Cd14-Promotors ... 66
7.3.2 Inaktivierung potentieller Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen ... 68
7.3.2.1 Deletion durch Promotorverkürzungen ... 68
7.3.2.1.1 Luziferase-Analyse des C3Bir-Cd14-Promotors ... 68
7.3.2.1.2 Luziferase-Analyse des B6-Cd14-Promotors ... 70
7.3.2.2 Mutagenisierung der Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen ... 72
7.3.2.2.1 Luziferase-Analyse des mutagenisierten C3Bir-Cd14-Promotors 72 7.3.2.2.2 Luziferase-Analyse des mutagenisierten B6-Cd14-Promotors .... 75
7.4 Physikalische Interaktion von Transkriptionsfaktoren mit den Cd14- Promotoren von B6 und C3Bir ... 77
7.4.1 EMSA der PPARG-, SP2- und OCT1-Bindungsstellen von C3Bir ... 78
7.4.2 EMSA der OCT1-Bindungsstelle von B6 ... 80
8 Diskussion ... 82
8.1 Vorarbeiten zur Etablierung des Modells für die Promotoranalysen ... 82
8.2 Aktivitäten der Cd14-Promotoren von C3Bir-Il10-/- und B6-Il10-/- ... 83
8.3 Ausblick ... 87
9 Zusammenfassung... 89
10 Summary ... 91
11 Anhang 1: Literaturteil ... 92
11.1 Kandidatengene für CED ... 92
Tabelle 5: Kandidatengene für CED (modifiziert nach BÜCHLER, 2010) ... 92
11.2 CED Suszeptibilitätsloci und Genassoziationen ... 93
Tabelle 6: In GAWS detektierte, mehrfach replizierte CED Suszeptibilitätsloci und Genassoziationen... 93
12 Anhang 2: Material und Methoden ... 107
12.1 Promotorsequenzen und Primer ... 107
12.2 Oligokukleotide ... 110
12.2.1 Verwendete Oligonukleotide ... 110
Tabelle 7: Verwendete Oligonukleotide ... 110
12.2.2 Oligonukleotide für EMSA ... 113
Tabelle 8: Oligonukleotide für EMSA ... 113
13 Anhang 3: Ergebnisse ... 116
13.1 Vergleich chemischer Transfektionsmethoden ... 116
13.1.1 Polyfect® (NIH3T3) ... 116
13.1.2 Fugene® (RAW264.7) ... 116
13.1.3 Targefect® (RAW264.7) ... 116
13.1.4 Superfect® (RAW264.7) ... 117
13.1.5 Xtreme Gene 9 DNA® (RAW264.7) ... 117
13.1.6 Xtreme Gene HP DNA® (RAW264.7) ... 118
13.2 Aktivität der Cd14-Promotoren von C3Bir und B6 ... 119
13.2.1 Bestimmung der Basalaktivität durch Trunkierung der Cd14-Promotoren 119 13.2.2 Inaktivierung potentieller Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen ... 121
13.2.2.1 Deletion durch Promotorverkürzungen ... 121
13.2.2.2 Mutagenisierung der Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen ... 125
14 Literaturverzeichnis ... 127
15 Erklärung ... 154
16 Danksagung... 155
2 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Beispiele für die Einflüsse der Darmflora auf CED-Modelle (modifiziert nach BÜCHLER, 2006) ... 21 Tabelle 2: Ausrichtung der Colitis bei Il10-/- Mäusen verschiedener Hintergrundstämme (modifiziert nach BÜCHLER, 2006) ... 22 Tabelle 3: Vergleich chemischer Transfektionsmethoden ... 61 Tabelle 4: Stammspezifische Polymorphismen, Transkriptionsfaktorbindungsstellen und deren Lage (modifiziert nach DE BUHR et al., 2006) ... 63 Tabelle 5: Kandidatengene für CED (modifiziert nach BÜCHLER, 2010) ... 92 Tabelle 6: In GAWS detektierte, mehrfach replizierte CED Suszeptibilitätsloci und Genassoziationen ... 93 Tabelle 7: Verwendete Oligonukleotide ... 110 Tabelle 8: Oligonukleotide für EMSA ... 113
3 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Hauptweg der Beeinflussung von CED durch CD14 ... 25
Abbildung 2: Murine Embryonale Firboblasten der Zellinie NIH3T3 ... 59
Abbildung 3: Murine Makrophagen der Zelllinie RAW264.7 ... 59
Abbildung 4: Western Blot Untersuchung der basalen und stimulierten Cd14- Expression an NIH3T3- und RAW264.7-Zellen ... 60
Abbildung 5 Luziferase-Analyse der ersten Trunkierungen des C3Bir-Cd14- Promotors ... 65
Abbildung 6 Luziferase-Analyse der ersten Trunkierungen des B6-Cd14-Promotors 67 Abbildung 7 Luziferase-Analyse aller Trunkierungen des C3Bir-Cd14-Promotors ... 69
Abbildung 8 Luziferase-Analyse aller Trunkierungen des B6-Cd14-Promotors ... 71
Abbildung 9 Luziferase-Analyse der Mutagenesen des C3Bir-Cd14-Promotors ... 74
Abbildung 10 Luziferase-Analyse der Mutagenesen des B6-Cd14-Promotors ... 76
Abbildung 11: EMSA der Bindungsstelle für PPARG (C3Bir) ... 78
Abbildung 12: EMSA der Bindungsstelle für SP2 (C3Bir) ... 79
Abbildung 13: EMSA der Bindungsstelle für OCT1 (C3Bir) ... 80
Abbildung 14: EMSA der Bindungsstelle für OCT1 (B6) ... 81
Abbildung 15: Transfektion von NIH3T3-Zellen mit Polyfect® ... 116
Abbildung 16: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Fugene HD® ... 116
Abbildung 17: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Targefect® ... 116
Abbildung 18: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Superfect® ... 117
Abbildung 19: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Xtreme Gene 9 DNA® ... 117
Abbildung 20: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Xtreme Gene HP DNA® .... 118
Abbildung 21: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten des B6-Cd14-Promotors nach Trunkierung ... 119
Abbildung 22: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten des C3Bir-Cd14- Promotors nach Trunkierung ... 120
Abbildung 23: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten der ersten Trunkierungen des B6-Cd14-Promotors nach Deletion durch Promotorverkürzung ... 121
Abbildung 24: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten des B6-Cd14-Promotors nach Deletion durch Promotorverkürzung ... 122
Abbildung 25: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten der ersten Trunkierungen des C3Bir-Cd14-Promotors nach Deletion durch Promotorverkürzung ... 123
Abbildung 26: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten des C3Bir-Cd14- Promotors nach Deletion durch Promotorverkürzung ... 124
Abbildung 27: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten des B6-Cd14-Promotors nach Mutagenisierung der Transkriptionsfaktorbindungsstellen ... 125
Abbildung 28: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten des C3Bir-Cd14- Promotors nach Mutagenisierung der Transkriptionsfaktorbindungsstellen ... 126
4 Abkürzungsverzeichnis
°C Grad Celsius
% Prozent
ABCB1 ATP-Binding Cassette, Subfamily B, Member 1
adap. Adaptive
AP1 Anionic Peroxidase 1
APS Ammoniumpersulfat
Areg Amphiregulin
ARPC2 Actin-Related Protein 2
ATF Activating Transcription Factor 2 ATG16L1 Autophagy Related 16-Like 1 β-Gal β-Galaktosidase
B6 C57/BL6J(B6)-Il10-/-
BACH2 BTB and CNC homology 1 Basic Leucine Zipper Transcription Factor 2
BCL6 B-Cell Leukemia/Lymphoma 6
Bp Basenpaar
BSA Bovines Serum Albumin
BSN Basonuclein
BTNL2 Butyrophilin-Like 2 bzw. beziehungsweise
C11orf30 Chromosome 11 Open Reading Frame 30 C3Bir C3H/HeJBir-Il10-/-
CARD Caspase Activated Recruitment Domain CCDC122 Coiled-Coil Domain Containing 122
CCL Chemokine (C-C motif) Ligand
CCNY Cycline Y
CCR 6 Chemokine(C-C motif) receptor 6 CD Cluster of differentiation
Cdcs Cytokine deficiency induced colitis susceptibility CDH1 Cadherin 1 Type 1
CDKAL 1 Cyclin-dependent kinase 5 regulatory subunit associated protein 1-like 1
cDNS zirkuläre Ribonukleinsäure
CED Chronisch Entzündliche Darmerkrankung CEP72 Centrosomal Protein 72kDa
cfu colony forming untis
CIITA Class II Major Histocompatibility Complex Transactivator CLN Ceroid-Lipofuscinosis Neuronal 3
