der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und dem Institut für Tierernährung der Universität Hohenheim
Einfluss einer Spermin- oder Nukleotidzulage auf Aminkonzentrationen und
Enzymaktivitäten im Dünndarm von Ferkeln
INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Andrea Schad
aus Backnang
Hannover 2002
Univ.-Prof. Dr. J. Zentek
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. J. Zentek
2. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. B. Schröder
Tag der mündlichen Prüfung: 30. 5. 2002
und besonders Mama und Vater sowie meiner Pe, Wolfe und Dedden, eben der ganzen Familie
und den Bären.
Ziel des durch das Land Baden-Württemberg geförderten Projektes (Landesforschungs- schwerpunktprogramm) „Nutritive Regulation der Darmproliferation und -differenzierung“
war es, Pilotstudien über die nutritive Beeinflussung des Darmwachstums beim Ferkel durchzuführen. Im Vordergrund stand hierbei die Wirkung bestimmter Milchinhaltsstoffe auf die Zellteilung, -differenzierung und den programmierten Zelltod (Apoptose).
Das Projekt wurde interdisziplinär bearbeitet. Zu den beteiligten Instituten der Universität Hohenheim gehören das Institut für Tierhaltung, Fachgebiet Tierhaltung und Leistungsphysiologie unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Claus (Antragsteller und Sprecher), das Institut für Umwelt und Tierhygiene, Fachgebiet Anatomie und Physiologie der Haustiere unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Amselgruber sowie das Institut für Tierernährung, Fachgebiet Futtermittelkunde unter der Leitung von Herrn Prof. Dr.
Mosenthin (Stellvertretender Leiter) in Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Dr. Zentek vom Institut für Tierernährung der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
1 EINLEITUNG... 23
2 LITERATURÜBERSICHT... 24
2.1 Morphologie und Funktion des Dünndarmes... 24
2.1.1 Proliferation, Differenzierung und Apoptose... 25
2.1.2 Postnatale Veränderungen des Dünndarmes ... 26
2.1.2.1 Morphologische Veränderungen... 27
2.1.2.2 Funktionelle Veränderungen... 27
2.1.3 Veränderungen in der Darmstruktur zum Zeitpunkt des Absetzens vom Muttertier... 30
2.1.4 Regulation des Darmwachstums ... 30
2.2 Biogene Amine ... 32
2.2.1 Chemische Struktur und Eigenschaften... 32
2.2.1.1 Monoamine... 32
2.2.1.2 Polyamine... 33
2.2.2 Polyamine in der Zelle... 35
2.2.2.1 Polyamintransportsysteme in Zellen ... 38
2.2.2.2 Abbau von Aminen ... 38
2.2.3 Aminresorption aus Nahrungsstoffen... 39
2.2.4 Aminbildung in Mikroorganismen ... 40
2.2.5 Amine in Lebensmitteln tierischer und pflanzlicher Herkunft sowie Milch verschiedener Spezies... 40
2.2.6 Intoxikationen durch biogene Amine ... 42
2.2.7 Physiologische Effekte der Amine ... 43
2.2.7.2 Polyamine und ihre Effekte am Darm... 44
2.3 Purin- und Pyrimidinnukleotide... 48
2.3.1 Struktur der Nukleotide ... 48
2.3.2 Biosynthese der Nukleotide... 48
2.3.3 Abbau der Nukleotide... 50
2.3.4 Vorkommen der Nukleotide ... 51
2.3.5 Nukleotide und ihre Effekte auf Zellen und Gewebe... 53
2.4 Analytik der Amine mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie... 55
2.4.1 Prinzip der HPLC ... 55
2.4.2 HPLC-Verfahren mit chemischer Derivatisierung... 55
2.4.2.1 Methoden zur Vorsäulenderivatisierung ... 57
2.4.2.1.1 Vorsäulenderivatisierung mit 9-Fluorenylmethylchloroformiat ... 57
2.4.2.1.2 Vorsäulenderivatisierung mit Dansylchlorid ... 58
2.4.2.1.3 Vorsäulenderivatisierung mit Phenylisothiocyanat (PITC) ... 59
2.4.2.1.4 Weitere Vorsäulenderivatisierungsverfahren... 59
2.4.2.2 Nachsäulenderivatisierungsverfahren ... 60
2.4.2.2.1 Derivatisierung mit ortho-Phtaldialdehyd (OPA) ... 60
2.4.2.2.2 Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin ... 61
2.4.2.2.3 Nachsäulenderivatisierung mit Fluorescamin ... 61
2.4.2.3 Vor- und Nachteile der Derivatisierungsverfahren ... 62
3 MATERIAL UND METHODEN... 63
3.1 Zielsetzung... 63
3.2 Tierexperimentelle Untersuchungen ... 64
3.2.1 Versuchsaufbau ... 64
3.2.3.1 Rationszusammensetzung ... 68
3.2.3.2 Versuchsrationen... 69
3.2.3.3 Fütterung ... 69
3.2.4 Euthanasie der Ferkel ... 70
3.2.5 Probenahme aus den einzelnen Kompartimenten des Intestinaltraktes... 70
3.2.5.1 Gewebeentnahme ... 70
3.2.5.2 Aufarbeitung und Lagerung der Proben... 72
3.2.5.2.1 Darmgewebe und Chymus ... 72
3.2.5.2.2 Blutplasma... 72
3.3 Analytische Verfahren ... 73
3.3.1 Aminanalytik ... 74
3.3.1.1 Fragestellung ... 74
3.3.1.2 HPLC-Anlage, Geräte und Chemikalien... 74
3.3.1.2.1 HPLC-Anlage... 74
3.3.1.2.2 Sonstige Geräte und Laborzubehör... 75
3.3.1.2.3 Verwendete Chemikalien ... 76
3.3.2 Bestimmung von Enzymen... 78
3.3.2.1 Laktase- und Maltase-Bestimmung im Chymus ... 78
3.3.2.1.1 Probenaufarbeitung ... 79
3.3.2.1.2 Bestimmung der Disaccharidasen ... 79
3.3.2.1.2.1 Disaccharidspaltung ...79
3.3.2.1.2.2 Farbreaktion ...80
3.3.2.1.3 Auswertung ... 80
3.3.2.1.4 Verwendete Chemikalien und Geräte ... 80
3.3.2.1.5 Qualitätskriterien der Methode zur Disaccharidasebestimmung ... 82
3.3.2.2 Leucinarylamidasebestimmung im Chymus ... 83
3.3.2.3 Trockensubstanz der Chymusproben ... 84
3.4 Statistische Auswertung... 84
4 ERGEBNISSE... 86
4.1 Fütterungsversuch... 86
4.1.1 Zootechnische Parameter... 86
4.2 Methodenentwicklung zur Bestimmung von Aminen in Chymus und Darmgewebe... 87
4.2.1 Voruntersuchungen... 87
4.2.2 Analyseverfahren zur Aminbestimmung... 90
4.2.2.1 Probenaufarbeitung und -derivatisierung der Chymusproben und des Aminstandards ... 90
4.2.2.2 Probenaufarbeitung und -derivatisierung der Gewebeproben, des internen Standards und des Aminstandards ... 92
4.2.2.3 HPLC-Bedingungen zur Trennung der Amine ... 95
4.2.3 Validierung der HPLC-Methode zur Aminbestimmung im Chymus und Darmgewebe... 101
4.2.3.1 Überprüfung der Linearität ... 101
4.2.3.2 Überprüfung der Reproduzierbarkeit ... 105
4.2.3.3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze ... 105
4.2.3.4 Wiedergewinnung des Amin-Standardgemisches im Chymus ... 107
4.2.3.5 Wiedergewinnung des Amin-Standardgemisches im Darmgewebe... 108
4.3 Ergebnisse der Aminbestimmung... 110
4.3.1 Amingehalte im Dünndarmchymus... 110
4.3.2 Amingehalte im Darmgewebe... 115
4.3.3 Prozentuale Anteile der Amine des Chymus und Darmgewebes im distalen Jejunum... 126
Dünndarmes... 127
4.4.1 Maltaseaktivität ... 127
4.4.2 Laktaseaktivität ... 130
4.4.3 Leucinarylamidaseaktivität ... 132
5 DISKUSSION ... 136
5.1 Aminbestimmung ... 136
5.2 TierexperimentelleUntersuchungen... 139
5.3 Diskussion der Ergebnisse der Amin- und Enzymbestimmung... 140
5.3.1 Amine im Chymus und Darmgewebe sowie Ergebnisse der Darmmorphologie und Proliferationsparameter... 141
5.3.2 Enzymaktivitäten im Chymus ... 146
5.3.2.1 Maltase ... 146
5.3.2.2 Laktase ... 147
5.3.2.3 Leucinarylamidaseaktivität ... 148
5.4 Schlussfolgerungen... 149
6 ZUSAMMENFASSUNG... 150
7 SUMMARY... 152
8 LITERATURVERZEICHNIS ... 154
9 ANHANG ... 174
Tab. 1: Nukleotidgehalt im Kolostrum verschiedener Spezies... 51
Tab. 2: Puringehalte verschiedener Lebensmittel... 52
Tab. 3: Versuchsaufbau ... 64
Tab. 4: Versuchsablauf ... 65
Tab. 5: Zusammensetzung der Basisdiät (% Originalsubstanz) ... 68
Tab. 6: Übersicht über verwendete Analysemethoden ... 73
Tab. 7: Regressionsgeradengleichung (y = ax + b) und Korrelationskoeffizient ... 83
Tab. 8: Zootechnische Parameter des Fütterungsversuches ... 86
Tab. 9: Aufarbeitung der Chymusproben ... 91
Tab. 10: Aufarbeitung des Aminstandards für die Chymusproben ... 91
Tab. 11: Derivatisierung der Chymusproben (ebenso Standard)... 92
Tab. 12: Aufarbeitung der Darmgewebeproben ... 94
Tab. 13: Aufarbeitung des internen Standards 1,8-Diaminooktan ... 94
Tab. 14: Aufarbeitung des Aminstandards für die Gewebeproben... 94
Tab. 15: Probenderivatisierung (ebenso Standard)... 95
Tab. 16: Gradientenprogramm zur Amintrennung nach der Derivatisierung... 96
Tab. 17: Reproduzierbarkeit der Fluoreszenzmessung nach Derivatisierung mit FMOC-Cl. ... 105
Tab. 18: Nachweis- (NG) und Bestimmungsgrenze (BG) für die Fluoreszenz- detektion von Aminen nach Derivatisierung mit FMOC-Cl. ... 106
Tab. 19: Wiedergewinnung und Variationskoeffizienten für biogene Amine im Chymus... 108
Tab. 20: Wiedergewinnung und Variationskoeffizienten für biogene Amine im Darmgewebe... 109
Tab. 21: Anteile der Amine (in Mol.%) am Gesamtamingehalt im Chymus (C) und Darmgewebe (D) des distalen Jejunums ... 126
der einzelnen Fütterungsgruppen ... 142
Tab. 23: Proliferationsparameter Ki-67 und Thymidinkinaseaktivität... 143
Tab. 24: Enzymaktivitäten des Chymus im distalen Jejunum ... 146
