6 Material und Methoden
6.8 Zellkultur
6.8.1 Verwendete Zelllinien
NIH3T3: Der Herstellung transient transfizierter Zellen dienten murine embryonale Fibroblasten (MEF) der Zelllinie NIH3T3 (ATCC: CRL-1658), die mit ausreichender Effizienz transfiziert werden konnten. Die Fibroblasten wurden aus Embryonen des Mausstammes NIH/Swiss gewonnen. Laut Hersteller wurden die Zellen negativ auf Ectromelieviren getestet und reagierten sehr sensitiv auf Leukämie- und Sarkomavirusinfektionen.
RAW264.7: Zur Herstellung stabil und transient transfizierter Zellen wurden murine Makrophagen der Zelllinie RAW264.7 (ATCC: TIB-71) verwendet. Auch sie konnten mit ausreichender Effizienz transfiziert werden. Diese Makrophagenzellinie wurde aus einem Tumor des BALB/c-Maus-Stammes gewonnen, der durch das Murine Leukämievirus hervorgerufen wurde. Sie war laut Hersteller negativ auf die Oberflächenimmunglobuline Ia und Thy-1.2 getestet. Außerdem sezernierten sie keine nachweisbaren Viruspartikel.
6.8.2 Allgemeine Zellkulturverfahren
Folgende Medien, Puffer und Zusätze wurden für die Zellkultur verwendet:
Dulbecco´s MEM (Modified Eagles Medium, Fa. Invitrogen®)
Dulbecco’s MEM mit Glutamax-I (enthält L-Alanyl-L-Glutamine, Natriumpyruvat, 4,5 g/L Glukose und Pyridoxine, Fa. Invitrogen®)
PBS (w/o Calcium und Magnesium, Fa. Invitrogen®) Penicillin/ Streptomycin 10000 µg/mL (Fa. Biochrom®) Dimethylsulfoxid (DMSO, Fa. Sigma-Aldrich®)
Endotoxinfreies Fetales Kälberserum (FCS EF, Fa. PAA®)
Trypsin/EDTA-Lösung (in PBS w/o Ca2+, Mg2+, Fa. Biochrom®) Zellkullturmedium NIH3T3-Zellen:
500 mL Dulbecco’s MEM mit Glutamax-I 50 mL FCS EF (Fa. PAA®)
10 mL Penicillin/Streptomycin (Fa. Biochrom®) Zellkulturmedium RAW264.7-Zellen:
500 mL Dulbecco’s MEM 50 mL FCS EF (Fa. PAA®)
10 mL Penicillin/Streptomycin (Fa. Biochrom®)
NIH3T3-Zellen wurden in 250 mL Zellkulturflaschen mit 20 mL Zellkulturmedium bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Konfluenz war strikt zu vermeiden, da die Zellen sonst unerwünschte Differenzierungsprozesse begannen. Alle 3 Tage oder bei Erreichen einer Konfluenz des Zellrasens von maximal 50% wurde das Medium abgesaugt, die Zellen mit PBS gewaschen, anschließend trypsiniert und im Verhältnis 1:10 in 250 mL Zellkulturflaschen ausgesäht.
RAW264.7-Zellen wurden in 250 mL Zellkulturflaschen mit 20 mL Zellkulturmedium bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Alle 2 Tag oder bei einer Konfluenz von 70% wurde das Medium abgesaugt, die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend mit einem Zellschaber vom Flaschenboden gelöst. Die Zellen wurden in Zellkulturmedium resuspendiert und im Verhältnis 1:3 bis 1:6 in 250 mL Zellkulturflaschen ausgesäht.
