Aktivitäten der Cd14-Promotoren von C3Bir-Il10 -/- und B6-Il10 -/-

-/-Cd14 wurde im Colitis suszeptiblen Mausstamm C3Bir-Il10^-/- deutlich höher exprimiert als in den resistenten B6-Il10^-/- (BLEICH et al., 2003). Sequenzanalysen und in silico Untersuchungen ließen vermuten, dass diese divergierenden Expressionen durch stammspezifische Promotorpolymorphismen verursacht wurden und zur Ausbildung unterschiedlicher Transkriptionsfaktorbindungsstellen führten (DE BUHR et al., 2009). Um die Position der für die unterschiedliche Promotoraktivität verantwortlichen Sequenzen nun in dieser Arbeit zu bestimmen,

wurden beide Promotoren zunächst in annähernd 300 bp großen Schritten verkürzt.

Nach transienter Transfektion in RAW264.7-Zellen und Reportergenanalysen konnten die putativen Funktionen einiger Elemente ermittelt werden. Die Promotorabschnitte, die den größten Einfluss auf die Aktivität zu haben schienen, wurden weitergehend untersucht und durch Elimination der zu analysierenden Erkennungssequenzen genauer betrachtet. In einem letzten Schritt wurden die nun vorläufig identifizierten Wirkungsweisen einiger Zielsequenzen, die das Expressionsniveau stark zu beeinflussen schienen, mittels Mutagenese ihrer zentralen Bindungselemente analysiert. Auf diese Weise konnten die Funktionen der überprüften Zielsequenzen endgültig geklärt werden.

Bei diesen Untersuchungen stellten sich PPARG, SP2 (beide C3Bir-Il10^-/-) und OCT1 (B6-Il10^-/-) als aktivierend heraus. In den Trunkierungsversuchen zeigten sich SP1 (C3Bir-Il10^-/-), PPARG und SP1 (beide B6-Il10^-/-) als anregend, während sich in den Mutageneseanalysen ihre hemmende Funktion herausstellte . Die zunächst als inhibitorisch betrachteten Zielsequenzen für OCT1 (C3Bir-Il10^-/-), E2F sowie PAX2 (beide B6-Il10^-/-) stellten sich als anregend heraus.

PPARG

PPARG wird sowohl bei der Maus als auch beim Menschen auf Chromosom 6 kodiert und fördert Plazenta-, Herz- sowie Fettgewebsentwicklung (BARAK et al., 1999). Außerdem dient es der Makrophagendifferenzierung und wird aufgrund seiner antiinflammatorischen Wirkung zur Behandlung von TypII-Diabetes eingesetzt (TONTONOZ et al., 1998; HAARA et al., 2000). Des Weiteren werden PPARG-Liganden in der Colitis-Therapie gegen die Entzündungsreaktion der Darmschleimhaut verwendet (SU et al., 1999), denn es verhindert die Zytokinausschüttung von Monozyten und somit die Aktivierung des NFκB-Pfades (RICOTE te al., 1998). Es wurde gezeigt, dass die PPARG-Erkennungssequenz des C3Bir-Cd14-Promotors eine aktivierende Wirkung vermittelte. HORTECELLAS et al.

(2011) fanden heraus, dass PPARG einen schützenden Effekt auf den Verlauf muriner entzündlicher Darmerkrankungen hatte. Diese antiinflammatorische Wirkung wurde einer Inhibition der Zytokinausschüttung sowie der Expression proinflammtorischer Adhäsionsmoleküle in Maus-T-Zellen zugeschrieben (GURI et al., 2010). Im Mausmodell konnte nachgewiesen werden, dass die Anwesenheit intestinaler Mikroflora zu einer erhöhten Expression von PPARG führte, die in murinen Darmentzündungsmodellen ausblieb (DUBUQOUY et al, 2003). Außerdem wurden Polymorphismen im humanen PPARG-Gen mit einer erhöhten Suszeptibilität für CED in Verbindung gebracht (ANDERSEN et al., 2011). Die Ergebnisse der vorliegenden Studie bezüglich der Funktion von PPARG stimmen also mit den bisher zu diesem Thema veröffentlichten Untersuchungen überein. Mittels EMSA wurde bewiesen, dass der PPARG-Transkriptionsfaktor im C3Bir-Cd14-Promotor

physikalisch mit der zugehörigen Bindungsstelle im Promotor interagierte und sich dort anlagerte. Außerdem konnte gezeigt werden, dass diese Bindung nach Mutagenese der zentralen Zielsequenz nicht entstand.