Tab. I: Inhaltsstoffe/Zusatzstoffe Immunozog®... 174
Tab. II: Inhaltsstoffe/Zusatzstoffe PorVit Lak®... 175
Tab. III: Durchschnittliche Analyse des Molkefettkonzentrates ... 176
Tab. IV: Zusammensetzung der Mineralstoff-/Vitamin-Mischung ... 177
Tab. V: Putrescingehalte des Chymus im proximalen Jejunum ... 178
Tab. VI: Putrescingehalte des Chymus im distalen Jejunum... 178
Tab. VII: Cadaveringehalte des Chymus im proximalen Jejunum... 179
Tab. VIII: Cadaveringehalte des Chymus im distalen Jejunum ... 179
Tab. IX: Spermidingehalte des Chymus im proximalen Jejunum ... 180
Tab. X: Spermidingehalte des Chymus im distalen Jejunum ... 180
Tab. XI: Spermingehalte des Chymus im proximalen Jejunum... 181
Tab. XII: Spermingehalte des Chymus im distalen Jejunum ... 181
Tab. XIII: Putrescingehalte des Darmgewebes (Duodenum) ... 182
Tab. XIV: Putrescingehalte des Darmgewebes (proximales Jejunum)... 182
Tab. XV: Putrescingehalte des Darmgewebes (distales Jejunum) ... 183
Tab. XVI: Putrescingehalte des Darmgewebes (Ileum)... 183
Tab. XVII: Cadaveringehalte des Darmgewebes (Duodenum)... 184
Tab. XVIII: Cadaveringehalte des Darmgewebes (proximales Jejunum) ... 184
Tab. XIX: Cadaveringehalte des Darmgewebes (distales Jejunum)... 185
Tab. XXII: Spermidingehalte des Darmgewebes (proximales Jejunum)... 186
Tab. XXIII: Spermidingehalte des Darmgewebes (distales Jejunum)... 187
Tab. XXIV: Spermidingehalte des Darmgewebes (Ileum)... 187
Tab. XXV: Spermingehalte des Darmgewebes (Duodenum) ... 188
Tab. XXVI: Spermingehalte des Darmgewebes (proximales Jejunum)... 188
Tab. XXVII: Spermingehalte des Darmgewebes (distales Jejunum)... 189
Tab. XXVIII: Spermingehalte des Darmgewebes (Ileum)... 189
Tab. XXIX: Maltaseaktivität des Chymus im Duodenum... 190
Tab. XXX: Maltaseaktivität des Chymus im proximalen Jejunum... 190
Tab. XXXI: Maltaseaktivität des Chymus im distalen Jejunum... 191
Tab. XXXII: Maltaseaktivität des Chymus im Ileum ... 191
Tab. XXXIII: Laktaseaktivität des Chymus im Duodenum ... 192
Tab. XXXIV: Laktaseaktivität des Chymus im proximalen Jejunum ... 192
Tab. XXXV: Laktaseaktivität des Chymus im distalen Jejunum... 193
Tab. XXXVI: Laktaseaktivität des Chymus im Ileum ... 193
Tab.XXXVII: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im Duodenum ... 194
Tab.XXXVIII: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im proximalen Jejunum... 194
Tab. XXXIX: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im distalen Jejunum... 195
Tab. XL: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im Ileum ... 195
Abb. 1: Kompartimentierung der Zotten/Krypten-Einheit ... 25
Abb. 2: Chemische Strukturformeln einiger Amine... 34
Abb. 3: Biosynthese von Polyaminen... 37
Abb. 4: Schema zur Purinnukleotidbiosynthese... 49
Abb. 5: HPLC-Chromatogramm eines Standardgemisches der FMOC-Cl- Derivate von Aminen (0,25 µmol/ml) ... 97
Abb. 6: HPLC-Chromatogramm der FMOC-Cl-Derivate von Aminen einer aminarmen Chymusprobe (Putrescin und Cadaverin n.n.)... 98
Abb. 7: HPLC-Chromatogramm der FMOC-Cl-Derivate von Aminen einer aminreichen Chymusprobe ... 99
Abb. 8: HPLC-Chromatogramm der FMOC-Cl-Derivate von Aminen einer Darmgewebeprobe (Cadaverin n.n.)... 100
Abb. 9: Eichreihen mit 1,7-Diaminoheptan als internem Standard für Putrescin, Cadaverin, Spermidin und Spermin... 102
Abb. 10: Eichreihen mit 1,6-Diaminohexan als internem Standard für Putrescin, Cadaverin, Spermidin und Spermin... 103
Abb. 11: Eichreihen mit 1,8-Diaminooktan als internem Standard für Putrescin, Cadaverin, Spermidin und Spermin... 104
Abb. 12: Putrescingehalte des Chymus im proximalen Jejunum ... 111
Abb. 13: Putrescingehalte des Chymus im distalen Jejunum... 112
Abb. 14: Cadaveringehalte des Chymus im proximalen Jejunum... 112
Abb. 15: Cadaveringehalte des Chymus im distalen Jejunum ... 113
Abb. 16: Spermidingehalte des Chymus im proximalen Jejunum ... 113
Abb. 17: Spermidingehalte des Chymus im distalen Jejunum ... 114
Abb. 18: Spermingehalte des Chymus im proximalen Jejunum... 114
Abb. 20: Putrescingehalte im Darmgewebe (Duodenum)... 118
Abb. 21: Putrescingehalte im Darmgewebe (proximales Jejunum) ... 118
Abb. 22: Putrescingehalte im Darmgewebe (distales Jejunum) ... 119
Abb. 23: Putrescingehalte im Darmgewebe (Ileum) ... 119
Abb. 24: Cadaveringehalte im Darmgewebe (Duodenum) ... 120
Abb. 25: Cadaveringehalte im Darmgewebe (proximales Jejunum)... 120
Abb. 26: Cadaveringehalte im Darmgewebe (distales Jejunum) ... 121
Abb. 27: Cadaveringehalte im Darmgewebe (Ileum)... 121
Abb. 28: Spermidingehalte im Darmgewebe (Duodenum) ... 122
Abb. 29: Spermidingehalte im Darmgewebe (proximales Jejunum) ... 122
Abb. 30: Spermidingehalte im Darmgewebe (distales Jejunum) ... 123
Abb. 31: Spermidingehalte im Darmgewebe (Ileum) ... 123
Abb. 32: Spermingehalte im Darmgewebe (Duodenum) ... 124
Abb. 33: Spermingehalte im Darmgewebe (proximales Jejunum)... 124
Abb. 34: Spermingehalte im Darmgewebe (distales Jejunum) ... 125
Abb. 35: Spermingehalte im Darmgewebe (Ileum)... 125
Abb. 36: Maltaseaktivität des Chymus im Duodenum... 128
Abb. 37: Maltaseaktivität des Chymus im proximalen Jejunum... 128
Abb. 38: Maltaseaktivität des Chymus im distalen Jejunum... 129
Abb. 39: Maltaseaktivität des Chymus im Ileum ... 129
Abb. 40: Laktaseaktivität des Chymus im Duodenum ... 130
Abb. 41: Laktaseaktivität des Chymus im proximalen Jejunum ... 131
Abb. 42: Laktaseaktivität des Chymus im distalen Jejunum... 131
Abb. 43: Laktaseaktivität des Chymus im Ileum ... 132
Abb. 44: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im Duodenum ... 133
Abb. 46: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im distalen Jejunum... 134 Abb. 47: Leucinarylamidaseaktivität des Chymus im Ileum ... 134
Abb. Abbildung
ABTS 2,2-Azini-di-(3-ethylbenzthiazolin)
ACTH Adrenocorticotropes Hormon
AG Aktiengesellschaft
ADAM 1-Aminoadamantan
AMP Adenosin-5-phosphat, Adenosinmonophosphat
Best. Nr. Bestellnummer
bidest. bidestilliert
bzw. beziehungsweise
C Kohlenstoff
ca. circa
CaCo colorectal adenocarcinoma cell line
CAD Cadaverin
CN Cyanid
CH Schweiz
CMP Cytidin-5-phosphat, Cytidinmonophosphat
Co Cooperation
d Tag
D Deutschland
Dabsyl-Cl Dabsylchlorid
Dansyl-Cl Dansylchlorid, 5-Dimethylaminonaphthalin-1-sulfonylchlorid
DEAE Diethylaminoethyl
DNA Desoxyribonukleinsäure
EGF Epidermaler Wachstumsfaktor
et al. et alii
Fa. Firma
Fluorescamin, Fluram 4-Phenylspiro[furan-2(3H),1`phtalan]-3,3`-dion FMOC-Cl 9-Fluorenylmethylchloroformiat
fmol Femtomol
FNBT 4-Fluor-3-nitrobenzotrifluorid
GLMP General Linear Models Procedure GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung
GMP Guanosin-5-phosphat, Guanosinmonophosphat
H2 Wasserstoff
HIST Histamin
HSQC N-Hydroxysuccinimidyl 6-Quinolinyl-Carbamat HPLC High Performance Liquid Chromatography
(Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) IEC Intestinal epithelial cell line
IgG Immunglobulin G
IMP Inosin-5-phosphat, Inosinmonophosphat
i.v. intravenös
k Korrelationskoeffizient
kg Kilogramm
KM Körpermasse
l Liter
LAP Leucinarylamidase, Leucinaminopeptidase
LS-Means Least Square Means
MAO Monoaminooxidase
Min./Vit.-Mischung Mineralstoff- und Vitaminmischung
min Minute
mg Milligramm
µg Mikrogramm
ml Milliliter
mmol Millimol
µmol Mikromol
mU Milliunits
n Anzahl
NaOH Natronlauge
NDA Naphthalendialdehyd
n. n. nicht nachweisbar
n. s. nicht signifikant
ODC Ornithindecarboxylase
OPA ortho-Phthaldialdehyd
p. a. zur Analyse
PEOC 2-(1-Pyrenyl)Ethylchloroformiat
pH potentia hydrogenii
PITC Phenylisothiocyanat
pmol Picomol
PRPP Phosphoribosylpyrophosphat
PUT Putrescin
® Eingetragenes Warenzeichen
R- Rest
R2 Bestimmtheitsmaß
RNA Ribonukleinsäure
RP Reversed Phase (Umkehrphase)
s Sekunde
S Schwefel
S. Seite
SAM-DC S-Adenosylmethionin-Decarboxylase
SPD Spermidin
SPN Spermin
s. u. siehe unten
Tab. Tabelle
TRIS Tri-(hydroxymethyl)-aminomethan
TS Trockensubstanz
u. und
U Units (Einheiten)
u.a. unter anderem
UMP Uridin-5-phosphat, Uridinmonophosphat
usw. und so weiter
UV Ultraviolett
Vk Variationskoeffizient
Vol % Volumenprozent
arithmetischer Mittelwert
z.B. zum Beispiel
°C Grad Celsius
x g mal Erdbeschleunigung
± s Standardabweichung
± SEM Standard Error of the Mean, Standardfehler
1 Einleitung
Die postnatale Phase stellt bei der Ferkelaufzucht einen besonders kritischen Lebensabschnitt dar. Verschiedene Faktoren wie hohe Wurfgröße, geringes Geburtsgewicht, unzureichende Adaptation, Alter der Sau, schlechter Hygienestatus, Streß usw. bedingen eine hohe Sterblichkeitsrate in dieser Zeit (SVENDSEN 1992).
