2. Material und Methoden
2.6. Färbung der Intrazellulären Zytokine und Transkriptionsfaktoren
Tabelle 10 Material zur Färbung der Intrazellulären Zytokine und Transkriptionsfaktoren
Material Hersteller
PMA Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
D-82024 Taufkirchen
Ionomycin Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
82024 Taufkirchen
cRPMI Twincore, Hannover
Brefeldin A Affymatrix/eBioscience, 92121 San Diego,
USA
Live/Dead® fixable Aqua dead cell stain kit Invitrogen, Eugene, Oregon, USA
Fixation/Permeabilisation Reagent Affymatrix/eBioscience, 92121 San Diego, USA
Material Hersteller
FACS-Puffer (BSA 0,25%, NaN3 0,02%, PBS) Twincore, Hannover PBA-S (Saponin 0,5%+FACS-Puffer) Twincore, Hannover
Fc-Block Twincore, Hannover
Antikörper
- FoxP3-eFluor450 Affymetrix/eBioscience
- IL-17-APC Affymetrix/eBioscience
- IFNy-PE Cy7 Affymetrix/eBioscience
- RoRyt-PE Affymetrix/eBioscience
PBA-E (EDTA+FACS-Puffer) Twincore, Hannover
Seite 24 Nach der nächtlichen Inkubation wurden die Zellen in PBA-S gewaschen. Dieser Saponin-Puffer bringt in der Zelle den Golgi-Apparat zum Stillstand, verhindert die Zytokinausschüttung und hält die Vesikel mit den Zytokinen in der Zelle gefangen, sodass es möglich wird diese mit Antikörper zu markieren. Vorerst wurde aber Fc-Block zu den Zellen hinzugefügt. Die Antikörper wurden dann im Anschluss direkt auf die Zellen gegeben und 30 Minuten inkubiert. Zuletzt wurden die Zellen in PBA-E aufgenommen, um diese dann im Durchflusszytometer einzulesen.
2.5. Durchflusszytometrie
Material Hersteller
CyAn ADP Beckman Coulter, Brea, USA
Coulter LH Series Cleaner Beckman Coulter, Brea, USA IsoFlow Sheath Fluid Beckman Coulter, Brea, USA
PBA-E ( FACS Puffer) Twincore, Hannover
Tabelle 11 Material zur Ausführung der Durchflusszytometrie
Es wurden nach Möglichkeit versucht jeweils 1 x 10⁶ Zellen pro Probe einzulesen. Die T- Lymphozyten wurden zunächst über die Oberflächenrezeptoren CD3 und CD4 identifiziert und dann nach ihrem Zytokinprofil und ihrer Transkriptionsfaktorexpression quantifiziert.
Zuvor wurde die Kompensation und die Voltage über die Aquisitionssoftware Summit® durch die Einzelfärbungen optimiert und das Hineinstrahlen in andere Kanäle damit reduziert.
2.6. Histologie und histopathologischer Score
Material Hersteller
PFA (Paraformaldehyd) 4% Roti Histofix®, Carl Roth GmbH, D-76185 Karlsruhe
Paraffin ZTL
HE (Hämatoxilin/ Eosin) ZTL
Tabelle 12 Material zur Aufbereitung der histologischen Präparate
Parallel zur Isolation von L. propria-Zellen wurde ein kleiner Teil des Darms zur histologischen Weiterverarbeitung an das Zentrale Tierlabor (ZTL) der MHH weitergeleitet.
Dazu wurde das Präparat direkt nach Entnahme in eine einzig dafür geeignete Kassette gebettet und in 4%igem PFA für mindestens 48 Stunden fixiert. Danach wurde das Präparat
Seite 25 im Zentralen Tierlabor (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover paraffiniert, geschnitten, mit HE gefärbt und auf Objektträger übertragen.
Um das Ausmaß der Pathologie beurteilen zu können, haben Leppkes et al. [15] einen histopathologischen Score gebildet, der sich insgesamt aus zwei der folgenden Kriterien zusammensetzt: 1. der Grad der lymphozytären Infiltration in die Lamina propria und 2. die epitheliale Destruktion der Darmwand. Diese wurden ferner in folgende Schweregrade quantifiziert: 0= keine, 1= geringgradige, 2= mäßige, 3= schwere Infiltration/ Destruktion.
