Tabellenverzeichnis - Charakterisierung des Maus-Cd14-Promotors hinsichtlich der Bedeutung von

Tabelle 1: Beispiele für die Einflüsse der Darmflora auf CED-Modelle (modifiziert nach BÜCHLER, 2006) ... 21 Tabelle 2: Ausrichtung der Colitis bei Il10^-/- Mäusen verschiedener Hintergrundstämme (modifiziert nach BÜCHLER, 2006) ... 22 Tabelle 3: Vergleich chemischer Transfektionsmethoden ... 61 Tabelle 4: Stammspezifische Polymorphismen, Transkriptionsfaktorbindungsstellen und deren Lage (modifiziert nach DE BUHR et al., 2006) ... 63 Tabelle 5: Kandidatengene für CED (modifiziert nach BÜCHLER, 2010) ... 92 Tabelle 6: In GAWS detektierte, mehrfach replizierte CED Suszeptibilitätsloci und Genassoziationen ... 93 Tabelle 7: Verwendete Oligonukleotide ... 110 Tabelle 8: Oligonukleotide für EMSA ... 113

3 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Hauptweg der Beeinflussung von CED durch CD14 ... 25

Abbildung 2: Murine Embryonale Firboblasten der Zellinie NIH3T3 ... 59

Abbildung 3: Murine Makrophagen der Zelllinie RAW264.7 ... 59

Abbildung 4: Western Blot Untersuchung der basalen und stimulierten Cd14-Expression an NIH3T3- und RAW264.7-Zellen ... 60

Abbildung 5 Luziferase-Analyse der ersten Trunkierungen des C3Bir-Cd14-Promotors ... 65

Abbildung 6 Luziferase-Analyse der ersten Trunkierungen des B6-Cd14-Promotors 67 Abbildung 7 Luziferase-Analyse aller Trunkierungen des C3Bir-Cd14-Promotors ... 69

Abbildung 8 Luziferase-Analyse aller Trunkierungen des B6-Cd14-Promotors ... 71

Abbildung 9 Luziferase-Analyse der Mutagenesen des C3Bir-Cd14-Promotors ... 74

Abbildung 10 Luziferase-Analyse der Mutagenesen des B6-Cd14-Promotors ... 76

Abbildung 11: EMSA der Bindungsstelle für PPARG (C3Bir) ... 78

Abbildung 12: EMSA der Bindungsstelle für SP2 (C3Bir) ... 79

Abbildung 13: EMSA der Bindungsstelle für OCT1 (C3Bir) ... 80

Abbildung 14: EMSA der Bindungsstelle für OCT1 (B6) ... 81

Abbildung 15: Transfektion von NIH3T3-Zellen mit Polyfect® ... 116

Abbildung 16: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Fugene HD® ... 116

Abbildung 17: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Targefect® ... 116

Abbildung 18: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Superfect® ... 117

Abbildung 19: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Xtreme Gene 9 DNA® ... 117

Abbildung 20: Transfektion von RAW264.7-Zellen mit Xtreme Gene HP DNA® .... 118

Abbildung 21: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten des B6-Cd14-Promotors nach Trunkierung ... 119

Abbildung 22: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten des C3Bir-Cd14-Promotors nach Trunkierung ... 120

Abbildung 23: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten der ersten Trunkierungen des B6-Cd14-Promotors nach Deletion durch Promotorverkürzung ... 121

Abbildung 24: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten des B6-Cd14-Promotors nach Deletion durch Promotorverkürzung ... 122

Abbildung 25: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten der ersten Trunkierungen des C3Bir-Cd14-Promotors nach Deletion durch Promotorverkürzung ... 123

Abbildung 26: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten des C3Bir-Cd14-Promotors nach Deletion durch Promotorverkürzung ... 124

Abbildung 27: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten des B6-Cd14-Promotors nach Mutagenisierung der Transkriptionsfaktorbindungsstellen ... 125

Abbildung 28: Luziferase- und β-Galaktosidase-Aktivitäten des C3Bir-Cd14-Promotors nach Mutagenisierung der Transkriptionsfaktorbindungsstellen ... 126