Die in dieser Phase auftretenden Anpassungsphänomene des Gastrointestinaltraktes sind von großer Bedeutung für die Verdauung und Absorption aufgenommener Inhaltsstoffe der im zeitlichen Ablauf zur Verfügung stehenden Nahrung. Die Regulation sowie der Verlauf dieser intestinalen Anpassungsprozesse sind bisher kaum bekannt. Zum Zeitpunkt der Geburt scheint der Anstieg an Glucocorticoiden mit den Differenzierungsvorgängen in den Darmmukosazellen in Verbindung zu stehen (SANGILD et al.1995). Eine Beteiligung bei der Stimulation des intestinalen Zellwachstums wird auch für bioaktive Substanzen (Wachstumsfaktoren, Hormone) des Kolostrums angenommen (ODLE et al. 1996). Neben Wachstumsfaktoren und Hormonen (JAEGER et al.1987) zählen dazu auch Polyamine, wobei Spermidin und Spermin hier die größte Fraktion darstellen (MOTYL et al.1995, KELLY et al.
1991 a). Des Weiteren enthält Milch verschiedener Spezies Nukleotide (Purine und Pyrimidine) in unterschiedlichen Konzentrationen, wobei hohe Gehalte hauptsächlich im frühen Laktationsstadium ermittelt werden (CARVER u. WALKER 1995). Studien über die Wirkungen exogener Polyamin- und Nukleotidzufuhr weisen auf deren Beteiligung bei der Differenzierung und Proliferation des intestinalen Epithels hin (RAAB 1998; KAOUASS et al.
1996; BARDOCZ et al.1995; CAPANO et al.1994; HARADA et al.1994; KAOUASS et al.1994;
BARDOCZ 1993; BUTS et al.1993; WILD et al.1993; MCCORMACK u.JOHNSON 1991; DUFOUR
et al.1988).
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluß von exogen zugeführtem Spermin und Nukleotiden auf den Entwicklungszustand des Intestinaltraktes von Ferkeln bis zum Alter von drei Wochen zu untersuchen. Als Parameter wurden die Aminkonzentrationen im Chymus und Darmgewebe sowie intestinale Enzymaktivitäten zur Charakterisierung des Funktionszustandes des Darmes bestimmt.
2 Literaturübersicht
2.1 Morphologie und Funktion des Dünndarmes
Der Darmkanal, dessen Aufgabe der Aufschluss und die Resorption von lebensnotwendigen Bestandteilen der Nahrung, aber auch die Schutzfunktion gegenüber schädigenden Futterinhaltsstoffen oder Bakterien ist, besitzt eine den verschiedenen Leistungen des Dünn- und Dickdarmes angepasste innere Wandung, die Schleimhaut oder Tunica mucosa (Mukosa) (JANKOWSKI et al. 1994; NICKEL et al. 1987). Die Oberfläche der Schleimhaut des Dünndarmes wird durch die Darmzotten, Villi intestinales, erheblich vergößert. Es handelt sich hierbei um 0,5 bis 1 mm lange Ausstülpungen der Lamina propria mucosae, deren inneres retikuläres Gewebe glatte Muskelzellen, Blut- und Lymphgefäße enthält (NICKEL et al. 1987). Am Zottengrund bildet das Epithel Vertiefungen, die Glandulae intestinales oder Lieberkühnschen Krypten, in denen undifferenzierte mitotische Zellen neue Zellen produzieren, um Zellverluste an der Zottenspitze auszugleichen. Die abgestoßenen Epithelzellen zerfallen im Darmlumen und setzen auch dort Verdauungsenzyme frei (SILBERNAGL u.DESPOPOULOS 1991).
Der Dünndarm stellt mit einer sehr hohen Zellteilungsrate in den Krypten eines der dynamischsten Gewebe des Körpers dar. Dadurch erfolgt die Bildung von einem Gramm Darmgewebe (ca. 109 Zellen) innerhalb von 5 Tagen bei der Maus bzw. innerhalb von ca. 20 min beim Menschen (POTTEN 1992). Bei den in den Krypten kontinuierlich gebildeten Zellen handelt es sich um entero-endokrine Zellen, Paneth´sche Zellen, schleimbildende Drüsenzellen und Saumzellen oder Enterozyten (WRIGHT 1997). Die Enterozyten stellen mit 90 – 95 % den vorherrschenden Zelltyp des Darmepithels dar, die ihre Funktionsfähigkeit während ihrer Wanderung entlang der Darmzotte erhalten. Nach zwei bis fünf Tagen erreichen diese Zellen die Villusspitze und werden dort in das Darmlumen abgestoßen (FREEMAN 1995).
2.1.1 Proliferation, Differenzierung und Apoptose
Dieser Abstoßungsprozeß, die Apoptose, ist ein kontrollierter, natürlicher Prozess, der nach einer Überproduktion von Zellen stattfindet oder abläuft, wenn Zellen Schäden an ihrer Desoxyribonukleinsäure (DNA) aufweisen. Apoptose, der programmierte Zelltod (JANKOWSKI et al. 1994) dient auch dazu, einen Gleichgewichtszustand im Gewebe zu erhalten (POTTEN 1992), das einer hohen mechanischen und funktionellen Belastung z. B.
durch die Nahrung ausgesetzt ist. Der Zellverlust wird durch die Bereitstellung neuer, arbeitsfähiger Zellen ausgeglichen.
Die Lokalisationen der Zellneubildung (Proliferation), der Differenzierung und der Apoptose im Darmepithel sind streng voneinander getrennt (s. Abb. 1). Dieses Phänomen wurde bereits im Jahre 1888 von dem italienischen Wissenschaftler Bizarro beschrieben, bewiesen wurde die Hypothese jedoch erst 1948 (CREAMER 1967).
Abb. 1: Kompartimentierung der Zotten/Krypten-Einheit (modifiziert nach RIEKEN et al.
1989)
2. Differenzierungskompartiment (Differenzierung/Reifung)
1.
1. Proliferationskompartiment (Stammzellenmitosen) Darmzotte
3. Abstoßungszone (Verschleiß/Apoptose)
2.
3.
Die Regenerationsfähigkeit des Darmepithels basiert auf der Teilungsfähigkeit undifferenzierter Stammzellen endodermalen Ursprungs (WRIGHT 1997), die im unteren Kryptenbereich lokalisiert sind (POTTEN 1992). Erst nach weiteren 3-4 Teilungen der entstehenden Tochterzellen findet eine Differenzierung der neuen Zellen statt (WRIGHT 1997, JOHNSON u. MCCORMACK 1994). Durch die Ausbildung von funktionellen Elementen wie z. B. einen Mikrovillisaum (SMITH 1985) werden sie auf ihrer Wanderung in Richtung Zottenspitze (FREEMAN 1995) zur Sekretion von Verdauungsenzymen und zur Resorption befähigt. Diese spezialisierten Zellen, die Enterozyten, sind nicht mehr teilungsfähig (WRIGHT 1997). Der Differenzierung der Darmzellen folgt zwangsläufig der spätere Zellverlust durch Zelltod (Apoptose), der aber unter Gleichgewichtsbedingungen (steady- state) mit der Zellproliferation in der Krypte ausbalanciert wird (POTTEN 1995).
2.1.2 Postnatale Veränderungen des Dünndarmes
Die erste Phase nach der Geburt stellt eine besonders risikoreiche Periode dar.