6.8.3 Kryokonservierung von Zellen
Einfriermedium wurde durch die Zugabe von 10% FCS EF und 10% Dimethyl Sulfoxid (DMSO, Fa. Sigma-Aldrich®) zum Zellkulturmedium hergestellt. Das Zellkulturmedium wurde von den Zellen abgesaugt und die Zellen mit 5 mL PBS gewaschen. Anschließend wurden sie mit Trypsin/EDTA (0,25%, Fa. Invitrogen®) von den Zellkulturflaschen gelöst und durch Zentrifugation bei 1000 rpm für 6 Minuten bei 4°C sedimentiert. Das Zellpellet wurde im Einfriermedium resuspendiert,
in Kryoröhrchen überführt und bei -80°C langsam vorgefroren. Nach etwa 48 Stunden wurden die Zellen zur langfristigen Lagerung in flüssigen Stickstoff überführt.
6.8.4 Auftauen von Zellen
Die dem Stickstofftank entnommenen Zellen wurden rasch bei 37°C im Wasserbad aufgetaut. Die Zellen wurden umgehend mit 50 mL Zellkulturmedium verdünnt und bei 4°C 6 Minuten bei 1000 rpm sedimentiert, um das bei höheren Temperaturen zytotoxische Frostschutzmittel DMSO aus den Zellen auszuwaschen. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 20 mL Kulturmedium resuspendiert. Anschließend wurden sie in Zellkulturflaschen überführt und bei 37°C und 5% CO2 kultiviert.
6.8.5 Transfektion
Die Transfektionen der Zellen erfolgten mit verschiedenen Reagenzien. Je Transfektionsansatz wurden 4,5 µg Reporter-Plasmid-DNS und 0,5 µg CMV-β-Galaktosidasevektor kotransfiziert.
6.8.5.1 Transfektion der murinen Embryonalen Fibroblasten NIH3T3 mit PolyFect Transfection Reagent
Für die Einschleusung von Plasmid-DNS in murine Zellen bedarf es eines speziellen Reagenz’. In dieser Arbeit wurde das Polyfect® Transfection Reagent zur stabilen Transfektion von NIH3T3-Zellen verwendet. Durch rezeptorvermittelte Endozytose (transmembrane Asialoglykoproteine) gelangte der Polyfect-DNS-Komplex als Endosom in die Zelle und wurden in den Kern transportiert.
Die NIH3T3-Zellen wurden am Tag vor der Transfektion in 6-cm-Durchmesser-Schalen in einer Konzentration von 4 x 105 Zellen pro Schale ausgesäht, mit 5 mL Zellkulturmedium versehen und bei 37°C sowie 5% CO2 kultiviert. Die Zellen wurden 30 Minuten vor Transfektionsbeginn mit 4 mL PBS gewaschen und mit frischem Zellkulturmedium versorgt. Zur Transfektion wurden pro Flasche 5 µg linearisierte DNS mit 150 µL Dulbecco’s MEM mit Glutamax-I verdünnt und anschließend mit 15 µL Polyfect versetzt und gemischt. Zur Bildung der Polyfect-DNS-Komplexe folgte eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur, an deren Ende 1 mL Zellkulturmedium mit den Polyfect-DNS-Komplexen vermischt wurde. Das Zellkulturmedium der NIH3T3-Zellen wurde mit dieser Suspension supplementiert.
Nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C und 5% CO2 wurde mit der Antibiotikaselektion begonnen, um nicht transfizierte Zellen zu eliminieren.
6.8.5.2 Transfektion der murinen Makrophagenzellen RAW264.7
Für die Einschleusung von Plasmid-DNS in murine Makrophagenzellen sind spezielle Transfektionsreagenzien notwendig. In dieser Arbeit kamen verschiedene Reagenzien zur Anwendung. Die Versuche wurden letztendlich mit dem XtremeGene® HP DNA Transfection Reagent (Fa. Roche®) durchgeführt.