Letztendlich entsteht dabei ein Score von 0-6, wobei der Score von 0 ein gänzlich physiologisches Kolon darstellen und der Score von 6 ein höchstgradig entzündetes Kolon wiederspiegeln soll. Die Auswertung der histologischen Präparate erfolgte durch eine am Experiment unbeteiligte Person und fand geblindet statt.
3. Ergebnisse
3.1. Transferkolitis
Zur Vorbereitung auf den lymphatischen Organen (Milz, nach CD4+CD25- und CD4+CD2
Abb. 9 Ermittlung der Reinheit CD3+ Zellsortierung (MACSTM), die Charakte
3.1.1 Behandlung mit So
Zunächst sollte das Soraphen A herangetragen werden. Dies w Tiere praktisch umgesetzt. Es w am Tag zu sich nimmt und Trinkwasser einen ausreichend würde.
en Zelltransfer wurden naive T-Zellen au ilz, Lymphknoten) von Mäusen der C57 Bl/6J CD25+-Oberflächenantigenen getrennt. Dies g (Reinheit) von 89-99%, was für eine gute spezif nantikörper gegen CD4-und CD25-Reze nhand des in Abb. 9 aufgeführten Gating-Beispi Die Zellen, die sich innerhalb der „Gates“ b nd zur intraperitonealen Injektion weiterverwen
+/CD4+ T-Zellen mittels Durchflusszytometrie nach mag rakterisierung erfolgte anhand der CD4-und CD25-Oberflä
it SorA im Trinkwasser
en A über die enterale Aufnahme direkt an de es wurde durch das Lösen der Substanz in dem
Es wurde angenommen, dass jedes Tier bis zu nd somit eine Konzentration von 100 µg So hend hohen Spiegel im Organismus der Tiere
Seite 26 aus den sekundär l/6J-Linie isoliert und es geschah mit einer
Die Tiere der Teff-Gruppe er Menge DMSO ins Trinkwasser Treg-Zellen zu Beginn, nichts W etwa zwei Wochen, ließen sich Gruppe wesentlich beeindruck gespritzt bekommen haben.
Analog zur klinischen Symptom interpretiert werden. Dabei ze initialen Körpergewichtes in d ersten zwei Wochen eine relat in den drei Versuchsgruppen Abnahme des durchschnittlich Gruppe nimmt tendenziell ehe heranwachsenden sechs bis s starken Gewichtsschwankunge unterschiedlichen Tageszeiten
Abb. 10 prozentuale Gewichtsveränd jeder Punkt beschreibt den Mittelwer an Tag 0. Anzahl der verwendeten Ind
erhielten dabei, anstatt des Testsubstrates, sser gelöst, während die Treg-Gruppe, außer d hts Weiteres als herkömmliches Trinkwasser er
sich die Symptome der Kolitis bei den Tieren ruckender beobachten als bei den Tieren, di
ptomatik, kann auch der Gewichtsverlauf der i zeigt Abb. 10 die durchschnittliche prozentu in den jeweiligen Versuchsgruppen. Zunächst relative Konstanthaltung des durchschnittlichen
en zu konstatieren. Danach zeigt sich tenden tlichen Körpergewichtes in der SorA- und Teff l eher an Gewicht zu, was physiologischer W
is sieben Wochen alten Tieren zu erwarten is ngen könnte man dabei auf die Messung des Kö ten zurückführen.
änderung im Verlauf der Zeit (Tag 0-38) bezogen auf das lwert der KG aller Individuen einer Gruppe (in %) in Bezug n Individuen n=3, Treg: n=2.
Seite 27 denziell eine relative eff-Gruppe. Die Treg-
Nach Extirpation des Kolons a Entzündungsausmaßes der Entzündungsreaktion korreliert Abbildung 11 veranschaulicht jeweiligen Gruppen. Dabei zeig stärkere Verkürzung des Kolo intestinale Entzündungsreaktio besteht kein relevanter Unters der Soraphen A Gruppe.