Untersuchungen über die Häufigkeit von Ferkelverlusten zeigen, dass annähernd die Hälfte der Todesfälle in der ersten Lebenswoche auftreten (SVENDSEN 1992; BOLLWAHN 1982). Die Verlustrate wird unter anderem durch den Verlauf der Geburt, das Geburtsgewicht der Ferkel, die Umgebungstemperatur, die Kolostralmilchaufnahme, die Eisenversorgung sowie die Funktion des Verdauungstraktes beeinflußt (HUBER 1992).
Jungtiere werden sowohl zum Zeitpunkt der Geburt als auch beim Absetzen vom Muttertier mit einem mehr oder weniger abrupten Wechsel in der Zusammensetzung der zugeführten Nahrung konfrontiert. Vor der Geburt wird Fruchtwasser abgeschluckt, anschließend folgt die Milchaufnahme während der Säugeperiode, der sich mit dem Absetzen die feste Nahrungsaufnahme anschließt (BUDDINGTON 1994). Mit dem nach der Geburt stattfindenden Übergang von plazentärer zur intestinalen Nährstoffversorgung des Neugeborenen tritt der Gastrointestinaltrakt erstmals mit dem nährstoffreichen Kolostrum in Kontakt. Dies führt zu gravierenden morphologischen und funktionellen Veränderungen (XU 1996).
2.1.2.1 Morphologische Veränderungen
Untersuchungen von SMITH undJARVIS (1978) über die Zottenmorphologie des Dünndarmes von Ferkeln zeigen, dass in den ersten zehn Tagen post natum die Höhe und der Durchmesser der Darmzotten stark zunimmt. Während die Zotten beim Neugeborenen überwiegend die gleiche Länge aufweisen, scheint es neun Tage post natum zwei verschiedene Zottengenerationen zu geben: Es werden sowohl sehr lange Zotten (doppelte Länge im Vergleich zu Zotten neugeborener Ferkel) als auch sehr kurze Zotten gefunden. Die Autoren gehen davon aus, dass die ausgedehnten Villi sich aus den bereits bei der Geburt vorhandenen Zotten entwickeln, während die kurzen Zotten erst postnatal gebildet werden. Im Gegensatz dazu berichten PAUER et al.(1991), dass die Villi neugeborener Ferkel verschiedene Längen besitzen, während 2 Wochen alte Tiere über einheitlich geformte Darmzotten verfügen.
In den ersten Lebenstagen weist der Dünndarm säugender Ferkel im Vergleich zum Gesamtkörperwachstum das stärkste Wachstum, d.h. die höchste Zellproliferationsrate auf.
Die Erhöhung des Darmgewichtes pro Längeneinheit wird durch einen größeren Querschnitt des Darmkanals und den damit verbundenen höheren Proteingehalt bedingt. Im Gegensatz hierzu vermindert sich die relative Darmlänge bezogen auf die Körpermasse eines Tieres.
Diese Angaben beziehen sich auf einen Untersuchungszeitraum einer 30-tägigen Säugeperiode (TARVID et al.1994). Ähnliche Ergebnisse erzielten XU et al.(1992), die über eine Erhöhung des Darmgewichtes, Zunahme des Durchmessers des Darmes und der Darmlänge sowie der intestinalen Villushöhe und des Zottendiameters post natum berichten.
2.1.2.2 Funktionelle Veränderungen
Diese morphologischen Veränderungen am Darm haben Auswirkungen auf die Funktion des Gastrointestinaltraktes. Die Mukosa des Dünndarmes mit ihren Villi und Mikrovilli besteht aus den teilungsfähigen Kryptenzellen an der Zottenbasis und den für die Verdauung zuständigen Zellen entlang der Zotte, den differenzierten Enterozyten (FORTIN-MAGANA et al.
1970). Bestimmte Enzyme können unterschiedlichen Bereichen der Zotten-Krypteneinheit zugeordnet werden, d. h. diese Enzyme werden erst während der Wanderung der Enterozyten
entlang der Darmzotte gebildet und stellen somit Parameter für den Differenzierungs- oder den Proliferationszustand von Zellen des Dünndarmes dar (RAAB 1998). Die Thymidinkinase wird z. B. vorrangig im Bereich der Krypten gefunden und dient als Proliferationsmarker, während die Laktase ihr Aktivitätsmaximum in der Bürstensaummembran der mittleren Zottenabschnitte besitzt und die Differenzierung von Zellen charakterisiert (FORTIN-MAGANA
et al. 1970). Die von den Enterozyten gebildeten Aminopeptidasen und Dipeptidasen sind in der Bürstensaummembran oder aber im Zytoplasma der Zelle lokalisiert (CRANWELL 1995).
Die Leucinaminopeptidasen, eine der trivialen Bezeichnungen für Aminopeptidasen mit breiter Spezifität, sind im Zytoplasma der Enterozyten lokalisiert (SJÖSTRÖM u.NORÉN 1986).
Verschiedene Enzymaktivitäten im Dünndarm von Ferkeln wurden eingehend von JAMES et al. (1987) untersucht. In den ersten vier Lebenstagen ist die Aktivität der Maltase und der Saccharase in der Dünndarmmukosa gering (0,4 bzw. 0,1 µmol umgesetztes Substrat/h/mg Protein). Anschließend steigen die Werte bis zum 10. Tag post natum an, wobei das Enzym Saccharase im Vergleich zur Maltase eine höhere Aktivität aufweist. Im Gegensatz dazu verringert sich die Aktivität von Laktase in der Dünndarmschleimhaut im Verlaufe der Wachstumsentwicklung des Ferkels (KELLY et al.1991 c). Aus den Untersuchungen lässt sich ableiten, dass Ferkel, die ausschließlich mit Kolostralmilch, d. h. mit einem relativ hohen Anteil proliferations- und differenzierungsfördernder Substanzen gefüttert werden, eine deutliche Aktivitätsabnahme der Laktase aufweisen. Geringere Aktivitätsabnahmen werden bei Tieren festgestellt, die mit Milch der späteren Laktationsphase gefüttert wurden. Die genauen Regulationsmechanismen der Enzymsekretion sind noch nicht vollständig geklärt.
Vergleichbare Ergebnisse wurden in früheren Untersuchungen von MANNERS und STEVENS
(1972) erzielt. Sie bestimmten die Aktivität der Disaccaridasen Laktase und Saccharase bei neugeborenen Ferkeln bis hin zu ausgewachsenen Tieren. Trotz großer Variation in den Enzymaktivitäten zwischen den einzelnen Tieren konnten die Autoren zeigen, dass die Laktaseaktivität neugeborener Tiere hoch ist und ein Maximum in den vorderen Abschnitten des Dünndarmes aufweist. Innerhalb der ersten Lebenswoche nach der Geburt ist ein deutlicher Rückgang der Aktivität in den proximalen Dünndarmabschnitten zu verzeichnen.
Tiere im Altersbereich von ein bis vier Wochen zeigten erhebliche Variationen in der
oder mehrere Aktivitätsmaxima konnten im gesamten Dünndarm der untersuchten Tiere nachgewiesen werden, die sich hauptsächlich auf verschiedene Abschnitte des Jejunums erstreckten. Mit zunehmenden Alter trat weiterhin eine Aktivitätsabnahme auf, wobei Aktivitätsmaxima im proximalen Darmbereich zu finden waren. Die Saccharaseaktivität verhielt sich gegensätzlich und nahm mit dem Alter der Tiere zu.
Auch AUMAITRE undCORRING (1973) befassten sich mit der Entwicklung der Enzymaktivität bei Ferkeln, und zwar an Föten bis hin zu 8 Wochen alten Saugferkeln. Bei Föten (105.
Entwicklungstag) konnte sowohl Laktase- als auch Maltaseaktivität in der Dünndarmmukosa festgestellt werden, während eine Saccharaseaktivität erst in der ersten Woche post natum nachgewiesen werden konnte. Die spezifische Aktivität von Laktase (bezogen auf den Proteingehalt des Darmgewebes) zeigte ein Maximum in der ersten Woche post natum, in den nachfolgenden Wochen verminderte sich die Enzymaktivität. In der 2. Lebenswoche konnten die Autoren ein Maximum der spezifischen Aktivität von Maltase und Saccharase verzeichnen. Die Maltaseaktivität nahm von der 2.- 4. Lebenswoche ab, um anschließend wieder anzusteigen, während sich die spezifische Saccharaseaktivität bis zur 8. Lebenswoche kontinuierlich verringerte.
BUDDINGTON (1994) faßt die möglichen Ursachen für die postnatale Veränderung intestinaler Enzymaktivitäten wie folgt zusammen: Durch die Proliferation von Enterozyten nach der Geburt ist die Zahl funktionell unreifer Enterozyten erhöht, die noch nicht über funktionierende Hydrolasen verfügen. Außerdem führen Änderungen in der Expression von Genen zu Unterschieden in der Zusammensetzung und dem Vorkommen von Proteinen der Bürstensaumembran, welche die Bausteine der Enzyme darstellen. Ein weiterer Faktor, der die Zellfunktion beeinflußt, ist die jeweilige Aktivität der vorhandenen Proteine. Genetisch vorprogrammierte altersabhängige Veränderungen der intestinalen Morphologie und Funktion können zwar durch den Einfluß der aufgenommenen Nahrung verzögert, jedoch nicht verhindert werden.
2.1.3 Veränderungen in der Darmstruktur zum Zeitpunkt des Absetzens vom Muttertier
Das Absetzen führt zu deutlichen Veränderungen in der Struktur der Mukosa des Dünndarmes. Ergebnisse von HAMPSON (1986) und MILLER et al. (1986) zeigen, dass die Kryptentiefe nach dem Absetzen zunimmt, während bis zum 5. Tag nach dem Absetzen eine Verminderung der Zottenhöhe (Villusatrophie) um fast 50 % festzustellen ist. In den distalen Abschnitten des Dünndarmes erscheint die Kryptenvertiefung deutlicher(HAMPSON 1986). Im Gegensatz dazu werden im proximalen Dünndarm kürzere Darmzotten gefunden. Auch die Anzahl der Kryptenzellen pro Darmzotte erhöht sich signifikant am fünften Tag nach dem Absetzen.