4 Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celsius

% Prozent

ABCB1 ATP-Binding Cassette, Subfamily B, Member 1

adap. Adaptive

AP1 Anionic Peroxidase 1

APS Ammoniumpersulfat

Areg Amphiregulin

ARPC2 Actin-Related Protein 2

ATF Activating Transcription Factor 2 ATG16L1 Autophagy Related 16-Like 1 β-Gal β-Galaktosidase

B6 C57/BL6J(B6)-Il10

-/-BACH2 BTB and CNC homology 1 Basic Leucine Zipper Transcription Factor 2

BCL6 B-Cell Leukemia/Lymphoma 6

Bp Basenpaar

BSA Bovines Serum Albumin

BSN Basonuclein

BTNL2 Butyrophilin-Like 2 bzw. beziehungsweise

C11orf30 Chromosome 11 Open Reading Frame 30 C3Bir C3H/HeJBir-Il10

-/-CARD Caspase Activated Recruitment Domain CCDC122 Coiled-Coil Domain Containing 122

CCL Chemokine (C-C motif) Ligand

CCNY Cycline Y

CCR 6 Chemokine(C-C motif) receptor 6 CD Cluster of differentiation

Cdcs Cytokine deficiency induced colitis susceptibility CDH1 Cadherin 1 Type 1

CDKAL 1 Cyclin-dependent kinase 5 regulatory subunit associated protein 1-like 1

cDNS zirkuläre Ribonukleinsäure

CED Chronisch Entzündliche Darmerkrankung CEP72 Centrosomal Protein 72kDa

cfu colony forming untis

CIITA Class II Major Histocompatibility Complex Transactivator CLN Ceroid-Lipofuscinosis Neuronal 3

cm Zentimeter

CMV Cytomegalievirus

CPEB Cytoplasmic Polyadenylation Element Binding Protein CREM cAMP-Response Element Modulator

CU Colitis Ulcerosa

CUL2 Cullin 2

DENND1B Differentially Expressed in Normal and Neoplastic Cells/ MAP-kinase Activating Death Domain Containing 1B

DLG 5 Disks Large Homolog 5 DMSO Dimethylsulfoxid

DNMT3A DNA Methyltransferase 3 Alpha DNS Desoxyribonukleinsäure

DSS Dextran Sodium Sulfat DTT Dithiothreitol

E2F E2F Transcription Factor ECM Extracellular Matrix Protein 1 E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EIF3C Eukaryotic Translation Initiation Factor 3 Subunit C ELISA Enzyme Linked Immunosorbant Assay

ENOX 1 Ecto-NOX Disulfide-Thiol Exchanger 1 ERAP Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase ESRRA Estrogen-related Receptor Alpha

Fa. Firma

FADS Fatty Acid Desaturase

FAM92B Family with Sequence Similarity 92, member B FCGR2A Fc Fragment of IgG Low Affinity IIa Receptor FMO4 Flavin-containing Monooxygenase 4 FUT2 Fucosyltransferase 2

g Gramm

g g-Beschleunigung

G418 Geneticin

GALC Galactosylceramidase

GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase Gbp Guanylate binding protein

GCKR Glucokinase Regulator GFP grün floureszierendes Protein

Gnb1 Guanine Nucleotide Binding Protein 1 GPI Glykosylphoshpatidolinositol

GPR65 G Protein-coupled Receptor 65 GPX1 Glutathione Peroxidase 1 GWAS Genomweite Assoziationsstudien HERC2 Hect Domain and Rolled Leaf 2 HLA Human Leukocyte Antigen HNF4A Hepatocyte Nuclear Factor 4 Alpha HORMAD2 HORMA domain containing 2

HPLC High-Performance Liquid Chromatography HRP Horseradichperoxidase

HSP Heat Shock Protein

IBD Inflammatory Bowel Disease ICAM Intercellular Adhesion Molecule

ICOSLG Inducible T-cell Costimulator Ligand Gen

Il Interleukin

Il10RA Interleukin 10 Receptor α Il1Rl1 Interleukin 1 Receptor-like 1 Il10RB Interleukin 10 Receptor β Il17REL Interleukin 17 Receptor E-like