11 a)
Abb. 11 a) gemessene Kolonlänge in dazugehörigen Mittelwert der Kolonl Individuen der Teff (links)- und der Tr (rechts).
Nach der Isolation und immunz RAG-/--Mäuse, zeigt die folgen der Größe und Zellfläche nach v
ns aus dem Situs der Maus, wurde dieser zur er Länge nach gemessen. Eine ausgepr
liert dabei häufig mit einer verstärkten Verkürzu cht den Unterschied in der Verkürzung des Kol zeigt die Teff-Gruppe eine um durchschnittlich
Kolons im Vergleich zur Treg-Gruppe, was aktion bei den Teff- und SorA-Mäusen sugg
terschied zwischen der DMSO-Kontrollgruppe
11 b)
in cm, jeder Punkt stellt ein Individuum dar und jeder Q lonlänge in der Versuchsgruppe, b) Beispiel eines Kolon m er Treg (mitte)-Gruppe und ein als Vergleichsmaßstab bei
unzytologischen Färbung der L. propria Zellen lgende Abbildung beispielhaft anhand der Dur
ch verifizierte Lymphozyten (Abb. 12a/b).
Teff Treg
Abb. 12 c) durchflusszytometrische E Beispiel (Dotplot-Diagramm).
olgter Durchflusszytometrie der isolierten L. propria Zelle der Lymphozyten erfolgte nach a) Zellgröße und b) Zellf
ebenden von den toten Zellen mit Hilfe des F filtert. Es konnte daraufhin bei den lebenden Ze
werden (Abb. 12 c/d).
12 d)
he Ermittlung lebendiger Lymphozyten und d) CD3+/CD4
PMA und Ionomycin bewirkt eine Stimulation d mulation der CD4+ T-Zellen mit dem PMA/Ion stieg und eine verstärkte FoxP3-Expression
die anschließende Sekretion von Zytokinen nac ikeltransport zur Zellmembran durch die Zuga
Seite 29 Zellen am Beispiel eines
ellfläche.
s Fluoreszensmarkers n Zellen ein Filter auf
CD4+ T-Zellen im
Gating-on der intrazellulären Ionomycin lässt sich ion in allen Proben nach extrazellulär zu gabe von Brefeldin A
12 e)
Abb. 12 e) Gating-Beispiel nach PMA/Ionomycin und Brefeldin A stim
Folgende Diagramme stellen zusammengefasst in Balkend fungierten die Kolonproben aus
Abbildung 13 stellt die H Paradoxerweise konnte hierbe beobachtet werden. Auffallend DMSO-behandelten und Soraph
Abb. 13 prozentuale Häufigkeit der d Versuchsgruppen, Balkendiagramm m
ach Durchflusszytometrie von CD3+/CD4+ L. propr stimulierten Probe.
llen Durchschnittswerte aus den Daten d kendiagrammen, dar. Als Quelle der Zellm
aus den jeweiligen RAG-/--Mäusen.
Häufigkeit der IL-17A-positiven T-Zellen ierbei in der Treg-Fraktion eine gesteigerte I
lend ist, dass auch hier kein relevanter Untersch raphen A-behandelten Mäusen besteht.
er durchschnittlichen IL-17A-Produktion in den verschied m mit Mittelwert und Standardfehler bzw. #Spannweite
#
Seite 30 ropria-Zellen einer mit
der FACS-Analyse, ellmaterialgewinnung
en in Prozent dar.
te IL-17A Produktion rschied zwischen den
iedenen
ite, n=3, Treg: n=2.