Auch KELLY et al.(1991 b) berichten, dass das Absetzen zu einer weiteren Verkürzung der Zottenlänge und Vertiefung der Krypten führt. Die vor dem Absetzen fingerförmigen Zotten werden nach dem Absetzen in zungenförmige, gedrungenere Villi umgewandelt, wodurch sich deren Oberfläche und dadurch die Verdauungskapazität der intestinalen Mukosa verringert (CERA et al. 1988). Hierin sehen die Autoren eine mögliche Ursache für die Anfälligkeit frisch abgesetzter Ferkel, an enteralen Infektionen, Diarrhoe, Dehydratation oder Malabsorption zu erkranken.
Diese strukturellen Veränderungen resultieren in einer verminderten Absorptionsfläche und einer erhöhten Anzahl von unreifen Enterozyten. Auch HAMPSON (1986) vermutet, dass dieses Phänomen zu einer erhöhten Anfälligkeit der Ferkel für Diarrhöen und zum eventuell auftretenden Wachstumsrückstand in der Absetzphase beiträgt.
2.1.4 Regulation des Darmwachstums
Unter Wachstum versteht man sowohl die Vergrößerung von Zellen (Hypertrophie) als auch die Zunahme der Zellzahl (Hyperplasie). Die Teilung undifferenzierter Stammzellen führt zur Proliferation der gastrointestinalen Mukosa, d.h. zur Zunahme der Zellzahl. Anschließend
die Funktionsfähigkeit maturer Zellen erhalten und sich in ihrem Phänotyp unterscheiden können. Funktionen reifer Zellen sind beispielsweise die Absorption bestimmter Nährstoffe, Sekretionsvorgänge, Kontraktilität sowie die Reaktion auf bestimmte Signale (MCCORMACK
u. JOHNSON 1991). Die Zellen können von nun an ihre Aufgaben der Absorption und Verdauung erfüllen. An der Villusspitze werden die reifen Zellen im Mittel nach 3 Tagen in das Darmlumen abgestoßen, somit erneuert sich die Epithelschicht in kürzester Zeit (BARDOCZ 1993).
Das Epithel des Verdauungstraktes weist die höchste Zellturnover-Rate und Stoffwechselaktivität des Säugerorganismus auf (BARDOCZ 1993). Das Wachstum der intestinalen Mukosa wird durch verschiedene Faktoren stimuliert: Gastrointestinale Peptide (Gastrin, Secretin, Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), O´LOUGHLIN et al.1985), luminale Faktoren (Polyamine, Purine) und Hormone, die nicht gastrointestinalen Ursprungs sind, beeinflussen die Entwicklung der Mukosaauskleidung des Verdauungstraktes (ORTEGA et al.
1995; MCCORMACK u. JOHNSON 1991). Sie sind essentiell für die mukosale Proliferation (GINTY et al.1989) und die Differenzierung des Gastrointestinaltraktes (DUFOUR et al. 1988).
Gastrin fördert die Proliferation von Zellen der gastrointestinalen Mukosa, Secretin hemmt diesen Prozess (JOHNSON 1988). Auch EGF besitzt eine mitogene Wirkung. Untersuchungen an Zellkulturen (IEC-6-Zellen) zeigten, dass EGF die DNA-Synthese steigert (SIMMONS et al.
1995).
2.2 Biogene Amine
2.2.1 Chemische Struktur und Eigenschaften
Die Amine können als Derivate des Ammoniaks in primäre (R-NH2), sekundäre (R-NH-R) und tertiäre (R-NR-R) Amine eingeteilt werden (BEUTLING et al. 1996). Als niedermolekulare organische Basen besitzen sie die Struktur von aliphatischen, aromatischen bzw.
heterozyklischen Verbindungen. Sie werden im Stoffwechsel von Mensch, Tier, Pflanze und Mikroorganismen gebildet und metabolisiert (ASKAR u. TREPTOW 1986) und entstehen aus proteinogenen Aminosäuren durch Abspaltung der CO2-Gruppe (BEUTLING et al.1996):
R-CH(NH2)-COOH → R-CH2-NH2 + CO2
Die Reaktion erfordert das Vorhandensein von geeigneten Decarboxylasen. Diese sind meist substratspezifisch und können nur eine bestimmte Reaktion katalysieren. Darüber hinaus sind sie spezifisch für die L-Konfiguration der jeweiligen Aminosäure.
Anhand der Anzahl der im Molekül vorhandenen Aminogruppen werden Mono- und Polyamine unterschieden. Die biogenen Amine sind aufgrund der großen Zahl ihrer Reaktionsmöglichkeiten in vielfältiger Weise am Stoffwechsel lebender Zellen beteiligt (BEUTLING et al. 1996). Einige Verbindungen aus der Gruppe der biogenen Amine haben Bedeutung als Wachstumsfaktoren, wirken als Hormone oder sind für die Nukleinsäure- und Proteinsynthese notwendig. Teilweise sind sie für die Funktion des Nervensystems, die Regulation der Körpertemperatur, die Darmmotorik, die Aktivität des Gehirns und den Wach- Schlaf-Rhythmus wichtig (ASKAR u.TREPTOW 1986).
2.2.1.1 Monoamine
Fast alle Monoamine stammen von der Aminosäure Tyrosin bzw. deren Derivaten ab, wobei nur wenige der vorkommenden Monoamine von physiologischer Bedeutung sind.
Die Katecholamine Adrenalin und Noradrenalin zählen zu den wichtigsten Monoaminen, da sie die Funktion des Nervensystems regulieren. Sie werden ausschließlich endogen aus Tyrosin über Dioxyphenylalanin (DOPA) und Dopamin in den chromaffinen Zellen des Nebennierenmarkes und den sympathischen Nervenendigungen gebildet. Katecholamine sind in geringen Mengen in tierischem Eiweiß enthalten und werden nach der Aufnahme durch Verdauungs- oder aminabbauende Enzyme inaktiviert (BEUTLING et al.1996).
Andere Monoamine (Tyramin, Octopamin, β-Phenylethylamin) kommen häufig in größeren Mengen in der Nahrung vor und können enteral resorbiert werden. Dies kann deutliche Reaktionen im Organismus hervorrufen, wie z. B. lebensbedrohlichen Bluthochdruck, kreislaufbedingte Übelkeit und Schwindelgefühl, Diarrhoe und Kopfschmerzen (BEUTLING et al.1996).
Die basisch reagierenden Monoamine sind sehr hitzebeständig und werden deshalb auch bei der Zubereitung von Speisen nicht zerstört. Sie sind in einem weiten pH-Bereich von pH 5 bis pH 11 chemisch stabil und physiologisch wirksam. Monoamine sind gut resorbierbar und können Zellwände leicht passieren, mit Ausnahme der Blut-Hirn-Schranke. Diese wird allerdings bei sehr hohen Konzentrationen überschritten (BEUTLING et al.1996).
2.2.1.2 Polyamine
Zu den Polyaminen gehören sowohl die Indolabkömmlinge (Serotonin, Tryptamin) als auch die Imidazolderivate (Histamin) und die aliphatischen Amine mit zwei oder mehr Aminogruppen (z.B. Putrescin, Cadaverin, Spermidin, Spermin und Agmatin). Polyamine mit in Ringformen integrierten Aminogruppen sind weniger reaktiv als solche mit freien endständigen Aminogruppen. Die chemischen Strukturformeln einiger Amine sind in Abb. 2 dargestellt.
Cadaverin Putrescin
Spermidin Spermin
Histamin
Abb. 2: Chemische Strukturformeln einiger Amine (BEUTLING et al. 1996)
Die Resorbierbarkeit der Polyamine ist aufgrund ihrer Größe weniger gut als diejenige der Monoamine. Sie sind, ebenso wie die Monoamine, sehr hitze- (> 100 °C über mehrere Stunden) und pH-stabil.
Polyamine besitzen eine Schutzfunktion für Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA), indem sie mit den freien Phosphatgruppen von Nukleinsäuren
Temperaturen (TABOR u.TABOR 1984), Wassermangel und osmotischen Belastungen (SCHLEE
1992)) schützen. Das Gewebshormon Histamin liegt größtenteils an Eiweißstoffe gebunden vor und kann aufgrund seiner Aminogruppen in primärer, sekundärer und tertiärer Bindung als Monoamin und als Diamin reagieren. Es kommt in zwei stereoisomeren Formen vor und besitzt eine flexible Konfiguration. Seine Reaktionsmöglichkeiten sind daher sehr variabel (BEUTLING et al.1996).
Spermin und Spermidin konnten erstmals in Seminalplasma nachgewiesen werden, woher sich ihre Bezeichnung ableitet. Die Bezeichnung von Cadaverin und Putrescin stammt von ihrem typischen Verwesungsgeruch (BARDOCZ 1993). Sie werden bei der Eiweißzersetzung gebildet und wurden deshalb ursprünglich den „Ptoaminen“ (Leichengiften) zugeordnet.
Heute ist jedoch bekannt, dass es sich bei den auftretenden Giften um Bakterientoxine handelt (SCHEUER u.RÖDEL 1995).
Zu den in lebenden Zellen am häufigsten vorkommenden Polyaminen gehören Putrescin und Spermidin, während Spermin nicht in allen biologischen Materialien zu finden ist (TABOR u.
TABOR 1985). Während Prokaryonten hauptsächlich Putrescin und Spermidin synthetisieren, bilden Eukaryonten zusätzlich Spermin. Das Diamin Cadaverin wird fast auschließlich von Bakterien synthetisiert (BARDOCZ 1993).
Histamin wird hauptsächlich in der Granula von Mukosa- und Bindegewebemastzellen, basophilen Granulozyten und Histiozyten des Gastrointestinaltraktes gespeichert. Auch die Nervenendigungen des Zentralnervensystemes dienen als Histaminspeicher (MEJSTRIK 1996).