cm Zentimeter
CMV Cytomegalievirus
CPEB Cytoplasmic Polyadenylation Element Binding Protein CREM cAMP-Response Element Modulator
CU Colitis Ulcerosa
CUL2 Cullin 2
DENND1B Differentially Expressed in Normal and Neoplastic Cells/ MAP- kinase Activating Death Domain Containing 1B
DLG 5 Disks Large Homolog 5 DMSO Dimethylsulfoxid
DNMT3A DNA Methyltransferase 3 Alpha DNS Desoxyribonukleinsäure
DSS Dextran Sodium Sulfat DTT Dithiothreitol
E2F E2F Transcription Factor ECM Extracellular Matrix Protein 1 E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EIF3C Eukaryotic Translation Initiation Factor 3 Subunit C ELISA Enzyme Linked Immunosorbant Assay
ENOX 1 Ecto-NOX Disulfide-Thiol Exchanger 1 ERAP Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase ESRRA Estrogen-related Receptor Alpha
Fa. Firma
FADS Fatty Acid Desaturase
FAM92B Family with Sequence Similarity 92, member B FCGR2A Fc Fragment of IgG Low Affinity IIa Receptor FMO4 Flavin-containing Monooxygenase 4 FUT2 Fucosyltransferase 2
g Gramm
g g-Beschleunigung
G418 Geneticin
GALC Galactosylceramidase
GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase Gbp Guanylate binding protein
GCKR Glucokinase Regulator GFP grün floureszierendes Protein
Gnb1 Guanine Nucleotide Binding Protein 1 GPI Glykosylphoshpatidolinositol
GPR65 G Protein-coupled Receptor 65 GPX1 Glutathione Peroxidase 1 GWAS Genomweite Assoziationsstudien HERC2 Hect Domain and Rolled Leaf 2 HLA Human Leukocyte Antigen HNF4A Hepatocyte Nuclear Factor 4 Alpha HORMAD2 HORMA domain containing 2
HPLC High-Performance Liquid Chromatography HRP Horseradichperoxidase
HSP Heat Shock Protein
IBD Inflammatory Bowel Disease ICAM Intercellular Adhesion Molecule
ICOSLG Inducible T-cell Costimulator Ligand Gen
Il Interleukin
Il10RA Interleukin 10 Receptor α Il1Rl1 Interleukin 1 Receptor-like 1 Il10RB Interleukin 10 Receptor β Il17REL Interleukin 17 Receptor E-like
Il18RAP Interleukin 18 Receptor Accessory Protein Il23R Interleukin 23 Receptor
INPP5E Inositol Polyphosphate-5-phosphatase INSL Insulin-Like
IRF Interferon Regulatory Factor
IRGM Immunity-Related GTPase Family M Protein JAK 2 Janus Kinase 2
KB Kilobase
kDa kilo Dalton
KIF21B Kinesin Family Member 21B KPNA7 Karyopherin Alpha 7
L Liter
LB Luria Bertani
LIF Leukemia Inhibitory Factor LPS Lipopolysaccharid
LRRK2 leucine-rich repeat kinase 2
Ly6g6c Lymphocyte Antigen 6 Complex, Locus G6C
mA Milliampere
MAP3K7IP1 TGF-beta Activated Kinase 1/MAP3K7 Binding Protein 1
MC Morbus Crohn
mCD membrangebundenes Cluster of differentiation MDR1 Multi Drug Resistance 1
MEF Murine Embryonale Fibroblasten MEM Modified Eagle’s Medium MHC Major Histocompatibility Complex MST1 Macrophage-Stimulating 1 MTMR3 Myotubularin Related Protein 3
µg Mikrogramm
mg Milligramm
µL Mikroliter
mL Milliliter
mMol Millimol
MOPS 3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure mRNS messenger Ribonukleinsäure
MUC Mucin
MYO9B Myosin IXB
NDFIP1 Neural Precursor Cell Expressed developmentally Down- regulated 4 Family Interacting Protein 1
NKX2-3 Natural Killer Cell-associated Antigen 2 Transcription Factor Related, Locus 3
nm Nanometer
NUPR1 Nuclear Protein Transcriptional Regulator 1 NOD nucleotide-binding oligomerization domain
NR Nitrat Reductase
OCT Organic Cation Transporter
OD Optische Dichte
ORMDL3 Orosomucoid 1 Like 3
P53 Transformation Related Protein 53 PAX2 Paired Box Gene 2
PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction Pla2g2a Phospholipase A2 group IIA PLCL1 Phospholipase C-like 1
PPARG Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma
PRDX Peroxiredoxin
PSMG1 Proteasome (Prosome, Macropain) Assembly Chaperone 1
PTGER4 Prostaglandin E Receptor Subtype EP4
PTPN1 Protein Tyrosine Phosphatase, Non-Receptor Type 1 PTPN 2 Protein Tyrosine Phosphatase, Non-Receptor Type 2
PTPN22 Protein Tyrosine Phosphatase Non-Receptor Type 22 (lymphoid)
pMol Picomol
PTPN22 Protein Thyrosin Phosphatase 22 PUS10 Pseudouridylate Synthase 10 qRT Quantitative Real-Time QTL Quantitative Trait Loci
® Registrierte Warenmarke
RASIP Ras Interacting Protein
REL Reticuloendotheliosis Viral Oncogene Homolog RNASE2 Ribonuclease A Family 2
RNS Ribonukleinsäure rpm revolutionso per minute rRNS ribosomale Ribonukleinsäure
RT Reverse Transkription
RTEL1 Regulator of Telomere Elongation Helicase 1
SATB2 Special AT-rich Sequence Binding Protein Homebox 2 SCAMP Secretory Carrier Membrane Protein
sCD soluble Cluster of Differentiantion
SDCCAG3 Serologically Defined Colon Cancer Antigen 3 SDS Sodium Dodecyl Sulfat
SEC16A Putative UDP-N-Acetylglucosamine-Peptide N- Acetylglucosaminyltransferase Homolog 16 A SLC Single Level Cell
SMAD3 Mothers Against Decapentaplegic Homolog 3 SMURF1 SMAD-specific E3 Ubiquitin-protein Ligase 1
SNAP4 Small Nuclear RNA Activating Complex Polypeptide 4 SNP single nukleotide polymorphism
SP1 Specificity Protein 1
SP140 SP140 Nuclear Body Protein SP2 Transkriptionsfaktor SP2 SPF Specified Pathogen Free
ssp. Subspezies
STAT Signal Transducer and Activator of Transcription
SULT1A1 Sulfotransferase Family Cytosolic 1A Phenol-Preferring Member
T/A Thymin/Adenin
TAGAP T-cell Activation RhoGTPase Activating Protein TFBS Transkriptionsfaktorbindunsstelle
Th T-Helfer
THADA Thyroid Adenoma Associated TL1A TNF-like ligand 1 A
TLR Toll Like Receptor TNF Tumor-Nekrose-Faktor
TNFRSF6B Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily 6B TNFSF15 Tumor Necrosis Factor Superfamily Member 15 TPPP Tubulin Polymerization Promoting Protein TR2 Nuclear Receptor Subfamily 2 Group C Member 1 TRAF Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-α assoziierter Faktor TRIF Toll-Like Receptor Adaptor Molecule 2
tRNS transfer Ribonukleinsäure
TYK Tyrosinkinase
u.a. unter anderem
UBE2D1 Ubiquitin-conjugating Enzyme E2D 1 USP12 Ubiquitin Specific Peptidase 12
UV Ultraviolett
V Volt
VAMP Vesicle-associated Membrane Protein
Vol. Volumen
z.B. zum Beispiel
ZFP36L1 Zinc Finger Protein 36 C3H Type-like 1 ZMIZ1 Zinc Finger MIZ-type Containing 1 ZNF 365 Zinc Finger 365
ZPBP Zona Pellucida Binding Protein
5 Literaturteil
5.1 Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen (CED)
Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen (CED) sind schubweise verlaufende Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes. Sie untergliedern sich in die beiden Haupterscheinungsformen Colitis Ulcerosa und Morbus Crohn, die bei den betroffenen Patienten in der Regel das erste Mal im Alter zwischen 20 und 40 Jahren auftreten (PICCO et al., 2009). Bei Colitis Ulcerosa beschränkt sich die Entzündung auf die Mukosa und die oberflächliche Submukosa des Dickdarms. Sie beginnt distal, schreitet kontinuierlich nach proximal fort und führt neben Ulzerationen langfristig zu einem erhöhten Darmkrebsrisiko (BERNSTEIN et al., 2001). Morbus Crohn ist durch eine diskontinuierliche transmurale Entzündung des gesamten Gastrointestinaltraktes gekennzeichnet, wobei Abszesse, Strikturen und Fisteln in den Bauchraum oder zu anderen Abdominalorganen entstehen können.
