Modulation der Immunantwort bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Hannover-Zentrum für experimentelle und klinische Infektionsforschung erstellt im Rahmen der strukturierten

Doktorandenausbildung

Modulation der Immunantwort bei chronisch entzündlichen

Darmerkrankungen

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von

Alexa Goharani Sefid Dashti aus

Baden-Baden

Hannover 2016

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 12.02.2018.

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Professor Dr. med. Christopher Baum Wissenschaftliche Betreuung: Professor Dr. med. Tim Sparwasser

1. Referent: PD Dr. med. Christian Könecke 2. Referent: Prof. Dr. med. Georg Behrens Tag der mündlichen Prüfung: 12.02.2018 Prüfungsausschuss:

Vorsitz: Prof. Dr. med. Hans-Heinrich Kreipe 1. Prüfer: PD Dr. med. Albert Heim

2. Prüfer: Prof. Dr. med. Reinhard Brunkhorst

Für meine Liebsten Für meine Liebsten Für meine Liebsten Für meine Liebsten

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ...1

1.1. Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) ...1

1.1.1. Pathogenese der CED und mukosale Immunität ...2

1.1.2. Funktion und Interaktion der Th17- und Treg-Zellen ...4

1.2. Soraphen A und der metabolische Einfluss auf die T-Zell-Differenzierung ...6

1.3. Experimentell induzierte Kolitis im Maus-Modell ...8

1.3.1. Immunologische Zelltransfer-Kolitis ...9

1.3.2. Chemische Kolitis ...9

1.4. Ziel der Arbeit ... 10

2. Material und Methoden ... 13

2.1. Versuchstiere ... 13

2.2. Transferkolitis ... 14

2.2.1. Isolation und Anreicherung von CD4⁺ T-Zellen ... 14

2.2.2. Färbung und Sortierung der CD4⁺ T-Zellen ... 15

2.2.3. Behandlungsplan der RAG^-/- -Mäuse im Transferkolitis-Modell ... 16

2.3. DSS-Kolitis ... 18

2.3.1. Behandlungsplan der CD4cre und FOXcre konditionellen ACC1-Knockout- und der C57 Bl/6J-Wildtyp-Mäuse ... 18

2.4. Isolation von Lymphozyten aus der Lamina propria ... 20

2.5. Restimulation und oberflächliche Antikörpermarkierung der Zellen ... 23

2.6. Färbung der Intrazellulären Zytokine und Transkriptionsfaktoren ... 23

2.7. Durchflusszytometrie ... 24

2.8. Histologie und histopathologischer Score ... 24

3. Ergebnisse ... 26

3.1. Transferkolitis ... 26

3.1.2. Behandlung mit SorA/ EtOH-PBS ... 33

3.1.3. Behandlung mit SorA/ PEG-Tween80 ... 37

3.1.4. Behandlung mit SorA bzw. Sor-S1036/ PEG-Tween80 ... 42

3.2. DSS-Kolitis ... 47

3.2.1. Behandlung mit Soraphen A ... 47

3.2.2. DSS-Kolitis bei ACC1-KO Mäusen ... 50

4. Diskussion ... 55

4.1. Die Intraperitoneale Applikation von Soraphen A im Lösungsmittel PEG/Tween80 zeigt T-Zell reduzierende Effekte ... 56

4.1.1. Sor-S1036-behandelte Mäuse weisen im Transferkolitis-Modell klinisch und histologisch eine tendenzielle Besserung ihrer Erkrankung auf ... 58

4.2. Die Soraphen A Behandlung von C57 Bl/6J Wildtyp-Mäusen im DSS-Kolitis-Modell hat keine signifikanten Auswirkungen auf das Th17/Treg-Gleichgewicht ... 59

4.2.1. DSS-behandelte transgene ACC1-Knockout-Mäuse zeigen nicht eindeutige Ergebnisse bezüglich des Ausmaßes ihrer CED ... 60

5. Zusammenfassung ... 62

6. Literaturverzeichnis ... 64

7. Anhang ... 70

7.1. Abkürzungsverzeichnis ... 70

7.2. Abbildungs- und Tabellenverzeichnis ... 74

7.2.1. Abbildungsverzeichnis ... 74

7.2.2. Tabellenverzeichnis ... 78

7.3. Kreuzungsschema transgener ACC1-KO Mäuse (Anhang 1) ... 79

7.4. Wiederholungsversuche ... 80

7.4.1. Wiederholungsversuch: Transferkolitis und Behandlung mit SorA/PEG-Tween80 (Anhang 2) ... 80

7.4.2. Wiederholungsversuch: DSS-Kolitis und Behandlung mit Soraphen A (Anhang 3) ... 82

7.4.3. Wiederholungsversuch: DSS-Kolitis bei ACC1-KO Mäusen (Anhang 4) ... 84

9. Danksagung ... 90 10. Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 6 und 7 der PromO ... 91

Seite 1

1. Einleitung

1.1. Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED)

Die chronisch entzündlichen Darmerkrankungen bezeichnen als Oberbegriff eine Gruppe von Erkrankungen, die sich durch eine permanente chronisch-rezidivierende Art und Weise im Darm entzündlich bemerkbar machen. Die häufigsten Vertreter der CED sind die Colitis ulcerosa (CU) und der Morbus Crohn (MC). Sie sind oft auf das Kolon beschränkt (CU), können jedoch auch den gesamten Verdauungstrakt betreffen (MC) [1].

In der westlichen Welt, sind nach einer Schätzung der Leitlinien für Colitis ulcerosa von 2011 etwa mit 160-250 CED-Erkrankten auf 100.000 Einwohnern zu rechnen, wobei der Altersgipfel zwischen dem 16.-25. Lebensjahr liegt [2].

Symptomatisch zeigt sich die CED oft durch rezidivierende Diarrhöen, unspezifische Bauchschmerzen und okkulten Stuhl. Aber auch Symptome wie Müdigkeit, ein genereller Leistungseinbruch und Gewichtsverlust können die Erkrankung auszeichnen [1], [3], [4].

Die Ätiologie der CED ist derweil noch nicht vollständig geklärt. Allerdings diskutieren Wissenschaftler aktuell ein multifaktorielles Geschehen, welches die Genese der Erkrankung erklären könnte. Dieses, wird vermutet, setzt sich prinzipiell zusammen aus der genetischen Prädisposition des Betroffenen (NOD-2-Mutation, IL-10-Genmutation) und bestimmten Umweltfaktoren, die die Zusammensetzung der intestinalen Flora (Mikrobiom) beeinflussen sollen [5], [6]. Zum Beispiel können durch spezielle Diäten und Lebensgewohnheiten des Individuums, aber auch durch verschiedene Genmutationen, bestimmte Keimspektren im gastrointestinalen Trakt begünstigt werden, wobei diese sowohl pathogene als auch kommensale Bakterien sein können [7], [8]. Diese Bakterien, werden dann in Form von Antigenen vermehrt dem mukosalen Immunsystem präsentiert, welches dann mit einer überschwänglichen Immunreaktion (Entzündung) darauf reagieren kann [7].

Seite 2

1.1.1. Pathogenese der CED und mukosale Immunität

In der Pathogenese der CED spielt das mukosale Immunsystem eine entscheidende Rolle. Ein Teil davon stellt das erworbene Immunsystem dar, wozu unter anderem die Lymphozyten gehören. Diese werden in B- und T-Lymphozyten unterteilt. Während die B-Lymphozyten unter anderem mit der Bildung von Antikörpern die Immunabwehr stärken, unterstützen die T-Lymphozyten über die Antigen-Erkennung das Immunsystem. Dabei unterscheidet man zwei unterschiedliche T-Zell-Gruppen, die sich über ihre CD-Oberflächenmerkmale unterscheiden: die CD8-positiven T-Zellen wirken nach Aktivierung durch ein Antigen (z.B.

Bakterienpartikel) direkt zytotoxisch an ihren Zielzellen, während die CD4-positiven T-Zellen als Helferzellen bei Stimulation bestimmte Zytokine produzieren, die dann die CD8⁺ Zellen und Makrophagen wiederum aktivieren, was dann folglich zu einer Verstärkung der Immunantwort führt [9].

Naive T-Zellen sind CD4⁺ Vorläuferzellen, aus denen sich je nach Antigenkontakt und herrschendem Zytokin-Milieu entweder entzündungsfördernde Effektor-T-Zellen (Teff) oder regulatorische T-Zellen (Tregs) differenzieren können (s. Abb. 1) [10]. Bis vor kurzem teilte man die Teff-Zellen in zwei verschiedene Untergruppen ein. Dazu zählten zum einen die Th1- Zellen, die insbesondere in der bakteriellen Infektabwehr von hoher Relevanz sind und zum anderen die Th2-Zellen, die u. a. in der Abwehr parasitärer Infektionen eine große Rolle spielen. Erst vor wenigen Jahren wurde eine weitere Subpopulation ermittelt, die prinzipiell, ähnlich wie auch die Th1- und Th2-Zellen, eine wesentliche Rolle in der Abwehr von Mikroorganismen spielt [11]. Diese sog. Th17-Zellpopulation ist derzeit Gegenstand aktueller Forschung, da sie stark im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen wie rheumatoider Arthritis, multipler Sklerose und chronisch entzündlichen Darmerkrankungen vermutet wird [11], [12], [13].