Auch hier unterscheiden sich
Interessant in diesem Zusam Zellzahlen (Abb. 15), die unter Proliferations- und Expansionsp der Entzündung im Kolon gebe Gruppen eine auffallend Entzündungsausmaß hindeuten
sich die Teff-und SorA-Gruppe angesichts d Markers FoxP3 kaum voneinander. Währen Soraphen A-behandelten Mäusen messbar war, in dreifacher Ausprägung nachgewiesen werden
ung der Frequenz von Foxp3+ Treg-Zellen innerhalb der CD rt und Standardfehler bzw. #Spannweite, n=3, Treg: n=2
sammenhang ist außerdem die Ermittlung d ter den verschiedenen Therapiebedingungen Au ionspotenzial der T-Zellen und damit einen Hinw eben. Die Treg-Gruppe zeigt im Vergleich zu de d niedrige T-Zellzahl, was folglich auf
In den histologischen Präparat ausgeprägte Destruktionen in d bis in die L. propria. In den Präp zeigen sich ein paar mehr int Quantifizierung der Kolitis in de Hilfe des von Leppkes et al resultierend errechnet sich f niedrigerer Score als in den and auszugehen ist, dass die mit in den Kolonkrypten und eine vermehrte Lymph Präparaten der co-injizierten Individuen (Treg-r intakte K(Treg-rypten und ge(Treg-ringe(Treg-re Lymphozyten in den unten abgebildeten histologischen Präpa t al. erstmals definierten histopathologischen
h für die Treg-Gruppe ein um durchschnitt anderen beiden Versuchsgruppen, sodass hier mit Tregs co-injizierten Mäuse ein verbesserte
SorA
16 b)
arate im Vergrößerungsmaßstab von 1:100, Paraffin fix orA-, c) und Treg-Mäusen, d) histopathologischer Sco und Standardfehler bzw. #Spannweite bei n=3, Treg: n=2
16 d) nittlich zwei Punkte ier von der Annahme
3.1.2. Behandlung mit
Um einen möglichen First-Pass Versuch mit einigen Modifika Lösungsmittel Ethanol/PBS (EtO mit dem Soraphen A den Mäus Im Laufe des Versuches nehm Gewicht ab. Grund hierfür sin das Zusammensetzen der Tiere Die PBS- und die Treg-Gru Anfangsgewicht, während die bis auf <90% ihres initialen Körp
Abb. 17 prozentuale Gewichtsveränd jeder Punkt beschreibt den Mittelwer an Tag 0, n=4.
Beim Ermitteln der Kolonlänge Kolons bei der SorA-behandelt unterscheidet sich in beiden Gruppe weniger stark von der PBS-Gruppe keine Anzeichen fü
mit SorA/ EtOH-PBS
Pass-Effekt beim vorherigen Versuch auszuschl ifikationen wiederholt. Bei diesem Versuchsa (EtOH/PBS) anstatt des Trinkwassers verwende
usen täglich intraperitoneal, also systemisch, ehmen initial alle Versuchsgruppen konstant bi
sind mögliche Stressfaktoren wie die tägliche iere mit fremden Mäusen, die über eine SFB-Da Gruppe erholen sich allerdings im Verlau die Teff- und SorA-Gruppen weiterhin an Gewi Körpergewichtes stagnieren (Abb. 17).
änderung im Verlauf der Zeit (Tag 0-22) bezogen auf das lwert der KG aller Individuen einer Gruppe (in %) in Bezug
änge (Abb. 18) beobachtet man eine deutliche delten- sowie bei der Teff-Gruppe. Das Ausma den Versuchsgruppen wenig voneinander. Wä
der Kolonverkürzung beeinflusst erscheint, ze n für stattgehabte Verkürzungen. ewicht verlieren und
das initiale KG an Tag 0,
Abb. 18 gemessene Kolonlänge in cm dazugehörigen Mittelwert der Kolonl
Ähnlich wie in Abb. 13 zeigt auc Frequenzen in der Teff- und So Treg-Gruppe erheblich verstärk
Abb. 19 prozentuale Häufigkeit der d Versuchsgruppen, Balkendiagramm m
Vergleichbar mit der Abb. 14 der Treg-Gruppe zu beobach zurückzuführen ist (Abb. 20)
cm, jeder Punkt stellt ein Individuum dar und jeder Que lonlänge in der Versuchsgruppe.
t auch die folgende Auswertung (Abb. 19), dass s SorA-Gruppe gleichermaßen verhalten, währen tärkt ist.
er durchschnittlichen IL-17A-Produktion in den verschied m mit Mittelwert und Standardfehler, n=4.