Die RAW264.7-Zellen wurden am Tag vor der Transfektion in 6-cm-Durchmesser-Schalen in einer Konzentration von 4 x 106 Zellen pro Schale in 5 mL Zellkulturmedium bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Die Zellen wurden 30 Minuten vor Transfektionsbeginn mit 4 mL PBS gewaschen und mit frischem Zellkulturmedium versehen. Die Transfektionsreagenzien XtremeGene® HP DNA Transfection Reagent, XtremeGene® 9 DNA Transfection Reagent und Fugene® HD Transfection Reagent (alle Fa. Roche®) funktionieren nach dem gleichen Prinzip. Die Reagenzien setzten sich aus Lipiden, Ethanol und anderen Komponenten zusammen. Der Lipidkomplex band die zugefügte DNS neutral und der entstandene Komplex lagerte sich an die Zellwand an, sodass die Zelle ihn mittels Endozytose als Endosom aufnehmen konnte. Das Endosom wurde in den Zellkern transportiert, wo es zur Freisetzung der DNS kam. Die Transfektionen mit den verschiedenen Reagenzien verliefen wie folgt:
6.8.5.2.1 Transfektion mit Fugene® HD Transfection Reagent
Mit 10 µL Plasmid-DNS wurden 25 µL Transfektionsreagenz und 465 µL Wasser gemischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gemisch wurde anschließend auf die Zellen gegeben und diese vor dem Ernten 24 Stunden inkubiert.
6.8.5.2.2 Transfektion mit XtremeGene® HP DNA Transfection Reagent
Mit 5 µg der zu transfizierenden Plasmid-DNS wurden 500 µL DMEM gemischt, 20 µL Transfektionsreagenz versehen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde die Mischung vor der 48-stündigen Inkubation zu den Zellen gegeben und die Schale 30 Sekunden geschwenkt. Es folgte das Ernten der Zellen.
6.8.5.2.3 Transfektion mit XtremeGene® 9 DNA Transfection Reagent
Mit 5 µg der zu transfizierenden Plasmid-DNS wurden 500 µL DMEM gemischt, 30 µL Transfektionsreagenz versehen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Mischung wurde zu den Zellen gegeben und die Schale 30 Sekunden geschwenkt. Nach 48 Stunden Inkubationszeit folgte das Ernten der Zellen.
6.8.5.2.4 Transfektion mit Superfect® Transfection Reagent
Das Transfektionsreagenz bestand aus einem aktiven Dendrimermolekül, von dessen zentraler Bindungsstelle aus positiv geladene Aminogruppen hervorragten, die mit den negativ geladenen Phosphatgruppen von Aminosäuren interagierten und Komplexe bildeten. Diese neutralen Komplexe lagerten sich an die Zellwand an und wurden von der Zelle mittels Endozytose aufgenommen. Die daraus resultierenden
Endosomen wurden in den Zellkern transportiert, wo die enthaltene DNS freigesetzt wurde.
Mit 5 µg der zu transfizierenden Plasmid-DNS wurden 145 µL DMEM gemischt, mit 30 µL Transfektionsreagenz versehen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Zu dem Komplex wurde 1 mL Vollmedium gegeben, gemischt und das Gemisch sofort auf die Zellen appliziert. Die Schale wurde 3 Stunden im Brutschrank inkubiert, bevor der Überstand abgenommen und die Zellen einmal mit 4 mL PBS gewaschen wurden. Anschließend wurden die Zellen mit frischem Vollmedium versorgt und weitere 48 Stunden unter Zellkulturbedingungen inkubiert bevor sie geerntet wurden.
6.8.5.2.5 Transfektion mit Targefect® RAW und Virofect®
Targefect® war ein lipidbasiertes Transfektionsreagenz, bei dem ein neutraler DNS-Lipid-Komplex entstand, der sich an die Zellwand anlagerte und mittels Endozytose von der Zelle als Endosom aufgenommen wurde. Das Endosom gelangte in den Zellkern, wo die enthaltene DNS freigesetzt wurde. Bei Virofect® handelte es sich um ein replikationsdefizientes Adenovirus, das in Verbindung mit Targefect®
unterstützend eingesetzt wurde. Das Virus band an die Adenovirusrezeptoren der Zelloberfläche und verstärkte so die Endozytose von Transfektionsreagenz-DNS-Komplexen durch die Zelle. Außerdem wurde die lysosomale Degradation der Komplexe verhindert.