Anknüpfend an die Thematik der CED, legt sich folglich der Fokus dieser Dissertation auf den Zusammenhang zwischen regulatorischen T-Zellen und Th17-Zellen und ihrer Rolle in der mukosalen Immunität.

Abb. 1 T-Zell-Untergruppen und (Quelle:Weiping Zou & Nichola Reviews Immunology 2010 10:

Um die verschiedenen T-Zell-Su sich besonderer Merkmale e Transkriptionsfaktoren, der charakterisierender Oberfläc Oberflächenkonfiguration CD4 Transkriptionsfaktor FoxP3 (Fo produzieren, ist der Transkri receptor gamma t) und das Zy 17⁺ Th17-Zellen (s. Abb. 1) [10]

Prinzipiell herrscht bei gesunde in der Darmmukosa. Bei Patien dieses Gleichgewicht, z. B.

Mutationen, zu entzündungs folglich mit einer übertriebene wirft (s. Abb. 2) [5], [6], [16].

und ihre Milieu-abhängige Differenzierung aus naiven T holas P. Restifo „Th17- cells in tumor immunity and immu

0: 248-256)

Subpopulationen voneinander trennen zu kön le einer Zelle, wie beispielsweise die Induk er Produktion bestimmter Zytokine und rflächenmerkmale. Während die Treg-Ze

CD4⁺CD25⁺ Rezeptoren aufweisen und typ (Forkhead box Protein 3) exprimieren, sowie d

skriptionsfaktor RORγt (retinoic acid recepto s Zytokin IL-17 (Interleukin-17) charakterisieren [10], [14], [15].

nden Individuen ein Gleichgewicht zwischen Te tienten mit CU oder MC geht man allerdings da B. getriggert durch bestimmte Pathogene gsfördernden Teff-Zellen (z.B. Th17-Zellen) hi enen Immunreaktion die Homöostase des Darm

].

Seite 3 n T-Zellen

munotherapy“, Nature

können, bedient man duktion zelltypischer nd der Expression Zellen in ihrer typischerweise den ie das Zytokin TGF-β eptor-related orphan rend für die CD4⁺/IL-

n Teff-und Treg-Zellen s davon aus, dass sich

ne oder genetische hin verschiebt und arms aus der Balance

Abb. 2 Imbalance der regulatori Entzündungsreaktion in der Darm

1.1.2. Funktion und

Die Differenzierung von Th17 miteinander zusammen. Beide [18], [19]. Die Th17-Zellen be TGF-β und IL-6 das IL-1β und Zytokinmilieus wirkt sich auf di vom Zytokin IL-23 in inflammationsfördernd einstuf als vielmehr nicht pathogen Vermutlich wird dieser anti-en von den nicht-pathogenen Th17 Nach der Auffassung von Kuchr vor allem die Eliminierung Insbesondere tun sie dies Darmbarriere beitragen und au Gegenwart bestimmter kolonis (SFB) können die Th17-Zellen d bedeutend antreiben [26], [27 vermehrte Produktion von Reaktionspfade zu einer Induk führt [5].

torischen (Tregs) und inflammatorischen (Teff) T-Zellen fü Darmmukosa (vereinfachtes Beispiel)

und Interaktion der Th17- und Treg

h17- und Treg-Zellen aus naiven T-Zellen hä eide Subgruppen entwickeln sich durch Zugabe

benötigen zusätzlich zur Differenzierung IL-6 und IL-23 [20], [21]. Der Einfluss der beiden f die Pathogenität der Th17-Zelle aus. Während

ihren Effektor-Funktionen eher als stufen lassen, werden die TGF-β und IL-6 exponi gen bzw. entzündungshemmend beschrieben entzündliche Effekt durch das Zytokin IL-10 h Th17-Zellen produziert wird [23], [25].

uchroo et al. [11] gehören zu den Hauptaufgabe ung von extrazellulären pathogenen Bakter

s an mukosalen Oberflächen, sodass sie d auf diese Weise den Organismus vor Keimen lonisierender Bakterien wie den segmented fila len dabei stark expandieren und die Inflammati , [27]. Diese ungehemmte Expansion der Th1 on IL-17A zur Folge, welche vermutlich duktion von IFNγ, dem stärksten pro-inflammat

Seite 4

n führt zur

eg-Zellen

hängt grundsätzlich gabe von TGF-β [17], 6 oder anstatt von n unterschiedlichen rend sie sich abhängig ls pathogen, also ponierten Th17-Zellen ben [22], [23], [24].

0 hervorgerufen, das

aben der Th17-Zellen kterien und Pilzen.

zur Stärkung der men schützen. In der filamentous bacteria mation im Intestinum Th17-Zellen hat eine ch über bestimmte matorischen Zytokin,

Seite 5 Der Einfluss des Zytokinmilieus führt zur Induktion des Transkriptionsfaktors RORγt, der dann wiederum die Produktion des inflammatorischen Zytokins IL-17A antreibt [17], [28], [29]. Bei tierexperimentellen Modellen autoimmuner Erkrankungen wie z. B. bei der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) oder der experimentellen rheumatoiden Arthritis wurde das IL-17A als ein eindeutig pro-inflammatorisches Zytokin identifiziert [30], [31]. Nichtsdestotrotz wurden kürzlich ambivalente Eigenschaften des IL- 17A in experimentellen Kolitis-Tiermodellen entdeckt. Dabei konnte gezeigt werden, dass das IL-17A in verschiedenen dieser Modelle sowohl pro- als auch anti-inflammatorische Eigenschaften aufzeigte. Zum Beispiel konnten Ogawa et al. [32] protektive Funktionen des IL-17A im DSS-Kolitis Modell nachweisen, bei der durch Neutralisation dieses Zytokins, mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers, die Kolitis bei Mäusen immens aggraviert werden konnte. Auch Yang et al. [33] beobachteten einen verschlimmerten Krankheitsverlauf bei sog. IL-17A-KO Mäusen, bei denen das IL-17A genetisch eliminiert wurde. Gleichzeitig konnte aber im Transferkolitis-Modell verdeutlicht werden, dass das IL-17A in Gegenwart vom IL- 17F (einem weiteren Zytokin, welches u. a. von den Th17-Zellen produziert wird) einen verstärkt pro-inflammatorischen Einfluss auf den Krankheitsverlauf der Tiere hat [15]. Des Weiteren konnten Studien von Maxwell et al., sowie Lee et al. an unterschiedlichen Mausmodellen belegen, dass das Zytokin IL-17 eine zentrale Rolle bei der Stabilisierung der Darmbarriere spielt. In den Experimenten, in welchen das IL-17A antagonisiert wurde, konnte eine erhöhte intestinale Permeabilität beobachtet werden, die am ehesten mit einer Dysregulation von sog. Occludinen (tight junctions Proteine) erklärt werden konnte. Diese haben einen bedeutenden Einfluss auf die Abdichtung der Zellzwischenräume der Darmepithelien und bilden somit eine adäquate parazelluläre Diffusionsbarriere (tight junction), die verhindern soll, dass extrazelluläre Keime in den Organismus gelangen und eine vermeintliche Entzündungsreaktion auslösen [34], [35], [36].

Die Tregs hingegen differenzieren sich ausschließlich unter dem Einfluss von TGF-β und bilden unter Expression des Transkriptionsfaktors FoxP3 bestimmte anti-inflammatorische Zytokine wie TGF-β, IL-4 und vor allem das stärkste anti-inflammatorische Zytokin IL-10 [24], [25], [37]. Mit dem IL-10 und in Form direkter Zell-zu-Zell Interaktionen können die Tregs inflammatorische T-Zellen, wie Th1 und Th17, in ihrer Funktion und Proliferation inhibieren

und fördern somit den an Autoimmunerkrankungen auch

1.2. Soraphen A und d Differenzierung

In den letzten Jahren wurde v Differenzierung von naiven T- Th17/Treg-Gleichgewichtes zu konnten Retinoide (ATRA) be Einfluss auf das Th17/Treg- experimentellen Kolitis in posit Eine weitere Substanz könnt darstellen. Das Soraphen A Sorangium cellulosum (Abb. 3b Sorangium cellulosum lebt üb [40], [41], [42]. Außerdem behe Mio. Basenpaaren [43].