14 ist auch hier eine tendenziell verstärkte Fo achten, welche auf die co-injizierten regulat
Seite 34 Querbalken den
ass sich die IL-17A-hrend diese in der
iedenen
e FoxP3-Expression in ulatorischen T-Zellen
Abb. 20 prozentuale Quantifizierung im Balkendiagramm mit Standardfeh
Bezugnehmend auf Abb. 11 zei Treg-Gruppe. Anders als im Tri Vergleich zur Teff-Gruppe, eine
Abb. 21 zeigt die durchschnittliche ab Mittelwert und Standardfehler, n=4.
Die Teff- und SorA-Versuchsg mäßiggradige Entzündung. Ve mildere Form der Kolitis e physiologisches Bild der Kolonw
ung der Frequenz von Foxp3+ Treg-Zellen innerhalb der CD fehler und Mittelwert, n=4.
zeigt sich auch hier eine stark verminderte Ges Trinkwasserversuch lässt sich aber auch in der eine verringerte T-Zellzahl beobachten (Abb. 21
e absolute Anzahl CD3/CD4-positiver T-Zellen in einem B
=4.
sgruppen zeigen nach dem Scoring eine der Ko . Vergleichsweise dazu lässt die Treg-Gruppe is erkennen, wohingegen die PBS-Mäuse lonwand aufweisen (Abb. 22).
Seite 35 er CD4+ T-Zellpopulation
Gesamtzellzahl in der der SorA-Gruppe, im . 21).
m Balkendiagramm mit
Kolitis angemessene ppe eine tendenziell se ein vollkommen
Teff
22 a)
Treg
22 c)
22 e)
Abb. 22 histologische Kolon-Präparat HE gefärbt von a) Teff-, b) SorA-, c) Tr Balkendiagramm mit Mittelwert und
SorA
22 b)
PBS
22 d)
arateim Vergrößerungsmaßstab von 1:100, Paraffin fixie Treg-, d) und PBS-Mäusen, e) histopathologischer Scor und Standardfehler bei n=4.
Seite 36 fixiert, geschnitten und
core, Darstellung im
3.1.3. Behandlung mit S
Im dritten Versuchsansatz wu Puffer ersetzt. Dieser hat in B sodass eine höhere Dosis an S dem EtOH/PBS insgesamt 200 Puffer ca. 500 µg der Substan zudem das Injektionsintervall werden.
Anhand des Gewichtsverlaufs Gewicht zunehmen und im Ver bzw. T-regulatorischen Zellen e nimmt die PBS-Gruppe stetig a an Körpergewicht abnimmt. D vom Gewichtsverlust betroffen an Soraphen A mit einer Injektion zu appliziere 00 µg SorA lösbar sind, besteht die Möglichkeit stanz zu lösen. Mit dem besseren Löslichkeits vall von täglich auf eine Applikation alle zwe
aufs erkennt man, dass alle Versuchsgruppen Verlauf bis ca. zum 10. Tag nach dem Transfer d len eher wieder an Körpergewicht abnehmen. A
ig an Gewicht zu, während besonders die Teff t. Dabei ist die SorA-Gruppe hier verhältnismä offen als die Teff- und Treg-Gruppe und auch n Versuchsansätzen (Abb. 23).
änderung im Verlauf der Zeit (Tag 0-24) bezogen auf das lwert der KG aller Individuen einer Gruppe (in %) in Bezug
Seite 37
Ausgehend von der physiolo gleichzusetzen), zeigt sich in Erkennbar ist auch hier wieder und eine relativ milde Verkürzu
Abb. 24 gemessene Kolonlänge in cm dazugehörigen Mittelwert der Kolonl
Bei der Auswertung der IL-17A diese in der Treg-Gruppe im Ve verhalten, d. h. die Frequenzen zu sein, während sie zuvor leic der Gesamtzellzahl heraus, da erhöht sind (s. Abb. 27). Ein Versuchsbeginn das veränderte Während in den vorangegange den Tregs den RAG-/--Mäusen aufgrund von begrenzter Ausb von 1:3 co-injiziert werden, d.