Il18RAP Interleukin 18 Receptor Accessory Protein Il23R Interleukin 23 Receptor

INPP5E Inositol Polyphosphate-5-phosphatase INSL Insulin-Like

IRF Interferon Regulatory Factor

IRGM Immunity-Related GTPase Family M Protein JAK 2 Janus Kinase 2

KB Kilobase

kDa kilo Dalton

KIF21B Kinesin Family Member 21B KPNA7 Karyopherin Alpha 7

L Liter

LB Luria Bertani

LIF Leukemia Inhibitory Factor LPS Lipopolysaccharid

LRRK2 leucine-rich repeat kinase 2

Ly6g6c Lymphocyte Antigen 6 Complex, Locus G6C

mA Milliampere

MAP3K7IP1 TGF-beta Activated Kinase 1/MAP3K7 Binding Protein 1

MC Morbus Crohn

mCD membrangebundenes Cluster of differentiation MDR1 Multi Drug Resistance 1

MEF Murine Embryonale Fibroblasten MEM Modified Eagle’s Medium MHC Major Histocompatibility Complex MST1 Macrophage-Stimulating 1 MTMR3 Myotubularin Related Protein 3

µg Mikrogramm

mg Milligramm

µL Mikroliter

mL Milliliter

mMol Millimol

MOPS 3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure mRNS messenger Ribonukleinsäure

MUC Mucin

MYO9B Myosin IXB

NDFIP1 Neural Precursor Cell Expressed developmentally Down-regulated 4 Family Interacting Protein 1

NKX2-3 Natural Killer Cell-associated Antigen 2 Transcription Factor Related, Locus 3

nm Nanometer

NUPR1 Nuclear Protein Transcriptional Regulator 1 NOD nucleotide-binding oligomerization domain

NR Nitrat Reductase

OCT Organic Cation Transporter

OD Optische Dichte

ORMDL3 Orosomucoid 1 Like 3

P53 Transformation Related Protein 53 PAX2 Paired Box Gene 2

PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction Pla2g2a Phospholipase A2 group IIA PLCL1 Phospholipase C-like 1

PPARG Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma

PRDX Peroxiredoxin

PSMG1 Proteasome (Prosome, Macropain) Assembly Chaperone 1

PTGER4 Prostaglandin E Receptor Subtype EP4

PTPN1 Protein Tyrosine Phosphatase, Non-Receptor Type 1 PTPN 2 Protein Tyrosine Phosphatase, Non-Receptor Type 2

PTPN22 Protein Tyrosine Phosphatase Non-Receptor Type 22 (lymphoid)

pMol Picomol

PTPN22 Protein Thyrosin Phosphatase 22 PUS10 Pseudouridylate Synthase 10 qRT Quantitative Real-Time QTL Quantitative Trait Loci

® Registrierte Warenmarke

RASIP Ras Interacting Protein

REL Reticuloendotheliosis Viral Oncogene Homolog RNASE2 Ribonuclease A Family 2

RNS Ribonukleinsäure rpm revolutionso per minute rRNS ribosomale Ribonukleinsäure

RT Reverse Transkription

RTEL1 Regulator of Telomere Elongation Helicase 1

SATB2 Special AT-rich Sequence Binding Protein Homebox 2 SCAMP Secretory Carrier Membrane Protein

sCD soluble Cluster of Differentiantion

SDCCAG3 Serologically Defined Colon Cancer Antigen 3 SDS Sodium Dodecyl Sulfat

SEC16A Putative UDP-Acetylglucosamine-Peptide N-Acetylglucosaminyltransferase Homolog 16 A SLC Single Level Cell

SMAD3 Mothers Against Decapentaplegic Homolog 3 SMURF1 SMAD-specific E3 Ubiquitin-protein Ligase 1

SNAP4 Small Nuclear RNA Activating Complex Polypeptide 4 SNP single nukleotide polymorphism

SP1 Specificity Protein 1

SP140 SP140 Nuclear Body Protein SP2 Transkriptionsfaktor SP2 SPF Specified Pathogen Free

ssp. Subspezies

STAT Signal Transducer and Activator of Transcription

SULT1A1 Sulfotransferase Family Cytosolic 1A Phenol-Preferring Member

T/A Thymin/Adenin

TAGAP T-cell Activation RhoGTPase Activating Protein TFBS Transkriptionsfaktorbindunsstelle