3 a)

Abb. 3 a) Strukturformel des Soraph

Molekularbiologisch wirkt Sora novo Fettsäuresynthese. Zu d wobei die beiden Isoformen A

anti-inflammatorischen Effekt und im Zus uch die Selbst-Toleranz [38].

nd der metabolische Einfluss auf die

de vermehrt nach Substanzen gesucht, die eine -Zellen ausüben und so einen Einfluss auf die zu Gunsten der regulatorischen T-Zellen bereits als Stoffklasse identifiziert werden, d

-Gleichgewicht haben und damit den Kran ositiver Hinsicht beeinflussen können [39].

nnte der niedermolekulare Wirkstoff Soraph A ist eine Substanz, die ursprünglich vom . 3b) stammt und zur Abwehr fremder Bakterie überwiegend in der Erde und bildet sogenan beherbergt es das vermutlich größte bakterielle

3 b)

aphen A [41], b) Sorangium cellulosum (E-mikroskop. Auf

Soraphen A inhibitorisch auf Schlüsselenzyme d u diesen Enzymen gehören die Acetyl-CoA-Ca en ACC1 und ACC2 ubiquitär in den Körperzell

Seite 6 Zusammenhang mit

die T-Zell-

eine Wirkung auf die die Verschiebung des len bewirken. Dabei n, die einen solchen rankheitsverlauf der

raphen A (Abb. 3a) om Myxobakterium erien und Pilze dient.

nannte Fruchtkörper elle Genom mit ca. 13

Aufnahme)

e der zelleigenen de Carboxylasen (ACC), rzellen vertreten sind

Seite 7 [44]. Während das ACC1-Isoenzym vorwiegend im Zytosol auffindbar ist, befindet sich das ACC2-Enzym membranständig an den Mitochondrien der Zelle (s. Abb. 4) [44], [45]. In Krebsstudien konnte bereits gezeigt werden, dass die Aktivität der ACC-Enzyme in kultivierten Krebszellen unentbehrlich für die Proliferation und das Überleben der Zelle ist.

Durch eine Hemmung dieser Enzyme mit Hilfe des Soraphen A konnte bereits ein Wachstumsarrest in den Krebszellen induziert werden [46]. Dieser antiproliferative Effekt beschränkte sich dabei nicht nur auf Krebszellen, sondern konnte auch in vitro bei naiven T- Lymphozyten beobachtet werden.

Abb.4 Rolle der ACC-Isoenzyme im Fettsäurestoffwechsel der Zelle (Quelle: Yugang&Burn, Nat Rev Drug Discovery 2004)

Ein Einfluss der Substanz auf die in vitro Differenzierung kultivierter naiver CD4⁺ T-Zellen konnte bereits durch die Arbeit von Berod et al. verdeutlicht werden. Dabei zeigte sich in Soraphen A (SorA)-behandelten Zellenkulturen, im Vergleich zu den mit der Trägersubstanz (DMSO) behandelten Zellen, eine eindeutige Reduktion in der IL-17-Fraktion und eine deutliche Induktion vom Transkriptionsfaktor FoxP3 (Abb. 5a). Daraus lässt sich schlussfolgern, dass sich in der Gegenwart der Substanz naive T-Zellen leichter in regulatorische T-Zellen differenzieren lassen. Diese Begebenheit ist ebenso dosisabhängig zu beobachten. Je höher die SorA-Dosis, desto stärker zeichnet sich der o. g. Effekt ab (Abb.

5b). Dieser Effekt stagniert allerdings ab einer gewissen Konzentration [44].

5 a)

5 b)

Abb. 5 a) Durchflusszytometrie: naive b) dosisabhängiger Verlauf der links:

fatty acid synthesis controls the fate

Zusammenfassend lässt sich d Hemmung der ACC-Enzyme, ein sich einerseits über eine Wach kann sie auch eine Verschiebu die T-Zelldifferenzierung, zu Gu

1.3. Experimentell ind

Um ein besseres Verständnis f aufbringen zu können, wurden wiederspiegeln sollen. Unter an chemisch induzierte (DSS) K

aive T-Zellen (CD4⁺) mit DMSO behandelt (links), mit SorA ks: IL-17-Produktion, rechts: FoxP3-Induktion (Quelle: Be ate between regulatory T and T helper 17 cells”, Nat Med

ch darauf hinweisen, dass das Soraphen A ver , eine Veränderung im Stoffwechsel der Zelle be achstumshemmung der Zelle bemerkbar mac iebung des Th17/Treg-Gleichgewichtes durch E

Gunsten der Tregs bewirken.

ll induzierte Kolitis im Maus-Modell

nis für die humanen chronisch entzündlichen D den Tiermodelle entwickelt, die den Zustand die er anderem wurden sowohl immunologisch (Zel S) Kolitis-Modelle entwickelt, die den CED

Seite 8 SorA behandelt (rechts)

Berod et al. „ De novo Med 2014)

vermutlich über die le bewirkt. Diese kann machen, andererseits ch Einflussnahme auf

n Darmerkrankungen dieser Erkrankungen (Zelltransfer) als auch CED des Menschen

Seite 9 nahekommen sollen. Sie spiegeln dabei die humane Erkrankung nicht in Gänze wieder, geben aber dennoch Aufschluss auf gewisse Pathomechanismen der CED [47].

1.3.1. Immunologische Zelltransfer-Kolitis

Für die immunologischen Zelltransfer-Modelle werden im Allgemeinen homozygote RAG^-/- (recombination activating gene knock out)-Mäuse verwendet. Diese Gruppe genetisch modifizierter Mäuse zeigt phänotypisch ein defizitäres adaptives Immunsystem, welches sich durch das Fehlen von T- und B-Zellen bemerkbar macht [48]. Laut Ostanin et al. [49]

verursacht der Transfer von naiven T-Zellen (CD4⁺CD45RB^high), isoliert aus gesunden Wildtyp- Mäusen vom C57 Bl/6J-Stamm, in die oben beschriebenen RAG^-/--Mäuse,eine Pankolitis aus;

sowie eine unspezifische Dünndarmentzündung vergleichbar mit der Erkrankung des Morbus Crohn. Andere Arbeitsgruppen haben hingegen naive CD4⁺CD25^- T-Zellen in RAG^-/--Mäuse transferiert und dadurch eine Kolitis auslösen können. Sie haben in diesem Zusammenhang zeigen können, dass der Co-Transfer von Tregs (CD4⁺CD25⁺), vermutlich durch die Ausschüttung von Zytokinen wie IL-10 und TGF-β, das Ausmaß der Entzündung eingrenzen und so eine positive Auswirkung auf das Outcome der Kolitis haben kann [15], [50]. Unter herkömmlichen Umständen, treten die ersten Anzeichen einer Kolitis wie Diarrhoe, Hämatochezie und Gewichtsverlust meist nach circa acht Wochen post-Transfer auf. Durch das Zusammensetzen der RAG^-/--Mäuse mit Mäusen, die in ihrer Darmflora segmented filamentous bacteria aufweisen, kommt es bei Kontakt zur Übertragung dieser Bakteriengruppe, was wiederum dazu führt, dass die Kolitis in den RAG^-/--Mäusen vorzeitig und in verstärktem Ausmaß eintreten kann [26], [27]. Andersherum besteht bei keimfrei gehaltenen (gnotobiotischen) Mäusen die Möglichkeit, dass das Erscheinungsbild der Kolitis gar fehlt [51].

1.3.2. Chemische Kolitis

Das DSS (Dextran Sodium Sulfat Salz) ist ein Polysaccharid, dass in reiner Form als weißes Pulver vorkommt. Es ist durch seine negative Ladung gut wasserlöslich und in gelöster Form

Seite 10 farblos. DSS hat bei einem Molekulargewicht von 36-50 kD ein stark kolitogenes Potenzial und löst in der richtigen Dosierung eine auf das Kolon begrenzte ulcerative Entzündung aus, die am ehesten vergleichbar mit der Colitis ulcerosa beim Menschen ist [52]. Bei Mäusen mit C57 Bl/6J Hintergrund werden üblicherweise Konzentrationen zwischen 1,5-3% im Trinkwasser angestrebt. Gewöhnlich wird das DSS in zwei Zyklen gegeben, wobei es initial in einer niedrigen Konzentration für etwa sieben Tage angesetzt wird. Anschließend wird es für 10 Tage abgesetzt und dann wieder für sieben Tage höherprozentig ins Trinkwasser der Tiere gelöst. Dabei entsteht eine chronisch-floride Entzündung im Kolon der Tiere, die der in Schüben ausbrechenden Colitis ulcerosa relativ ähnlich sieht [52], [53]. Die schädigende Wirkung des DSS ist noch nicht ganz geklärt. Allerdings geht man davon aus, dass die Kolitis das Resultat einer Schädigung der mukosalen Epithelzellen ist, durch die eine Barrierestörung im Kolon ausgelöst wird und auf die das mukosale Immunsystem mit einer überschießenden Entzündung reagiert [54]. Ähnlich wie bei der Zelltransfer-Kolitis, weisen Körpergewicht, Gewichtsverlust und rektale Blutungen auf das Ausmaß der Entzündung hin und werden zum Monitoring der Tiere verwendet.