Symptomatisch sind beide Krankheitskomplexe durch abdominale Algesie, Meläna, Diarrhoe, Anorexie und Maldigestion gekennzeichnet. Außerdem zeigen sich vielfältige extraintestinale Symptome, wie z.B. Pyrexie, Anämie, Arthralgien, Uveitis oder Erythema nodosum (TRAVIS u. STANGE et al., 2007). Ätiopathogenetisch sind CED noch nicht vollständig geklärt, aber es steht fest, dass es sich um ein multifaktorielles Geschehen handelt (FORABOSCO et al., 2000). Demnach können sowohl Umweltfaktoren als auch die Mikroflora des Darmes und genetische Komponenten ausschlaggebend für die Entstehung und den Verlauf von CED sein (LAKATOS et al. 2003; HUGOT et al., 2004; CARIO et al., 2005), während Stress und andere sozioökonomische Faktoren ebenfalls Einfluss auf den Ausbruch und den Hergang der Erkrankung nehmen. Außerdem scheint eine erhöhte Permeabilität der Darmwand für Bakterien eine entscheidende Rolle zu spielen (MUNKHOLM et al., 1994). Seit dem Ende des Zweiten Weltkrieges steigt die Inzidenz beider Erkrankungserscheinungen sowohl in den Westlichen Industrienationen als auch in den verhältnismäßig weniger oft betroffenen Entwicklungsländern an (BERNSTEIN et al., 2010). Mittlerweile tritt in den Industrienationen eine Stagnation der Krankheitshäufigkeit ein, während sie in Entwicklungsländern weiter steigt. In Mitteleuropa erkranken jährlich zwischen 4 und 7 von 100.000 Einwohnern neu an Morbus Crohn, während Colitis Ulcerosa mit einer Häufigkeit von 9 bis 12 neuen Krankheitsfällen pro 100.000 Einwohner deutlich öfter auftritt (LOFTUS et al., 2004).
5.2 Genetik der CED
Obwohl die genaue Ätiopathogenese der CED noch nicht vollständig geklärt ist, stellte sich schon früh heraus, dass eine genetische Komponente eine Rolle spielen muss. So wurde bereits 1932 eine familiäre Häufung von CED festgestellt (CROHN et al., 1932), der ein polygenetischer Erbgang zu Grunde zu liegen schien (FORABOSCO et al., 2000). Heute zeigt sich, dass in Familien mit einem CED- Patienten die Häufigkeit für weitere innerfamiliäre Krankheitsfälle im Vergleich zur allgemeinen Bevölkerung 15-fach erhöht ist und so bis zu 20% der Verwandten von Betroffenen ebenfalls unter CED leiden (ORHOLM et al., 1991; VERMEIRE u.
PEETERS et al., 1996). In Zwillingsstudien wurde untersucht, inwieweit die Vererbung von CED genetisch bedingt ist. Die Übereinstimmungsraten bei eineiigen Zwillingen bezüglich der Krankheitsbetroffenheit von Morbus Crohn lag zwischen 20% und 50% (HALFVARSON et al., 2003), während sie bei zweieiigen Zwillingen zwischen 0% und 7% lag (ORHOLM et al, 2000; HALFVARSON et al., 2007). Eine weitere Studie zeigte, dass bei MC sogar der Ausprägungstyp der Erkrankung genetisch determiniert sein könnte. Bei Zwillingen mit Colitis Ulcerosa liegt ebenfalls eine genetische Komponente vor, die aber nicht so stark ausgeprägt ist, wie bei MC (HALFVARSON et al., 2003). Den Studien zufolge wird klar, dass Erbgut-Einflüsse eine große Rolle spielen, CED aber auch von weiteren Faktoren bestimmt wird.
5.2.1 Kopplungsanalysen
Bei Kopplungsanalysen werden genetische Merkmale, die in der Bevölkerung variabel verteilt sind, in einer Gruppe verwandter Personen untersucht, zu der sowohl von einer Krankheit betroffene als auch nicht betroffene Familienmitglieder gehören. So können bei Erkrankten genetische Variationen identifiziert werden, die bei Gesunden nicht zu finden sind (siehe 11.1). Das Nucleotide-binding Oligomerization Domain containing 2 Gen (NOD2 oder Caspase Activated Recruitment Domain protein 15, CARD15) befindet sich im Inflammatory Bowel Disease (IBD) 1 Lokus auf Chromosom 16. Es wird vor allem in Panethzellen sowie peripheren Blutmonozyten exprimiert und war das erste Gen, das mit einer erhöhten Suszeptibilität für Morbus Crohn in Verbindung gebracht werden konnte. Durch das Binden von Bakterienzellwandbestandteilen (Muramyldipeptid) an das C-terminale Ende des Proteins wird eine Nuclear Factor Kappa B (NF-κB) Kaskade in Gang gesetzt, die zur Ausschüttung von Entzündungsmediatoren führt. Mehrere seltene Polymorphismen, die oft in Zusammenhang mit Morbus Crohn auftreten, wurden in diesem Gen gefunden (OGURA et al., 2001; LESAGE et al., 2002; HUGOT et al.,
2008). Die Human Leukocyte Antigen (HLA) Klasse II Region und der Inflammatory Bowel Disease (IBD) 5 Lokus konnten bisher noch nicht unabhängig voneinander als Suszeptibilitätslokus für CED identifiziert werden, da sie in unmittelbarer Nähe zueinander liegen. Zu den Allelen, die mit dem Krankheitskomplex in Verbindung gebracht werden, gehören außerdem u.a. HLA-DRB1*1502 (ASAKURA et al., 1982;
SUGINMURA et al., 1993), HLA-DRB1*0701 (FERNANDEZ et al., 2004; NEWMAN et al., 2004; AHMAD et al., 2002) und HLA-DRB1*0103 (SATSANGI et al., 1996;
SILVERBERG et al., 2003; ORCHARD et al., 2002). Noch konnte aber nicht festgestellt werden, ob die Kopplungsergebnisse auf die einzelnen Allele selbst oder ihre Kopplung miteinander zurückzuführen sind. In der Promotorregion des Tumor Nekrose Faktor (TNF) Genes, das auch in der IBD 3 Region liegt, wurden mit CED assoziierte Single Nukleotide Polymorphisms (SNPs) gefunden (ORCHARD et al., 2002; VAN HEEL et al., 2002; TREMELLING et al., 2006). Funktionelle Abweichungen von organischen Kationentransportern (Organic Cation Transporter, OCT) der Gene Single Level Cell (SLC) 22A4 und SLC22A5 im IBD5-Lokus werden als kausal für deren Rolle bei CED betrachtet (PELTEKOVA et al., 2004). Letztere Gene agieren eng mit Interferon Regulatory Factor (IRF) 1, Interleukin (IL) 3-5 und IL13, weshalb diese ebenfalls als Kandidatengene in Betracht gezogen werden. Es wurden weitere Kandidatengene gefunden, deren Assoziation zu CED allerdings nicht eindeutig reproduziert werden konnte, wie z.B. NOD1/CARD4 (MCGOVERN et al., 2005), TLR4 (FRANCHIMONT et al., 2004; DE JAGER et al., 2007), Myosin IXB (MYO9B; VAN BODEGRAVEN et al., 2006) und NFκB1 (KARBAN et al., 2004).
5.2.2 Genomweite Assoziationsstudien (GWAS)
Um ein bestimmtes Merkmal mit dem genetischen Hintergrund des Merkmalträgers in Verbindung zu bringen, werden sogenannte genomweite Assoziationsstudien (GWAS) durchgeführt. Innerhalb einer Population werden zu diesem Zweck Assoziationen von Polymorphismen mit Krankheitsmerkmalen untersucht. Während Kandidatengenassoziationsstudien zur Verifizierung bereits bestehender Verdachtsmomente genutzt werden, können GWAS nach statistischer Auswertung von SNP-Verteilungen lediglich Hinweise auf mögliche genetische Zusammenhänge geben. SNPs, die nur bei Merkmalsträgern zu finden sind, können so nach weiterer Überprüfung als genetische Marker eingesetzt werden, z.B. für die Diagnostik von Krankheiten (siehe 11.2).
Obwohl die genauen Pathomechansimen, über die die durch GWAS ermittelten Kandidatengene wirken, meist noch nicht bekannt sind, können die Gene dem innaten bzw. dem adaptiven Immunsystem zugeordnet werden. Zu der erworbenen
Abwehr gehören einige Faktoren der T-Zell-Immunantwort; Interleukin 10 (IL10), Protein Tyrosine Phosphatase Non-Receptor Type 1 (PTPN2) sowie Protein Tyrosine Phosphatase Non-Receptor Type 22 lymphoid (PTPN22) verringern die Aktivität von T-Zellen, während eine Anregung der T-Helfer (Th) 1- und Th2-Zytokin- Produktion durch das Inducible T-cell Costimulator Ligand Gen (ICOSLG) stattfindet.
Die Gene IL23R und IL12b kodieren für Proteine, die an der Entwicklung beziehungsweise Funktion von Th-Zellen der Typen 1 und 17 beteiligt sind, während viele weitere Gene ebenfalls Einfluss auf das adaptive Immunsystem nehmen (siehe 11.2). Sie regulieren z.B. die Apoptose (CDKAL1, TNFRSF6B, TNFS15) oder Transkriptionsfaktorexpressionen (C11orf3, CREM, JAK2, LRRK2). Im Bereich der angeborenen Abwehrmechanismen spielen MUC19 für die Protektion der Darmbarriere und ATGL16L- sowie IRGM- regulierte Autophagieantigene eine Rolle.
Des Weiteren steuert MST1 die Chemotaxis von Makrophagen und NOD2 die Immunantwort auf Bakterien.