SP2

SP2 wird im Mausgenom auf Chromosom 11 kodiert und beim Menschen auf Chromosom 17q21.3. Der Transkriptionsfaktor SP2 hat eine stark aktivierende Funktion und reguliert das Zellwachstum sowie die Differenzierung und die Tumorgenese von epidermalen Stammzellen (KIM, 2011). Außerdem ist es an der Regulation von Entzündungsprozessen beteiligt, indem es die Interfreon γ induzierte Expression des Suppressor of cytokine signalling (SOCS) Gens fördert (LETOURNEUR et al., 2009). In der vorliegenden Studie wurde bewiesen, dass die SP2-Bindungsstelle im C3Bir-Cd14-Promotor eine aktivierende Funktion hat. Im Zuge der Untersuchung des humanen Cd14-Promotors zeigte sich, dass SP2 dort – unseren Ergebnissen entsprechend – eine anregende Wirkung hatte. Homozygote Träger einer Mutation dieser Zielsequenz zeigten eine stark reduzierte Expression von Cd14, was mit einer erhöhten Anfälligkeit für entzündliche Erkrankungen in Verbindung gebracht wurde (LEVAN et al., 2001). Diese Untersuchungen stimmen mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit überein. Durch EMSA-Analysen konnte gezeigt werden, dass der SP2-Transkriptionsfaktor im C3Bir-Cd14-Promotor physikalisch mit der zugehörigen Bindungsstelle im Promotor interagierte und sich dort anlagerte. Außerdem wurde bewiesen, dass diese Bindung nach Mutagenese der zentralen Zielsequenz nicht entstand.

OCT1

OCT1 wird im Mausgenom auf Chromosom 17 kodiert und beim Menschen auf Chromosom 10q22.2. Es fungiert als Transportprotein sowie Transkriptionsfaktor und konnte mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden; so ist ein Polymorphismus im TNF-Promotor mit einer vierfach erhöhten Suszeptibilität für zerebrale Malaria assoziiert. Durch den SNP entsteht eine neue Bindungsstelle und es lagern sich OCT1-Proteine an den TNF-Promotor an. Das erhöht die Genexpression (KNIGHT et al., 1999). Der anregende Effekt von OCT1 wurde bereits an B-Zellen und an humanen Monozyten für die Expression von Lipoxin A4 nachgewiesen (ANNWEILER et al., 1993; WAECHTER et al., 2012). Es wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass die Bindungsstelle für OCT1 in den Cd14-Promotoren beider Stämme aktivierend auf die Expression dieses Proteins wirkt.

Eine ähnliche Funktion von OCT1 wurde bereits mit humaner CED in Verbindung gebracht. Im menschlichen TNF-Promotor konnte ein SNP ermittelt werden, der die Bindungsstelle eines OCT1-Elementes veränderte, sodass OCT1 nicht mehr binden konnte; das führte zu einer erhöhten Suszeptibilität für CED (VAN HEEL et al., 2002).

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie stimmen mit den Angaben in der Literatur über die transkriptionsfördernden Eigenschaften des Promotorelements überein.

Die Bindung des OCT1-Transkriptionsfaktors an seine Zielsequenz im Cd14-Promotor von C3Bir-Il10^-/- wurde durch EMSA nachgewiesen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass diese Interaktion nach Mutagenese der zentralen Zielsequenz nicht entstand.

E2F

E2F wird im murinen Genom auf Chromosom 2 kodiert, während es beim Menschen auf Chromosom 20q11.2 liegt. Es wirkt als anregender Transkriptionsfaktor (DYSON et al., 1998) und ist so an der Apoptoseinduktion in eukaryotischen Zellen beteiligt (WU et al., 1994). Außerdem aktiviert es als Transkriptionsfaktor die Progression des Zellzyklus von der G2- in die Metaphase und fördert die Zelldifferenzierung (REN et al., 2002). Des Weiteren wirkt es antiinflammatorisch, indem es in Endothelzellen IκB stabilisiert und so den NFκB-Pfad blockiert (CHEN et al., 2002). Die Analyse der Zielsequenz für E2F im Cd14-Promotor von B6-Il10^-/- ergab, dass sie einen fördernden Effekt auf die Proteinexpression hatte, was mit den genannten Publikationen übereinstimmt. Im Rahmen einer Darmentzündung wurde E2F in der vorliegenden Studie zum ersten Mal untersucht und stellt bezüglich CED möglicherweise einen neuen Therapieansatz dar. Anhand von EMSA-Untersuchungen wurde bewiesen, dass der E2F-Transkriptionsfaktor im Cd14-Promotor von C3Bir-Il10^-/- physikalisch mit der zugehörigen Bindungsstelle im Promotor interagierte und sich dort anlagerte. Außerdem konnte gezeigt werden, dass diese Bindung nach Mutagenese der zentralen Zielsequenz nicht entstand.