Fall nur 100.000 Tregs (CD4+CD und FoxP3-induzierenden Effe
cm, jeder Punkt stellt ein Individuum dar und jeder Que lonlänge in der Versuchsgruppe
17A-und der FoxP3-Frequenzen (Abb. 25, 26) Vergleich zu den beiden vorherigen Versuchen nzen erscheinen in diesem Versuchsansatz tend leicht erhöht waren. Des Weiteren stellt sich b , dass CD3+CD4+ Zellen im Vergleich zur SorA . Eine mögliche Erklärung für diese Beobach erte Verhältnis von injizierten naiven T-Zellen zu
ngenen Versuchen die naiven T-Zellen im Verh sen simultan i.p. gespritzt wurden, konnten in usbeute bei der Zellisolation, die Tregs nur in , d. h. auf 300.000 naive T-Zellen (CD4+CD25
-CD25+). Folglich lassen sich hier die zuvor beo Effekte, sowie mögliche Gesamtzellzahl-reduzie ht darlegen. uzierende Effekte, in
Abb. 27 zeigt die durchschnittliche ab Mittelwert und Standardfehler bzw.
Der histopathologische Score Gruppen, wobei die Teff-Versu mittelgradige und die PBS G aufweisen.
Abb. 25 prozentuale Häufig durchschnittlichen IL-17A-Prod
e absolute Anzahl CD3/CD4-positiver T-Zellen in einem B zw. #Spannweite, n=3, SorA: n=2.
ore verdeutlicht den Unterschied zwischen de ersuchsgruppe eine hochgradige, die Treg- und
S Gruppe keinen Anhalt für eine Inflamma
e Quantifizierung der Treg-Zellen innerhalb Zellpopulation im Standardfehler bzw.
elwert, n=3, SorA: n=2.
#
Teff
28 a) Treg
28 c)
Abb. 28 histologische Kolon-Präpara HE gefärbt von a) Teff-, b) SorA-, c) Balkendiagramm mit Mittelwert und
28 e)
SorA
28 b)
PBS
parate im Vergrößerungsmaßstab von 1:100, Paraffin fix c) Treg-, d) und PBS-Mäusen, e) histopathologischer und Standardfehler bzw. *Spannweite bei n=3, SorA: n=2.
28 d)
#
Seite 40
n fixiert, geschnitten und her Score, Darstellung im
n=2.
Seite 41 Um die Aussagekraft der Ergebnisse des letzten Versuches zu erhärten, wurde das letzte Experiment ein weiteres Mal unter nahezu den gleichen Bedingungen wiederholt. Dabei wurde bei dem Transfer naiver T- und Treg-Zellen zu Versuchsbeginn wieder auf ein Verhältnis von 1:1 geachtet. Die Ergebnisse konnten dabei im selben Maße wie im oben abgebildeten Versuch reproduziert werden mit dem Unterschied, dass sich die FoxP3- und IL-17A-Frequenzen, sowie die absoluten T-Zellzahlen sich dem 2. Versuchsansatz angeglichen haben (s. Anhang 2).
3.1.4. Behandlung mit
Auch bei dem folgenden Vers Behandlung mit dem Lösungsm um eine weitere Versuchsgrup Tage eine intraperitoneale B Soraphen A, dem Sor-S1036, er gar keine klinischen Anzeichen Gruppe. den Mittelwert an Tag 0, n=4, PBS: n=
it SorA bzw. Sor-S1036/ PEG-Tween8
Versuch wurde, in Anlehnung an den letzten V gsmittel PEG/Tween80 fortgesetzt. Zudem wurd ruppe erweitert, die neben der Injektion naiver le Behandlung mit dem besser wasserlöslic 6, erhalten hat. Erstaunlicherweise wiesen diese chen für eine Kolitis auf, ähnlich wie bei den
nd Treg-Versuchsgruppe, die im Verlauf des zugenommen haben, nimmt die Teff-Gruppe te ugekommene Sor-S1036-Gruppe hält dabei d isch zeigt die Derivatgruppe kaum klinische A ich auch vom Allgemeinzustand nicht effektiv be
änderung im Verlauf der Zeit (Tag 0-22) bezogen auf das lwert der Körpergewichte aller Individuen einer Gruppe ( S: n=3. e tendenziell eher an ei das Körpergewicht
Anzeichen für eine v beeinträchtigt.