5.3 Tiermodelle CED
Tiermodelle dienen der Erforschung menschlicher Erkrankungen, um durch Untersuchungen an diesem Modell neue Erkenntnisse bezüglich der Ursache, des Verlaufs oder der Therapie des jeweiligen Leidens zu finden. Für Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen (CED) gibt es zahlreiche Tiermodelle, die entweder eine spontane Colitis entwickeln (SAMP1/Yit-Maus, MATSUMOTO et al., 1998) oder artifiziell beeinflusst werden müssen, um die gewünschte Symptomatik zu zeigen, wie z.B. bei der durch Natriumdextransulfat (Dextran Sodium Sulfat, DSS) induzierten Colitis. Außerdem werden verschiedene Mausstämme eingesetzt, die aufgrund genetischer Modifikationen Entzündungen des Gastrointestinaltraktes entwickeln (PIZARRO et al., 2003). Bei CED handelt es sich um eine multifaktorielle Erkrankung, auf deren Entstehung neben der Genetik des Patienten auch Umwelt und Darmflora Einfluss nehmen. Daher ist es wichtig, dass diese Faktoren bei genetisch determinierten Mäusen genau definiert und reguliert werden können. Die Bakterien im Darm eines gesunden Tieres erfüllen diverse essentielle Funktionen;
sie versorgen den Wirtsorganismus mit verschiedenen Vitaminen und kurzkettigen Fettsäuren, regen die Peristaltik an, entgiften Xenobiotika (NICHOLSON et al., 2005), unterdrücken das Wachstum von pathogenen Bakterien durch die Produktion von Antimikrobiotika und sind an der Immunmodulation beteiligt (RAKOFF-NAHOUM et al., 2004). Des Weiteren stabilisieren sie die Darmbarriere durch die Produktion von Butyrat, das von den Darmepithelzellen zur Energiegewinnung verstoffwechselt wird.
All diese Funktionen beeinflussen die Entstehung von Colitis im Mausmodell, sodass einige Stämme, die mit einer konventionellen Darmflora eine Darmentzündung
entwickeln, unter keimfreien Haltungsbedingungen nicht vom Ausbruch der Erkrankung betroffen sind. Außerdem gibt es Bakterien, die nachweislich entzündungshemmende (z.B. Lactobacillus ssp.) oder -fördernde (z.B. Helicobacter ssp.) Eigenschaften besitzen.
Tabelle 1: Beispiele für die Einflüsse der Darmflora auf CED-Modelle (modifiziert nach BÜCHLER, 2006)
Ausprägung Mausstamm/ Modell Referenz
Keine Kolitis bei keimfreier Haltung
IL2-defizient IL10-defizient SAMP1/Yit
SADLACK et al., 1993;
SELLON et al., 1998;
MATSUMOTO et al., 1998;
Reduzierte Kolitis bei strikter SPF- Haltung
IL2-defizient IL10-defizient Mdr1α-defizient
CD4+/CD45RBhigh-Transfer
KÜHN et al., 1993;
SADLACK et al., 1993;
MORRISSEY et al., 1994;
PANWALA et al., 1998;
HANS et al., 2000;
MADSEN et al., 2000;
Reduzierte Kolitis trotz kolitogener Flora
IL10-defiziente Mäuse: Lactobacillus spp.
DSS Kolitis: Lactobacillus ssp., Bifidobacterium infantis, Escherichia coli (E. coli) Nissle CD4+/CD26L+- Prkdcscid-Transfer:
Bifidobacterium infantis, Lactobacillus reuteri und E. coli Nissle
MADSEN et al., 2000;
SCHULTZ et al., 2000;
JIJON et al., 2004;
SCHULTZ et al., 2004;
GEIER et al., 2007;
FITZPATRICK et al., 2007;
VAN DER KLEIJ et al.,
2008;
Forcierte Kolitis bei kolitogener Flora
Enterococcus faecalis bei IL10-defizienten Mäusen
E. coli bei IL10-defizienten Mäusen Helicobacter spp. bei verschiedenen Mausmodellen
CAHILL et al., 1997;
KULLBERG et al., 1998;
CHIN et al., 2000;
BURICH et al., 2001;
BALISH et al., 2002; KIM et al., 2005
Auch die Genetik der Mäuse spielt bei einigen Modellen eine bedeutende Rolle, z.B.
im Modell der Il10-defizienten (Il10tm1Cgn) Maus. Je nach Stamm zeigen die Mäuse verschiedene Schweregrade und Verlaufsformen der Colitis. Als Ausgangspunkt für die vorliegende Arbeit dienen hierbei die Stammesunterschiede zwischen Mäusen der Stämme C57BL/6J.129P2-Il10tm1Cgn/JZtm (B6-I10-/-) und C3H/HeJBir.129P2- Il10tm1Cgn/JZtm (C3Bir-Il10-/-).
Tabelle 2: Ausrichtung der Colitis bei Il10-/- Mäusen verschiedener Hintergrundstämme (modifiziert nach BÜCHLER, 2006)
Hintergrundstamm Schwere und Verlauf der Kolitis
Referenz
C57BL/6J Mild, protrahiert BERG et al., 1996; TAKEDA et al., 1999; BRISTOL et al., 2000 BALB/c Intermediär, progressiv TAKEDA et al., 1999 NOD/Lt Intermediär, progressiv MÄHLER et al., 2002 NOD.NON-H2nb1 Intermediär, progressiv MÄHLER et al., 2002 129/SvEv Schwer, progressiv TAKEDA et al., 1999 C3H/HeJBir Schwer, beginnt sehr früh BRISTOL et al., 2000 C3H.SW Schwer, beginnt sehr früh MÄHLER et al., 2002
5.4 Vorarbeiten
1993 wurde am Institut für Genetik der Universität Köln die Interleukin10 (Il10)- defiziente (Il10tm1Cgn; Il10-/-) Maus entwickelt. IL10 dient der Regulation des Immunsystems und schützt den Organismus, indem es überschießende Abwehrreaktionen vermeidet (GRÜTZ, 2005). Die Nullmutation von Il10 im oben genannten Mausstamm verursachte eine überschießende Immunreaktion auf luminale Xenoantigene des Darmes, die verschiedene Merkmale der Colitis Ulcerosa und Morbus Crohn aufwiesen (KÜHN et al., 1993); die Tiere entwickelten eine meist letal verlaufende, chronische Enterocolitis, die vornehmlich Zäkum sowie Kolon betraf und histologisch durch mukosale Entzündungszellinfiltrate in Verbindung mit intraluminalen fibrinoiden Ablagerungen gekennzeichnet war. Bei der Untersuchung verschiedener Il10-/--Stämme zeigte sich in Zusammenarbeit mit Dr. Leiter (The Jaxon Laboratory, USA), dass die Nullmutanten des C3Bir-Stammes eine deutlich schwerere Form der Colitis entwickelten als B6-Il10-/--Mäuse, was verdeutlicht, dass die Krankheitsausprägung von der Genetik des Hintergrundstammes beeinflusst wird.
Sich anschließende genomweite Kopplungsanalysen an segregierenden Kreuzungspopulationen dieser Stämme zeigten, dass die 10 gefundenen CED- Suszeptibilitäzsloki (Quantitative Trait Loci, QTL), die auch als Cytokine deficiency induced colitis susceptibility (Cdcs) 1 bis 10 bezeichnet werden, einer sehr umfassenden genetischen Kontrolle unterliegen (BLEICH et al., 2004). Wie schon bei anderen QTL beobachtet, findet man diese Allele nicht nur im suszeptiblen Stamm C3Bir, sondern teilweise (Cdcs4, Cdcs6, Cdcs8) auch bei den eigentlich resistenten B6-Mäusen. Innerhalb der 10 QTL konnten durch weitere genetische Untersuchungen und Microarray-Analysen 8 Kandidatengene identifiziert werden (DE BUHR et al., 2006): Guanylate Binding Protein 1 (Gbp1) im Cdcs1; Heat Shock Protein (Hsp) 1a, Hsp1b und Lymphocyte Antigen 6 Complex Locus G6C (Ly6g6c) im Cdcs5; Cluster of differentiation (Cd14) im Cdcs6; Phospholipase A2 group IIA (Pla2g2a) und Guanine Nucleotide Binding Protein 1 (Gnb1) im Cdcs9; Amphiregulin (Areg) im Cdcs10. Nach einem Vergleich der Gen-Expressionen zwischen Il10-/- Mäusen beider Hintergrundstämme und Wildtypvarianten kristallisierten sich 3 Kandidatengene heraus, die in allen Stämmen einen hohen Einfluss auf das Expressionsniveau hatten: Gbp1 (Cdcs1, Chromosom 3), Cd14 (Cdcs6, Chromosom 18) und Pla2g2a (Cdcs9, Chromosom 4). Bezüglich C3Bir zeigten sowohl Mäuse in konventioneller als auch in keimfreier Haltung eine deutlich höhere CD14-Produktion als B6 (DE BUHR et al., 2006), wobei CD14 im Darm in löslicher Form vorlag (soluble CD14, sCD14) und einen protektiven Effekt gegen die Colitisentwicklung hatte. Die insgesamt geringere CD14-Produktion in keimfreien Tieren zeigte, dass die Mikroflora über verschiedene Rückkopplungsmechanismen einen Einfluss auf die Expressionshöhe des Proteins hatte. Es konnte nachgewiesen werden, dass es bei
Mäusen parallel zum Menschen eine Gewebespezifität der Cd14-Expression gab (DE BUHR et al., 2009) und die stammabhängige Expressionshöhe nicht durch einen defekten Toll Like Receptor (TLR) 4 hervorgerufen wurden (DE BUHR et al., 2006).