PAX2

Pax2 liegt im Genom der Maus auf Chromosom 19 und beim Menschen auf Chromosom 10q24, auf dem sich auch ein Suszeptibilitätslokus für CED befindet (siehe Tabelle 6). Der Transkriptionsfaktor PAX2 spielt eine zentrale Rolle in der regelgerechten Entwicklung des Nieren- und Zentralnervensystems, indem es die Expression des Wilms' Tumor Suppressor Gens (WT1) fördert (FICKENSCHER et al., 1993; DEHBI et al., 1996). Durch die Untersuchung der PAX2-Bindungsstelle des Cd14-Promotors von B6-Il10^-/- konnte gezeigt werde, dass sie eine aktivierende Wirkung hatte. Die fördernde Eigenschaft des Transkriptionsfaktors wurde im Rahmen der Entwicklung des Nieren- und Zentralnervensystems bereits mehrfach belegt. Die Assoziation zu Darmerkrankungen wird in dieser Untersuchung zum ersten Mal dargelegt. Möglicherweise bietet PAX2 einen Ansatz für neue Therapien der CED des Menschen. Die EMSA-Analyse des PAX2-Transkriptionsfaktors zeigte, dass er an den C3Bir-Cd14-Promotor band, und dass diese Bindung nach

Mutagenese der zentralen Bindungsstelle der Erkennungssequenz nicht mehr zustande kam.

In weiteren Studien wurden die CD14-Promotoren anderer Spezies untersucht, wie z.B. an den Leberzellen der Ratte (LIU et al., 2000): Bei der Ratte existierten, wie in diesem Mausmodell, zahlreiche AP1- und SP1-Erkennungssequenzen. Es wurde gezeigt, dass Zielsequenzen für sowohl AP1 als auch SP1 die Hintergrundaktivität der Expression bewirkten. Die Studie zu einem bovinen Cd14-Promotor förderte ebenfalls eine hohe Anzahl an Bindungsstellen für AP1 und SP1 zutage, denen eine basal aktivierende Wirkung zugesprochen wurde (IBEAGHA-AWEMU et al., 2008).

Eine Analyse des Maus-Cd14-Promotors (MATSUURA et al., 1992) identifizierte gleichermaßen eine AP1-Bindungsstelle als für die Hintergrundaktivität des Promotors verantwortliches Element, ebenso wie im humanen CD14-Promotor (LEVAN et al., 2001). Wie in der vorliegenden Studie dargelegt, trifft das nicht auf die vorliegenden, untersuchten Elemente zu. Das in der 3‘-Region gelegene SP1 zeigte in den Trunkierungsversuchen eine inhibitorische Wirkung. Diese Wirkung trat in beiden Mausstämmen auf und wurde vermutlich durch ein weiteres, die SP1-Bindungsstelle flankierendes Promotorelement verursacht.

Die Transkriptionsfaktorbindungsstellen PPARG, SP2 (beide C3Bir-Il10^-/-) und OCT1 (B6-Il10^-/-) ließen sich hinsichtlich ihrer aktivierenden Funktion verifizieren. In den Trunkierungsversuchen stellten sich SP1 (C3Bir-Il10^-/-), PPARG und SP1 (beide B6-Il10^-/-) als anregend dar, während sich in den Mutageneseanalysen ihre hemmende Funktion zeigte. Die zunächst als inhibitorisch betrachteten Zielsequenzen für OCT1 (C3Bir-Il10^-/-), E2F sowie PAX2 (beide B6-Il10^-/-) stellten sich als anregend heraus.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die stammesspezifische Cd14-Expression auf den Einfluss mehrerer divergierender Transkriptionsfaktor-bindungsstellen zurückzuführen ist und nicht durch einen einzigen Promotorpolymorphismus verursacht wird.