Th T-Helfer

THADA Thyroid Adenoma Associated TL1A TNF-like ligand 1 A

TLR Toll Like Receptor TNF Tumor-Nekrose-Faktor

TNFRSF6B Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily 6B TNFSF15 Tumor Necrosis Factor Superfamily Member 15 TPPP Tubulin Polymerization Promoting Protein TR2 Nuclear Receptor Subfamily 2 Group C Member 1 TRAF Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-α assoziierter Faktor TRIF Toll-Like Receptor Adaptor Molecule 2

tRNS transfer Ribonukleinsäure

TYK Tyrosinkinase

u.a. unter anderem

UBE2D1 Ubiquitin-conjugating Enzyme E2D 1 USP12 Ubiquitin Specific Peptidase 12

UV Ultraviolett

V Volt

VAMP Vesicle-associated Membrane Protein

Vol. Volumen

z.B. zum Beispiel

ZFP36L1 Zinc Finger Protein 36 C3H Type-like 1 ZMIZ1 Zinc Finger MIZ-type Containing 1 ZNF 365 Zinc Finger 365

ZPBP Zona Pellucida Binding Protein

5 Literaturteil

5.1 Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen (CED)

Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen (CED) sind schubweise verlaufende Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes. Sie untergliedern sich in die beiden Haupterscheinungsformen Colitis Ulcerosa und Morbus Crohn, die bei den betroffenen Patienten in der Regel das erste Mal im Alter zwischen 20 und 40 Jahren auftreten (PICCO et al., 2009). Bei Colitis Ulcerosa beschränkt sich die Entzündung auf die Mukosa und die oberflächliche Submukosa des Dickdarms. Sie beginnt distal, schreitet kontinuierlich nach proximal fort und führt neben Ulzerationen langfristig zu einem erhöhten Darmkrebsrisiko (BERNSTEIN et al., 2001). Morbus Crohn ist durch eine diskontinuierliche transmurale Entzündung des gesamten Gastrointestinaltraktes gekennzeichnet, wobei Abszesse, Strikturen und Fisteln in den Bauchraum oder zu anderen Abdominalorganen entstehen können.

Symptomatisch sind beide Krankheitskomplexe durch abdominale Algesie, Meläna, Diarrhoe, Anorexie und Maldigestion gekennzeichnet. Außerdem zeigen sich vielfältige extraintestinale Symptome, wie z.B. Pyrexie, Anämie, Arthralgien, Uveitis oder Erythema nodosum (TRAVIS u. STANGE et al., 2007). Ätiopathogenetisch sind CED noch nicht vollständig geklärt, aber es steht fest, dass es sich um ein multifaktorielles Geschehen handelt (FORABOSCO et al., 2000). Demnach können sowohl Umweltfaktoren als auch die Mikroflora des Darmes und genetische Komponenten ausschlaggebend für die Entstehung und den Verlauf von CED sein (LAKATOS et al. 2003; HUGOT et al., 2004; CARIO et al., 2005), während Stress und andere sozioökonomische Faktoren ebenfalls Einfluss auf den Ausbruch und den Hergang der Erkrankung nehmen. Außerdem scheint eine erhöhte Permeabilität der Darmwand für Bakterien eine entscheidende Rolle zu spielen (MUNKHOLM et al., 1994). Seit dem Ende des Zweiten Weltkrieges steigt die Inzidenz beider Erkrankungserscheinungen sowohl in den Westlichen Industrienationen als auch in den verhältnismäßig weniger oft betroffenen Entwicklungsländern an (BERNSTEIN et al., 2010). Mittlerweile tritt in den Industrienationen eine Stagnation der Krankheitshäufigkeit ein, während sie in Entwicklungsländern weiter steigt. In Mitteleuropa erkranken jährlich zwischen 4 und 7 von 100.000 Einwohnern neu an Morbus Crohn, während Colitis Ulcerosa mit einer Häufigkeit von 9 bis 12 neuen Krankheitsfällen pro 100.000 Einwohner deutlich öfter auftritt (LOFTUS et al., 2004).

