Methoden zur Vorsäulenderivatisierung

2.4.2.1.1 Vorsäulenderivatisierung mit 9-Fluorenylmethylchloroformiat (FMOC-Cl) CARPINO und HAN (1972) verwendeten FMOC-Cl ursprünglich zum Schutz von Aminogruppen bei der Synthese von Peptiden. Im Jahr 1983 setzten EINARSSON et al.(1983) FMOC-Cl erstmals zur Analyse von Aminosäuren ein.

9-Fluorenylmethylchloroformiat reagiert schnell und vollständig sowohl mit primären als auch mit sekundären Aminogruppen zu stabilen, fluoreszierenden Carbamaten. Die Reaktion, bei der HCl abgespalten wird, läuft im leicht alkalischen Milieu innerhalb von 30 Sekunden bis drei Minuten ab (KIRSCHBAUM u.LUCKAS 1994; GUSTAVSSON u.BETNÉR 1990; BETNÉR u.

FÖLDI 1986). HARDUF et al. (1988) und BETNÉR und FÖLDI (1988) berichten über die gute Stabilität der entstehenden Derivate. Auch EINARSSON et al. (1983) zeigten, dass die Derivatisierungsprodukte von zwanzig untersuchten Aminosäuren eine hohe Stabilität aufweisen, mit Ausnahme des Derivatisierungsproduktes von Histidin. Des Weiteren ist die hohe Empfindlichkeit der Methode mit einer Nachweisgrenze im femtomolaren Bereich von großem Vorteil (GUSTAVSSON u.BETNÉR 1990; BETNÉR u.FÖLDI 1988; COHEN u.STRYDOM

1988; EINARSSON et al.1983). Deshalb ist diese Reaktion gut für die Vorsäulenderivatisierung von Aminoverbindungen geeignet (KIRSCHBAUM 1995).

Im Gegensatz zu ortho-Phtaldialdehyd (OPA) und Dansylchlorid ist FMOC-Cl selbst fluoreszierend. Um eine quantitative Reaktion zu ermöglichen, muss es im Überschuß eingesetzt werden (BETNÉR u. FÖLDI 1988). Überschüssiges FMOC-Cl und fluoreszierende Nebenprodukte dürfen die Analyse der fluoreszierenden Aminderivate nicht durch Koelution stören. Da jedoch die derivatisierten Aminosäuren und das FMOC-Cl-Reagenz annähernd übereinstimmende Excitations- und Emissionsspektren sowie auch übereinstimmende Retentionszeiten aufweisen (GUSTAVSSON u.BETNÉR 1990), muss das unverbrauchte FMOC-Cl nach dem Derivatisierungsvorgang wieder entfernt werden (FÜRST et al.1990; COHEN u.

STRYDOM 1988; SCHUSTER 1988). Die Extraktion des Überschusses mit Pentan (EINARSSON et al.1983) zeigte keine ausreichende Reproduzierbarkeit (HAYNES et al.1991 b; GUSTAVSON u.

BETNÉR 1990), da hydrophobe Aminosäuren zu einem großen Anteil mitextrahiert werden.

Andere Autoren (BETNÉR u. FÖLDI 1988) versuchten, den FMOC-CL-Überschuß mit 1-Aminoadamantan (ADAM) zu entfernen, indem es nach der Aminosäurenderivatisierung dem Derivatisierungsansatz zugegeben wird. Das hierbei entstehende Derivat eluiert deutlich nach den derivatisierten Aminosäuren und stört daher deren Bestimmung nicht. HAYNES et al.

(1991 a) beschrieb eine Methode zur Analyse von Aminosäuren, bei der eine Extraktion von überschüssigem FMOC-Cl nach dem Derivatisierungsvorgang nicht notwendig ist.

Bei der Untersuchung von Aminen in Lebensmitteln wurde FMOC-Cl ebenfalls angewendet (SCHEUER u. RÖDEL 1995; KIRSCHBAUM et al. 1994), wobei HARDUF et al. (1988) eine Reaktion von Histamin mit FMOC-Cl weder in Fleischextrakten, denen Histamin zugesetzt wurde, noch in Standard-Lösungen nachweisen konnte. Verschiedene Aminoverbindungen (Diaminohexan, Diaminoheptan, Diaminooktan, Diaminononan, Heptylamin und Methylamin) wurden von KIRSCHBAUM (1995) hinsichtlich ihrer Eignung zur Entfernung des FMOC-Cl-Überschusses untersucht. Die besten Resultate lieferte die Verwendung von Heptylamin, da hierbei keinerlei Koelution mit den FMOC-Derivaten der untersuchten biogenen Amine auftrat. MAIER-ROSENKRANZ (1995) setzte die polare Aminosäure Glycin zur Entfernung des FMOC-Cl-Überschusses ein, da diese wesentlich früher als die Aminderivate eluiert. Glycin wird auch in der Methode vonPIETRZAK (1997) zur Bestimmung von Aminen in Kot- und Chymusproben von Hunden angewendet, welche die Grundlage der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Aminanalytik darstellt.