2.2.2 Polyamine in der Zelle
Für das Wachstum und die Differenzierung von Zellen sind Polyamine essentiell. Vielen Mikroorganismen und höheren Pflanzen ist es möglich, Putrescin aus Agmatin, das mit Hilfe des Enzyms Arginindecarboxylase aus Arginin entsteht, zu bilden. In den Zellen von Säugetieren kommt dieses Enzym nicht vor und Putrescin kann nur über die Decarboxylierung von Ornithin synthetisiert werden. Ornithin wird über das Plasma zur Verfügung gestellt, aber auch eine Synthese in der Zelle aus Arginin unter Einwirkung des
Enzyms Arginase ist möglich (PEGG u. MCCANN 1982). Cadaverin entsteht durch die Decarboxylierung von Lysin fast ausschließlich in Mikroorganismen und Pflanzen (BARDOCZ
1993).
Die endogene Polyaminsynthese in der Säugerzelle unterliegt differenzierten Regulationsmechanismen (MAUDSLEY 1979). Die Bildung erfolgt im Cytoplasma der Zelle (BARDOCZ 1993). Vier Enzyme sind für die Polyaminsynthese wichtig (s. Abb. 3). Es handelt sich hierbei um zwei Decarboxylasen und zwei Synthasen. Das Enzym Ornithindecarboxylase (ODC) leitet den ersten Schritt, die Decarboxylierung der Aminosäure Ornithin ein, wobei Putrescin entsteht. Die ODC besitzt eine sehr kurze Halbwertszeit von 10-20 Minuten (IWAMI
et al.1990) und fungiert als limitierender Faktor in der Polyaminsynthese. Werden Zellen zur Proliferation angeregt, steigt die ODC-Aktivität stark an. So besitzen z.B. Tumorzellen durch eine hohe Aktivität der Ornithindecarboxylase eine sehr hohe Synthesekapazität für Polyamine (BARDOCZ 1993). In der Mukosa des Rattendünndarmes ist die ODC vorrangig in den differenzierten Villusenterozyten lokalisiert, nicht jedoch in den Kryptenzellen (FITZPATRICK et al. 1986). Beim abgesetzen Ferkel besitzen die differenzierten Villusenterozyten nur eine geringe ODC-Aktivität, im Gegensatz zu neugeborenen Ferkeln, bei denen die ODC-Aktivität um ein Vielfaches höher ist (M´RABET-TOUIL et al. 1995;
BLACHIER et al. 1992). Durch verschiedene Stimuli (Geweberegeneration, Hormone, Medikamente, Wachstumsfaktoren) ist das Enzym ODC sehr schnell induzierbar (SEIDEL
1986; MAUDSLEY 1979).
Als weiterer Syntheseschritt wird aus S-Adenosylmethionin durch Einwirkung der S- Adenosyl-L-Methionin-Decarboxylase eine Propylamingruppe freigesetzt. Durch die Anlagerung dieser Propylamingruppe an Putrescin mit Hilfe der Spermidinsynthase entsteht Spermidin. Eine weitere Propylaminanlagerung an Spermidin mittels der Sperminsynthase führt zur Bildung von Spermin. Auch eine Rückwandlung von Spermin zu Spermidin und von Spermidin zu Putrescin ist möglich. Hierfür sind die Enzyme Spermidin-N-Acetyltransferase und die Polyaminoxidase notwendig.
Abb. 3: Biosynthese von Polyaminen (nach MAUDSLEY 1979)
Verschiedene Substanzen hemmen die Synthese von Polyaminen. So hemmt beispielsweise α-Difluoromethylornithin (DFMO) das Enzym ODC (PEGG u. MCCANN 1982). Darüber hinaus besteht eine negative Rückkopplung zwischen hohen Putrescinkonzentrationen und der ODC-Aktivität (IWAMI et al. 1990). Weitere Inhibitoren hemmen verschiedene Enzyme (S-Adenosyl-L-Methionin-Decarboxylase, Spermidin-Synthase, Spermin-Synthase), die an der Biosynthese der Polyamine beteiligt sind (PEGG u.MCCANN 1982).
Obwohl jede Zelle von Säugetieren die Fähigkeit zur Polyaminsynthese besitzt, ist ein kontinuierliches Angebot an Polyaminen durch die Nahrung nötig, falls der Bedarf durch die Biosynthese nicht gedeckt werden kann (BARDOCZ 1993).
Putrescin
NH2(CH2)4 NH2
Propylamingruppe
(CH2)3 NH2
Spermidin
NH2(CH2)4 NH(CH2)3 NH2
Spermin
NH2(CH2)3 NH(CH2)4 NH(CH2)3 NH2
Ornithin- Decarboxylase
S-Adenosyl-L-Methionin- Decarboxylase
Spermidin-Synthase
Spermin-Synthase
Ornithin S-Adenosylmethionin
2.2.2.1 Polyamintransportsysteme in Zellen
Transportsysteme für Polyamine sind in vielen Zellen vorhanden (PEGG u.MCCANN 1982).
Sie dienen sowohl der Aufnahme von Polyaminen als auch ihrer Exkretion.
Wachstumsfaktoren, Hormone und die Hemmung der intrazellulären Polyaminsynthese können eine vermehrte Aufnahme aus dem Extrazellulärraum bedingen. Zellen in der Ruhephase nehmen im Gegensatz zu proliferierenden Zellen weniger Polyamine auf (MORGAN 1990).
Zum Transport von Polyaminen wird Energie benötigt. Der Vorgang verläuft temperaturabhängig, ist sättigbar und kann auch entgegen einem Konzentrationsgefälle stattfinden (MORGAN 1990). Eine Beteiligung von unterschiedlichen Transportsystemen wurde festgestellt, wobei ein gemeinsamer Carrier für Spermidin und Spermin vorliegt (SEILER u. DEZEURE 1990). Die Putrescinaufnahme unterliegt einem davon unabhängigen Carrier (KUMAGAI et al.1989).
2.2.2.2 Abbau von Aminen
Es bestehen unterschiedliche Möglichkeiten zum Abbau von Aminen zu physiologisch unwirksamen Verbindungen, wobei die Oxidation zu Carbonsäuren vorherrschend ist und durch Aminoxidasen katalysiert wird (BEUTLING et al.1996).
Die Monoaminoxidasen (MAO) oxidieren annähernd alle biogenen Amine und einfache aliphatische Amine (ASKAR u. TREPTOW 1986). Diaminoxidasen bauen Diamine und Polyamine ab, Polyaminoxidasen (BEUTLING et al.1996) oxidieren Polyamine. Aminoxidasen kommen beispielsweise in der Leber, Lunge, Niere, Haut, Placenta und besonders in der Dünndarmmukosa vor. Somit stellen sie eine körpereigene Kontrolleinrichtung zur Regulation biogener Amine (wie z.B. Adrenalin und Serotonin) und exogen zugeführter Amine dar (ASKAR u.TREPTOW 1986).
Der Aminoxidation liegt folgende Reaktion zugrunde:
R-CH2-NH2 + H2O + O2 → R-CHO + H2O2 + NH3
Amine können daher als N-Donatoren im Stoffwechsel fungieren.
Des Weiteren sind N- und O-Methylierung, N-Acetylierung, Hydroxylierung und oxidative Decarboxylierung bekannt. Es ist nicht genau geklärt, wodurch die jeweiligen Abbauvorgänge eingeleitet werden (BEUTLING et al.1996).
2.2.3 Aminresorption aus Nahrungsstoffen
Der Säugerorganismus verfügt über Regelmechanismen zur Aufnahme von Stoffen in Zellen und Gewebe und für den Stoffaustausch zwischen Gewebe, Blut und lebenswichtigen Organsystemen. Amine werden aus der Nahrung in Abhängigkeit von physikalischen Einflüssen und anderen Inhaltsstoffen resorbiert. Des Weiteren spielt die zeitgleiche Aufnahme adsorbierender Nahrungsbestandteile und die Muzinbildung im Verdauungstrakt eine entscheidende Rolle. Die Resorptionsraten sind daher nicht nur aminspezifisch, sondern von einer Vielzahl von Faktoren abhängig (BEUTLING et al.1996).
Von den enteral aufgenommenen Polyaminen wird Putrescin zu 80 % mittels der Diaminoxidase metabolisiert und hauptsächlich zu Aminosäuren abgebaut, während Spermidin und Spermin zu 75 % in ihrer ursprünglichen Form verbleiben (BARDOCZ 1995).
Da diese beiden Substanzen für die weitere Nutzung im Organismus unverändert vorliegen und vorrangig absorbiert werden, liegt die Vermutung nahe, dass sie von größerer physiologischer Bedeutung sind, im Gegensatz zu Putrescin, welches rasch abgebaut wird (BARDOCZ 1993).
2.2.4 Aminbildung in Mikroorganismen
Bereits in den 40er Jahren des 20. Jahrhunderts wurde die Aminbildung durch Mikroben genauer untersucht. Besonders die Histaminbildung fand aufgrund zahlreicher nahrungsbedingter Intoxikationen Beachtung. Die Enterobacteriaceae stellen die größte und artenreichste Gruppe der Histaminbildner dar. Enterokokken, Pediokokken und Laktobazillen stellen die Hauptvertreter der tyraminbildenden Mikroorganismen dar. Tryptamin konnte bei Bazillen und Clostridien nachgewiesen werden.
Auch Spermidin, Putrescin, Cadaverin und Octopamin können bakterieller Herkunft sein (BEUTLING 1996).
2.2.5 Amine in Lebensmitteln tierischer und pflanzlicher Herkunft sowie Milch verschiedener Spezies
Alle vorkommenden Polyamine können in Lebensmitteln enthalten sein (BEUTLING et al.
1996), wobei vor allem das Histamin als Ursache von Lebensmittelintoxikationen eine bedeutende Rolle spielt (ASKAR u.TREPTOW 1986). Mit einem vermehrten Vorkommen von biogenen Aminen ist in solchen Lebensmitteln zu rechnen, in denen biochemische und mikrobielle Eiweißveränderungen stattgefunden haben. Vor allem verdorbene Lebensmittel weisen größere Mengen an biogenen Aminen auf, was in der Qualitätskontrolle von Lebensmitteln berücksichtigt wird.