Durch verschiedene Untersuchungen konnten u.a. 11 Polymorphismen identifiziert werden, die verschiedene mögliche Transkriptionsfaktorbindungsstellen verändern, z.B. STAT1 (nur bei C3Bir an Position -823), BCL6 (nur bei B6 an -244), SP2 (nur bei C3Bir an-244) und PPARG (nur bei B6 an -360). Der Einfluss beider Promotoren auf die CD14-Produktion wurde mittels Kotransfektion des jeweiligen Ausgangspromotors in einem Luziferasreporterplasmid mit einem β-Galaktosidase kodierenden Plasmid in RAW264.7-Zellen (murine Makrophagen) untersucht. Die vorher bereits in vivo beobachtete höhere Basalaktivität von Cd14 im C3Bir-Stamm wurde in vitro sowohl basal als auch nach Lipopolysaccharid-Stimulation verifiziert.
5.5 Cd14
Cluster of differentiation 14 (Cd14) ist ein 356 Aminosäuren langes und 55 kDa großes Glykoprotein, das in einem Suszeptibilitätslocus für Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen auf Chromosom 5q 23-31 kodiert ist (CED; VAN HEEL et al., 2004). Es ist über eine Glykosylphoshpatidolinositol(GPI)-Verbindung in der Zellmembran verankert (SIMMONS et al., 1989) und bildet dort zusammen mit dem Lymphozyten-Antigen 96 sowie dem Toll Like Receptor 4 (TLR4) einen Rezeptor für Lipopolysaccharide (LPS), die einen Bestandteil der Zellwand gramnegativer Bakterien darstellen. Cd14 wird auf reifen Monozyten exprimiert und die auf den Monozyten verbleibende Form wird als membrangebundenes CD14 (membrane bound CD14, mCD14) bezeichnet. Durch die Bindung von LPS an mCD14 wird das Myeloid differentiation primary response Gen 88 (Myd88) aktiviert, was zu einer Rekrutierung der Interleukin-1-Rezeptor assoziierten Kinase führt. Daraus resultiert eine Initialisierung des Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)-Rezeptor-α assoziierten Faktors 6 (TRAF6). TRAF6 verursacht die Phosphorylierung der Inhibitor of κ B (IκB) Kinase und die Freisetzung von NF-κB sowie das Einschlagen des Mitogen aktivierten Proteinkinase-Weges. Neben Myd88 wird durch das Binden von LPS an mCD14 und TLR4 auch der Toll-Like Receptor Adaptor Molecule 2 (TRIF) Weg aktiviert, der zur Rekrutierung von IRF3 führt. Die Triggerung von NF-κB und IRF3 führt zur Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine und in einigen Zellen zur Apoptose (FUKATA et al., 2008). Zudem nimmt mCD14 an der Integrin abhängigen Fibrinogen- Adhäsion und der Komplement unabhängigen Phagozytose gramnegativer Bakterien teil (LANDMANN et al., 2000). Lösliches CD14 (soluble CD14, sCD14) zirkuliert als Plasmaprotein ohne Verankerung in der Zellwand (DZIARSKI et al., 2000) und entsteht, indem entweder keine GPI-Verankerung synthetisiert oder die Verankerung
in der Zellmembran durch Serinproteinasen gelöst wird (BUFLER et al., 1995). Es konkurriert mit mCD14 um die Bindung von LPS und zeigt einen hemmenden Einfluss auf die Aktivierung des Komplementsystems (HAZIOT et al., 1994). TLR4, der von den Epithelzellen des Darms nur spärlich exprimiert wird, sowie CD14 werden bei Patienten mit Chronisch Entzündlicher Darmerkrankung (CED) vermehrt synthetisiert, was zu einer erhöhten Sensibilität und Reaktivität gegenüber der Mikroflora des Darmes führt (ABREU et al., 2001; SUZUKI et al., 2003). Es bleibt zu klären, ob die erhöhte Expression von CD14 tatsächlich die Ursache der Entzündung ist oder durch sie ausgelöst wird. Gleiches gilt für die gesteigerte TLR4-CD14- Expression in Makrophagen der Lamina Propria (FUKATA et al., 2008).
Abbildung 1: Hauptweg der Beeinflussung von CED durch CD14
5.6 Ziele dieser Arbeit
Der deutlich schwerere Verlauf der Colitis bei C3Bir-Il10-/--Mäusen im Vergleich zu Tieren des Stammes B6-Il10-/- konnte auf deren genetischen Hintergrund zurückgeführt werden. Durch anschließende Kopplungs- und Microarrayanalysen wurden verschiedene Kandidatengene identifiziert, zu denen unter anderem auch Cd14 gehörte; es wurde im C3Bir-Stamm signifikant höher exprimiert als bei B6 und hatte einen protektiven Einfluss auf die Entstehung einer Colitis. Reportergenassays zeigten auch in vitro eine signifikant höhere Aktivität des C3Bir-Cd14-Promotors und es stellte sich heraus, dass in beiden Stämmen eine Reihe von Promotorpolymorphismen vorlagen. Das führte zu dem Ziel dieser Arbeit, die zur unterschiedlich hohen Cd14-Expression zu Grunde liegenden Promotorpolymorphismen zu identifizieren. Beide Promotoren wurden trunkiert (1300bp-, 900bp-, 600bp-, 300bp-, 130bp-Fragmente), anschließend transient in murine Makrophagen der Zelllinie RAW264.7 transfiziert und durch Luciferaseanalysen ausgewertet, um die Promotorabschnitte einzugrenzen, die für die divergierende Aktivität der Stämme verantwortlich waren. Bereiche, die einen entscheidenden Einfluss auf die Expression von Cd14 zu haben schienen, sollten weiter verkürzt werden, um die Zahl der in Frage kommenden Promotorelemente zu dezimieren. Die so identifizierten Transkriptionsfaktorbindungsstellen sollten durch gezielte Mutagenese inaktiviert werden, um ihre Funktion anschließend in Reportergenanalysen zu überprüfen. Abschließend sollten zum Nachweis der physikalischen Bindung zwischen DNS und spezifischen Proteinen Electrophoretic Mobility Shift und Supershift Analysen durchgeführt werden.
6 Material und Methoden 6.1 Geräte
CO2-Inkubatoren INC108 (Fa. Memmert®)
ELISA-Reader 2030 Multilabel Reader Victor X3 (Fa.
Perkin Elmer®)
Feinwaage LA230S (Fa. Sartorius®)
TE1502S (Fa. Sartorius®) Gelelektrophoresekammer Forschungswerkstätten MHH Kapillarsequenzierer 310 Genetic Analyzer (Fa. ABI
PRISM®)
Kühleinrichtungen 4°C Comfort 111714 (Fa. Liebherr®) 1111724 (Fa. Liebherr®) -20°C 361414 (Fa. Liebherr®) -80°C 6483 (Fa. GFL®)
Laborwaage MC1 Laboratory CC2200S (Fa.
Sartorius®)
Magnetrührer RH-KT/C (Fa. IKA®)
Mehrkanalpipetten Transferpette-8 10-100 µL (Fa.
Brand®)
Mikroskop Axiovert 135 (Fa. Zeiss®)
Mikrowelle R-2V16 700W (Fa. Sharp®)
Photometer Biotechnologie Nanodrop
Spectrophotometer ND-1000 (Fa.
Peqlab®)
Pipetten Research 2,5 µL/10 µL/100 µL/200 µL/1000 µL/10 mL (Fa. Eppendorff®), Serological Pipette, sterile, non- pyrogenic, Größe 25 mL/10 mL/5 mL (Fa. Sarstedt®)
Pipettierhilfe Pipetboy acu (Integra Biosciences®) Reaktionsgefäßschüttler Mixing Block MB-102 (Fa. BIOER®) Realtime-PCR-Gerät StepOnePlus Real-Time PCR System,
StepOne/StepOnePlus-Version 2.0 (Fa. Applied Biosystems®)
Schüttelinkubator 3033 (Fa. GFL®)
Semi-Dry Blotter Maxi V20-SDB (Fa. Carl Roth®)
Stromquelle MBP 300 EP 3000 Volt Programmable
Power Supply (Fa. MBP®) Power Pack P25 (Fa. Biometra®)
Thermocycler PTC-200 Peltier Thermal cycler (Fa.
MJ Research®)
Thermoschüttler Mixing Block MB-102 (Fa. BIOER®)
Tischzentrifuge Biofuge fresco (Fa. Heraeus®)
Vertikaldoppelelektrophoresekammer MINI-Vertikal Doppel-
Elektrophoresekammer kühlbar (Fa.
Carl Roth®)
Vortexer MS3 digital (Fa. IKA®)
6.2 Verbrauchsmaterialien
Abdeckung Optical Adhesive Covers (Fa. Applied
Biosystems®)
Einfriergefäß Kryoröhrchen (Fa.Greiner®)
Nylon-Membran Immobilon-P Transfer Membrane (Fa.
Millipore®)
Pipettenspitzen 1000 µL/200 µL/10 µL (Fa. Sarstedt®) Reaktionsgefäße 96-Well Reaction Plate 0,1 mL (Fa.