5.2 Genetik der CED

Obwohl die genaue Ätiopathogenese der CED noch nicht vollständig geklärt ist, stellte sich schon früh heraus, dass eine genetische Komponente eine Rolle spielen muss. So wurde bereits 1932 eine familiäre Häufung von CED festgestellt (CROHN et al., 1932), der ein polygenetischer Erbgang zu Grunde zu liegen schien (FORABOSCO et al., 2000). Heute zeigt sich, dass in Familien mit einem CED-Patienten die Häufigkeit für weitere innerfamiliäre Krankheitsfälle im Vergleich zur allgemeinen Bevölkerung 15-fach erhöht ist und so bis zu 20% der Verwandten von Betroffenen ebenfalls unter CED leiden (ORHOLM et al., 1991; VERMEIRE u.

PEETERS et al., 1996). In Zwillingsstudien wurde untersucht, inwieweit die Vererbung von CED genetisch bedingt ist. Die Übereinstimmungsraten bei eineiigen Zwillingen bezüglich der Krankheitsbetroffenheit von Morbus Crohn lag zwischen 20% und 50% (HALFVARSON et al., 2003), während sie bei zweieiigen Zwillingen zwischen 0% und 7% lag (ORHOLM et al, 2000; HALFVARSON et al., 2007). Eine weitere Studie zeigte, dass bei MC sogar der Ausprägungstyp der Erkrankung genetisch determiniert sein könnte. Bei Zwillingen mit Colitis Ulcerosa liegt ebenfalls eine genetische Komponente vor, die aber nicht so stark ausgeprägt ist, wie bei MC (HALFVARSON et al., 2003). Den Studien zufolge wird klar, dass Erbgut-Einflüsse eine große Rolle spielen, CED aber auch von weiteren Faktoren bestimmt wird.

5.2.1 Kopplungsanalysen

Bei Kopplungsanalysen werden genetische Merkmale, die in der Bevölkerung variabel verteilt sind, in einer Gruppe verwandter Personen untersucht, zu der sowohl von einer Krankheit betroffene als auch nicht betroffene Familienmitglieder gehören. So können bei Erkrankten genetische Variationen identifiziert werden, die bei Gesunden nicht zu finden sind (siehe 11.1). Das Nucleotide-binding Oligomerization Domain containing 2 Gen (NOD2 oder Caspase Activated Recruitment Domain protein 15, CARD15) befindet sich im Inflammatory Bowel Disease (IBD) 1 Lokus auf Chromosom 16. Es wird vor allem in Panethzellen sowie peripheren Blutmonozyten exprimiert und war das erste Gen, das mit einer erhöhten Suszeptibilität für Morbus Crohn in Verbindung gebracht werden konnte. Durch das Binden von Bakterienzellwandbestandteilen (Muramyldipeptid) an das C-terminale Ende des Proteins wird eine Nuclear Factor Kappa B (NF-κB) Kaskade in Gang gesetzt, die zur Ausschüttung von Entzündungsmediatoren führt. Mehrere seltene Polymorphismen, die oft in Zusammenhang mit Morbus Crohn auftreten, wurden in diesem Gen gefunden (OGURA et al., 2001; LESAGE et al., 2002; HUGOT et al.,

2008). Die Human Leukocyte Antigen (HLA) Klasse II Region und der Inflammatory Bowel Disease (IBD) 5 Lokus konnten bisher noch nicht unabhängig voneinander als Suszeptibilitätslokus für CED identifiziert werden, da sie in unmittelbarer Nähe zueinander liegen. Zu den Allelen, die mit dem Krankheitskomplex in Verbindung gebracht werden, gehören außerdem u.a. HLA-DRB1*1502 (ASAKURA et al., 1982;

SUGINMURA et al., 1993), HLA-DRB1*0701 (FERNANDEZ et al., 2004; NEWMAN et al., 2004; AHMAD et al., 2002) und HLA-DRB1*0103 (SATSANGI et al., 1996;