Eine Gefahr für den Menschen stellen biogene Amine in Lebensmitteln nur dann dar, wenn sie in erhöhter Konzentration vorkommen und dadurch die körpereigenen Kontrollmechanismen überlastet werden bzw. wenn die Kontrollfunktionen gegen Amine insuffizient sind.
In Nahrungsmitteln, denen Nitrit zugesetzt wurde oder in denen Nitrit gebildet werden kann (z.B. Pökelware), müssen Amine auch hinsichtlich der Bildung von karzinogenen
Histamin ist in frischen Fischen und Meerestieren nur in geringen Mengen enthalten, während in Fischprodukten, z.B. aus Makrelen, Hering und Thunfisch, höhere Konzentrationen an Histamin enthalten sein können (ASKAR 1984). Die Bildung von biogenen Aminen, hier insbesondere Histamin, ist auf eine bakterielle Decarboxylierung von Aminosäuren (Histidin) zurückzuführen (ASKAR 1994). Es besteht ein Zusammenhang zwischen dem Frischegrad von Fischen, der Verarbeitung und der damit einhergehenden mikrobiellen Kontamination, und dem Histamingehalt. Aufgrund dieses Zusammenhanges erstellte KARMAS (1981) einen Index (BAI = Biogenic Amine Index) zur Bestimmung des Verderbnisgrades von Fisch:
Histamin + Putrescin + Cadaverin Biogenic Amine Index (BAI) =
1 + Spermin + Spermidin
Er konnte nachweisen, dass Veränderungen der Amingehalte im Verlauf des Verderbs von Thunfisch auftreten. Während es zu einer Zunahme von Cadaverin, Histamin und Putrescin kommt, sinken die Gehalte an Spermidin und Spermin. Ein BAI-Wert >10 deutet auf eine mindere Qualität hin (ASKAR u.TREPTOW 1986). In fortgeschrittenem Fäulnisstadium besteht die Möglichkeit, dass der Gehalt an biogenen Aminen wieder abnimmt, obwohl eine hohe Keimbelastung vorherrscht. Dieses Phänomen kann durch aminabbauende Mikroorganismen erklärt werden (BEUTLING 1987).
Frischfleisch enthält Spermin (BLACHIER 1991), ist aber im Gegensatz zu Fleischerzeugnissen arm an biogenen Aminen. Auch in Weinen, Bier, Sauerkraut, Früchten und Gemüsen sind Amine in den unterschiedlichsten Mengen enthalten (ASKAR et al. 1996). Früchte, Gemüse, die kein Chlorophyll enthalten, sowie Käse stellen die Hauptquelle für Putrescin dar.
Spermidin ist vor allem in chlorophyllhaltigem Gemüse enthalten (BLACHIER 1991).
Auch in Milch und ihren Verarbeitungsprodukten sind Amine nachweisbar. Während der Reifung von Käse entstehen aus freien Aminosäuren durch die Wirkung mikrobieller
Decarboxylasen biogene Amine wie Tyramin, Tryptamin, Phenylethylamin, Cadaverin und Putrescin. Die Gehalte steigen mit dem Alter des Käses an (ASKAR u.TREPTOW 1986).
Untersuchungen zum Amingehalt in Kuh- (MOTYL et al.1995; SANGUANSERMSRI 1974) und Sauenmilch zeigten, dass Spermin mit Konzentrationen von 5,16 µmol/l in der 5.
Laktationswoche bis zu 21,6 µmol/l in der 1. Laktationswoche das vorherrschende Polyamin in der Sauenmilch ist (MOTYL et al. 1995). In Kuhmilch hingegen lagen die Werte für Spermidin in den meisten Fällen über der Sperminkonzentration. Frühere Untersuchungen (KELLY et al. 1991 a) über die Aminkonzentrationen in Sauenmilch der 1. bis 8.
Laktationswoche führten zu der Aussage, dass sich der Spermidingehalt in den ersten 3-4 Laktationswochen konstant verhält und dann bis zur 7. Woche auf die vierfache Konzentration (~ 20 µmol/l) ansteigt. Spermin und Putrescin konnten in diesen Milchproben nicht nachgewiesen werden. Frauenmilch enthält hauptsächlich Spermidin und Spermin, die Putrescinkonzentrationen sind jedoch deutlich geringer als die Spermidin- und Sperminkonzentrationen. Auch Rattenmilch enthält ähnlich hohe Putrescin- und Sperminkonzentrationen wie Frauenmilch, während der Spermidingehalt um ein Vielfaches höher ist (POLLAK et al.1992). Der signifikante Anstieg der Aminkonzentration in der ersten Woche post partum beim Menschen könnte ein Hinweis auf die biologische Wichtigkeit der Polyamine für das Neugeborene sein. Auch bei anderen Spezies kann dieses Phänomen beobachtet werden. So geht beispielsweise die Zunahme des Spermidingehaltes der Sauenmilch mit einer Erhöhung des mukosalen RNA-Gehaltes, höheren intestinalen Spermidinkonzentrationen und einer verstärkten Aktivität der Disaccharidase Maltase beim Ferkel einher (BUTS et al.1995).
2.2.6 Intoxikationen durch biogene Amine
Histamin steht an erster Stelle bei Lebensmittelintoxikationen durch Amine. Durch die Aufnahme histaminhaltiger Nahrungsmittel kann bereits nach kurzer Inkubationszeit von 30 Minuten eine Histaminintoxikation auftreten. Die Symptome sind sehr variabel, wobei sowohl Übelkeit, Erbrechen, Kopfschmerzen, Hautrötung, Durchfall als auch Störungen des
Erkrankungsbild wird am häufigsten durch Fisch und Fischerzeugnisse ausgelöst und wird deshalb auch als „Scombroid fish poisoning“ bezeichnet (BEUTLING 1996).
Durch die Aufnahme von Tyramin können ebenfalls Blutdruckkrisen entstehen. Da die toxische Dosis mit 25-250 mg jedoch relativ hoch liegt, wird es von gesunden Menschen meist gut vertragen (BEUTLING 1996). Auch andere Amine wie Cadaverin, Tryptamin und Ethylamin u. a. können Störungen verursachen, sie scheinen aber weniger toxisch zu sein (ASKAR u. TREPTOW 1986). Ihnen kommt jedoch Bedeutung zu, wenn sie gemeinsam mit anderen Aminen auftreten und deren Wirkung verstärken. Putrescin und Cadaverin beispielsweise hemmen den Abbau von Histamin und können damit seine negative Wirkung steigern (BEUTLING 1996).
2.2.7 Physiologische Effekte der Amine
2.2.7.1 Exogene Aminzufuhr und Amine aus de novo Synthese
Alle Organe eines Organismus benötigen Polyamine für das Wachstum, die Erneuerung von Zellen und ihren Stoffwechsel. Lange Zeit wurde angenommen, dass Zellen ihren Polyaminbedarf durch die Eigensynthese abdecken. Die Konzentrationen von Polyaminen in Körperflüssigkeiten befinden sich im Bereich von pmol/ml und sind somit sehr gering. Nur die Samenflüssigkeit ist reich an Polyaminen. Heute ist bekannt, dass Polyamine exogener Herkunft somit von großer Bedeutung für den Organismus sind (BARDOCZ 1993).
Je nach Herkunft werden Polyamine exogenen Ursprungs und aus de novo Synthese unterschieden. Exogene Quellen stellen die Nahrung, das Blut, exokrines Pankreassekret (BUTS et al.1995; OSBORNE u.SEIDEL 1990) und die Mikroorganismen des Darmtraktes dar (BLACHIER 1991). Außerdem können bei der Lyse abgeschilferter Enterozyten Polyamine freigesetzt werden (MCCORMACK u.JOHNSON 1991). Folglich kann der Polyaminpool in der Darmzelle einerseits durch exogene Polyamine aus dem Darmlumen (apikal) und andererseits über die basolaterale Membran aus dem zirkulierenden Blut (basolateral) aufgefüllt werden (BARDOCZ 1993). Für die Homöostasis des Polyaminhaushaltes muss der Organismus seinen Polyaminbedarf durch Absorption aus dem Darmlumen decken (BARDOCZ 1993).
Nach M´RABET et al.(1995) stellen exogene Polyamine bei Ferkeln die Hauptquelle für den intrazellulären Polyaminpool von Enterozyten dar. Ihren Untersuchungen zufolge unterliegt die Aufnahme von Polyaminen in die Darmzelle (apikal und basolateral) folgender Hierarchie: Es dominiert die Resorption von Spermin, es folgt Spermidin und an letzter Stelle steht die Putrescinaufnahme. Dies entspricht auch dem Muster der intrazellulären Polyaminkonzentrationen dieser Amine.
Positiv geladene Metallionen wie Mg2+ oder Ca2+ können die Wirkung von Polyaminen in nicht-spezifischen Reaktionen ersetzen. Andere Funktionen sind für die Polyamine spezifisch und können durch andere Polykationen nicht hervorgerufen werden. Deshalb sind Polyamine für das Wachstum und die Proliferation von Zellen essentiell (BARDOCZ 1993).
2.2.7.2 Polyamine und ihre Effekte am Darm
Die Wirkung von Polyaminen am Intestinaltrakt wurde sowohl an säugenden als auch bei abgesetzten Tieren untersucht. Bei Neonaten spielen Polyamine eine wichtige Rolle in der Entwicklung des Intestinaltraktes. In der Literatur existieren mehrere Studien über die Effekte einer exogenen Polyaminzufuhr, diese Untersuchungen wurden größtenteils in vivo an Ratten oder in vitro durchgeführt.
Untersuchungen in vivo:
Die Polyaminsynthese ist essentiell für den Zellturnover der intestinalen Mukosa. Wird die Aktivität der ODC durch DFMO gehemmt, sinkt der DNA-, RNA- und Proteingehalt in der Mukosa des Jejunums und Ileums von Ratten stark ab. Exogenes Spermin und Spermidin können dies jedoch verhindern, indem sie intrazellulär gebildete Amine ersetzen (WANG et al.
1991).