1.4. Ziel der Arbeit

Nach den relativ eindeutigen Ergebnissen der Arbeit von Berod et al. [44] (s. Abb. 5a/b), die gezeigt haben, dass das Gleichgewicht von Th17- und Treg-Zellen in vitro unter inflammatorischen Bedingungen mit dem Substrat Soraphen A durchaus zu Gunsten der anti-inflammatorischen Tregs verschiebbar ist, interessiert nun in diesem Zusammenhang, ob diese Erkenntnisse auch auf in vivo Tiermodelle übertragbar sind. Um dies zu realisieren, werden in dieser Arbeit Tiermodelle verwendet, die den Zustand der humanen Kolitis nachahmen und auf zellulärer Ebene eine T-Zell vermittelte, überschießende Immunreaktion auf bestimmte Agenzien auslösen.

Dabei soll die potenzielle in vivo Wirkung des Soraphen A in dieser Dissertation anhand zweier verschiedener, gut etablierter muriner Kolitis-Modelle geprüft werden. Zum einen soll das Prinzip der Transferkolitis zum Tragen kommen, bei dem naive CD4⁺CD25^- T-Zellen aus weiblichen C57 Bl/6J Wildtyp-Mäusen isoliert und anschließend in gleichgeschlechtliche genmodifizierte RAG^-/--Mäuse mit C57 Bl/6J Hintergrund intraperitoneal injiziert werden,

Seite 11 während gleichzeitig eine Behandlung mit dem Soraphen A stattfindet. Zum anderen sollen, nach dem Prinzip der chemisch induzierten Kolitis, C57 Bl/6J Wildtyp-Mäuse nach dem o. g.

Schema mit dem DSS behandelt und ebenso parallel dazu mit dem Soraphen A therapiert werden. Die Einbeziehung beider Modelle soll die Validität und Aussagekraft der Ergebnisse bezüglich der möglichen Soraphen A-Wirkung erhöhen.

Um eine wirkungsvolle Behandlung mit der Substanz zu ermöglichen, stellen sich allerdings von vornherein Fragen zum Applikationsweg, Lösungsmittel und zu evtl. besser löslichen Derivaten der Substanz. Daher werden im Folgenden Applikationswege (oral, i.p.), sowie Lösungsmittel (Trinkwasser, EtOH/PBS, PEG/Tween80-Puffer) variiert und im weiteren Verlauf ein Derivat des Soraphen A (Sor-S1036), in die Versuche mit eingebunden, um damit den bestmöglichsten Weg zur Behandlung mit der Substanz zu ermitteln. Das Sor-S1036 unterscheidet sich dabei von der Originalsubstanz hauptsächlich durch eine zusätzliche hydrophile Polyethylenglykol-Kette, welches die Wasserlöslichkeit des Stoffes enorm verbessert.

Ferner sollte in dieser Arbeit anhand eines genetischen konditionellen Knockout-Modells an Mäusen die Auswirkung des Fehlens des ACC1-Enzyms in allen CD4⁺ T-Helferzellen, sowie speziell in FoxP3⁺-Zellen (Treg-Zellen) im DSS-Kolitis-Modell erörtert werden und mit der einer aktiven ACC1-Hemmung durch das Soraphen A im Transferkolitis-Modell verglichen werden. Diese konditionellen transgenen Knockout-Mäuse, sowie ihre Wurfgeschwister- Kontrollgruppe vom Wildtyp unterzogen sich dabei einer Behandlung mit DSS und wurden dann auf das Ausmaß der Kolitis (Körpergewicht, Kolonlänge, Histopathologie) untersucht.

Schließlich sollten in allen Versuchen die Häufigkeiten FoxP3-exprimierender Tregs, IL-17- produzierender Th17-Zellen und die absoluten Zahlen von CD3⁺/CD4⁺ T-Zellen ermittelt werden.

Der Arbeit zugrundeliegend ergaben sich in diesem Zusammenhang folgende Fragestellungen:

1) Welcher Applikationsweg und welches Lösungsmittel eignen sich am ehesten, um die bestmögliche Pharmakokinetik und Pharmakodynamik aus der Substanz Soraphen A zu schöpfen?

Seite 12 2) Gibt es hinsichtlich der Effekte des Soraphen A Unterschiede bei den beiden murinen

Kolitis-Modellen zu verzeichnen?

3) Hat die konditionelle Ausschaltung des ACC1-Enzyms in den T-Zellen bzw. in den Treg- Zellen Einfluss auf das Outcome der chemisch induzierten DSS-Kolitis?

Seite 13

2. Material und Methoden

2.1. Versuchstiere

Für die Isolation und den Transfer naiver CD4⁺ T-Zellen wurden mesenterische Lymphknoten und Milz aus weiblichen Wildtyp-Mäusen des C57 Bl/6J-Stammes entfernt, welche zuvor unter spezifisch pathogenfreien Konditionen im Tierhaus des Twincore gehalten wurden.

Die isolierten naiven CD4⁺ T-Zellen wurden anschließend in sieben bis neun Wochen alte weibliche RAG1^-/--Mäuse transferiert, welche unter Quarantänebedingungen im Tierhaus des Twincore gehalten wurden und im Durchschnitt ein Körpergewicht von 15-20g aufwiesen.

Bei diesen Mäusen handelt es sich um transgene Tiere, die keine reifen T- und B- Lymphozyten bilden und folglich kein reifes, adaptives Immunsystem besitzen. Durch gezielte Genmodifikation und daraus folgender Eliminierung des V(D)J-recombination activation gene-1 (RAG1) bleibt die für die T- und B-Zellen essentielle Bildung des T-Zell- Rezeptors (TCR) und der Immunglobuline aus [48]. Zudem wurden die RAG^-/--Mäuse eine Woche vor dem T-Zelltransfer mit speziellen Mäusen zusammengesetzt, die über eine spezifisch pathogene Darmflora aus segmented filamentous bacteria verfügen, mit dem Ziel, durch die Übertragung der SFB auf die transgenen Tiere, die erwartete autoimmune Entzündungsreaktion anzutreiben [55]. Zuletzt wurden sowohl männliche als auch weibliche Wildtyp-C57 Bl/6J, sowie transgene konditionelle ACC1-CD4cre- und Foxcre Knockout-Mäuse mit ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern nach dem Schema von Abb. 7 mit dem DSS oral über das Trinkwasser behandelt. Diese CD4cre- und Foxcre-konditionellen Knockout-Mäuse unterscheiden sich von ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern durch das Fehlen eines funktionellen ACC1-Enzyms in allen CD4⁺ T-Zellen bzw. nur in den FoxP3⁺ T-Zellen (Tregs) [56].

Alle Tiere der folgenden Versuchsreihen wurden artgerecht in einzelbelüfteten IVC- Käfigsystemen von Techniplast^® gehalten und im Tierhaus des Twincore gezüchtet. Als Ernährungsgrundlagen dienten pelletiertes Alleinfuttermittel und im Twincore hergestelltes autoklaviertes Trinkwasser. Des Weiteren wurden die Tiere einem konstanten 12-Stunden Tag-Nacht-Rhythmus und einer durchschnittlichen Raumtemperatur von 20°C ausgesetzt.

Die nachfolgenden Versuchsreihen mit den o. g. Tieren wurden vom niedersächsischen Amt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit unter dem Aktenzeichen 10/0244

Seite 14 genehmigt und alle therapeutischen Behandlungen im Rahmen der experimentellen Kolitisversuche unter dem AZ 10/0039 bewilligt.

2.2. Transferkolitis

2.2.1. Isolation und Anreicherung von CD4

T-Zellen

Materialien Hersteller

PBS+2% FCS Gibco^® by life technologies™, PA49RF,

UK

Cell strainer 100µm (Filter) BD Falcon™

RBC-Lyse-Puffer (150 mM NH₄Cl+10 mM KHCO₃+0,5 M EDTA)

Twincore

Beads Dynal Mouse CD4 negative isolation kit Invitrogen/ ThermoFisher™

Magnetic stand (Magnetständer) MACS Miltenyi Biotec, 51429 Bergisch Gladbach, Germany

MACS-Puffer (PBS+0,5% BSA+2 mM EDTA) Twincore

FCS (fetal calf serum) Twincore

Tabelle 1 Material zur Isolation und Anreicherung von CD4⁺ T-Zellen

Zur Gewinnung von CD4⁺ Zellen wurden aus ca. fünf Mäusen vom C57 Bl/6J-Stamm Milz, periphere und mesenterische Lymphknoten entfernt, zerrieben und durch einen 100 µm Filter gegeben. Danach wurde die Suspension mittels RBC-Lyse-Puffer von vorhandenen Erythrozyten befreit. Inkubiert wurde ca. eine Minute lang. Zur Abstoppung der Reaktion wurde PBS dazu gegeben. Das ganze zentrifugierte für fünf Minuten bei 1500 rpm, das Pellet wurde in Puffer (PBS/2%FCS) aufgenommen und die Zellzahl anhand der Neubauer Zählkammer bestimmt.