SILVERBERG et al., 2003; ORCHARD et al., 2002). Noch konnte aber nicht festgestellt werden, ob die Kopplungsergebnisse auf die einzelnen Allele selbst oder ihre Kopplung miteinander zurückzuführen sind. In der Promotorregion des Tumor Nekrose Faktor (TNF) Genes, das auch in der IBD 3 Region liegt, wurden mit CED assoziierte Single Nukleotide Polymorphisms (SNPs) gefunden (ORCHARD et al., 2002; VAN HEEL et al., 2002; TREMELLING et al., 2006). Funktionelle Abweichungen von organischen Kationentransportern (Organic Cation Transporter, OCT) der Gene Single Level Cell (SLC) 22A4 und SLC22A5 im IBD5-Lokus werden als kausal für deren Rolle bei CED betrachtet (PELTEKOVA et al., 2004). Letztere Gene agieren eng mit Interferon Regulatory Factor (IRF) 1, Interleukin (IL) 3-5 und IL13, weshalb diese ebenfalls als Kandidatengene in Betracht gezogen werden. Es wurden weitere Kandidatengene gefunden, deren Assoziation zu CED allerdings nicht eindeutig reproduziert werden konnte, wie z.B. NOD1/CARD4 (MCGOVERN et al., 2005), TLR4 (FRANCHIMONT et al., 2004; DE JAGER et al., 2007), Myosin IXB (MYO9B; VAN BODEGRAVEN et al., 2006) und NFκB1 (KARBAN et al., 2004).

5.2.2 Genomweite Assoziationsstudien (GWAS)

Um ein bestimmtes Merkmal mit dem genetischen Hintergrund des Merkmalträgers in Verbindung zu bringen, werden sogenannte genomweite Assoziationsstudien (GWAS) durchgeführt. Innerhalb einer Population werden zu diesem Zweck Assoziationen von Polymorphismen mit Krankheitsmerkmalen untersucht. Während Kandidatengenassoziationsstudien zur Verifizierung bereits bestehender Verdachtsmomente genutzt werden, können GWAS nach statistischer Auswertung von SNP-Verteilungen lediglich Hinweise auf mögliche genetische Zusammenhänge geben. SNPs, die nur bei Merkmalsträgern zu finden sind, können so nach weiterer Überprüfung als genetische Marker eingesetzt werden, z.B. für die Diagnostik von Krankheiten (siehe 11.2).

Obwohl die genauen Pathomechansimen, über die die durch GWAS ermittelten Kandidatengene wirken, meist noch nicht bekannt sind, können die Gene dem innaten bzw. dem adaptiven Immunsystem zugeordnet werden. Zu der erworbenen

Abwehr gehören einige Faktoren der T-Zell-Immunantwort; Interleukin 10 (IL10), Protein Tyrosine Phosphatase Non-Receptor Type 1 (PTPN2) sowie Protein Tyrosine Phosphatase Non-Receptor Type 22 lymphoid (PTPN22) verringern die Aktivität von T-Zellen, während eine Anregung der T-Helfer (Th) 1- und Th2-Zytokin-Produktion durch das Inducible T-cell Costimulator Ligand Gen (ICOSLG) stattfindet.

Die Gene IL23R und IL12b kodieren für Proteine, die an der Entwicklung beziehungsweise Funktion von Th-Zellen der Typen 1 und 17 beteiligt sind, während viele weitere Gene ebenfalls Einfluss auf das adaptive Immunsystem nehmen (siehe 11.2). Sie regulieren z.B. die Apoptose (CDKAL1, TNFRSF6B, TNFS15) oder Transkriptionsfaktorexpressionen (C11orf3, CREM, JAK2, LRRK2). Im Bereich der angeborenen Abwehrmechanismen spielen MUC19 für die Protektion der Darmbarriere und ATGL16L- sowie IRGM- regulierte Autophagieantigene eine Rolle.

Des Weiteren steuert MST1 die Chemotaxis von Makrophagen und NOD2 die Immunantwort auf Bakterien.