2.4.2.1.2 Vorsäulenderivatisierung mit 5-Dimethylaminonaphthalin-1-sulfonylchlorid (Dansyl-Cl)

5-Dimethylaminonaphthalin-1-sulfonylchlorid (Dansyl-Cl) reagiert mit primären und sekundären Aminen unter Abspaltung von Salzsäure zu Dansylderivaten. Auch mit Phenolen, Imidazolen, Alkoholen und Kohlenhydraten kann Dansyl-Cl Derivate bilden (KOTZABASIS et al.1993; HAYMAN et al.1985; SEILER 1977). Dansyl-Derivate sind sehr stabil. Nach BROSSAT

et al. (1983) sind die Derivate bei Aufbewahrung im Dunkeln und einer Umgebungstemperatur von 4 °C bis zu einer Woche stabil. Aufgrund ihrer ausgeprägten Fluoreszenz sind Dansyl-Cl Derivate mit hoher Empfindlichkeit detektierbar (KIRSCHBAUM

pflanzlichem und tierischem Gewebe nach Vorsäulenderivatisierung mit Dansyl-Cl und anschließender Fluoreszenzdetektion. Hierbei lagen die Nachweisgrenzen im Bereich von 0,5 bis 1 pmol.

Als Nachteil dieser Methode sind die lange Reaktionszeit (>30 min) und die schlechtere Auftrennung der hydrophoben Dansyl-Derivate an einer RP-C 18-Säule im Vergleich zu den entsprechenden Phenylisothiocyanat (PITC)- und OPA-Derivaten zu erwähnen (KIRSCHBAUM

1995). Auch die Bildung fluoreszierender Nebenprodukte und die ungenügende Derivatisierung von Aminosäuren, wenn diese in geringer Konzentration in komplexen Matrizes vorkommen, muss berücksichtigt werden (FÜRST et al.1990; EINARSSON et al.1983;

NEADLE u.POLLIT 1965).

2.4.2.1.3 Vorsäulenderivatisierung mit Phenylisothiocyanat (PITC)

Phenylisothiocyanat bildet mit primären und sekundären Aminen in alkalischer Lösung ein stabiles Phenylthiocarbamyl-Derivat (KIRSCHBAUM 1995). Durch anschließendes Ansäuern entsteht ein sehr stabiles Phenylhydantoin, welches durch UV-Detektion bestimmt werden kann (KIRSCHBAUM 1995; O´HARE et al.1987).

Der Nachteil dieser Methode ist die geringere Empfindlichkeit gegenüber der Bestimmung von OPA- oder FMOC-Cl-Derivaten (FÜRST et al.1990; BETNÉR u.FÖLDI 1986).

2.4.2.1.4 Weitere Vorsäulenderivatisierungsverfahren

Wie TAIBI und SCHIAVO (1993) setzten auch SCHENKEL et al. (1995) Benzoylchlorid als Derivatisierungsreagenz in der Aminanalytik ein. In einer Untersuchung über Amingehalte in pflanzlichem Material verwendeten KOTZABASIS et al. (1993) ebenfalls Benzoylchlorid zur Derivatisierung. Nach der Vorsäulenderivatisierung können die Derivate anhand ihrer UV-Absorption bestimmt werden.

LIN et al. (1975) verwendeten Dabsylchlorid (Dabsyl-Cl) zur Vorsäulenderivatisierung von Aminosäuren, mit denen es rot- gelborangene Derivate bildet. Nachfolgend wurde Dabsyl-Cl auch für die Derivatisierung primärer und sekundärer Amine eingesetzt (LIN et al.1982). Mit Hilfe der Vorsäulenderivatisierung durch Dabsylchlorid konnten auch KRAUSE et al. (1995)

die Gehalte an Aminosäuren und biogenen Aminen in biologischen Geweben und Nahrungsmitteln bestimmen. Dabsylderivate sind außerordentlich stabil und ihre Detektion erfolgt im VIS-Bereich bei 436-460 nm mit einer Nachweisgrenze im picomolaren Bereich (CHANG et al.1983; CHANG et al.1981 a;CHANG et al.1981 b).

4-Fluor-3-Nitrobenzotrifluorid (FNBT) wurde zur Vorsäulenderivatisierung von Putrescin, Spermidin und Spermin in einer Untersuchung von SPRAGG und HUTCHINGS (1983) verwendet.

CICHY et al. (1993) nutzten erstmals 2-(1-Pyrenyl)Ethylchloroformiat (PEOC) zur Vorsäulenderivatisierung von Aminen in Serum mit anschließender Fluoreszenzdetektion.

PEOC reagiert mit primären und sekundären Aminen zu fluoreszierenden Carbamaten.

Ein Verfahren zur Vorsäulenderivatisierung mit N-Hydroxysuccinimidyl 6-Quinolinyl-Carbamat (HSQC) wurde von WEISS et al. (1997) beschrieben. HSQC findet sowohl in der Aminosäuren- als auch in der Aminanalytik Anwendung.

SCHOLLENBERGER (1993) optimierte ein Derivatisierungsverfahren für Aminosäuren mit Naphthalendialdehyd/Kaliumcyanid (NDA/CN), so dass es zur Bestimmung biogener Amine verwendet werden konnte.