Üblicherweise wurden Zellzahlen von ca. 1x10⁷ pro Maus gezählt. Nach der Bestimmung der Zellzahl wurden die Zellen in 100 μL Puffer/10⁷ Zellen aufgenommen und 5 μL/10⁷ Zellen Antikörper hinzugegeben. Das Gemisch wurde gut resuspendiert und für 20 Minuten bei 4°C inkubiert. Danach wurden die Zellen mit Puffer gewaschen und für fünf Minuten bei 1300 rpm abzentrifugiert. Anschließend wurde das Pallet in 800 µL Puffer/10⁷ Zellen resuspendiert und 50 µL Beads/10⁷ Zellen hinzugegeben. Das Gemisch wurde dann 15 Minuten bei Raumtemperatur und bei leichtem Schwenken und/oder Rotieren (auf einer Rotationsplatte) inkubiert. Die Zellen und die Beads wurden erneut resuspendiert, mit frischem Puffer

Seite 15 versetzt und maximal sieben Milliliter des Gemischs in jeweils 15 mL Falcon^®-Röhrchen transferiert. Die Falcons wurden dann in einen Magnetständer gestellt und es wurde ca. ein bis zwei Minuten abgewartet bis sich die Beads an dem Magneten gesammelt haben, sodass der Überstand dann vorsichtig mit einer Pipette abgenommen und in ein neues Röhrchen übertragen werden konnte.

Die Zellzahl der im Überstand befindlichen Zellen wurde anschließend ermittelt.

2.2.2. Färbung und Sortierung der CD4

T-Zellen

Materialien Verdünnung Hersteller

PBS Gibco^® by life technologies™

Fc-Block 1:100 Twincore, Hannover

MACS-Puffer Twincore, Hannover

Antikörper-Fluorochrome

- Anti-CD3-APC 1:100 Affymetrix/eBioscience - Anti-CD4-FITC 1:400 Affymetrix/eBioscience - Anti-CD25-PE 1:100 Affymetrix/eBioscience - Anti-CD62L-PECy7 1:300 Affymetrix/eBioscience Sorting Tubes (Sortierungsröhrchen)

2 x 15 mL Zentrifugenröhrchen Falcon^®

FCS Twincore, Hannover

Tabelle 2 Material zur Färbung und Sortierung der CD4⁺ T-Zellen

Zur Markierung der Zellen mit Antikörpern wurden diese zunächst erneut zentrifugiert und anschließend mit Fc-Block für 15 Minuten bei 4°C behandelt. Im Anschluss wurden die o. g.

Antikörper in ihren jeweiligen Verdünnungen in MACS Puffer direkt auf die mit Fc-Block behandelten Zellen gegeben und 20-30 Minuten bei 4°C inkubiert. Nachfolgend wurde das Zellgemisch zentrifugiert, in 200 µL MACS Puffer aufgenommen und durch einen Filter in ein spezielles Sortierungsröhrchen gegeben. Der Filter wurde anschließend mit 2x200 µL MACS Puffer gespült, sodass auch die restlichen im Filter hängen gebliebenen Zellen gelöst wurden.

Ferner wurden zwei 15 mL Falcon^®

-

In einem kleinen Behälter mit Eis wurden die markierten Zellen in das Sorter-Labor der MHH transportiert, wo an einem FACS-Sorter das erste Gate auf die CD3⁺/CD4⁺ T-Zell- Populationen gesetzt wurde, während die folgenden Gates auf CD4⁺/CD25⁺ doppelt-positive

Seite 16 (Tregs) und auf CD4⁺CD25^- einfach positive (Teff) Populationen gesetzt wurden (s. Abb. 9).

Aus den letzten beiden Gates wurden die Populationen getrennt in die beiden 15 mL Falcon^®-Röhrchen mit vorgelegtem FCS durch das FACS hineinsortiert.

2.2.3. Behandlungsplan der RAG1

-Mäuse im Transferkolitis-Modell

Materialien Hersteller

PBS Biochrom AG, D-12247 Berlin

Spritzen Omnican^®F, Braun Melsungen AG

Soraphen A Twincore, Hannover

Sor-S1036 Twincore, Hannover

DMSO (Dimethylsulfoxid) AppliChem, 64291 Darmstadt, Germany PEG (Polyethylenglycol)/Tween80 Carl Roth^®, 76185 Karlsruhe, Germany

EtOH (Ethanol) Merck, 64293 Darmstadt, Germany

Autoklaviertes Trinkwasser Twincore, Hannover

Tabelle 3 Material zur Behandlung der RAG1^-/--Mäuse im Transferkolitis-Modell

Nach dem Sortieren der Zellen wurden die beiden getrennten Zellpopulationen mit PBS gewaschen und nochmals gezählt. Die T-Zellen wurden dann jeweils in einem bestimmten Volumen aufgenommen, sodass schlussendlich ca. 300.000 Zellen in 200 µL PBS gelöst waren.

Nachdem die RAG^-/--Mäuse in Versuchsgruppen mit bestimmten Behandlungsschemata eingeteilt wurden (s. Tab. 4), konnten diesen noch am selben Tag (Tag 0) die entsprechenden T-Zellen intraperitoneal (i.p.) injiziert werden.

Versuchsgruppe T-effektor-Zellen (CD4⁺CD25^-)

300.000 Zellen/200µL

T-regulatorische-Zellen (CD4⁺CD25⁺)

300.000 Zellen/200µL

Therapie

1. Teff + - 200 μL Puffer

2. SorA +

-

SorA in 200 μL Puffer

3. Treg + + - 4. PBS - - - 5. Sor-S1036

(im letzten Experiment)

+ - Sor-S1036 in 200 µL

Puffer Tabelle 4 Gruppeneinteilung und Behandlungsplan der RAG^-/--Mäuse im Transferkolitis-Modell

Seite 17 Es wurden insgesamt vier verschiedene Versuchsansätze erprobt, die sich sowohl in der Art der Testsubstanz, der Verabreichungsform als auch im verwendeten Lösungsmittel unterschieden haben:

1. Im ersten Versuchsansatz wurde die Behandlungssubstanz Soraphen A mit dem Trinkwasser der Versuchstiere in einer Konzentration von 0,1 mg/mL vermengt.

Ausgehend von einer Trinkmenge von bis zu 5 mL pro Tag, hat jede Maus damit täglich ca. 500 µg Soraphen A oral aufgenommen. Die Kontrollgruppe erhielt die entsprechende Menge an DMSO ins Trinkwasser gelöst.

2. Im zweiten Versuchsansatz wurden 100 µg Soraphen A in dem Trägerstoff EtOH-PBS gelöst und den Tieren täglich i.p. verabreicht. Die Vergleichsgruppe erhielt dabei lediglich das Lösungsmittel EtOH/PBS.

3. Im dritten Versuchsansatz wurden 500 µg Soraphen A in dem Trägerstoff PEG- Tween80 gelöst und den Tieren jeden zweiten Tag i.p. injiziert. Die Kontrollgruppe bekam nur das Lösungsmittel PEG/Tween80 verabreicht.

4. Der letzte Versuch entspricht grundsätzlich dem dritten Versuchsansatz. Den einzigen Unterschied bildet hier die zusätzliche Versuchsgruppe, die mit dem Derivat des Soraphen A (dem Sor-S1036) therapiert wurde. Das Sor-S1036 unterscheidet sich von der Originalsubstanz durch eine zusätzliche Polyethylenglykol-Kette. Diese ist stark hydrophil und damit besser wasserlöslich. Gelöst im PEG-Tween80 Puffer, wurde das Derivat, genauso wie das Soraphen A auch, in einer Konzentration von 500 µg den Mäusen alle zwei Tage i.p. verabreicht.

Am ersten Tag nach Injektion der T-Zellen (Tag 1) wurden die Mäuse entweder mit Soraphen A oder mit den entsprechenden Trägerstoffen (PEG-Tween80/ DMSO-Trinkwasser/ EtOH- PBS-Puffer) behandelt. Die Behandlung wurde dann solange durchgeführt bis die erste Maus 20% ihres initialen Körpergewichtes verloren hatte. Erfahrungen haben gezeigt, dass dies durchschnittlich nach ca. 20-30 Tagen der Fall war (s. Abb. 6). Parameter wie das Körpergewicht und Zeichen der Kolitis wie Diarrhö, blutiger Stuhl und der reduzierte Allgemeinzustand der Mäuse (Haltung, Fellpflege etc.) wurden im Behandlungszeitraum mit berücksichtigt.