5.3 Tiermodelle CED

Tiermodelle dienen der Erforschung menschlicher Erkrankungen, um durch Untersuchungen an diesem Modell neue Erkenntnisse bezüglich der Ursache, des Verlaufs oder der Therapie des jeweiligen Leidens zu finden. Für Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen (CED) gibt es zahlreiche Tiermodelle, die entweder eine spontane Colitis entwickeln (SAMP1/Yit-Maus, MATSUMOTO et al., 1998) oder artifiziell beeinflusst werden müssen, um die gewünschte Symptomatik zu zeigen, wie z.B. bei der durch Natriumdextransulfat (Dextran Sodium Sulfat, DSS) induzierten Colitis. Außerdem werden verschiedene Mausstämme eingesetzt, die aufgrund genetischer Modifikationen Entzündungen des Gastrointestinaltraktes entwickeln (PIZARRO et al., 2003). Bei CED handelt es sich um eine multifaktorielle Erkrankung, auf deren Entstehung neben der Genetik des Patienten auch Umwelt und Darmflora Einfluss nehmen. Daher ist es wichtig, dass diese Faktoren bei genetisch determinierten Mäusen genau definiert und reguliert werden können. Die Bakterien im Darm eines gesunden Tieres erfüllen diverse essentielle Funktionen;

sie versorgen den Wirtsorganismus mit verschiedenen Vitaminen und kurzkettigen Fettsäuren, regen die Peristaltik an, entgiften Xenobiotika (NICHOLSON et al., 2005), unterdrücken das Wachstum von pathogenen Bakterien durch die Produktion von Antimikrobiotika und sind an der Immunmodulation beteiligt (RAKOFF-NAHOUM et al., 2004). Des Weiteren stabilisieren sie die Darmbarriere durch die Produktion von Butyrat, das von den Darmepithelzellen zur Energiegewinnung verstoffwechselt wird.

All diese Funktionen beeinflussen die Entstehung von Colitis im Mausmodell, sodass einige Stämme, die mit einer konventionellen Darmflora eine Darmentzündung

entwickeln, unter keimfreien Haltungsbedingungen nicht vom Ausbruch der Erkrankung betroffen sind. Außerdem gibt es Bakterien, die nachweislich entzündungshemmende (z.B. Lactobacillus ssp.) oder -fördernde (z.B. Helicobacter ssp.) Eigenschaften besitzen.

Tabelle 1: Beispiele für die Einflüsse der Darmflora auf CED-Modelle (modifiziert nach BÜCHLER, 2006)

Ausprägung Mausstamm/ Modell Referenz

Keine Kolitis bei

DSS Kolitis: Lactobacillus ssp., Bifidobacterium infantis, Escherichia coli (E. coli) Nissle CD4+/CD26L+- Prkdc^scid-Transfer:

Bifidobacterium infantis, Lactobacillus reuteri und E. coli Nissle

2008;

Forcierte Kolitis bei kolitogener Flora

Enterococcus faecalis bei IL10-defizienten Mäusen

E. coli bei IL10-defizienten Mäusen Helicobacter spp. bei verschiedenen Mausmodellen

CAHILL et al., 1997;

KULLBERG et al., 1998;

CHIN et al., 2000;

BURICH et al., 2001;

BALISH et al., 2002; KIM et al., 2005

Auch die Genetik der Mäuse spielt bei einigen Modellen eine bedeutende Rolle, z.B.

im Modell der Il10-defizienten (Il10^tm1Cgn) Maus. Je nach Stamm zeigen die Mäuse verschiedene Schweregrade und Verlaufsformen der Colitis. Als Ausgangspunkt für die vorliegende Arbeit dienen hierbei die Stammesunterschiede zwischen Mäusen der Stämme C57BL/6J.129P2-Il10^tm1Cgn/JZtm (B6-I10^-/-) und C3H/HeJBir.129P2-Il10^tm1Cgn/JZtm (C3Bir-Il10^-/-).

Tabelle 2: Ausrichtung der Colitis bei Il10^-/- Mäusen verschiedener Hintergrundstämme (modifiziert nach BÜCHLER, 2006)

Hintergrundstamm Schwere und Verlauf der Kolitis

Referenz

C57BL/6J Mild, protrahiert BERG et al., 1996; TAKEDA et al., 1999; BRISTOL et al., 2000 BALB/c Intermediär, progressiv TAKEDA et al., 1999 NOD/Lt Intermediär, progressiv MÄHLER et al., 2002 NOD.NON-H2^nb1 Intermediär, progressiv MÄHLER et al., 2002 129/SvEv Schwer, progressiv TAKEDA et al., 1999 C3H/HeJBir Schwer, beginnt sehr früh BRISTOL et al., 2000 C3H.SW Schwer, beginnt sehr früh MÄHLER et al., 2002