Mit 30 µg der zu transfizierenden Plasmid-DNS wurden 60 µL Targefect® und 120 µL Virofect® sowie 3 mL DMEM Glutamax gemischt und 20 Minuten bei 37°C inkubiert.
Die Mischung wurde auf die zu transfizierenden Zellen gegeben und diese anschließend 24 Stunden unter Zellkulturbedingungen inkubiert. Es folgte das Ernten der Zellen.
6.8.6 Etablierung stabil transfizierter Zellen
Stabil transfizierte Zelllinien zeichnen sich durch die dauerhafte Integration eines Plasmids in das Genom der Zellen aus. Im Rahmen dieser Arbeit wurden durch Transfektion linearisierte Plasmide, die eine zusätzliche Resistenz gegen das Antibiotikum Geneticin (G418, Fa. Sigma-Aldrich®) vermitteln, in RAW264.7-Zellen eingeschleust. Es schloss sich eine Antibiotikabehandlung für 10 Tage an, die nicht-rekombinante Zellen eliminierte. In dieser Arbeit wurde 1 Tag nach der Transfektion mit der Selektion begonnen und die Zellen mit 400 µg G418/mL Zellkulturmedium versehen. Alle 2 Tage wurde das Medium abgenommen und die Zellen mit PBS (Fa.
Invitrogen®) gewaschen, um abgestorbene Zellen zu eliminieren. Anschließend wurde neues Medium mit G418 supplementiert und auf die Zellen gegeben. Die
überlebenden Zellen, die durch Integration des Plasmids resistent gegen das Antibiotikum waren, wurden mittels PCR und Reverse Transcription PCR (RT-PCR) analysiert. Den Zellkulturmedien wurde ständig das entsprechende Antibiotikum zugefügt, sodass der fortgesetzte Selektionsdruck eine Deletion des integrierten Plasmid verhinderte.
6.8.7 Luziferase-Analyse
Von dem wie bei der β-Galaktosidase-Analyse beschrieben geernteten Zellextrakt wurden 20 µL in einer weißen 96-well-Platte vorgelegt. Das Extrakt wurde zunächst mit 120 µL Messpuffer versehen und geschüttelt. Direkt vor der Messung wurden 40 µL D-Luziferin-Natriumsalz-Lösung (Fa. Applichem®) zugegeben und erneut geschüttelt. Infolge der Transfektion des Luziferase-Reporterplasmids pGL4.17 in die Zellen produzierten sie das Enzym Luziferase. Diese Luziferase sorgte unter Anwesenheit von Sauerstoff für die Umsetzung von Luziferin in instabile Dioxetane.
Die Dioxetane oxidierten, was zur Lichtemission führte. Diese Biolumineszenz war bei 450 nm im ELISA-Reader messbar. Sowohl die Zugabe des Messpuffers als auch des D-Luziferin-Natriumsalzes sowie das anschließende Schwenken erfolgten durch 2 Injektoreinheiten des ELISA-Readers sowie den ELISA-Reader selbst.
Luziferase-Messpuffer:
1,65 g Glycylglycin (Fa. Carl Roth®)
15 mL von 1 M Magnesiumsulfat (Fa. Merck®) ad 500 mL H2O
frisch zugeben:
25 mL von 100 mM ATP (Fa.Carl Roth®)-Stock Gesamtvolumen: 500 mL
ATP (Adenosintriphosphat) Stock: 100 mM ATP (Fa. Carl Roth®) in 200 mM Tris-Base, 1g/18,14 mL; die Lösung wurde aliquotiert und bis zur Verwendung bei -20°C gelagert.