Seite 18 Das tägliche Wiegen diente sowohl zum Monitoring der Mäuse (zum Einschätzen des Gesundheitszustandes und des Ausprägungsgrades der Kolitis) als auch dafür, das Ende des Experimentes zu definieren. Wurden 80% des initialen Körpergewichtes einer Maus erreicht, galt dies als Abbruchkriterium für das Experiment und definierte den Beginn des Analysetages. Die Mäuse wurden am selben Tag mittels CO₂-Gas euthanasiert.

Abb. 6 Versuchsaufbau und Therapieschema der Transferkolitis (Bilder: The Jackson Laboratory-www.jax.org)

2.3. DSS-Kolitis

2.3.1. Behandlungsplan der CD4cre und FOXcre konditionellen ACC1- Knockout- und der C57Bl/6J Wildtyp-Mäuse

Material Hersteller

Dextran Sodium Sulfat Salz (DSS) MP Biomedicals, 50067 Ilkirch, France

Soraphen A Twincore, Hannover

PEG/Tween80-Puffer Twincore, Hannover

DMSO AppliChem, 64291 Darmstadt, Germany

Spritzen 1 mL OmnicanF^® Braun Melsungen AG

Autoklaviertes Wasser Twincore, Hannover

Tabelle 5 Material zur Behandlung der CD4cre und FOXcre konditionellen ACC1-Knockout und der C57Bl/6J Wildtyp-Mäuse

Tag 0 Tag 1

Analysetag Tag 20-30

T-Zell- Injektion (i.p.) RAG 1^-/-

Start der Therapie mit Soraphen A/

Puffer CD4⁺CD25^-/

CD4⁺CD25⁺ Zellen

Seite 19 Für das folgende Experiment wurden sowohl C57 Bl6 Wildtyp-Mäuse (s. Tab. 6) als auch transgene konditionelle ACC1 Knockout-Mäuse, sowie ihre Wildtyp-Wurfgeschwister verwendet. Letztere wurden in Form von zwei Genotypen einbezogen (s. Tab. 7):

- ACC1-konditionelle Knockout-Maus vom CD4cre-Typ (AccCD4cre/tg): Das Enzym Acetyl-CoA-Carboxylase 1 (ACC1) wird in allen CD4⁺-T-Zellen funktionell deletiert.

Durch die vorhandene cre-Rekombinase wird das ACC1-Gen über die lox-P-sites herausgeschnitten. Bei den Wildtyp-Wurfgeschwistern (AccCD4cre/wt) wird das besagte Enzym in den Zellen wie gewöhnlich noch gebildet (Kontrollgruppe). Die Tiere verfügen über keine cre-Rekombinase, die das gefloxte Gen entfernt.

- ACC1-konditionelle Knockout-Maus vom FOXcre-Typ (AccFOXcre/tg): Das Enzym ACC1 wird in FoxP3⁺ T-Zellen (Tregs) funktionell deletiert (s. o.). Die cre-negativen Wurfgeschwister tragen weiterhin ein funktionsfähiges ACC1-Enzym in allen FoxP3⁺ T- Zellen (Kontrollgruppe) (s. Anhang 1).

Versuchsgruppe DSS-Anwendung Behandlung

Puffer s. Schema Abb. 7 PEG/Tween80-Puffer

SorA s. Schema Abb. 7 500 µg SorA in 200 μL Puffer

Tabelle 6 Behandlungsplan der C57 Bl6 Mäuse im DSS-Kolitis-Modell

Versuchsgruppe DSS-Anwendung Behandlung

AccCD4cre_tg s. Schema Abb. 7 - AccCD4cre_wt s. Schema Abb. 7 - AccFOXcre_tg s. Schema Abb. 7 - AccFOXcre_wt s. Schema Abb. 7 -

Tabelle 7 Behandlungsplan der AccCD4cre und AccFOXcre Mäuse im DSS-Kolitis-Modell

Zur Induktion der chemisch induzierten Kolitis wurde das Trinkwasser der Mäuse mit 1,2%igem DSS versetzt. Dieses bekamen die Tiere sieben Tage lang zu trinken. Danach wurde eine Pause von zehn Tagen eingelegt, in der die Tiere DSS-freies und damit reines autoklaviertes Trinkwasser bekamen. Zuletzt wurde eine 2. Phase mit DSS-versetztem Trinkwasser angesetzt, die ebenfalls sieben Tage anhielt und aus 2,4%igem DSS-Trinkwasser

bestand. Während dieser Zeit klinischen Merkmale einer Kol der Mäuse im Verlauf notiert. A und nach dem folgenden Prot

Tag 0

DSS 1,2%

Abb. 7 Versuchsaufbau und Therapie

Die folgenden Methoden von K auch bei der DSS-Kolitis angew der Analyse.

2.4. Isolation von Lym

Material

Präparierbesteck PBS (Ca²⁺/Mg²⁺-frei) Filter 100 µm RBC-Lyse-Puffer

Neubauer Zählkammer cRPMI Medium (Penicillin/Stre FCS 10%, RPMI)

PBS+30 mM EDTA DMEM

KollagenaseD DNAse PBS/FCS (2%) Percoll™

-40%ig -80%ig PFA 4%

Tabelle 8 Material zur Isolation von L C57 Bl/6J,

AccFoxcre wt/tg, AccCD4cre wt/tg

Zeit wurden auch hier, wie im Versuch der T Kolitis mit berücksichtigt und Parameter wie d rt. An Tag 26 wurden die Tiere schließlich artger rotokoll zur „Isolation von Lamina propria Zellen

Tag 8 Tag 19 Tag 27

2% Pause DSS 2,4% Analysetag

apieschema der DSS-Kolitis (Bilder: The Jackson Laborato

on Kapitel 2.4. bis 2.8. wurden sowohl bei der gewendet und folgten der artgerechten Tötung

Lymphozyten aus der Lamina propria

Hersteller

Twincore, Hannover

Biochrom AG, D-12247 Berlin BD Falcon™, BD Bioscience, NC Twincore, Hannover

Twincore, Hannover

/Streptomycin, Biochrom, Gibco^®, Twincore, H Twincore, Hannover

Gibco^® by life technologies™, P Sigma-Aldrich Chemie GmbH, D Roche, D-68305 Mannheim Twincore

GE Healthcare Biosciences AB, s.o.

s.o.

Roti Histofix^®, Carl Roth GmbH Karlsruhe

on Lymphozyten aus der Lamina propria

Seite 20 er Transferkolitis, die

ie das Körpergewicht tgerecht euthanasiert

llen“ seziert.

etag

ratory- www.jax.org)

der Transferkolitis als ung der Tiere am Tag

pria

, NC27712 USA

, Hannover

™, PA49RF, UK

H, D-89552 Steinheim

AB, SE-75184 Uppsala

bH, D-76185

Seite 21 Zuerst wurden Kolon, Dünndarm, mesenterische Lymphknoten (mLN) und Milz entnommen und in einem Gefäß mit PBS aufbewahrt.

Die mLNs und die Milz wurden dann zerrieben und durch einen 100 µm Filter gegeben.

Dabei wurde die Milzsuspension zusätzlich mit RBC-Lyse-Puffer versetzt, eine Minute inkubiert und die Reaktion mit PBS abgestoppt. Die Zellen wurden heruntergefugt, in cRPMI Medium aufgenommen, gezählt und auf Eis gestellt.

Beim Darmverdau wurden Kolon und Dünndarm zunächst von Fett und Peyer´schen Plaques befreit. Kolon und Dünndarm wurden längs aufgeschnitten und in PBS gewaschen bis das Gewebe vom Darminhalt befreit war. Der aufgeschnittene Darm wurde dann in zwei bis drei cm kleine Stücke geschnitten, in 50 mL große Falcon^®-Röhrchen gegeben und in 30mM EDTA und PBS für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Danach wurden die Röhrchen allesamt für ca.

zehn Sekunden lang kräftig durchgeschüttelt. Dieser Waschschritt zur Befreiung des Darms von Mukus wurde ca. acht bis zehn Mal mit je 20 mL PBS fortgeführt bis die Flüssigkeit klar wurde. Die Darmgewebestücke wurden dann in einer Petrischale gesammelt, mit einer scharfen Präparierschere in kleine Stücke geschnitten und für 30 Minuten in einer vorgewärmten DMEM- und DNase/KollagenaseD-Lösung zum Gewebeverdau im 37°C warmen Inkubator gestellt. Anschließend wurden die Gewebestücke einige Male auf- und abpipettiert und der Überstand durch einen 100 µm großen Filter gegeben. Die restlichen Gewebestücke wurden wiederum mit DNase, KollagenaseD und warmen DMEM versetzt und ein weiteres Mal in den Inkubator gestellt. Diese Schritte wurden so lange wiederholt bis sich auch die letzten Gewebestücke aufgelöst hatten. Meistens handelte es sich um drei bis fünf Verdauungsschritte.