Applied Biosystems®) in transparent und weiß
PCR Softtubes 0,2 mL (Fa. Biozym®) 0,5 mL EASY CAP (Fa. Sarstedt®) 1,5 mL EASY CAP (Fa. Sarstedt®)
Röntgenfilm Röntgenfilm (Fa. GE Healthcare®)
Zellkulturplatten 6-Well mit Flachboden (Fa. Greiner®) Zellkulturflaschen 75 cm2, Filterdeckel (Fa. Corning®) Zellkulturschalen 6 cm Durchmesser (Fa. Sarstedt®)
10 cm Durchmesser (Fa. Sarstedt®)
Zellschaber Cellscraper (Fa. Greiner BioOne®)
Zellzählkammer Neubauer Zählkammer (Fa.
Marienfeld-Neubauer®)
6.3 DNS
6.3.1 Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR)
Das grundlegende Prinzip der PCR-Methode ist die vielfache Wiederholung eines Teilschrittes des Zellzyklus‘, bei der eine Kopie der beiden ursprünglichen DNS- Einzelstränge synthetisiert wird. Da jeder Reaktionsschritt neue identische Matrizen- DNS erzeugt, steigt die Kopienzahl entsprechend einer Kettenreaktion exponentiell an (SAIKI et al., 1988).
Die in einzelnen Versuchsteilen verwendeten Oligonukleotide sind im Anhang (siehe 12.2.1) aufgeführt. Standardisiert wurde jeweils 1 pg bis 10 ng genomischer DNS als Matrize eingesetzt.
Folgender Reaktionsansatz wurde für Mutagenese-PCRs hergestellt:
Reaktionslösung
0,2 µL Phusion Hot Start DNA Polymerase (2 U/µL, Fa.NEB®) 1 µL Forward Primer (10 pmol)
1 µL Reverse Primer (10 pmol) 4 µL 5 x HF-Puffer (Fa. NEB®) 1 pg - 10 ng MatrizenDNS
0,4 µL dNTPs 100 mM (Fa. Fermentas®) ad 20 µL H2O
Gesamtvolumen: 20 µL
Folgendes Standardprogramm wurde für die verschiedenen Primerkonstellationen und DNS-Matrizen eingesetzt:
Vorgang Temperatur Dauer Sprung Zyklen
1. Denaturierung 98°C 3 Minuten 2. Denaturierung 98°C 10 Sekunden 3. Annealing 65 bis 72°C 30 Sekunden
4. Elongation 72°C 90 Sekunden 2. 30
5. Elongation 72°C 5 Minuten 6. Konservierung 15°C Pause
Bei 72°C Elongationstemperatur erzeugt die Phusion® Hot Start DNA Polymerase (Fa. Finnzymes®) 1-4 KB DNS pro Minute. Die PCR-Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese identifiziert.
Folgender Reaktionsansatz wurde für Trunkierung-PCRs hergestellt:
Reaktionslösung
0,5 µL Easy-A® High-Fidelity PCR Cloning Enzyme (Stratagene®) 1 µL Forward Primer (10 pmol)
1 µL PKrela (10pmol)
5 µL Easy-A® Reaction Buffer (Fa. Stratagene®) 1 µL MatrizenDNS
0,4 µL dNTPs 100 mM (Fa. Fermentas®) ad 50 µL dest. H2O
Gesamtvolumen: 50 µL
Folgendes Standardprogramm wurde für die verschiedenen Primerkonstellationen und DNS-Matrizen eingesetzt:
Vorgang Temperatur Dauer Sprung Zyklen
1. Denaturierung 95°C 2 Minuten 2. Denaturierung 95°C 40 Sekunden 3. Annealing 60°C 30 Sekunden
4. Elongation 72°C 60 Sekunden 2. 35
5. Elongation 72°C 7 Minuten 6. Konservierung 4°C Pause
Bei 72°C Elongationstemperatur erzeugte das Easy-A®High Fidelity PCR Cloning Enzyme (Fa. Agilent Technologies®) bis zu 1 KB DNS pro Minute. Die PCR- Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese identifiziert.
6.3.2 Mutagenese
Zur Mutagenese der verschiedenen Promotorelemente wurde in dieser Arbeit das Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit (Fa. Finnzymes®) eingesetzt. Die verwendeten Primer sind unter Oligonukleotide aufgeführt (siehe 12.2.1).
Mutagenisiert wurde der full-length-Promotor beider Stämme. Abweichend von der Gebrauchsanweisung des Herstellers wurden bei der PCR-Reaktion zusätzlich 4%
DMSO (Dimethylsulfoxid) eingesetzt. Alle anderen Schritte wurden nach Gebrauchsanleitung durchgeführt. Die zu mutagenisierenden Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen wurden in Restriktionsenzymschnittstellen umgeschrieben. So konnte der putative Erfolg der Mutagenese schnell mittels Restriktionsenzymverdau überprüft werden, bevor eine Sequenzierung zur Verifizierung der ersten Tests folgte.
Das PCR-Produkt wurde über Nacht mit dem Restriktionsenzym DpnI (Fa. NEB®) verdaut, um parentale DNS zu eliminieren.
6.3.3 Agarosegelelektrophorese
Die Agarosegelelektrophorese dient der Auftrennung von Nukleinsäuren. Da sich diese aufgrund ihrer negativen Ladung im elektrischen Feld gerichtet bewegen, lassen sie sich mit Hilfe einer an eine Agarose-Gelmatrix angelegten Spannung ihrer Größe nach auftrennen. Durch Ethidiumbromidfärbung können diese Nukleinsäurefragmente visualisiert werden, da Ethidiumbromid die DNS interkaliert.
Bei Betrachtung unter UV-Licht (254 nm) fluoresziert das Ethidiumbromid intensiv orange.
DNS: Für die analytischen Agarosegelelektrophoresen wurden 0,8%ige bis 3,0%ige Gele in TBE-Puffer mit 0,0001 Vol. Ethidiumbromidlösung (1%ig, Fa. Serva®) eingesetzt. Zur Herstellung der Gele wurde LE Agarose (Fa. Biozym®) verwendet.
Die Proben wurden vor dem Auftragen auf das Gel mit 0,1 Volumen 10 x Ladepuffer versetzt. Die Auftrennung erfolgte mit einer konstanten Spannung von 5 V/cm mit TBE als Laufpuffer. Als DNS-Größenstandard wurde die Generuler 1 kb Plus DNA Ladder (Fa. Fermentas®) eingesetzt.
RNS: Für die analytischen Agarosegelelektrophoresen wurden 0,8%ige bis 2%ige Gele in 3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure-Puffer (MOPS-Puffer, Fa. Sigma- Aldrich®) mit 0,0001 Vol. Ethidiumbromidlösung (1%ig, Fa. Serva®) eingesetzt. Zur Herstellung der Gele wurde LE Agarose (Fa. Biozym®) verwendet. Die Proben wurden vor dem Auftragen auf das Gel mit 0,1 Volumen 10 x Ladepuffer versetzt. Die Auftrennung erfolgte mit einer konstanten Spannung von 5 V/cm mit 1 x MOPS als
Laufpuffer. Als RNS-Größenstandard wurde die RiboRulerRNA Ladder (Fa.
Fermentas®) eingesetzt.
10 x MOPS
83,7 g 3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure (Fa.Sigma-Aldrich®) 13,6 g Sodium Acetat trihydrat (Fa. Merck®)
800 mL HPLC Wasser (Fa. J.T. Baker®) 3,7 g EDTA (Fa. Carl Roth®)
ad 1 L H2O
Gesamtvolumen: 1 L
10x RNS-Ladepuffer
9,5 mL Formamid (Fa. Carl Roth®) 0,1 mL 0,5 M EDTA (Fa. Carl Roth®) 12,5 µL 20% SDS (Fa. Carl Roth®) 2,5 mg Bromphenolblau (Fa. Merck®) 2,5 mg Xylencyanol (Fa. Merck®) ad 10 mL H2O
Gesamtvolumen: 10 mL
10x TBE
121 g Tris (Fa. Carl Roth®) 55,5 g Borsäure (Fa. Merck®) 9,3 g EDTA (Fa. Carl Roth®) ad 1 L H2O
Gesamtvolumen: 1 L
5x DNS-Ladepuffer
2 g Ficoll 400 (Fa. Sigma-Aldrich®) 2 mL 0,5 M EDTA, pH 8,0 (Fa. Carl Roth®) 100 mg SDS (Fa. Carl Roth®)
1 Spatelspitze Bromphenolblau (Fa. Merck®) 1 Spatelspitze Cylenxyanol (Fa. Merck®) Gesamtvolumen: 2 mL
6.3.4 Sequenzierung
Die zu sequenzierenden Proben wurden mit dem jeweils zugehörigen Sequenzierungsprimer (siehe 12.2.1) und dem Big Dye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Fa. Invitrogen®) nach Angaben des Herstellers bearbeitet. Die Aufreinigung der Proben erfolgte mit dem innu-PREP®-DYEpure-Kit (Fa. Analytic Jena®) nach Herstellerangaben. Die sich anschließende Sequenzierung wurde mit dem ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer (Fa. Applied Biosystems®) durchgeführt.