das initiale KG an Tag 0, pe (in %) in Bezug auf
Die neu hinzugekommene So vergleichbar mit der Treg-Gru weisen, wie auch in den Versuc
Abb. 30gemessene Kolonlänge in cm dazugehörigen Mittelwert der Kolonl
Die IL-17A-Frequenzen sind be zuvor, im Vergleich zur Treg weisen einen im Vergleich zu 17A Spiegel auf, womit sie sich
Sor-S1036 Gruppe zeigt in Hinsicht auf die Gruppe, mäßiggradige Verkürzung. Die stärkst rsuchen zuvor, die Teff- und die SorA-Gruppe au
n cm, jeder Punkt stellt ein Individuum dar und jeder Que lonlänge in der Versuchsgruppe.
bei den Teff- und SorA-Mäusen, wie auch in d reg-Versuchsgruppe reduziert. Die zu den ersten beiden Versuchsgruppen tenden sich diesbezüglich der Treg-Gruppe annähern.
Abb. 31 prozentuale Häufigkeit der d 17A-Produktion in den verschiedene Balkendiagramm mit Mittelwert und St
Seite 43 die Darmlänge eine, rksten Verkürzungen
auf.
Querbalken den
in den Auswertungen -behandelten Tiere denziell erhöhten
er durchschnittlichen IL-denen Versuchsgruppen,
d Standardfehler, n=4.
Bezüglich des Transkriptionsfak keine wesentlich erhöhten Freq
Abb. 32 prozentuale Quantifizierung im Balkendiagramm mit Standardfeh
Hinsichtlich der Gesamtzellzah Derivatgruppe eine stark red Versuchsgruppen nicht signifika auf die Teff-Gruppe unterscheid
Abb. 33 durchschnittliche absolute Signifikanzen *p<0,05, **p<0,01 wur Individuen pro Gruppe
sfaktors FoxP3 zeigen die Sor-S1036-behandelte Frequenzen auf.
ung der Frequenz von Foxp3+ Treg-Zellen innerhalb der CD fehler und Mittelwert, n=4.
llzahl im Kolon lässt sich sowohl in der Treg reduzierte T-Zellzahl beobachten, welche sic ifikant voneinander unterscheidet, also vergleic cheidet sie sich aber durchaus signifikant.
te Anzahl CD3/CD4-positiver T-Zellen mit Mittelwert un wurden anhand des Zweistichproben T-Test ermittelt, ns=
Seite 44 elten Tiere allerdings
er CD4+ T-Zellpopulation
reg- als auch in der sich in den beiden gleichbar ist. In Bezug
t und Standardfehler, die ns=nicht signifikant, n=4
Seite 45 Nach dem histopathologischen Score zu urteilen, findet nur ein mäßiger Entzündungsprozess im Kolon der Sor-S1036 behandelten-Mäuse statt. Dieser könnte vergleichbar mit dem der Treg-Gruppe sein, da sich die Scores beider Gruppen nicht signifikant voneinander unterscheiden. Im Vergleich zur Teff- und SorA-Gruppe lassen sich allerdings signifikante Unterschiede in der Kolon-Histologie feststellen.
Teff SorA
34 a) 34 b)
Sor-S1036 Treg
34 c) 34 d)
34 e)
Abb. 34 histologische Kolon-Präpara HE gefärbt von a) Teff-, b) SorA-, Darstellung im Balkendiagramm mit M
PBS
34 f)
parate im Vergrößerungsmaßstab von 1:100, Paraffin fix , c) Sor-S1036-, d) Treg- e) und PBS-Mäusen, f) histo it Mittelwert und Standardfehler bei n=4.
Seite 46 n fixiert, geschnitten und istopathologischer Score,
3.2. DSS-Kolitis
Mithilfe dieser chemisch indu untersucht werden, inwiefern nimmt und ob es, wie in Gleichgewichtes kommt. Daz umfassende Beleuchtung diese
3.2.1. Behandlung mit
Im ersten Versuchsansatz wur nach dem Schema von Abb. 7 A oder der PEG/Tween80-Trä therapiert wurden. Nach dem man, sowohl bei den behandel
Im ersten Versuchsansatz wur nach dem Schema von Abb. 7 A oder der PEG/Tween80-Trä therapiert wurden. Nach dem man, sowohl bei den behandel