Im nächsten Schritt wurde das verdaute Gewebe für zehn Minuten bei 860 x g zentrifugiert und das Pellet in 40%igem Percoll gelöst. Dies wurde dann mit 80%igem Percoll unterlegt, bis sich zwei sichtbar voneinander getrennte Phasen gebildet haben. Zwischen diesen beiden Phasen (in der Interphase) sollten sich später die gewollten Lymphozyten anreichern. Als nächstes wurde der Percollgradient für 20 Minuten bei 900 x g, 20°C und ohne Bremse gefahren.

Die Interphase wurde als nächstes mit einer Pipette aufgefangen und in ein Röhrchen mit PBS+2% FCS gegeben. Dieses Gemisch wurde dann bei 800 x g und 4°C für ca. acht Minuten zentrifugiert, das Pellet in cRPMI aufgenommen und die Zellen gezählt (s. Abb. 8).

****

Abb. 8 Schema Darmverdau und Isol (* www.scienceopen.com)

Sc

Darm Stück Waschen in PBS

30 min bei 4 °C

8-10x

Isolation von Lymphozyten aus der Lamina propria

Organentnahme

30mM EDTA

Schütteln & waschen in PBS

mgewebe in 1-2mm kleine cke schneiden

Kollagenaseverdau

Percollgradient

Abnahme der Interphase

Ze + DN

30

20

Seite 22 Zellen zählen + DMEM &

DNase/KollagenaseD

30 min (3-5x)

20 min, 900 x g, 20 °C

Seite 23

2.5. Restimulation und oberflächliche Antikörpermarkierung der Zellen

Tabelle 9 Material zur Restimulation und oberflächlichen Antikörpermarkierung der Zellen

Es wurden pro Probe ca. zwei Millionen Zellen in cRPMI Medium aufgenommen, in FACS Röhrchen überführt und mit PMA und Ionomycin für zwei Stunden restimuliert. Danach wurde die Probe mit Brefeldin A nochmals zwei Stunden inkubiert.

Nachdem die Zellen mit PBS gewaschen wurden, konnten diese zur Unterscheidung von lebenden und toten Zellen mit dem Live/Dead^® fixable Aqua dead cell stain kit für 20 Minuten bei 4°C fluoreszensmarkiert werden. Anschließend wurden diese für zehn Minuten mit Fc-Block und 20 min mit den Oberflächenantikörpern CD3⁺-APC und CD4⁺-FITC inkubiert (s. Tab. 2). Zuletzt wurden die Zellen mit dem Fixation/Permeabilisation Reagenz über Nacht bei 4°C fixiert und permeabilisiert. Damit wurden in der Zellmembran Poren geschaffen, um dann im Anschluss die intrazellulären Bestandteile der Zelle färben zu können.

2.6. Färbung der Intrazellulären Zytokine und Transkriptionsfaktoren

Tabelle 10 Material zur Färbung der Intrazellulären Zytokine und Transkriptionsfaktoren

Material Hersteller

PMA Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

D-82024 Taufkirchen

Ionomycin Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

82024 Taufkirchen

cRPMI Twincore, Hannover

Brefeldin A Affymatrix/eBioscience, 92121 San Diego,

USA

Live/Dead^® fixable Aqua dead cell stain kit Invitrogen, Eugene, Oregon, USA

Fixation/Permeabilisation Reagent Affymatrix/eBioscience, 92121 San Diego, USA

Material Hersteller

FACS-Puffer (BSA 0,25%, NaN₃ 0,02%, PBS) Twincore, Hannover PBA-S (Saponin 0,5%+FACS-Puffer) Twincore, Hannover

Fc-Block Twincore, Hannover

Antikörper

- FoxP3-eFluor450 Affymetrix/eBioscience

- IL-17-APC Affymetrix/eBioscience

- IFNy-PE Cy7 Affymetrix/eBioscience

- RoRyt-PE Affymetrix/eBioscience

PBA-E (EDTA+FACS-Puffer) Twincore, Hannover

Seite 24 Nach der nächtlichen Inkubation wurden die Zellen in PBA-S gewaschen. Dieser Saponin- Puffer bringt in der Zelle den Golgi-Apparat zum Stillstand, verhindert die Zytokinausschüttung und hält die Vesikel mit den Zytokinen in der Zelle gefangen, sodass es möglich wird diese mit Antikörper zu markieren. Vorerst wurde aber Fc-Block zu den Zellen hinzugefügt. Die Antikörper wurden dann im Anschluss direkt auf die Zellen gegeben und 30 Minuten inkubiert. Zuletzt wurden die Zellen in PBA-E aufgenommen, um diese dann im Durchflusszytometer einzulesen.

2.5. Durchflusszytometrie

Material Hersteller

CyAn ADP Beckman Coulter, Brea, USA

Coulter LH Series Cleaner Beckman Coulter, Brea, USA IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter, Brea, USA

PBA-E ( FACS Puffer) Twincore, Hannover

Tabelle 11 Material zur Ausführung der Durchflusszytometrie

Es wurden nach Möglichkeit versucht jeweils 1 x 10⁶ Zellen pro Probe einzulesen. Die T- Lymphozyten wurden zunächst über die Oberflächenrezeptoren CD3 und CD4 identifiziert und dann nach ihrem Zytokinprofil und ihrer Transkriptionsfaktorexpression quantifiziert.

Zuvor wurde die Kompensation und die Voltage über die Aquisitionssoftware Summit^® durch die Einzelfärbungen optimiert und das Hineinstrahlen in andere Kanäle damit reduziert.

2.6. Histologie und histopathologischer Score

Material Hersteller

PFA (Paraformaldehyd) 4% Roti Histofix^®, Carl Roth GmbH, D-76185 Karlsruhe

Paraffin ZTL

HE (Hämatoxilin/ Eosin) ZTL

Tabelle 12 Material zur Aufbereitung der histologischen Präparate

Parallel zur Isolation von L. propria-Zellen wurde ein kleiner Teil des Darms zur histologischen Weiterverarbeitung an das Zentrale Tierlabor (ZTL) der MHH weitergeleitet.

Dazu wurde das Präparat direkt nach Entnahme in eine einzig dafür geeignete Kassette gebettet und in 4%igem PFA für mindestens 48 Stunden fixiert. Danach wurde das Präparat

Seite 25 im Zentralen Tierlabor (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover paraffiniert, geschnitten, mit HE gefärbt und auf Objektträger übertragen.

Um das Ausmaß der Pathologie beurteilen zu können, haben Leppkes et al. [15] einen histopathologischen Score gebildet, der sich insgesamt aus zwei der folgenden Kriterien zusammensetzt: 1. der Grad der lymphozytären Infiltration in die Lamina propria und 2. die epitheliale Destruktion der Darmwand. Diese wurden ferner in folgende Schweregrade quantifiziert: 0= keine, 1= geringgradige, 2= mäßige, 3= schwere Infiltration/ Destruktion.

Letztendlich entsteht dabei ein Score von 0-6, wobei der Score von 0 ein gänzlich physiologisches Kolon darstellen und der Score von 6 ein höchstgradig entzündetes Kolon wiederspiegeln soll. Die Auswertung der histologischen Präparate erfolgte durch eine am Experiment unbeteiligte Person und fand geblindet statt.

3. Ergebnisse

3.1. Transferkolitis

Zur Vorbereitung auf den lymphatischen Organen (Milz, nach CD4⁺CD25^- und CD4⁺CD2 durchschnittlichen „Purity“ (Re verwendeten Oberflächenan Veranschaulicht wird dies anha Transferkolitis-Experimente. D schließlich heraussortiert und

Abb. 9 Ermittlung der Reinheit CD3⁺ Zellsortierung (MACS^TM), die Charakte

3.1.1 Behandlung mit So

Zunächst sollte das Soraphen A herangetragen werden. Dies w Tiere praktisch umgesetzt. Es w am Tag zu sich nimmt und Trinkwasser einen ausreichend würde.

en Zelltransfer wurden naive T-Zellen au ilz, Lymphknoten) von Mäusen der C57 Bl/6J CD25⁺-Oberflächenantigenen getrennt. Dies g (Reinheit) von 89-99%, was für eine gute spezif nantikörper gegen CD4-und CD25-Reze nhand des in Abb. 9 aufgeführten Gating-Beispi Die Zellen, die sich innerhalb der „Gates“ b nd zur intraperitonealen Injektion weiterverwen

+/CD4⁺ T-Zellen mittels Durchflusszytometrie nach mag rakterisierung erfolgte anhand der CD4-und CD25-Oberflä

it SorA im Trinkwasser

en A über die enterale Aufnahme direkt an de es wurde durch das Lösen der Substanz in dem

Es wurde angenommen, dass jedes Tier bis zu nd somit eine Konzentration von 100 µg So hend hohen Spiegel im Organismus der Tiere

Seite 26 aus den sekundär l/6J-Linie isoliert und es geschah mit einer ezifische Bindung der ezeptoren spricht.

eispiels aus einem der

“ befanden, wurden wendet.

magnetischer erflächenmarker.

den Entzündungsort dem Trinkwasser der s zu 5 ml Trinkwasser g Soraphen A/ml im iere aufrechterhalten

Die Tiere der Teff-Gruppe er Menge DMSO ins Trinkwasser Treg-Zellen zu Beginn, nichts W etwa zwei Wochen, ließen sich Gruppe wesentlich beeindruck gespritzt bekommen haben.