Alternativ wurden Proben extern mit den vorgegebenen Primern (siehe 12.2.1) sequenziert (Fa. MWG Eurofins Operon®).
6.3.5 Aufreinigung und Fällung von Nukleinsäuren
Natriumacetat-Ethanol-Fällung: Die DNS wurde aus wässrigen Lösungen durch Zugabe von 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat (Fa. Merck®), pH 5,2 sowie 2 Volumina 100%igem Ethanol (Fa. Büfa®) gefällt. Nach einer Zentrifugation bei 13000 x g und 4°C für 20 Minuten wurde der Überstand abgesaugt, die pelletierte DNS 2 Mal mit 500 µl 70%igem Ethanol gewaschen und erneut unter gleichen Bedingungen zentrifugiert. Nach Absaugen des Überstandes wurde das Pellet 10 bis 15 Minuten getrocknet und in destilliertem Wasser aufgenommen.
6.3.6 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Zur photometrischen Konzentrationsbestimmung von DNS und RNS wurde die Extinktion der DNS- bzw. RNS-Lösung mit dem Spectrophotometer gemessen. Dazu wurden 2 µL der Lösung auf das Gerät gegeben und bei 260 nm gemessen. Hierbei entspricht eine Extinktion von 1,0 ca. 50 µg/mL doppelsträginger DNS oder 40 µg/mL RNS. Aussagen über die Reinheit der Nukleinsäuren konnten bei zusätzlicher Messung der Extinktion bei 280 nm getroffen werden. Der Quotient E260/E280 liegt bei geringen Verunreinigungen für DNS bei 1,7-1,9 und für RNS zwischen 1,9-2,1.
6.3.7 Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)
Die quantitative Real-Time-Polymerase-Kettenreaktion (quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR) diente der Vervielfältigung von Nukleinsäuren.
Das Prinzip der qRT-PCR beruhte auf dem der herkömmlichen PCR. Durch Fluoreszenzmessungen, die während der PCR-Zyklen vorgenommen wurden, war es möglich, die Nukleinsäuren auch quantitativ nachzuweisen, da die Intensität der Fluoreszenz in der exponentiellen Phase der Vermehrung proportional zu der erzeugten Nukleinsäuremenge war. Die Floureszenz entstand durch den Einbau Floureszenz-gekoppelter Basen in den amplifizierten DNS-Strang. Alle für den PCR- Ansatz benötigten Labormaterialien, die mit der verwendeten RNS in Kontakt kamen, waren laut Hersteller RNAse-frei oder wurden vor Gebrauch autoklaviert und mit UV- Licht bestrahlt. Für einen qRT-PCR-Ansatz wurde folgende Menge an Reagenzien verwendet:
qRT-Ansatz
10 µL SYBR-Green-PCR-Mastermix (Fa. Applied Biosystems®) 1 µL MatrizenDNS
1 µL Forward-Primer (300 nm) 6 µL Revers-Primer (300 nm)
7 µL HPLC-Wasser (Fa. J.T. Baker®) ad 20 µL H2O
Gesamtvolumen: 20 µL
Die Reaktionsansätze wurden in eine 96-Well Platte überführt und mit Optical Adhesive Covers abgedeckt.
Folgendes Programm wurde für die verschiedenen Primerkonstellationen für die qRT eingesetzt:
Vorgang Temperatur Dauer Sprung Zyklen
1. Denaturierung 95°C 15 Minuten 2. Denaturierung 95°C 10 Sekunden 3. Annealing 60°C 20 Sekunden
4. Elongation 60°C 30 Sekunden 2. 40
6.4 RNS
6.4.1 Isolierung von RNS aus Zellen
Die Gewinnung von Gesamt-RNS (rRNS, tRNS und mRNS) aus RAW264.7-Zellen erfolgte mit Hilfe des RNeasy® Mini Kits (Fa. Qiagen®). Unter RNAse-freien Bedingungen wurden 5 x 106 RAW264.7-Zellen mit 0,25% Trypsin in PBS aus der Zellkulturflasche gelöst und 5 Minuten bei 300 x g in einem Zentrifugationstube zentrifugiert. Anschließend wurde vorsichtig der Überstand abgenommen. Die Isolierung der RNS erfolgte nach Herstellerangaben. Die gewonnene RNS wurde bei -20°C gelagert und war so 1 Jahr haltbar.
6.4.2 Reverse Transkription (RT) und RT-PCR
In vitro kann reife mRNS als Matrize für die Herstellung einer genauen DNS-Kopie (copy-DNS oder cDNS) dienen. An einem DNS-Primer beginnend synthetisierte das Enzym Reverse Transkriptase (Fa. Qiagen®), eine in Retroviren identifizierte RNS- abhängige DNS-Polymerase, eine identische DNS-Kopie der RNS (TAYLOR, ILLMENSEE u. SUMMERS, 1976; BERCHTOLD, 1989). Dieses Verfahren der Reversen Transkription kann in Verbindung mit der PCR zur Analyse der Expressionsmuster bestimmter Gene eingesetzt werden. cDNS dient zudem der Erzeugung rekombinanter Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde die Omniscript Reverse Transcriptase (Fa. QIAgen®) mit Oligo-dT 15 Primern (Fa. Fermentas®)
benutzt. Durch die Verwendung von Oligo-dT-Primern, die sich an die 3‘ terminale Poly(A)-Sequenz der reifen mRNS anlagern, wurde die Kopierung der vollständigen mRNS gewährleistet. Pro Reaktionsansatz hat sich der Einsatz von 2 µg Gesamt- RNS bewährt. Folgendes Reakionsgemisch wurde hergestellt:
Reaktionslösung:
1 µL Omniscript Reverse Transcriptase (Fa. Qiagen®) 5 µL 10 x Puffer RT
0,5 µL Oligo-dT 15 Primer (0,5 µg/µl, Fa. Fermentas®)
0,5 µL Random-Hexamere-Primer (0,5 µg/µL, Fa. Fermentas®)
4 µL dNTP-Mix (jeweils 2,5 mM, Fa. Qiagen®)
x µL Gesamt-RNS
ad 20 µL DEPC-Wasser (Fa. J.T. Baker®) Gesamtvolumen 20 µL
Die DNS-Synthese fand in 1 Stunde bei 37°C im Thermocycler statt, woran sich die Denaturierung der Reversen Transkriptase bei 73°C für 10 Minuten und die Konservierung bei 4°C anschlossen. Folgte außerdem eine PCR-Reaktion mit der synthetisierten cDNS als Matrize, so sprach man von einer Zweischritt-RT-PCR.
Durch PCR mit spezifischen Primern für die cDNS des übiquitär exprimierten Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase(GAPDH)-Gens aus der Glykolyse wurde zuerst die Integrität des cDNS-Gemisches bewiesen (Housekeeping-Gen).
Zugleich diente das GAPDH-Signal zur Bestätigung des Einsatzes gleicher Gesamt- RNS-Mengen in der RT-Reaktion und somit als Abgleich für die folgenden PCR- Experimente.
6.5 Plasmide
6.5.1 Verwendete Plasmide
pGL4.17[luc2/Neo] Vector (Fa. Promega®): T/A-Cloning Vektor. Der Vektor enthält ein Luziferasereportergen und ein Selektionsmarkergen für Neomycin, die Neomycinphosphotransferase.
StrataClone PCR Cloning Vector pSC-A-amp/kan (Fa. Strata Clone®): Basisvektor ohne Promotor zur Klonierung eines ausgewählten Promotors. Der Backbonevektor enthält Selektionsmarkergene für Kanamycin und Ampicillin sowie eine β- Galactosidase-α-Fragment-kodierende Sequenz (lacZ´).
pAd-Track-CMV (über Addgene®): Rekombinantes Adenovirus mit enthaltenem grün floureszierendem Protein (GFP) für die Transfektion von Transgenen. Der Backbonevector enthält einen Selektionsmarker für Kanamycin.
6.5.2 Analytische Plasmidpräparation
Plasmide wurden aus kleinen Bakterienkulturen (4 mL) isoliert, um schnell einzelne transformierte Bakterienklone durch einen nachfolgenden Restriktionsenzymverdau der präparierten Plasmid-DNS überprüfen zu können.
In ein Eppendorf-Reaktionsgefäß wurden 1,5 mL einer Escherichia-coli (E. coli)- Übernachtkultur überführt und 1 Minute bei 13000 x g zentrifugiert, um die Bakterien zu sedimentieren. Bis auf einen geringen Rest von 50 bis 100 µL, in dem das Bakterienpellet resuspendiert wurde, wurde der Überstandverworfen. Nach Zugabe von 300 µL TENS-Puffer wurde die Suspension 5 Sekunden geschüttelt sowie 5 Minuten bei Raumtemperatur zur alkalischen Lyse der Bakterien inkubiert (BIRNBOIM u. DOLY, 1979). Es folgte die Zugabe von 150 µL 3 M Natriumacetatlösung, pH 5,2, woraufhin die Proben 5 Minuten geschüttelt und zur Fällung der Proteine und chromosomaler DNS 20 Minuten bei -20°C gekühlt wurden.
Durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 13000 x g und Raumtemperatur wurden die milchig-weißlichen Präzipitate pelletiert. In einem frischen Eppendorf-Reaktionsgefäß wurden 450 µL des Überstandes rasch mit 900 µL auf -20°C vorgekühltem 100%igem Ethanol vermischt um die Plasmid-DNS zu fällen. Die präzipitierte Plasmid-DNS wurde durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 13000 x g und 4°C pelletiert und anschließend 2 Mal mit 70%igem Ethanol gewaschen. Nach einer weiteren Zentrifugation unter gleichen Bedingungen wurde der Überstand abgenommen, das Plasmid-Pellet ca. 20 Minuten luftgetrocknet und anschließend in 50 µL RNAse/TE-Puffer, pH 8,0, aufgenommen. Die erhaltene DNS wurde bei -20°C gelagert.
TENS-Puffer
5 mL 1 M Tris-HCl, pH 8,0 (Fa. Carl Roth) 1mL 0,5 M EDTA, pH 8,0 (Fa. Carl Roth) 5 mL 10N NaOH (Fa. Merck)
12,5 mL 20% SDS (Fa. Carl Roth) ad 500 mL H2O
Gesamtvolumen: 500 mL
6.5.3 Präparation hochreiner Plasmid-DNS
Um hochreine Plasmid-DNS für Sequenzanalysen zu erhalten wurde DNS aus Bakterienkulturen (4 mL) mit Hilfe des QIAprep® Spin Miniprep Kit (Fa. QIAgen®) isoliert, wobei die Herstellerangaben strikt befolgt wurden. Eine Analyse von Integrität und gegebenenfalls Insertgröße des Plasmids fand durch Restriktionsenzymspaltung und Agarosegelelektrophorese sowie anschließende Sequenzierung statt. Die DNS-Konzentration wurde photometrisch bestimmt. Die Plasmide wurden bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
6.5.4 Maxi-Präparation
Präparative Plasmidpräparationen wurden mit dem NucleoBond® Extra Maxi EF Kit (Fa. Macherey & Nagel®) nach dem Protokoll des Herstellers zur endotoxinfreien DNS-Präparation durchgeführt. Die Verwendung endotoxinfreier DNS erhöht bei Transfektionsexperimenten erheblich die Effizienz des Transfers. Die Ausbeute an Plasmid-DNS aus einer 250-mL-Übernachtkultur liegt bei dieser Aufarbeitungsmethode zwischen 100 und 1500 µg. Eine Analyse von Integrität und gegebenenfalls Insertgröße des Plasmids fand durch Restriktionsenzymverdau und Agarosegelelektrophorese statt. Die DNS-Konzentration wurde spektrophotometrisch bestimmt. Die Plasmide wurden bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
6.6 Ligation/Klonierung/Restriktion 6.6.1 Ligation von DNS
Die Ligationstechnik dient der Verknüpfung homolog-kohäsiver Enden (sticky ends) von DNS-Fragmenten. In eukaryotischen Zellen ist die hier verwendete DNS-Ligase für die Reparatur aufgebrochener Phosphodiesterbindungen zuständig. Sie ligiert die 5‘-Phosphat-Gruppe mit der 3‘-Hydroxy-Gruppe komplementärer Basenpaarstränge.
Sie ist somit ein wichtiges Reparaturenzym. Bei Klonierungsexperimenten wird diese Eigenschaft dazu genutzt, DNS-Moleküle in vitro miteinander zu verknüpfen. Die Ligation kohäsiver Enden erfolgte mit dem Quick Ligation Kit (Fa. Finnzymes®) nach Herstellerangaben oder über Nacht bei 16°C nach folgendem Ansatz:
Reaktionslösung 0,5 µg linearisiertes Plasmid 5 µg Insert
1 µL T4-DNA-Ligase (20.000 U/mL, Fa. NEB®) 2 µL T4-DNA-Ligase-Puffer (10x, Fa. NEB®) ad 20 µL H2O
Gesamtvolumen: 20 µL
Die Lagerung fand bis zur weiteren Verwendung bei -20°C statt.
6.6.2 T/A-Klonierung
PCR-Produkte weisen 3’-Adenosin-Überhänge auf, die direkt mit modifizierten Thymin-Überhängen linearisierter Vektoren durch die Topoisomerase II verknüpft werden können (T/A-Klonierung). In dieser Arbeit wurde dazu das StrataClone PCR Cloning Kit (Fa. Stratagene®) eingesetzt, unter Verwendung von SoloPack Competent Cells und des Vektors pSC-A-amp/kan. Es wurde nach Herstellerangaben verfahren.
6.6.3 Spaltung von DNS durch Restriktionsendonukleasen
Zur Kontrolle der gewonnenen Plasmid-DNS wurde das jeweilige Plasmid mit spezifischen Restriktionsenzymen verdaut und die entstandenen Fragmente mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt um ihre Größen zu bestimmen. Für den Verdau wurden alle Reaktionsreagenzien für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Auftrennung der Plasmidfragmente mittels Agarosegelektrophorese erfolgte wie oben beschrieben.
Verwendete Restriktionsenzyme (alle Fa. NEB®):
BglII, DpnI, EcoRI, EcoRV, FseI, KpnI, PacI, SmaI, XhoI
Reaktionslösung:
2 µg Plasmid-DNS
0,25 µL je Restriktionsenzym 1,2 µL NEB-X-Puffer (Fa. NEB®) 1,2 µL 10 x BSA (Fa. NEB®) ad 20 µL H2O
Gesamtvolumen: 20 µL
6.7 Bakterien
6.7.1 Verwendete Bakterienstämme
Chemisch kompetente JM109 (JM109 Competent Cells, Fa. Stratagene®), die eine Transformationseffizienz von mehr als 1 x 109 Transformanden pro µg pUC18 DNS aufwiesen, dienten der Transformation von Ligationsansätzen bzw. der Retransformation. Ultrakompetente Zellen des Stammes DH5α (BP5α Competent Cells, Fa. BioPioneer Inc®) wurden zur chemischen Transformation von Plasmiden verwendet. Sie bilden mehr als 1 x 109 Transformanden pro µg pUC19 DNS.
Ultrakompetente Zellen des Stammes SoloPack (SoloPack Competent Cells, Fa.
Stratagene®), die eine Transformationseffizienz von mehr als 1 × 108 Transformanden pro µg pUC18 DNS aufwiesen, wurden zur Transformation von Ligationsansätzen aus dem StrataClone PCR Cloning Kit (Fa. Stratagene®) verwendet. Ultrakompetente Zellen des E.-Coli-Stammes XL10-Gold Kan(R) (Fa.
Stratagene®) mit einer Transformationseffizienz von 5 × 109 cfu/mg pUC18 DNS wurden zur chemischen Transformation von Plasmiden verwendet. Diese Zellen enthalten ein F‘-Episom, das ein Kanamycinresistenzgen trägt.
Endotypen der benutzten Bakterienstämme:
JM109 e14-(McrA-) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 (rK-mK+) supE44 relA1
∆(lac-proAB) [F´ traD36 proAB lacIqZ∆M15]
BP5α F’/endA1 hsdR17(rK-mK+)supE44 thi-1 recA1 gyrA (Nalr) relA1 D(laclZYA-argF)U169 deoR (F80dlacD(lacZ)M15)
SoloPack Tetr ∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte [F´ proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr) Amy Camr]
XL10-Gold Tetr∆ (mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte[F’ proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr) Amy Camr]
6.7.2 Transformation von Plasmiden in E. coli
Auf Eis wurden 50 µL chemisch-kompetenter Bakterien aufgetaut. Nur die XL10- Gold-Zellen wurden mit 4 µL β-Mercaptoethanol (BME) gemischt und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einer Studie von BANNAI (1992) verbessert BME das Zellwachstum, da es sich um ein stark reduzierendes Agenz handelt, das die Oxidation von Cystein zu Cystin verhindert, sodass diese Aminosäure besser von den Zellen aufgenommen werden kann. Anschließend erfolgte bei allen Zelltypen die Zugabe von 10 bis 20 ng zirkulärer Plasmid-DNS oder der Hälfte eines Ligationsansatzes und eine 30-minütige Inkubation auf Eis, während der sich die DNS an die Zellen anlagerte. Daraufhin wurden die Bakterien für 30 Sekunden einem Hitzeschock von 42°C ausgesetzt, um durch eine Ausdehnung der Zellwände die Einschleusung von DNS in die Zelle zu ermöglichen. Es folgte ein Abschrecken auf Eis für 2 Minuten, sodass sich die erweiterten Zellwände wieder in ihren Ausgangszustand zusammenziehen konnten. Der Ansatz wurde mit 200 µL vorgewärmten SOC-Medium (Fa. Invitrogen®) versetzt und eine Stunde bei 37°C und 225 rpm im Thermoschüttler inkubiert. So konnten sich die Zellen regenerieren und beginnen, das eingeschleuste Resistenzgen zu exprimieren. Jeweils 25 µL, 75 µL und 150 µL des Transformationsansatzes wurden auf einer Agarplatte, welche 2 µg/mL Carbenicellin (Fa. Applichem®) als Selektionsmarker enthielt, ausgestrichen.
Die Agarplatten wurden über Nacht im Brutschrank bei 37°C bebrütet. Nur