6.8.8 β-Galaktosidase-Analyse
Die Kotransfektion des β-Galaktosidase-Expressionsvektors diente aufgrund der starken, vom Cytomegalievirus (CMV) Promotor abhängigen Expression des β-Galaktosidase-Gens als Kontrolle der Transfektionseffizienz und somit als Korrekturgröße für durch Transfektionsexperimente gewonnene Ergebnisse. Die Aktivität der β-Galaktosidase konnte in Zellextrakten mit geeigneten Substraten in einer Farbreaktion spektrophotometrisch schnell und einfach nachgewiesen sowie quantifiziert werden.
Pro Transfektionsansatz wurde 4,5 µg Reporter-Plasmid-DNS und 0,5 µg CMV-β-Galaktosidasevektor zugesetzt. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Transfektion zweimal mit PBS gewaschen, anschließend mit 350 µL 1 x Extraktionspuffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Daraufhin wurde das Zelllysat abgeschabt und 5 Minuten in der Tischzentrifuge bei 13000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bis zur Messung seiner Aktivität auf Eis gelagert. 10 µL der Zellextrakte wurden mit 100 µL Assaypuffer in einer transparenten 96-well-Platte bis zu einer leichten Gelbfärbung bei 37°C im Dunkeln inkubiert. Nach dem Abstoppen der Reaktion durch Zugabe von 50 µL 1 M Natriumhydrogencarbonat, was zur Intensivierung der Gelbfärbung führte, wurde die Färbung mit 405 nm im Photometer gegen einen Leerwert (pGL4.17-transfizierte Kontrolle) gemessen. Der lineare Bereich reichte von 0,2 bis 0,8 OD405.
5 x Extraktionspuffer:
12,5 mL 1 M Tris/Phosphat (pH 7,8 mit H3PO4, Fa. Merck®)
2 mL 0,5 M Ethylendiamintetraacetat (EDTA), pH 8,0 (Fa. Carl Roth®) 50 mL 100% Glycerol (Fa. Merck®)
5 mL Triton X-100 (Fa. Sigma-Aldrich®) ad 100 mL H20
frisch zufügen:
2 µL/mL 1 M Dithiotreitol(DTT)-Lösung (Fa. Carl Roth®) Gesamtvolumen: 100 mL
Analysepuffer:
10,7 g Na2PO4 x 2 H2O (Fa. Merck®) 5,4 g NaH2PO4 x H2O (Fa. Merck®) 10 mL 1 M KCl-Lösung (Fa. Merck®) 1 mL 1 M MgSO4-Lösung (Fa. Merck®) ad 1 L H2O
frisch zugeben:
2 µL/mL 1 M DTT-Lösung (Fa. Carl Roth®) 1 mg/mL ONPG (Fa. Sigma-Aldrich®) Gesamtvolumen: 1 L
1 M KCl-Lösung: 7,65 g KCL (Fa. Merck®) in 100 mL dest. H2O
1 M MgSO4-Lösung: 24,7 g MgSO4 x 5 H2O (Fa. Merck®) in 100 mL dest. H2O 1 M Natriumcarbonat-Lösung: 106 g Na2CO3 (Fa. Merck®) in 1 L dest. H2O D-Luziferin-Natriumsalz (Fa. Applichem®)
6.8.9 LPS-Stimulation der Zellen
Für die LPS-Stimulation (LPS, Fa. Sigma-Aldrich®) wurden 4 x 105 NIH3T3-Zellen und 4 x 106 RAW264.7-Zellen in Zellkulturschalen mit 10 cm Durchmesser ausgesäht.
Mit einer wässrigen LPS-Lösung (2 mg/mL) wurden sie 24 Stunden später versehen, sodass die Endkonzentration von 0,1 ng/mL Zellkulturmedium erreicht wurde. Die Proteine wurden 12 Stunden nach Beginn der Stimulation wie oben beschrieben geerntet.