Analog zur klinischen Symptom interpretiert werden. Dabei ze initialen Körpergewichtes in d ersten zwei Wochen eine relat in den drei Versuchsgruppen Abnahme des durchschnittlich Gruppe nimmt tendenziell ehe heranwachsenden sechs bis s starken Gewichtsschwankunge unterschiedlichen Tageszeiten

Abb. 10 prozentuale Gewichtsveränd jeder Punkt beschreibt den Mittelwer an Tag 0. Anzahl der verwendeten Ind

erhielten dabei, anstatt des Testsubstrates, sser gelöst, während die Treg-Gruppe, außer d hts Weiteres als herkömmliches Trinkwasser er

sich die Symptome der Kolitis bei den Tieren ruckender beobachten als bei den Tieren, di

ptomatik, kann auch der Gewichtsverlauf der i zeigt Abb. 10 die durchschnittliche prozentu in den jeweiligen Versuchsgruppen. Zunächst relative Konstanthaltung des durchschnittlichen

en zu konstatieren. Danach zeigt sich tenden tlichen Körpergewichtes in der SorA- und Teff l eher an Gewicht zu, was physiologischer W

is sieben Wochen alten Tieren zu erwarten is ngen könnte man dabei auf die Messung des Kö ten zurückführen.

änderung im Verlauf der Zeit (Tag 0-38) bezogen auf das lwert der KG aller Individuen einer Gruppe (in %) in Bezug n Individuen n=3, Treg: n=2.

Seite 27 die entsprechende er dem Transfer von r erhalten hat. Nach en der Teff-und SorA- , die simultan Tregs

der Versuchsgruppen ntuale Abnahme des hst einmal ist in den hen Körpergewichtes denziell eine relative eff-Gruppe. Die Treg- Weise bei gesunden n ist. Die anfänglich s Körpergewichtes zu

das initiale KG an Tag 0, ezug auf den Mittelwert

Nach Extirpation des Kolons a Entzündungsausmaßes der Entzündungsreaktion korreliert Abbildung 11 veranschaulicht jeweiligen Gruppen. Dabei zeig stärkere Verkürzung des Kolo intestinale Entzündungsreaktio besteht kein relevanter Unters der Soraphen A Gruppe.

11 a)

Abb. 11 a) gemessene Kolonlänge in dazugehörigen Mittelwert der Kolonl Individuen der Teff (links)- und der Tr (rechts).

Nach der Isolation und immunz RAG^-/--Mäuse, zeigt die folgen der Größe und Zellfläche nach v

ns aus dem Situs der Maus, wurde dieser zur er Länge nach gemessen. Eine ausgepr

liert dabei häufig mit einer verstärkten Verkürzu cht den Unterschied in der Verkürzung des Kol zeigt die Teff-Gruppe eine um durchschnittlich

Kolons im Vergleich zur Treg-Gruppe, was aktion bei den Teff- und SorA-Mäusen sugg

terschied zwischen der DMSO-Kontrollgruppe

11 b)

in cm, jeder Punkt stellt ein Individuum dar und jeder Q lonlänge in der Versuchsgruppe, b) Beispiel eines Kolon m er Treg (mitte)-Gruppe und ein als Vergleichsmaßstab bei

unzytologischen Färbung der L. propria Zellen lgende Abbildung beispielhaft anhand der Dur

ch verifizierte Lymphozyten (Abb. 12a/b).

Teff Treg

Seite 28 zur Einschätzung des geprägte intestinale ürzung des Kolons.

Kolons zwischen den lich einen Zentimeter as eine hochgradige uggeriert. Ergänzend pe (Teff-Gruppe) und

er Querbalken den on mit Caecum aus

beigefügtes Lineal

aus dem Kolon der Durchflusszytometrie

12 a)

Abb. 12 Gating-Strategie nach erfolgt FACS-Dotplots, die Identifizierung de

Im Anschluss wurden die lebe Aqua Live/Dead^® herausgefilte CD3⁺/CD4⁺ T-Zellen gesetzt wer

12 c)

Abb. 12 c) durchflusszytometrische E Beispiel (Dotplot-Diagramm).

Die kombinierte Gabe von PM Zytokinproduktion. Nach Stimu ein eindeutiger IL-17A-Anstie beobachten (Abb. 12e). Um die verhindern, wurde der Vesikelt unterbunden.

12 b)

olgter Durchflusszytometrie der isolierten L. propria Zelle der Lymphozyten erfolgte nach a) Zellgröße und b) Zellf

ebenden von den toten Zellen mit Hilfe des F filtert. Es konnte daraufhin bei den lebenden Ze

werden (Abb. 12 c/d).

12 d)

he Ermittlung lebendiger Lymphozyten und d) CD3⁺/CD4

PMA und Ionomycin bewirkt eine Stimulation d mulation der CD4⁺ T-Zellen mit dem PMA/Ion stieg und eine verstärkte FoxP3-Expression

die anschließende Sekretion von Zytokinen nac ikeltransport zur Zellmembran durch die Zuga

Seite 29 Zellen am Beispiel eines

ellfläche.

s Fluoreszensmarkers n Zellen ein Filter auf

CD4⁺ T-Zellen im Gating-

on der intrazellulären Ionomycin lässt sich ion in allen Proben nach extrazellulär zu gabe von Brefeldin A

12 e)

Abb. 12 e) Gating-Beispiel nach PMA/Ionomycin und Brefeldin A stim

Folgende Diagramme stellen zusammengefasst in Balkend fungierten die Kolonproben aus

Abbildung 13 stellt die H Paradoxerweise konnte hierbe beobachtet werden. Auffallend DMSO-behandelten und Soraph

Abb. 13 prozentuale Häufigkeit der d Versuchsgruppen, Balkendiagramm m

ach Durchflusszytometrie von CD3⁺/CD4⁺ L. propr stimulierten Probe.

llen Durchschnittswerte aus den Daten d kendiagrammen, dar. Als Quelle der Zellm

aus den jeweiligen RAG^-/--Mäusen.

Häufigkeit der IL-17A-positiven T-Zellen ierbei in der Treg-Fraktion eine gesteigerte I

lend ist, dass auch hier kein relevanter Untersch raphen A-behandelten Mäusen besteht.

er durchschnittlichen IL-17A-Produktion in den verschied m mit Mittelwert und Standardfehler bzw. ^#Spannweite

#

Seite 30 ropria-Zellen einer mit

der FACS-Analyse, ellmaterialgewinnung

en in Prozent dar.

te IL-17A Produktion rschied zwischen den

iedenen

ite, n=3, Treg: n=2.

Auch hier unterscheiden sich entzündungshemmenden Mar minimalen Anteilen in den Sora co-injizierten Treg-Mäusen in d

Abb. 14 prozentuale Quantifizierung im Balkendiagramm mit Mittelwert u

Interessant in diesem Zusam Zellzahlen (Abb. 15), die unter Proliferations- und Expansionsp der Entzündung im Kolon gebe Gruppen eine auffallend Entzündungsausmaß hindeuten

sich die Teff-und SorA-Gruppe angesichts d Markers FoxP3 kaum voneinander. Währen Soraphen A-behandelten Mäusen messbar war, in dreifacher Ausprägung nachgewiesen werden

ung der Frequenz von Foxp3⁺ Treg-Zellen innerhalb der CD rt und Standardfehler bzw. ^#Spannweite, n=3, Treg: n=2

sammenhang ist außerdem die Ermittlung d ter den verschiedenen Therapiebedingungen Au ionspotenzial der T-Zellen und damit einen Hinw eben. Die Treg-Gruppe zeigt im Vergleich zu de d niedrige T-Zellzahl, was folglich auf uten kann.

Abb.15 zeigt die durchschnittliche CD3/CD4-positiver T-Zellen im Balk Mittelwert und Standardfehler bzw Treg: n=2.

#

#

Seite 31 ts der Frequenz des rend dieser nur in war, konnte er in den rden.

er CD4⁺ T-Zellpopulation

=2.

ng der absoluten T- n Aufschluss über das Hinweis auf den Grad den anderen beiden auf ein geringeres

e absolute Anzahl Balkendiagramm mit

bzw. ^#Spannweite, n=3,