DUFOUR et al. (1988) befaßten sich mit der Wirkung einer Spermin- bzw.
Spermidinapplikation bei 15 Tage alten Ratten. Die Ergebnisse zeigten, dass die Aktivität der Bürstensaummembranenzyme Maltase und Saccharase in beiden Fällen anstieg, während die Laktaseaktivität abnahm. Auch die Morphologie des Intestinums deutete auf einen
Unreife noch supranucleäre Vakuolen auf, die im Falle der polyaminbehandelten Tiere nicht mehr vorhanden waren. Vergleichbare Ergebnisse stammen von WILD et al. (1993), die in ihren Untersuchungen über eine Sperminverabreichung an junge Ratten ebenfalls eine Veränderung der intestinalen Enzymaktivitäten nachweisen konnten, die mehr dem Enzymmuster adulter Tiere entsprachen.
Ähnliche Beobachtungen wurden von KAOUASS et al. (1996) mitgeteilt. Eine orale Sperminapplikation bei säugenden Rattenjungtieren führte zur Veränderung morphologischer und biochemischer Parameter im Dünndarm. An der Villusspitze trat vermehrt eine Zellabschilferung auf, während der intestinale DNA- und Proteingehalt sank. Dies führte dazu, dass der DNA- und Proteingehalt sowie die Disaccharidaseaktivität im Chymus erhöht waren. Nur wenige Stunden nach der Sperminapplikation kam es zu einer Verminderung der Laktaseaktivität im Jejunum und Ileum, während die Aktivität der Enzyme Maltase und Saccharase anstieg.
Auch BUTS et al. (1993) analysierten die Wirkung von oral zugeführtem Spermin auf die Entwicklung des Dünndarmes bei 2 Wochen alten, säugenden Ratten. Spermin in einer Dosis
>1 µmol/d bedingte einen Anstieg der Maltase, Saccharase und einer Aminopeptidase in den Enterozyten, während eine frühzeitige Abnahme der Laktaseaktivität zu beobachten war.
Über eine dosisabhängige Korrelation zwischen einer Spermingabe und der intestinalen Disaccharidaseaktivität berichten auch HARADA et al. (1994). Bei Rattenjungtieren trat eine Verminderung der Laktaseaktivität bei gleichzeitigem Anstieg der Maltaseaktivität auf. Auch die Absorption von exogen zugesetztem bovinen IgG war bei den sperminbehandelten Tieren vermindert, was für eine frühzeitige Ausbildung der Barrierefunktion des Darmes spricht.
Weitere Ergebnisse von CAPANO et al. (1994) belegen, dass an Ratten verabreichtes Spermidin die Aktivität des Enzyms Saccharase erhöht und zu morphologischen Veränderungen im distalen Dünndarm, wie z.B. das Verschwinden supranukleärer Vakuolen, führt.
DORHOUT et al. (1997) befaßten sich mit der Verteilung von oral zugeführten, radioaktiv markierten Polyaminen im Organismus. Die Ergebnisse zeigen, dass Polyamine nicht nur im
Darm, sondern auch in sämtlichen untersuchten Organen (Herz, Leber, Milz, Gehirn) nachzuweisen waren. SEIDEL et al. (1985) infundierten Putrescin in das Lumen des Ileums von Ratten, wodurch in diesem Darmabschnitt lokal begrenztes verstärktes Mukosawachstum auftrat. Die Autoren stellten jedoch keine Veränderung im Polyamingehalt der proliferierten Mukosa fest und werteten dieses als ein Indiz für die empfindliche Regulation der Polyaminkonzentration innerhalb der Zelle.
In einem Versuchsansatz mit Ratten erfassten NOACK et al. (1996) die Auswirkungen einer polyaminarmen und einer polyaminreichen Diät auf den endogenen Polyamingehalt und die mikrobielle Polyaminsynthese im Intestinaltrakt. Demnach ist Putrescin das am stärksten endogen gebildete Polyamin des Colongewebes, unabhängig von dem Polyamingehalt der Nahrung. Bei Ratten, die über einen keimfreien Intestinaltrakt verfügten, war Putrescin das vorherrschende Polyamin in den Faeces. Unabhängig vom Polyamingehalt der Nahrung wurden hohe Spermidinkonzentrationen im Darminhalt konventioneller Ratten nachgewiesen.
Die Autoren gehen davon aus, dass es sich hierbei hauptsächlich um mikrobiell gebildetes Spermidin handelt.
Untersuchungen über die Wirkung von Streß bei Ratten zeigten, dass aufgrund einer Streßbelastung Schädigungen der intestinalen Mukosa auftreten und ein Anstieg der ODC zu verzeichnen ist (WANG u. JOHNSON 1989). Wird die endogene Polyaminsynthese durch DFMO gehemmt, fördert exogenes Spermin und Spermidin die Heilung solcher Mikroulzerationen mehr als Putrescin (WANG u. JOHNSON 1992). Auch hier wird deutlich, dass exogene Polyamine die endogen gebildeten Polyamine ersetzen können.
Der Einfluß von Polyaminen aus der Nahrung bzw. mikrobiellen oder intrazellulären Ursprungs auf intestinale Funktionen wurde ebenfalls eingehend von DELOYER et al. (1996) untersucht. Die Autoren testeten sowohl den Einfluß einer Polyaminrestriktion in der Nahrung als auch die Wirkung verschiedener Inhibitoren der Polyaminsynthese. Die Ergebnisse zeigten, dass der Entzug mikrobieller Polyamine bzw. von Polyaminen aus der Nahrung nur in Verbindung mit dem Einsatz von Syntheseinhibitoren zu deutlichen Veränderungen intestinaler Funktionen führt.OSBORNE undSEIDEL (1990) gelang es, anhand
Luminales Putrescin gelangte aus dem Colon über die Blutbahn in die Leber sowie in die Bauchspeicheldrüse und wurde von dort mit der Galle und dem Pankreassekret wieder in das Duodenum sezerniert. Dies lässt vermuten, dass die im proximalen Dünndarm nachweisbaren Polyamine hauptsächlich von der Mikroflora des Dickdarmes gebildet wurden und über den enterohepatischen Kreislauf die proximalen Darmabschnitte erreichten. Die geringe Aktivität der ODC in den proximalen Dünndarmabschnitten unterstützt diese Vermutung.
Untersuchungen in vitro:
Der Einfluß von exogen zugeführtem Putrescin auf Darmepithelzellkulturen wurde von GINTY et al.(1989) untersucht. Die Autoren stellten fest, dass Putrescin die DNA-, RNA- und Proteinsynthese in der Zellkultur steigert.
Der Polyamingehalt isolierter Enterozyten neugeborener Ferkel wurde von BLACHIER et al.
(1992) erfaßt. Spermin war hierbei das vorherrschende Amin. Die Aktivität der ODC lag zum Zeitpunkt der Geburt deutlich höher als am Tag 2 post natum. Entgegen den Erwartungen wurde bei Ferkeln trotz der in dieser Phase typisch hohen Wachstumsrate der Mukosa keine gesteigerte ODC-Aktivität festgestellt. Die Vermutung, dass die ODC-Enzymaktivität aufgrund eines vermehrten Angebotes an exogenen Polyaminen durch die Aufnahme der Sauenmilch mit Beginn des Säugens absinkt, hat sich durch Untersuchungen an Tieren, denen nach der Geburt keine Nahrung angeboten wurde, nicht bestätigt. Trotzdem scheint die Hauptfraktion der Polyamine in den Enterozyten externen Ursprungs zu sein und wird nicht durch de novo Synthese gebildet.
JOHNSON et al. (1995) konnten nachweisen, dass die Hemmung der intestinalen Polyaminsynthese durch DFMO die maximale Transportrate von D-Glucose in Enterozyten von Kaninchen vermindert. Die gleichzeitige orale Verabreichung von Putrescin, Spermidin oder Spermin hemmt diesen Effekt und unterstützt somit die Vermutung, dass exogene Polyamine solche aus einer de novo Synthese in der Zelle ersetzen können.
2.3 Purin- und Pyrimidinnukleotide
Nukleotide sind Bausteine der Ribonukleinsäure (RNA) und Desoxyribonukleinsäure (DNA) und deshalb essentiell für Zellen, die sich in Teilung befinden. Wie auch die Polyamine stellen sie wichtige Metabolite für Zellen dar und sind in vielfältiger Weise in strukturelle, metabolische, energetische und regulatorische Funktionen eingebunden, wie z.B. als Co- Faktoren von Enzymen oder als Energieträger (RUDOLPH 1994 a).
2.3.1 Struktur der Nukleotide
Nukleotide bestehen aus einer stickstoffhaltigen heterocyklischen Purin- oder Pyrimidinbase, einer Pentose (D-Ribose oder 2´-Desoxyribose) und anorganischem Phosphat. Verbindungen, die nur aus einer Purin- oder Pyrimidinbase und einer Pentose bestehen, werden als Nukleoside bezeichnet. Nukleoside mit einem Phosphatrest werden als Mononukleotide (Nukleosidmonophosphat), solche mit zwei oder drei Phosphatresten als Nukleosiddi- bzw.
triphosphat definiert (BUDDECKE 1989). Nukleotide, die D-Ribose enthalten, dienen als Baustein der RNA. Für die Synthese der DNA werden Nukleotide mit 2´-Desoxyribose verwendet. Zu den Purinbasen gehören Adenin, Guanin, Hypoxanthin und Xanthin, während Thymin, Cytosin und Uracil den Pyrimidinbasen zugeordnet werden (RUDOLPH 1994 a).
2.3.2 Biosynthese der Nukleotide
Es bestehen zwei Möglichkeiten der Biosynthese von Nukleotiden (LELEIKO u.WALSH 1995):
- De novo Synthese, hauptsächlich aus den Vorstufen Glutamin, Glycin und Phosphoribosylpyrophosphat (PRPP).
- „Salvage pathway“, wobei entweder Nukleoside oder Basen aus bereits in der Zelle vorhanden Nukleotiden, oder aber aus Nukleotiden, die in der Nahrung enthalten sind, für