5.4 Vorarbeiten

1993 wurde am Institut für Genetik der Universität Köln die Interleukin10 (Il10)-defiziente (Il10^tm1Cgn; Il10^-/-) Maus entwickelt. IL10 dient der Regulation des Immunsystems und schützt den Organismus, indem es überschießende Abwehrreaktionen vermeidet (GRÜTZ, 2005). Die Nullmutation von Il10 im oben genannten Mausstamm verursachte eine überschießende Immunreaktion auf luminale Xenoantigene des Darmes, die verschiedene Merkmale der Colitis Ulcerosa und Morbus Crohn aufwiesen (KÜHN et al., 1993); die Tiere entwickelten eine meist letal verlaufende, chronische Enterocolitis, die vornehmlich Zäkum sowie Kolon betraf und histologisch durch mukosale Entzündungszellinfiltrate in Verbindung mit intraluminalen fibrinoiden Ablagerungen gekennzeichnet war. Bei der Untersuchung verschiedener Il10^-/--Stämme zeigte sich in Zusammenarbeit mit Dr. Leiter (The Jaxon Laboratory, USA), dass die Nullmutanten des C3Bir-Stammes eine deutlich schwerere Form der Colitis entwickelten als B6-Il10^-/--Mäuse, was verdeutlicht, dass die Krankheitsausprägung von der Genetik des Hintergrundstammes beeinflusst wird.

Sich anschließende genomweite Kopplungsanalysen an segregierenden Kreuzungspopulationen dieser Stämme zeigten, dass die 10 gefundenen CED-Suszeptibilitäzsloki (Quantitative Trait Loci, QTL), die auch als Cytokine deficiency induced colitis susceptibility (Cdcs) 1 bis 10 bezeichnet werden, einer sehr umfassenden genetischen Kontrolle unterliegen (BLEICH et al., 2004). Wie schon bei anderen QTL beobachtet, findet man diese Allele nicht nur im suszeptiblen Stamm C3Bir, sondern teilweise (Cdcs4, Cdcs6, Cdcs8) auch bei den eigentlich resistenten B6-Mäusen. Innerhalb der 10 QTL konnten durch weitere genetische Untersuchungen und Microarray-Analysen 8 Kandidatengene identifiziert werden (DE BUHR et al., 2006): Guanylate Binding Protein 1 (Gbp1) im Cdcs1; Heat Shock Protein (Hsp) 1a, Hsp1b und Lymphocyte Antigen 6 Complex Locus G6C (Ly6g6c) im Cdcs5; Cluster of differentiation (Cd14) im Cdcs6; Phospholipase A2 group IIA (Pla2g2a) und Guanine Nucleotide Binding Protein 1 (Gnb1) im Cdcs9; Amphiregulin (Areg) im Cdcs10. Nach einem Vergleich der Gen-Expressionen zwischen Il10 -/-Mäusen beider Hintergrundstämme und Wildtypvarianten kristallisierten sich 3 Kandidatengene heraus, die in allen Stämmen einen hohen Einfluss auf das Expressionsniveau hatten: Gbp1 (Cdcs1, Chromosom 3), Cd14 (Cdcs6, Chromosom 18) und Pla2g2a (Cdcs9, Chromosom 4). Bezüglich C3Bir zeigten sowohl Mäuse in konventioneller als auch in keimfreier Haltung eine deutlich höhere CD14-Produktion als B6 (DE BUHR et al., 2006), wobei CD14 im Darm in löslicher Form vorlag (soluble CD14, sCD14) und einen protektiven Effekt gegen die Colitisentwicklung hatte. Die insgesamt geringere CD14-Produktion in keimfreien Tieren zeigte, dass die Mikroflora über verschiedene Rückkopplungsmechanismen einen Einfluss auf die

Im Dokument Charakterisierung des Maus-Cd14-Promotors hinsichtlich der Bedeutung von CD14 für die intestinalen Barriere- und Abwehrmechanismen im Darm (Seite 14-0)